Ce travail décrit une méthode robuste et simple pour détecter et quantifier l’endocannabinoïde 2-arachidonoylglycérol (2-AG) dans C. elegans. Une norme analytique délutée nous a préparé et utilisé pour la quantification de 2-AG par dilution isotopique et la spectrométrie de masse d’ionisation-tandem d’ionisation d’électrospray liquide (LC-ESI-MS/MS).
Ce travail présente une méthode pour préparer une norme analytique pour analyser le glycérol 2-arachidonoyl (2-AG) qualitativement et quantitativement par la spectrométrie de masse d’ionisation-tandem de chromatographie-électrospray (LC-ESI-MS/MS). Les endocannabinoïdes sont des médiateurs lipidiques conservés qui régulent plusieurs processus biologiques dans une variété d’organismes. Dans C. elegans, 2-AG s’est avéré posséder différents rôles, y compris la modulation de la formation dauer et le métabolisme du cholestérol. Ce rapport décrit une méthode pour surmonter les difficultés associées aux coûts et à la stabilité des normes deuterated exigées pour la quantification de 2-AG. La procédure de synthèse de la norme est simple et peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire, sans avoir besoin d’expertise en synthèse organique ou d’équipement spécial. En outre, une modification de la méthode de Folch pour extraire la norme deuterated de la culture de C. elegans est décrite. Enfin, une méthode quantitative et analytique pour détecter 2-AG à l’aide de l’analogue stable étiqueté isotopique 1-AG-d5 est décrite, ce qui fournit des résultats fiables dans une course à la chromatographie rapide. La procédure est utile pour étudier les rôles multiples de 2-AG dans C. elegans tout en étant applicable à d’autres études de métabolites dans différents organismes.
Les endocannabinoïdes régulent plusieurs processus biologiques dans une variété d’organismes et sont des médiateurs lipidiques conservés1. Les premiers endocannabinoïdes découverts et les plus bien caractérisés sont l’anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) et le glycérol 2-arachidonoyl (2-AG). Les endocannabinoïdes jouent de nombreux rôles critiques, y compris ceux impliqués dans les systèmes de récompense du cerveau ainsi que la toxicomanie, la mémoire, l’humeur, et les processus métaboliques2. AEA et 2-AG ne sont synthétisés qu’en cas de besoin et ont une courte durée de vie, et ils sont dégradés par le transport de la reprise de protéines et de l’hydrolyse3.
L’utilisation de modèles animaux comme Caenorhabditis elegans (C. elegans) est devenue importante pour étudier la grande variété de processus biologiques, y compris l’apoptose, la signalisation cellulaire, le cycle cellulaire, la polarité cellulaire, la régulation des gènes, le métabolisme, le vieillissement, et la détermination du sexe4,5. En outre, C. elegans est un excellent modèle pour étudier les rôles physiologiques des acides gras polyinsaturés (PUFA). L’AEA a été identifiée chez C. elegans et est réduite en vertu de la restriction alimentaire6. Cette insuffisance prolonge la durée de vie du nématode par un mécanisme diététique de restriction qui peut être supprimé par la supplémentation avec l’endocannabinoïde. Récemment, il a été découvert que 2-AG et AEA jouent un rôle fondamental dans la réglementation du trafic de cholestérol dans C. elegans7. Plus important encore, il a été déterminé que la supplémentation avec exogène 2-AG peut sauver l’arrestation dauer, qui est causée par le trafic de cholestérol altéré dans Niemann-Pick type C1 C. elegans mutants.
Pour mieux comprendre la relation de 2-AG avec le trafic de cholestérol et d’autres processus biologiques dans le nématode (c.-à-d. la signalisation monoaminergique, la nociception et la locomotion), il est crucial d’étudier ce métabolite endogène et comment il est affectés dans certaines conditions environnementales et diététiques8,9,10,11,12,13. Par conséquent, il est impératif de concevoir et d’optimiser une méthode pour détecter et quantifier endogène 2-AG dans C. elegans qui est simple à utiliser pour les scientifiques de différents domaines, en particulier ceux qui étudient le comportement du nématode par rapport à cette endocannabinoïde.
En 2008, Lethonen et ses collègues ont réussi à identifier 2-AG et AEA dans C. elegans en utilisant les méthodes d’analyse LC-MS14. En 2011, ils ont réussi à étendre cette technique à d’autres endocannabinoïdes15. Des travaux plus récents ont montré d’autres méthodes analytiques qui ont réussi à détecter et à quantifier les endocannabinoïdes chez C. elegans, y compris la spectrométrie de masse et GC-MS16,17,18, et il a également signalé que des méthodes analytiques similaires peuvent être étendues à d’autres modèles19.
Les méthodes analytiques précédemment signalées utilisées pour quantifier le 2-AG dans les échantillons biologiques impliquent habituellement l’utilisation de normes diluées qui sont acquises commercialement et nécessitent une disponibilité pour l’achat20,21. De nombreuses normes analytiques pour la quantification des endocannabinoïdes LC-MS/MS sont disponibles dans le commerce auprès de différents fournisseurs. Néanmoins, ils sont chers, sont sensibles, et s’oxydent au fil du temps, en raison de la présence de multiples liaisons doubles. Les versions les plus courantes de ces normes sont basées sur l’acide arachidonique delué d’octa et conviennent à la quantification par dilution isotopique LC-MS/MS14,22. En outre, la plupart de ces normes sont substituées dans la position 2 du glycérol, les rendant instables dans la plupart des conditions puisqu’elles sont sujettes à la migration d’acyl19,23.
Pour surmonter les difficultés associées aux coûts et à la stabilité de ces normes deuterated, une méthode commode et simple est présentée pour préparer une norme analytique basée sur le glycérol-d5. La séquence pour préparer la norme penta-deuterated exige une procédure en trois étapes qui a comme conséquence la norme 1-AG-d5, qui est stable et ne subit pas la migration d’acyl (la question principale en visant à synthétiser 2-monoacylglycerols).
L’objectif principal ici est de montrer une méthode simple et reproductible pour étudier 2-AG dans C. elegans, y compris la synthèse de la norme analytique deuterated, la préparation et l’extraction des échantillons de nématode, et l’analyse par LC-MS/MS (Figure 1 ). Cette procédure synthétique est réalisable sans la connaissance sophistiquée de synthèse organique ou l’équipement spécial, le rendant approprié pour des scientifiques de différents domaines qui étudient le comportement de C. elegans sous l’influence endocannabinoïde. La méthode est également extensible à d’autres modèles d’étude, ce qui la rend utile pour différentes cibles. La norme, préparée comme indiqué ici, a été appliquée pour développer avec succès une méthode chromatographique rapide et fiable qui permet une détection efficace et la quantification de 2-AG d’une manière reproductible.
Les endocannabinoïdes sont une classe de lipides qui ont été impliqués dans la régulation de la formation dauer dans C. elegans7. Plus précisément, la synthèse des acides gras polyinsaturés (PUFA) est importante pour le trafic de cholestérol et le développement reproducteur des vers. Il est révélé ici que 2-AG, un acide arachidonique contenant de l’endocannabinoïde, est responsable de restituer la larve dauer à son cycle normal dans les vers qui ont altéré le métabolism…
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été soutenus par une subvention de recherche de l’Agencia Nacional de Promocion Cient-fica y Tecnol-gica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., et B.H.C. sont boursiers de CONICET. D.d.M. et G.R.L. sont membres de la carrière de recherche de CONICET. Nous remercions Gonzalo Lamberto (INMET) pour l’analyse LC-MS/MS et la discussion utile. Le tournage et le montage vidéo ont été réalisés par Ramiro Ortega et Maria Soledad Casasola de Direccion de Comunicacion de la Ciencia, Facultad de Ciencia Polàtica y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario à Rosario, Argentine.
4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |