Summary

Síntese de um padrão Deuterated para a quantificação de 2-Arachidonoylglycerol em elegans do Caenorhabditis

Published: September 21, 2019
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Summary

Este trabalho descreve um método robusto e direto para detectar e quantificar o endocanabinóide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) em C. elegans. Um padrão analítico deuterado nos preparou e utilizou para a quantificação de 2-AG por diluição isotópica e cromatografia líquida-eletroestimulação por espectrometria de massas tandem-electrospray (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Este trabalho apresenta um método para preparar um padrão analítico para analisar 2-arachidonoyl glicerol (2-AG) qualitativamente e quantitativamente pela espectrometria de massas de ionização em tandem (LC-ESI-MS/MS) de cromatografia líquida-electrospray. Os endocanabinoides são conservados mediadores lipídicos que regulam vários processos biológicos em uma variedade de organismos. Em C. elegans, 2-AG foi encontrado para possuir papéis diferentes, incluindo a modulação da formação do Dauer e do metabolismo do colesterol. Este relatório descreve um método para superar as dificuldades associadas com os custos e a estabilidade de padrões deuterado exigidos para a quantificação 2-AG. O procedimento para a síntese do padrão é simples e pode ser executado em todo o laboratório, sem a necessidade para a perícia orgânica da síntese ou o equipamento especial. Além disso, é descrita uma modificação do método de Folch para extrair o padrão deuterado da cultura C. elegans . Finalmente, um método quantitativo e analítico para detectar 2-AG usando o análogo isotopicamente etiquetado estável 1-AG-d5 é descrito, que fornece resultados de confiança em um funcionamento rápido-cromatográfico. O procedimento é útil para estudar as funções múltiplas de 2-AG em C. elegans ao igualmente ser aplicável a outros estudos dos metabolitos em organismos diferentes.

Introduction

Os endocanabinoides regulam processos biológicos múltiplos em uma variedade de organismos e são mediadores lipídicos conservados1. Os primeiros endocanabinoides descobertos e mais bem caracterizados são anandamida (arachidonoylethanolamide, AEA) e 2-arachidonoyl glicerol (2-AG). Endocannabinoids desempenham muitos papéis críticos, incluindo os envolvidos em sistemas de recompensa cerebral, bem como a toxicodependência, memória, humor e processos metabólicos2. AEA e 2-AG são sintetizados somente quando necessário e têm períodos de vida curtos, e são degradados com a recaptação e a hidrólise da proteína do transporte3.

O uso de modelos animais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) tornou-se importante para estudar a grande variedade de processos biológicos, incluindo apoptose, sinalização celular, ciclo celular, polaridade celular, regulação genética, metabolismo, envelhecimento, e determinação do sexo4,5. Adicionalmente, C. elegans é um excelente modelo para estudar os papéis fisiológicos de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs). A AEA foi identificada em C. elegans e é reduzida restrição dietética6. Esta deficiência estende a vida útil do nematoide através de um mecanismo de restrição dietética que pode ser suprimida pela suplementação com o endocanabinoide. Recentemente, descobriu-se que 2-AG e AEA desempenham papéis fundamentais na regulação do tráfico de colesterol em C. elegans7. Mais importante, determinou-se que a suplementação com 2-AG exógeno pode resgatar Dauer prisão, que é causada pelo tráfico de colesterol prejudicada em Niemann-Pick tipo C1 C. elegans mutantes.

Para obter uma melhor compreensão da relação 2-AG com o tráfico de colesterol e outros processos biológicos no nematódeo (i.e., sinalização monoaminérgica, nocicepção e locomoção), é crucial estudar este metabolito endógeno e como é afetados determinadas condições ambientais e dietéticas8,9,10,11,12,13. Portanto, é imperativo projetar e otimizar um método para detectar e quantificar 2-AG endógena em C. elegans que é simples de usar para cientistas de diferentes campos, especialmente aqueles que estudam o comportamento do nematódeo em relação a este endocanabinóide.

Em 2008, Lethonen e colegas de trabalho conseguiram identificar 2-AG e AEA em C. elegans utilizando métodos analíticos LC-MS14. Em 2011, conseguiram ampliar essa técnica para outros endocanabinoides15. Trabalhos mais recentes mostraram outros métodos analíticos que têm sido bem-sucedidos na detecção e quantificação de endocanabinoides em C. elegans, incluindoespectrometria de massas e GC-MS16,17,18, etem também foi relatado que métodos analíticos semelhantes podem ser expandidos para outros modelos19.

Os métodos analíticos previamente relatados usados para quantificar 2-AG em amostras biológicas envolvem geralmente o uso de padrões deuterado que são adquiridos comercialmente e exigem a disponibilidade para a compra20,21. Muitos padrões analíticos para a quantificação de LC-MS/MS de endocanabinoides estão disponíveis comercialmente a partir de diferentes fornecedores. No entanto, eles são caros, são sensíveis, e se tornam oxidados ao longo do tempo, devido à presença de múltiplas ligações duplas. As versões mais comuns destas normas baseiam-se no ácido araquidônico Octa-deuterado e são adequadas para quantificação por diluição isotópica LC-MS/MS14,22. Além disso, a maioria destes padrões são substituídos na posição 2 do glicerol, tornando-os instáveis na maioria das condições, uma vez que são propensas à migração de acilo19,23.

Para superar as dificuldades associadas aos custos e à estabilidade desses padrões deuterados, um método conveniente e simples é apresentado para elaborar um padrão analítico baseado em glicerol-d5. A sequência para preparar o padrão penta-deuterated requer um procedimento de três etapas que resulte no padrão 1-AG-d5, que é estável e não sofre migração de acilo (a principal questão quando se pretende sintetizar 2-monoacilgliceróis).

O objetivo principal aqui é mostrar um método simples e reprodutível para estudar 2-AG em C. elegans, incluindo a síntese do padrão analítico deuterado, preparação e extração das amostras de nematódeos e análise por LC-MS/MS (Figura 1 ). Este procedimento sintético é realizável sem o conhecimento orgânico sofisticado da síntese ou o equipamento especial, fazendo o apropriado para cientistas dos campos diferentes que estão estudando o comportamento de C. elegans a influência do endocanabinóide. O método também é expansível para outros modelos de estudo, tornando-o útil para diferentes alvos. O padrão, preparado como relatado aqui, foi aplicado para desenvolver com sucesso um método cromatográfico rápido e de confiança que permita a deteção e a quantificação eficazes de 2 AG em uma maneira reprodutível.

Protocol

1.1-AG-d5 preparação Nota: para a obtenção de 1-AG-d5 como um padrão interno deuterado para ensaios de quantificação, siga o protocolo conforme detalhado abaixo. Proteção diferencial Para proteger somente álcoois primários, primeiro adicione 38 mg de glicerol-d8 a um tubo de reação de 10 ml usando uma pipeta Pasteur e adicione um agitador magnético. Adicione 5 mL de diclorometano anidro (DCM) utilizando uma seringa Ham…

Representative Results

Um análogo isotopicamente marcado foi sintetizado com sucesso a partir de d8-glicerol e ácido araquidônico comercialmente disponíveis usando um método sintético de 3 etapas (Figura 2, Figura 3). Estes passos são simples e não necessitam de equipamentos sofisticados, especialmente condições controladas, ou reagentes caros. Assim, este método é robusto e pode ser estendido com sucesso para sintetizar monoacil…

Discussion

Os endocanabinoides são uma classe de lipídios que têm sido implicados na regulação da formação de Dauer em C. elegans7. Mais especificamente, a síntese de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) é importante para o tráfico de colesterol e o desenvolvimento reprodutivo de vermes. Revela-se aqui que 2-AG, um ácido araquidônico que contem o endocannabinoid, é responsável para restituir a larva do Dauer a seu ciclo normal nos sem-fins que prejudicaram o metabolismo do colesterol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Agencia Nacional de Promoción científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., e B.H.C. são companheiros da CONICET. D.d.M. e G.R.L. são membros da carreira de pesquisa da CONICET. Estamos gratos a Gonzalo Lamberto (INMET) para a análise LC-MS/MS e discussão útil. A filmagem e edição de vídeo foi feita por Ramiro Ortega e María Soledad Casasola da Dirección de comunicación de la Ciencia, Facultad de ciencia política y relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario em Rosario, Argentina.

Materials

4-dimethylaminopyridine Sigma-Aldrich 107700 reagent grade, 99%
antioxidant BHT Sigma-Aldrich W21805
Arachidonic acid Sigma-Aldrich 10931
Glycerol-d8 Sigma-Aldrich 447498
Mass detector Triple Quadrupole Thermo Scientific TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407
NMR spectrometer Bruker Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column Thermo Fisher 25003-052130 C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride Sigma-Aldrich 190500 reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride Sigma-Aldrich 216143 1.0M in THF
UHPLC System Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

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Fernández de Luco, J., Prez, G., Hernández Cravero, B., de Mendoza, D., Labadie, G. R. Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (151), e59882, doi:10.3791/59882 (2019).

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