Automatically Generated

Summary

בשל החפיפה הספקטרלית של עירור ואורכי גל הפליטה של NADH וfura-2 אנלוגיות, הפרעות האות משני הכימיקלים בתאים חיים הוא בלתי נמנע במהלך המדידה הכמותית של [Ca^{2 +}]. לפיכך, שיטת התיקון המקוונת הרומן של הפרעה באות NADH למדידה [Ca^{2 +}] פותחה.

Abstract

כדי למדוד [Ca 2 +] כמותית, fura-2 אנלוגיים, אשר משמשים לעתים קרובות משתמשים^בשתישדות פלואורומטרים. עם זאת, השימוש בצבע הוא מוגבל בתאים חיים בגלל הפרעה פלואורסצנטית אוטומטי, בעיקר מפני הפרעות מסוימות (NADH). באופן ספציפי יותר, זהו מכשול גדול כאשר מדידת מיטוכונדריאלי [Ca^{2 +}] ככמת באמצעות fura-2 האנלוגיים כי רוב הרוב של nadh הוא המיטו,. אם הריכוז צבע פלורסנט זהה, עוצמת עירור מסוים צריך לייצר את עוצמת הפליטה זהה. לכן, יחס עוצמת הפליטה של שני אורכי גל עירור שונים צריך להיות קבוע. מבוסס על עיקרון זה, שיטת תיקון מקוון הרומן של הפרעה האות NADH הפרעות למדוד [Ca^{2 +}] פותחה, ואת עוצמת האות האמיתית של nadh ו fura-2 ניתן להשיג. עוד, משוואה הרומן לחשב [Ca^{2 +}] פותחה עם עירור isosbestic או עירור ב 400 nm. עם שיטה זו, שינויים מיטוכונדריאלי [Ca^{2 +}] יכול להיות נמדד בהצלחה. בנוסף, עם קבוצה שונה של העירור ואת אורכי הגל, פרמטרים מרובים, כולל NADH, [Ca^{2 +}], ו-pH או הממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאל (ענבל_m), ניתן למדוד בו. מיטוכונדריאלי [Ca^{2 +}] ו ענבל_m או pH נמדדו באמצעות fura-2-FF ו טטרמתירומתיל אתיל אסתר (tmre) או קרבוקטרוקסי-סמיטואפאפופלויור-1 (קרבוXY-סנאפ -1).

Introduction

התפקיד המשמעותי של הרשות התאיים^{2 +} מוכר באופן נרחב¹. הקוונפיקציה של [Ca^{2 +}] חיוני כדי להבין את התהליכים של פונקציות פיזיולוגיות הסלולר. האנלוגית fura-2 הם שימושיים למדי משום שהם נרגשים בטווח UV (< 400 ננומטר), ואת השיטה הטימטרית ניתן להחיל על המדידה הכמותית. לכן, פרמטרים פיזיולוגיים אחרים כגון pH, פוטנציאל הממברנה, וכו ', ניתן למדוד עם צבעי פלורסנט אחרים. Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} ריכוז ([Ca^{2 +}]_m) היה הדיווחים 0.08-20 μm^2,3,4,5. בין fura-2 אנלוגיות, fura-2-FF מתאים למדידת טווח זה של [Ca^{2 +}]. עם זאת, התאים החיים למרבה הצער מכילים NADH/NADH עבור תהליכי חילוף החומרים שלהם, ו-NADH יוצר הפרעות האות בגלל העירור החופף וספקטרום הפליטה עם האנלוגי fura-2. הפרעה זו מגבילה מאוד את השימוש באנלוגיות של fura-2. במיוחד, אם האנלוגי מוחל על מדידת מיטוכונדריאלי [Ca^{2 +}], הפרעה זו היא המכשול הגדול ביותר, כי הסכום הגבוה ביותר של nadh הוא במיטו,. זה מסובך עוד יותר על ידי שינויים nadh להיות קשור הפוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ענבל_m) ושינוי של ענבל_m משפיע [Ca^{2 +}]_m^{6,7,8 , 9}. יתר על כן, עבור לימוד [Ca^{2 +}]_m דינמיקה, חיוני לדעת את מעמדם של פרמטרים מיטוכונדריאלי אחרים, כגון nadh, ענבל_m, ו-pH.

פליטות ב 450 ננומטר ו 500 nm עם ההתרגשות ב 353 nm, 361 nm, ו-400 nm מכילים את האותות מ-NADH ו-fura-2-FF, והמשוואות הן כדלקמן. בזאת, 353 nm ו 361 nm הם נקודות isosbestic של fura-2-FF עבור פליטות ב 450 nm ו ב 500 nm, בהתאמה.

F_361,450 = f_{361450, nadh} + F_{361450, משוואת פרא} 1
F_353,500 = f_{353500, nadh} + F_{353500, משוואת פרא} 2
F_400,500 = f_{400500, nadh} + F_{400500, משוואת פרא} 3

כאשר F_{x, y} היא עוצמת הפליטה הנמדדת ב-y-nm על-ידי עירור ה-x-Nm, f_{x, y, nadh} מייצגת את עוצמת הפליטה הטהורה התלוית התלות, ו-f_{x, y, fura} מייצגת את עוצמת הפליטה הטהורה של fura-2-FF. תחת הריכוז זהה של צבע פלורסנט, אינטנסיביות עירור מסוים צריך לייצר את עוצמת פליטה זהה. לכן, יחס עוצמת הפליטה של שני אורכי גל עירור שונים צריך להיות קבוע. Ca^{2 +} ו fura-2 לא השפיעו על מאפייני הזריחה של nadh; לכן, את היחס של הפליטה ב 450 ננומטר ו ב 500 ננומטר של NADH היה קבוע באורך גל כל עירור. אותו כלל ניתן להשתמש עבור fura-2-FF מבוסס על ההנחה כי NADH או [Ca^{2 +}] אינו משפיע על הפליטה ואת מהווה ספקטרום של fura-2-ff. עם זאת, Ca^{2 +} גרם שינוי ספקטרלי של הפליטה fura-2-FF. לכן, כדי להסיר את ההשפעה של Ca^{2 +}, הריגוש isosbestic אשר אינו תלוי ca^{2 +}, צריך להיות בשימוש. כל אורך הגל (כלומר, 450 nm ו 500 ננומטר) יש נקודה isosbestic ומתוך ההתקנה הניסיונית שלנו, 353 nm ב 500 nm ו-361 nm ב 450 nm נבחרו. מאלה, המשוואות הבאות תקפים¹⁰.

R_f = f_{361450, fura}/F_{353500, משוואת fura} 4
R_N1 = F_{400500, nadh}/F_{361450, משוואת נדיה} 5
R_N2 = F_{353500, nadh}/F_{361450, משוואת נדיה} 6

עם קבועים אלה, המשוואות הבאות מ (משוואה 1) (משוואה 2) ו (משוואה 3) הן חוקיות.

F_361,450 = f_{361450, nadh} + R_F × f_{353500, משוואת fura} 7
F_353,450 = R_N2 × f_{361450, nadh} + f_{353500, משוואת fura} 8
F_400,500 = R_N1 × f_{361450, nadh} + f_{400500, משוואת fura} 9

ממשוואות אלה, אם R_f, r_N1ו-r_N2 ידועים, אותות טהורים של nadh ו fura-2 ניתן להשיג כדלקמן.

F_{361450, NADH} = (F_361,450 -R_f × f_353,500)/(1-r_f × r_N2) משוואה 10
F_{353500, Fura} = (r_N2 × f_361,450 -f_353,500)/(r_F × r_N2 -1) משוואה 11
F_{400500, Fura} = F_400,500 -R_N1 × f_{361450, משוואת נדיה} 12
R_fura = F_{353500, fura}/F_{400500, משוואת fura} 13

Ca^{2 +}הטופס מאוגד של fura-2-FF היה כמעט לא פלורסנט ב 400 הריגוש ננומטר גל. בהתבסס על מאפיין זה, ניתן לגזור את משוואת הכיול החדשה הבאה.

[Ca^{2 +}] = K_d ∙ (F_{400500, max}/f_{353500, מקסימום}) × (R_fura -r_דקות) משוואה 14

כאשר K_d הוא קבוע הדיסוציאציה,_{f 400500, Max} ו_{-f 353500, max} הם הערכים המרביים של האותות הנפלטים ב 500 ננומטר עם ההתרגשות ב 400 nm ו 353 Nm, בהתאמה, ו r_דקות הוא מינימום r_fura ב Ca^{2 +}-תנאי פנוי. מאחר שנעשה שימוש בהתרגשות, המשוואה יכולה להיות פשוטה יותר כדלקמן.

[Ca^{2 +}] = K_d ∙ (1/R_דקות) ∙ (R_fura -r_דקות) משוואה 15

לכן, רק ערכי K ו_– R_{מינימום} נדרשים לחישוב [Ca^{2 +}].

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים מקומיים וועדת השימוש. 1. הכנת התמיסה הכינו מיציטים חד-לבבית.הערה: כל מעבדה עשויה להיות בעלת פתרון אחסון תאים שונה. כאן, המיציטים מאוחסנים במדיום התרבותי (DMEM). הכן 100 mL של Ca2 +-פתרון ח…

Representative Results

Ca מיטוכונדריאלי2 + שינויים עקב תיקון10איור 4 מציג את השינויים ב [Ca2 +]m לפני ואחרי התיקון. התוצאות הראו בבירור את השינויים הניכרים ב [Ca2 +]m. מיטוכונדריאלי מונח ריכוז סידן ללא cytosolic Ca2 + ([Ca2 +]c) היה 1.03 ± 0.13 μm (ממוצע ± S.E., n = 32), ואת …

Discussion

שיטת תיקון ההפרעות פותחה בהצלחה עבור מדידת האותות של NADH ו fura-2 אנלוגיות. מדידה מדויקת של האותות חיונית לתיקון מדויק. עם זאת, האופי הטבוע של מכשיר הפלורסנט מייצר אות רקע שאינו קשור לזה של NADH של fura-2. הפילטר האיכותי ביותר יכול להעביר עד 10 עד⁸ מאורכי הגל הלא רצויים של האור. עם זאת, אות הפלורס…

Materials

2 mL eppendorf tube	Axygen	MCT-200-C	2 mL Tube
AD/DA converter	Instrutech	ITC-18	Equipment
ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma-aldrich	A5285	Chemicals
Band pass filter	Ealing Electro-Optics, Inc	35-3920	Equipment, 640±11nm
Band pass filter	Omega Optical	690-9823	Equipment, 590±15nm
Band pass filter	Omega Optical	500DF20-9916	Equipment, 500±20nm
Band pass filter	Chroma Technology Corp.	60685	Equipment, 450±30nm
Calcium chloride solution	Sigma-aldrich	21114	Chemicals
carboxy-SNARF-1(AM)	Invitrogen	C1272	Chemicals
Charge-coupled device (CCD) camera	Philips	FTM1800NH/HGI	Equipment
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	86009	Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	567DCXRU	Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	480dclp	Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	20728	Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma-aldrich	154938	Chemicals
DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Sigma-aldrich	D5030	Chemicals
EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid	Sigma-aldrich	E4378	Chemicals
FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone	Sigma-aldrich	21857	Chemicals
field diaphragm	Nikon	86506	Equipment
Fura-2-FF(AM)	TEFLABS	137	chemicals
Green tube	DWM		test tube
HEPES,  4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma-aldrich	H3375	Chemicals
High-speed counter	National Instruments	NI-6022	Equipment
Hot mirror	Chroma Technology Corp.	21002	Equipment, 50:50
Inverted microscope	Nikon	TE-300	Equipment
Malate	Sigma-aldrich	27606	Chemicals
Near infrared filter	Chroma Technology Corp.	D750/100X	Equipment, 750±100nm
Oil immersion lens	Nikon	MRF01400	40x, NA 1.3; Equipment
Photon counter unit	Hamamatsu	C3866	Equipment
Photon multiplier tube	Hamamatsu	R2949	Equipment
Polychrome II	Till Photonics	SA3/MG04	Equipment
Potassium chloride	Merck	1.04936	Chemicals
Potassium hydroxide solution	Sigma-aldrich	P4494	Chemicals
Pyruvate	Sigma-aldrich	107360	Chemicals
Rotenone	Sigma-aldrich	R8875	Chemicals
Saponin	Sigma-aldrich	S4521	Chemicals
TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester	Molecular probes	T669	Chemicals