Un nuovo metodo di correzione Adenine Adenine nicotinamide per la misurazione intracellulare Ca2o con Fura-2-Analog nelle cellule vive
Summary
A causa della sovrapposizione spettrale delle lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione degli analoghi NADH e fura-2, l’interferenza del segnale da entrambe le sostanze chimiche nelle cellule vive è inevitabile durante la misurazione quantitativa di [Ca2 ‘]. Così, è stato sviluppato un nuovo metodo di correzione online dell’interferenza del segnale NADH per misurare [Ca2 ].
Abstract
Per misurare quantitativamente [Ca2o] analoghi fura-2, che sono fluorostiche ratiometriche. Tuttavia, l’uso di tintura è intrinsecamente limitato nelle cellule vive a causa dell’interferenza dell’autofluorescenza, principalmente da nicotinamide dinucleotide (NADH). Più specificamente, questo è un ostacolo importante quando si misura il mitocondriale [Ca2]quantitativamente utilizzando fura-2 analoghi perché la maggior parte di NADH è nei mitocondri. Se la concentrazione di tinti fluorescenti è la stessa, una certa intensità di eccitazione dovrebbe produrre la stessa intensità di emissione. Pertanto, il rapporto di intensità di emissione di due diverse lunghezze d’onda di eccitazione dovrebbe essere costante. Sulla base di questo principio, è stato sviluppato un nuovo metodo di correzione online dell’interferenza del segnale NADH per misurare [Ca2]e si può ottenere la reale intensità del segnale di NADH e fura-2. Inoltre, è stata sviluppata una nuova equazione per il calcolo di [Ca2]con eccitazione o eccitazione isosbestica a 400 nm. Con questo metodo, i cambiamenti nel mitocondriale [Ca2]potrebbero essere misurati con successo. Inoltre, con un diverso insieme di lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione, è possibile misurare simultaneamente più parametri, tra cui NADH, [Ca2]e pH o potenziale di membrana mitocondriale(m). I mitocondriali [Ca2]e/m o pH sono stati misurati utilizzando fura-2-FF e tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) o carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).
Introduction
Il ruolo significativo di Ca2 intracellulare è ampiamente noto1. La quantificazione di [Ca2]è essenziale per comprendere i processi delle funzioni fisiologiche cellulari. Gli analoghi Fura-2 sono molto utili perché sono entusiasti nella gamma UV (<400 nm) e il metodo ratiometrico può essere applicato per la misurazione quantitativa. Pertanto, altri parametri fisiologici come il pH, il potenziale della membrana, ecc., possono essere misurati con altri coloranti fluorescenti. L'intervallo mitocondriale di Concentrazione di Ca2 o m ([Ca2]]è stato riferito che 0,08,20 M2,3,4,5. Tra gli analoghi fura-2, il fura-2-FF è adatto per misurare questa gamma di [Ca2s]. Tuttavia, le cellule vive contengono purtroppo NADH/NADPH per i loro processi metabolici, e NADH genera interferenze di segnale a causa della sovrapposizione degli spettri di eccitazione ed emissione con l’analogico fura-2. Questa interferenza limita notevolmente l’uso di analoghi fura-2. In particolare, se l’analogico viene applicato per misurare il mitocondriale [Ca2s], questa interferenza è l’ostacolo più grande perché la quantità più alta di NADH è nei mitocondri. Ciò è ulteriormente complicato dal fatto che i cambiamenti NADH sono correlati al potenziale della membrana mitocondriale(m) e al cambiamento dim colpisce [Ca2 ]m6,7,8 , 9.Inoltre, per studiare le dinamiche di [Ca2]m, è essenziale conoscere lo stato di altri parametri mitocondriali, come NADH,me pH.
Le emissioni a 450 nm e 500 nm con eccitazioni a 353 nm, 361 nm e 400 nm contengono i segnali da NADH e fura-2-FF e le equazioni sono le seguenti. Qui, 353 nm e 361 nm sono i punti isosbestici di fura-2-FF per le emissioni a 450 nm e a 500 nm, rispettivamente.
Equazione F361,450 – F361.450,NADH – F361.450,Fura 1
Equazione F353.500 x F353.500,NADH , F353.500,Fura
F400.500 – F400.500,NADH – F400.500,Fura Equazione 3
dove Fx,y è l’intensità di emissione misurata a y-nm per eccitazione x-nm, Fx,y,NADH rappresenta l’intensità di emissione pura dipendente da NADH e Fx,y,Fura rappresenta l’intensità di emissione pura dipendente da fura-2-FF. Sotto la stessa concentrazione del tinrito fluorescente, una certa intensità di eccitazione dovrebbe produrre la stessa intensità di emissione. Pertanto, il rapporto di intensità di emissione di due diverse lunghezze d’onda di eccitazione dovrebbe essere costante. La frequenza Ca2 e fura-2 non hanno influenzato le caratteristiche della fluorescenza NADH; pertanto, il rapporto tra le emissioni a 450 nm e a 500 nm di NADH era costante a qualsiasi lunghezza d’onda di eccitazione. La stessa regola può essere utilizzata per fura-2-FF sulla base del presupposto che NADH o [Ca2 )non influenzino gli spettri di emissione ed eccitazione di fura-2-FF. Tuttavia, Ca2o causò uno spostamento spettrale dell’emissione di fura-2-FF. Pertanto, per rimuovere l’effetto dell’eccitazione isoscanica ca2,che è indipendente da Ca2, deve essere utilizzata. Ogni lunghezza d’onda di emissione (vale a dire 450 nm e 500 nm) ha un punto isosbestico diverso e, dalla nostra configurazione sperimentale, 353 nm a 500 nm e 361 nm a 450 nm sono stati scelti. Da queste, le seguenti equazioni sono valide10.
Rf – F361.450,Fura/F353.500,Fura Equazione 4
RN1 – F400.500,NADH/F361,450,NADH Equazione 5
RN2 – F353.500,NADH/F361,450,NADH Equazione 6
Con queste costanti, le equazioni seguenti da (Equazione 1) (Equazione 2) e (Equazione 3) sono valide.
F361,450 – F361,450,NADH , Rf 353.500,Equazione Fura 7
F353,450 , RN2 , F361,450,NADH , F353.500,Equazione Fura 8
F400.500 , RN1 , F361,450,NADH , F400,500,Equazione 9
Da queste equazioni, se Rf, RN1e RN2 sono noti, i segnali puri di NADH e fura-2 possono essere ottenuti come segue.
Equazione 10 (F361,450) –(F 361,450 )
F353.500,Fura : (RN2 , F361,450 F353.500)/(Rf – RN2 – 1) Equazione 11
F400.500,Fura : F400.500 , RN1 , F361,450,NADH Equazione 12
RFura – F353.500,Fura/F400,500,Equazione Fura 13
La forma di fura-2-FF legata a Ca2oera praticamente non fluorescente alla lunghezza d’onda dell’eccitazione di 400 nm. In base a questa proprietà, è possibile derivare la nuova equazione di calibrazione seguente.
Equazione [Ca2,] : Kd . (F400.500,max/F353.500,max) – (RFura – Rmin) 14
dove Kd è una costante di dissociazione, F400.500,max e F353.500,max sono i valori massimi dei segnali emessi a 500 nm con eccitazioni rispettivamente a 400 nm e 353 nm e Rmin è il valore minimo RFura in Ca2 –condizione -free. Poiché sono state utilizzate le eccitazioni isosoriche, l’equazione può essere ulteriormente semplificata come segue.
Equazione15(1 / Rmin)
Pertanto, solo I valori Kd e Rmin sono necessari per calcolare [Ca2 ‘].
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di correzione delle interferenze è stato sviluppato con successo per misurare i segnali degli analoghi NADH e fura-2. La misurazione esatta dei segnali è essenziale per la correzione esatta. Tuttavia, la natura intrinseca del dispositivo fluorescente produce un segnale di fondo non correlato a quello di NADH di fura-2. Il filtro a bande-passa-banda di altissima qualità può passare solo fino a 10euro delle lunghezze d’onda indesiderate della luce. Tuttavia, il segnale fluorescente da una singola c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell’Istruzione (2018R1A6A3A01011832), dal Ministero della Scienza, ICT & Future Planning (NRF-2016M3C1A6936606) e dal Ministero del Commercio, dell’Industria e dell’Energia (10068076).
Materials
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
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