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Summary

NADHとfura-2アナログの励起波長と発光波長のスペクトルが重なり合う^{ため、[Ca2+]}の定量測定中に生細胞内の両方の化学物質からの信号干渉は避けられません。そこで、NADH信号干渉を測定する新規なオンライン補正^{法「Ca2+」}を開発した。

Abstract

^[Ca2+]を定量的に測定するために、比率蛍素プローブであるフラ2アナログが頻繁に使用されます。しかし、色素の使用法は、主にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)からの自己蛍光干渉のために生細胞において本質的に制限される。具体的には、NADHの大部分がミトコンドリアにあるため、フラ-2アナログを定量的に用いてミトコンド^リア[Ca2+]を測定する際の大きな障害となる。蛍光色素濃度が同じである場合、特定の励起強度は同じ発光強度を生成する必要があります。したがって、2つの異なる励起波長の発光強度比は一定でなければならない。この原理に基づき、NADH信号干渉を測定する新規なオンライン補正^{法「Ca2+」}を開発し、NADHとフラ-2の実信号強度を得ることができる。また、400nmでイソスベスティック励起または励起を用^{いて「Ca2+」}を計算する新規方程式を開発した。この方法では、ミトコンド^リア[Ca2+]の変化を正常に測定することができました。さらに、励起波長と発光波長の異なるセットを用いて、NADH、[Ca2+]、およびpHまたはミトコンドリア膜電位(+m)を含む複数のパラメータを同時に測定することができる。ミトコンドリア[Ca2+]_およびαmまたはpHを、フラ-2-FFおよびテトラメチルロダミンエチルエステルエステル(TMRE)またはカルボキシセミナフトローダフールフルオール-1(カルボキシ-SNARF-1)を用いて測定した。

Introduction

細胞^内Ca2+の重要な役割は広く知^{られている1.}[Ca^2+]の定量化は、細胞の生理機能のプロセスを理解するために不可欠です。Fura-2アナログはUV範囲(<400 nm)で励起され、定量測定にレシオメトリック法を適用できるので非常に便利です。従って、pH、膜電位等の他の生理学的パラメータは、他の蛍光色素と共に測定することができる。ミトコンド^リアCa2+濃度([Ca2+]m)の範囲は、伝えられるところでは0.08−20 μM^{2、3、4、5}であった。フラ-2アナログの中でも、フラ2-FF^{は「Ca2+」}のこの範囲の測定に適しています。しかし、生細胞には代謝過程にNADH/NADPHが含まれており、NADHはフラ-2アナログと励起と発光スペクトルが重なり合うため信号干渉を発生します。この干渉は、fura-2アナログの使用を大幅に制限します。具体的には、ミトコンド^リア[Ca2+]を測定するためにアナログを適用した場合、NADHの最大量がミトコンドリアにあるため、この干渉が最大の障害となる。これは、ミトコンドリア膜電_位(+m)に関連するNADHの変化によってさらに複雑になり、及びmの変化は[Ca^{2+]m 6、7、8}に影響を与える^,9.さらに、[Ca^2+]_mダイナミクスを研究するためには、NADH、αm、pHなどの他のミトコンドリアパラメータの状態を知る必要がある。

353 nm、361 nm、および 400 nm の励起を伴う 450 nm および 500 nm の放出には、NADH および fura-2-FF からの信号が含まれており、式は次のとおりです。ここで、353 nmおよび361nmは、それぞれ450nmおよび500nmでの排出に対するフラ2-FFのイソスベスティックポイントである。

F_361,450 = F_361,450,NADH + F_{361,450,フラ}方程式 1
F_353,500 = F_353,500,NADH + F_{353,500,フラ}方程式 2
F_400,500 = F_400,500,NADH + F_{400,500,フラ}方程式 3

_{ここで、F x,y}は x-nm 励起による y-nm での測定された発光強度であり、F_x,y,NADHは純粋な NADH 依存性発光強度を表し、F_x,y,Furaは純粋なフラ-2-FF 依存性発光強度を表します。蛍光色素の同じ濃度の下で、特定の励起強度は、同じ発光強度を生成する必要があります。したがって、2つの異なる励起波長の発光強度比は一定でなければならない。Ca²⁺およびフラ-2はNADH蛍光特性に影響を与えなかった。従って、NADHの450nmおよび500nmでの放出の比率は、任意の励起波長で一定であった。NADH^{または[Ca2+]}がフラ-2-FFの放出および励起スペクトルに影響を与えないという仮定に基づいて、同じルールをフラ2-FFに使用することができます。^{しかし、Ca2+はフラ-2-FF}放出のスペクトルシフトを引き起こした。^{したがって、Ca2+}の効果を除去するには、Ca2+に依存しないイソスベスト励起を使用する必要があります。各発光波長(すなわち、450 nmおよび500 nm)は異なるアイソスベストポイントを有し、我々の実験セットアップから、500nmで353 nm、450nmで361nmを選択した。これらのことから、次の式は有効^{な 10}です。

R₌ F_{361,450,フラ/F353,500,フラ}方程式 4
R_N1 = F_400,500,NADH/F_361,450,NADH方程式 5
R_N2 = F_353,500,NADH/F_361,450,NADH式 6

これらの定数では、(式 1)(式2)および(式3)からの次の式が有効です。

F_361,450 = F_361,450,NADH + R_f × F_{353,500,フラ}方程式 7
F_353,450 = R_N2 × F_361,450,NADH + F_{353,500,フラ}方程式 8
F_400,500 = R_N1 × F_361,450,NADH + F_{400,500,フラ}方程式 9

これらの式から、R_f、RN1、およびR_N2が知られている場合、NADHおよびfura-2の純粋な信号は以下のように得ることができる。

F_361,450,NADH = (F_361,450 – R_f × F_353,500)/(1 – R_f × R_N2)式 10
F_{353,500,フラ}= (R_N2 × F_361,450 – F_353,500)/(R_f × R_N2 – 1) 式 11
F_{400,500,フラ}= F_400,500 – R_N1 × F_361,450,NADH方程式 12
R_ふら= F_{353,500,フラ}/F_{400,500,フラ}方程式 13

フラ-2-FF^のCa2+結合形態は、400nm励起波長で実質的に非蛍光であった。このプロパティに基づいて、次の新しいキャリブレーション方程式を導き出すことができます。

[Ca²⁺] = K_d ∙ (F_400,500,max/F_353,500,max)× (R_フラ– R_分)式 14

ここで、K_dは解離定数であり、F_{400,500、max}および F_{353,500、最大}は、それぞれ 400 nm と 353 nm の励起を持つ 500 nm で放出された信号の最大値であり、R_minは Ca 2 の最小 R_フラです。^+-フリー条件。アイソスベスティック励起を用いたので、この方程式は以下のようにさらに簡略化することができる。

[Ca²⁺] = K_d ∙ (1 / R_分)∙ (R_フラ– R_分)式 15

したがって、[Ca^2+]を計算するために必要なのは K_dと R_分の値だけです。

Protocol

すべての実験プロトコルは、地元の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。 1. ソリューションの準備 単一の新たに単一分離された心臓筋細胞11を調調す。注: 各ラボには異なる細胞貯蔵ソリューションがある場合があります。ここで、筋細胞は培養培地(DMEM)に貯蔵される。 Ca2+-フリー溶液の100 mLを準備します(<stron…

Representative Results

ミトコンドリアCa2+修正による変更10図4は、補正前後の[Ca2+]mの変化を示す。結果は明らかに[Ca2+]mの実質的な変化を示した。サイトソリックCa2+を含まないミトコンドリア安静カルシウム濃度は1.03±0.13μM(平均±S.E.、n=32)、最大[Ca2+]mは1μM[Ca2+]cで29.6±1.61μM( 平均 ±S….

Discussion

干渉補正法は、NADHとフラ2アナログの信号を測定するために開発されました。信号の正確な測定は、正確な補正に不可欠です。しかし、蛍光装置の本来の性質は、フラ-2のNADHとは無関係の背景信号を生成する。最高品質のバンドパスフィルタは、光の不要な波長^の10-8までしか通過できません。しかし、単一細胞からの蛍光シグナルは非常に小さく、バンドパスフィルタ後の励起光の?…

Materials

2 mL eppendorf tube	Axygen	MCT-200-C	2 mL Tube
AD/DA converter	Instrutech	ITC-18	Equipment
ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma-aldrich	A5285	Chemicals
Band pass filter	Ealing Electro-Optics, Inc	35-3920	Equipment, 640±11nm
Band pass filter	Omega Optical	690-9823	Equipment, 590±15nm
Band pass filter	Omega Optical	500DF20-9916	Equipment, 500±20nm
Band pass filter	Chroma Technology Corp.	60685	Equipment, 450±30nm
Calcium chloride solution	Sigma-aldrich	21114	Chemicals
carboxy-SNARF-1(AM)	Invitrogen	C1272	Chemicals
Charge-coupled device (CCD) camera	Philips	FTM1800NH/HGI	Equipment
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	86009	Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	567DCXRU	Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	480dclp	Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	20728	Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma-aldrich	154938	Chemicals
DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Sigma-aldrich	D5030	Chemicals
EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid	Sigma-aldrich	E4378	Chemicals
FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone	Sigma-aldrich	21857	Chemicals
field diaphragm	Nikon	86506	Equipment
Fura-2-FF(AM)	TEFLABS	137	chemicals
Green tube	DWM		test tube
HEPES,  4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma-aldrich	H3375	Chemicals
High-speed counter	National Instruments	NI-6022	Equipment
Hot mirror	Chroma Technology Corp.	21002	Equipment, 50:50
Inverted microscope	Nikon	TE-300	Equipment
Malate	Sigma-aldrich	27606	Chemicals
Near infrared filter	Chroma Technology Corp.	D750/100X	Equipment, 750±100nm
Oil immersion lens	Nikon	MRF01400	40x, NA 1.3; Equipment
Photon counter unit	Hamamatsu	C3866	Equipment
Photon multiplier tube	Hamamatsu	R2949	Equipment
Polychrome II	Till Photonics	SA3/MG04	Equipment
Potassium chloride	Merck	1.04936	Chemicals
Potassium hydroxide solution	Sigma-aldrich	P4494	Chemicals
Pyruvate	Sigma-aldrich	107360	Chemicals
Rotenone	Sigma-aldrich	R8875	Chemicals
Saponin	Sigma-aldrich	S4521	Chemicals
TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester	Molecular probes	T669	Chemicals