Summary
We beschrijven een methode voor de voorbereiding van de enkele vers geïsoleerde detrusor gladde spiercellen van menselijke urineblaas monsters gebruik maken van een twee-stap enzymatische procedure. De verkregen levensvatbare DSM-cellen kunnen worden bestudeerd door verschillende eencellige technieken, waaronder de beschreven amphotericine-B patch-clamp elektrofysiologie om fysiologische en farmacologische eigenschappen te onthullen.
Abstract
Detrusor gladde spier (DSM) cellen aanwezig in de urineblaaswand uiteindelijk vergemakkelijken urineopslag en voiding. Voorbereiding van de levensvatbare, verse en geïsoleerde DSM-cellen vormt een belangrijke technische uitdaging waarvan de prestatie optimale cellen biedt voor latere functionele en moleculaire studies. De methode ontwikkeld en uitgewerkt hierin, met succes gebruikt door onze groep voor meer dan een decennium, beschrijft dissectie van menselijke urineblaas monsters verkregen uit open blaas operaties, gevolgd door een enzymatische twee-staps behandeling van DSM stukken en mechanische trituratie om vers geïsoleerde DSM cellen te verkrijgen. De eerste stap omvat dissectie om de DSM-laag (ook bekend als muscularis propria) te scheiden van slijmvlies (urothelium, lamina propria en muscleis mucosa) en de aangrenzende bind-, vaat- en vetweefsel aanwezig. De DSM wordt vervolgens in stukken gesneden (2-3 mm x 4-6 mm) in nominale Ca2+-bevattende dissectie/spijsverteringsoplossing (DS). DSM-stukken worden vervolgens overgedragen aan en achtereenvolgens afzonderlijk behandeld met DS die papaïne en collagenase bij ~37 °C voor 30-45 min per stap bevatten. Na wasbeurten met DS die enzymvrij runderserum en trituratie met een brandgepolijste pipet bevatten, geven de stukken enkele DSM-cellen af. Vers geïsoleerde DSM-cellen zijn bij uitstek geschikt voor fragment-klem elektrofysiologische en farmacologische karakteriseringen van ionenkanalen. Concreet laten we zien dat de TRPM4-kanaalblokker 9-fenanthrol de spanningsstap-ontluchtingsstromen vermindert die zijn geregistreerd met de geperforeerde patchklembenadering van amphotericin-B. DSM-cellen kunnen ook worden bestudeerd door andere technieken zoals eencellige RT-PCR, microarray analyse, immunocytochemie, in situ nabijheid sjaer, en Ca2 + beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van enkele DSM-cellen is dat de gemaakte waarnemingen rechtstreeks betrekking hebben op enkele celkenmerken die aan het licht kwamen. Studies van vers geïsoleerde menselijke DSM-cellen hebben belangrijke inzichten opgeleverd die de eigenschappen van verschillende ionenkanalen karakteriseren, waaronder kation-doorlaatbaar in de urineblaas en zullen doorgaan als een gouden standaard bij het verduidelijken van dsm cellulaire eigenschappen en regelgevende mechanismen.
Introduction
Detrusor gladde spier (DSM) cellen vormen de meest voorkomende celtype in de urineblaas en uiteindelijk controle urine opslag en voiding door ontspanning en contractie, respectievelijk. DSM-cellen vormen vloeiende spierbundels die verstrengelen met aangrenzend bindweefsel, zenuwprocessen, interstitiële cellen en andere celtypen1. Het huidige begrip van de rol van DSM-cellen in de urineblaasfunctie is bereikt door middel van een geïntegreerde aanpak op meerdere niveaus. Elke experimentele methode - of het nu gaat om geïsoleerde enkelvoudige cellen in vitro, weefselstrips met gladde spierbundels in vitro/ex vivo, of in vivo bepalingen (zoals cytometrie en voiding function assessments) - biedt belangrijke en specifieke inzichten in fysiologische en farmacologische eigenschappen van DSM (zie beoordelingen1,2,3,4,5,6 voor details). De interpretatie van de resultaten die zijn verkregen uit geïsoleerde enkele cellen maakt het echter mogelijk conclusies specifiek toe te schrijven aan het eencellige type zelf. Deze realisatie is de drijvende kracht geweest voor het vaststellen van een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het verkrijgen van vers geïsoleerde DSM-cellen uit de gehele dikte urineblaasmonsters. In tegenstelling tot veel andere celtypen kunnen gladde spiercellen niet betrouwbaar worden gekweekt als gevolg van het verlies van hun inheemse fenotype, inclusief specifieke veranderingen in hun elektrofysiologische en contractiele eigenschappen7,8. Dit feit versterkt verder het belang van studies uitgevoerd op fysiologisch actieve vers geïsoleerde DSM cellen.
Eind jaren tachtig en begin jaren negentig publiceerde isenbergs groep (Duitsland) een reeks elektrofysiologische studies naar vers geïsoleerde DSM-cellen verkregen uit proefkonijnenurineblazen9,10,11,12,13 ( tabel1). De methode benadrukte twee belangrijke waarnemingen die hielpen bij het verkrijgen van vitale cellen en diende als een eerste richtlijn voor anderen te volgen. Ze waren 1) voorbehandeling van geïsoleerde DSM-stukken met Ca2+-vrije oplossing/medium voorafgaand aan enzymatische behandeling en 2) weefselvertering met een oplossing die collageen ase bevat. Deze twee kritieke stappen zijn opgenomen in alle volgende varianten van DSM-celdissociatieprocedures(tabel 1). Momenteel, onze groep maakt gebruik van een twee-stap sequentiële papaïne-collageen dissociatie aanpak. DSM-stukken worden eerst behandeld met een enzymoplossing die papaïne bevat en vervolgens met collageentype II in dezelfde oplossing (DS, dissectie/spijsverteringsoplossing). Deze aanpak levert enkele DSM-cellen op van verschillende soorten, waaronder cavia, varken, rat, muis en vooral menselijk(tabel 1).
Enkele DSM-cellen vormen een bron voor meerdere moleculaire biologie en fysiologische experimenten. Tot nu toe bestudeerden eiwit- en mRNA-uitdrukkingen met immunocytochemie, of RT-PCR/qRT-PCR-bepalingen onthulden hoge detectieniveaus voor verschillende ionenkanalen, waaronder de grote geleidingsspanning- en Ca2+-geactiveerd (BK), kleine geleiding Ca2+-geactiveerde K+ type 3 (SK 3), voltage-gated K+ (Kv),L-type voltage-gated Ca2+ (Cav), en voorbijgaande receptor potentiële melastatine type 4 (TRPM4) kanalen, evenals een Na/Ca2+ wisselaar 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Ze zijn allemaal gedacht aan DSM excitability controle, intracellulaire Ca2 + niveaus en contractility. Patch-clamp elektrofysiologische benaderingen, rechtstreeks uitgevoerd op cavia-, muis-, ratten- of menselijke DSM-cellen, gaven directe demonstratie van biofysische en farmacologische eigenschappen van L-type Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK en TRPM4 kanalen17,19,20,21,22,23,24, 25,25 ,26,27,28,29,30,31. De benaderingen omvatten een conventionele spanningsklem voor hele cellen, een geperforeerde spanningsklem en single-channel opnames (celbevestigd, binnenstebuiten- en buiten-outconfiguraties). Bovendien, membraan potentiële opname van DSM met behulp van een stroom-klem geleverd bewijs dat target-boeiende farmacologische middelen veranderen de cel prikkelbaarheid. Zo veroorzaakte de TRPM4-remmer 9-fenanthrol hyperpolarisatie in DSM-cellen verkregen van mensen, cavia en urineblazen van ratten19,20,22,31. Onder de verschillende elektrofysiologische methoden, de amphotericine-B (en nystatine, gramicicidive, en β-escin) geperforeerde patch-klem opnames bieden een belangrijk voordeel door het behoud van intrinsieke intracellulaire signalering moleculen en paden. Alleen lage moleculaire gewichtskationen en in mindere mate, Cl- - maar niet eiwitten of signaalmoleculen waaronder Ca2 + - zijn doorlaatbaar door de plasma membraan poriën gevormd door amphotericine-B of nystatine32. Het succesvolle resultaat van geperforeerde patch-clamp experimenten hangt af van verschillende algemene variabelen die uniek zijn voor deze techniek. Hier beschrijven we de details van de procedure met behulp van amphotericin-B die onze groep in de loop der jaren15,22,33,34,35,36,37,38,39heeft gebruikt .
Ongetwijfeld blijven niet-selectieve kationkanalen een van de minst begrepen kanaaltypen in DSM-cellen. Het eerste verslag van een niet-selectief kation-achtig kanaal dateert uit 1993. Het papier van Wellner en Isenberg11 beschreef een 33 pS stretch-geactiveerd enkelkanaal met de volgende rangvolgorde van ionendoorlaatbaarheid: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, en remming van kanaalactiviteit door Gd3+, een algemene remmer van niet-selectieve kationkanalen. Bijna tien jaar later beschreven Thorneloe en Nelson40 Na+ permeabele kationstromen in dsm-cellen van muizen, geremd door Gd3+,met behulp van whole-cell opnames. Aangezien moleculaire identiteiten van niet-selectieve kationkanalen en hun biofysische karakteriseringen nog moeten worden bepaald, zijn toekomstige onderzoeken op dit onderzoeksgebied gerechtvaardigd. Het hierbeschreven protocol voor de registratie van niet-selectieve kationkanaalstromen - met behulp van extracellulaire en pipet intracellulaire oplossingen die Cs+, TEA+en nifedipine(tabel 2) bevatten die de Kv- en Cav-stromen fysiologisch en farmacaal verzachten - is en zal nuttig blijven bij elektrofysiologische onderzoeken naar niet-selectieve katiekanalen. We hebben dit specifieke protocol gebruikt om de mate van remming van de hele cel kation stromen door de TRPM4 kanaal blokker 9-fenanthrol in cavia, rat en menselijke DSM cellen19,20,22.
Samen, de methode hier beschreven voor het verkrijgen van vers geïsoleerde enkele DSM cellen uit menselijke urineblaas biedt levensvatbare cellen zeer geschikt voor elektrofysiologische onderzoeken met behulp van verschillende configuraties van de patch-clamp techniek, Ca2 +-imaging, immunocytochemie, in situ proximale litigation test, en eencellige RT-PCR / qRT-PCR evenals geavanceerde moleculaire biologie technieken met inbegrip van microarray analyse, RNA-seq, en CHIP-seq. Het gebruik van de geperforeerde patchklemmethode met amphotericin-B behoudt de oorspronkelijke celomgeving in tegenstelling tot andere configuraties. Wanneer uitgevoerd met behulp van de specifieke voorwaarden die hier worden beschreven, ontworpen om bijdragen van K+ en Ca2+ stromen in DSM-cellen te ontkennen, tonen spanningsstap-geïnduceerde stromen de eigenschappen van niet-selectieve kationstromen die geschikt zijn voor biofysische en farmacologische karakteriseringen.
Protocol
Alle methoden die hier zijn beschreven zijn goedgekeurd door institutional Review Board Committees van de University of Tennessee Health Science Center (Memphis, TN, IRB # 17-05714-XP), en de Medische Universiteit van South Carolina (Charleston, SC, IRB # 00045232). De goedgekeurde procedures maken hele dikte urineblaasspecimens (>1 cm bij >1 cm) - met alle lagen inclusief slijmvlies, detrusor gladde spier, en serosa ook zijn bevestigd bloedvaten en vetweefsel) - worden verzameld van patiënten-donoren ondergaan chirurgische gedeeltelijke extractie van blaas. Patiënten-donoren zijn volwassen (leeftijdscategorie bestudeerd tot nu toe: 25 tot 87 jaar oud), hetzij mannelijke of vrouwelijke, met of zonder symptomen van overactieve blaas (zoals ingedeeld door american Urological Association I-PSS score41). Chirurgische ingrepen omvatten een verscheidenheid van medische aandoeningen, waaronder radicale cystectomie voor urotheliale carcinoma, en adenocarcinoma. In dergelijke gevallen is het verzamelde urineblaasmonster ver verwijderd van de plaats van tumor.
1. Dissectie van DSM-weefsels en bereiding van mucosa-vrije DSM-stukken
- Onderzoek het hele dikteurineblaasmonster dat vanuit de operatiekamer in het lab is aangekomen in een goed afgesloten container gevuld met de koude dissectie/spijsverteringsoplossing(figuur 1 en tabel 2 voor samenstelling van DS).
LET OP: Het monster wordt meestal bewaard in koude DS van een paar uur tot 's nachts voor aankomst in het laboratorium. Voor langere opslag wordt DS (tabel 2) aangevuld met 1 mM CaCl2. - Verwijder en spoel het menselijk DSM-exemplaar met de hele dikte (met alle lagen inclusief slijmvlies, DSM en serosa) met ijskoude DS om vast vuil en bloed uit te wassen.
- Pin de urineblaas specimen, slijmvlies naar boven en serosa naar beneden, op een siliconen enantiomer-gecoate (Tabel van materialen) 150 mm diameter ronde schotel gevuld met ijskoude DS ( Figuur1B).
- Verwijder het aangrenzende vetweefsel, bloedvaten, epitheel (urothelium) en spierslijmvlies uit het monster door scherpe dissectie met behulp van microschaar en tangen.
- Knip verschillende slijmvrije DSM-stukken uit (~ 2-3 mm lang en 4-6 mm breed) (figuur 1C).
2. Enzymatische dissociatie van DSM-stukken die vers geïsoleerde enkele DSM-cellen opleveren
- Plaats 3 tot 6 DSM-stukken in een buis met 1 tot 2 mL voorverwarmde (~37 °C) DS met papaïne en dithiothreitol (DS-P, tabel 2)en incubeer DSM-stukken in DS-P voor 30-45 min bij ~37 °C zachtjes schudden de buis af en toe (eenmaal per 10-15 min).
OPMERKING: Om de temperatuur voor enzymatische behandeling optimaal te regelen, worden buizen met weefselstukken en enzymoplossingen geplaatst in een glazen weefselkamer gevuld met water dat is aangesloten op een circulerend verwarmd waterbad(figuur 1D)of een hoognauwkeurig temperatuurgestuurd schudwaterbad(figuur 1E). - Verwijder DS-P uit de buis, was kort DSM-stukken met ijskoude DS, gooi koude DS uit de buis en laat DSM-stukken aan de onderkant van de buis zitten.
- Voeg 1 tot 2 mL DS-bevattende collageen type II (DS-C, tabel 2)toe aan de buis met DSM-stukken, meng zachtjes; en uitbroed en voor 25-40 min bij ~37 °C zachtjes schudden van de buis af en toe (elke 10-15 min).
- Gooi DS-C weg en was enzymbehandelde DSM-stukken 5-10 keer met ijskoude DS.
- Laat na de laatste wasbeurt de DS-oplossing in de buis achter; voorzichtig triturate met een vuurgepolijste Pasteur pipet meerdere malen om enkele DSM cellen vrij te geven.
- Plaats een paar druppels DS-oplossing met verspreide DSM-cellen op een glazen bodemkamer of een coverslip en controleer visueel op de kwaliteit onder een microscoop (met behulp van een 20x of 40x-doelstelling) na ten minste 5 minuten na de toepassing om de cellen in staat te stellen zich aan de de bodem.
- Gebruik onmiddellijk vers geïsoleerde DSM-cellen voor elektrofysiologische experimenten of bewaar de cellen in een buis met DS bij ~4 °C op ijs of in een koelkast tot gebruik (meestal voor maximaal 8 uur voorbereiding).
OPMERKING: Binnen hetzelfde preparaat varieert de kwaliteit van cellen van zeer levensvatbare tot oververteerde, dode DSM-cellen(figuur 2). Wanneer de sequentiële papain-collagenase methode een zeer hoog aantal niet-levensvatbare cellen oplevert, wordt het preparaat weggegooid en wordt een nieuwe vertering van DSM-stukken uitgevoerd, maar met verminderde incubatieintervallen. Als de procedure resulteert in te weinig DSM-cellen dan voor de daaropvolgende vertering van DSM-stukken, worden de incubatieintervallen verhoogd. Positieve immunoreactiviteit voor α-gladde spieractine bevestigt de identiteit van DSM-cellen (figuur 3).
3. Het registreren van spannings-stap geïnduceerde kation stromen van DSM cellen met behulp van amphotericine-B geperforeerde hele cel spanning patch-klem techniek
- Pipetteer 0,25-1 mL celvering op een glazen bodemkamer zittend op een podium van een omgekeerde microscoop en laat de cellen zich aan de glazen bodem hechten.
- Verwijder DS na incubatie gedurende ten minste 45 min uit het bad en vervang door de E-oplossing (tabel 2) door superfusie waarbij de oplossingstroom die door de zwaartekracht wordt geholpen via inlaatbuizen vertragen DS vervangt door de nieuwe oplossing, terwijl uitlaatbuizen die zijn aangesloten op een vacuümafvalvat de kameroplossing verwijdert en overloop voorkomt. Merk op dat E-oplossing tetraethylammonium (TEA+) en cesium (Cs+) ionen bevat om K+ stromen te remmen.
- Bereid een werkvoorraadoplossing voor van amphotericine-B in dimethylsulfoxide (DMSO) (1 mg per 10 μL DMSO). Om amphotericine poeder volledig op te lossen, sonicate (minstens 15 min) en vortex de oplossing goed.
OPMERKING: Deze stap duurt meestal minder dan 10 min. Het oplossen van 3-4 mg amphotericine-B in 30-40 μL DSMO in een 1,5 mL microcentrifuge buis werkt goed. Hogere hoeveelheden amphotericine-B vereisen meer DSMO-oplosmiddel meestal resulteert in een langer interval voor het mengen en onvolledige oplosbaarheid van de amphotericine-B vaste deeltjes aanwezig in de buis. - Los de voorraadoplossing van amphotericine-B op in de pipetoplossing (oplossing P, tabel 2) om een eindconcentratie van 200-500 μg/mL te verkrijgen. Deze stap vereist uitgebreide sonicatie en vortexing bij een hoge snelheid instelling (8-10/10) voor ~ 30 tot 60 min per stap om een optimale mix en preventie van amphotericine-B neerslag vorming in de pipet oplossing te garanderen.
OPMERKING: Amphotericin-B zal over-time neerslaan en lichtgevoelig is. De werkende pipetoplossing met Amphotericin-B wordt gecontroleerd op oplosbaarheid, met de hand gemengd voorafgaand aan pipetvulling en in het donker bewaard. - Trek meerdere patch elektroden, vuur-poolse elektrode tips, en (indien nodig) jas de uiteinden met tandwas.
- Vul de punt van een patch elektrode met de pipet oplossing (oplossing P, Tabel 2) zonder amphotericine-B door kort dompelen de elektrode in de oplossing.
- Vul de elektrode terug met dezelfde pipetoplossing met amphotericin-B.
- Monteer de elektrode op een houder aangesloten op een patch-clamp versterker kopwerk.
- Plaats met behulp van een micromanipulator de elektrode net onder het oppervlak van de extracellulaire oplossing, zodat de punt van de elektrode net onder water staat.
- Stel in de spanningsklemmodus het houdpotentieel in op 0 mV en pas de stroom aan op 0 pA met de pipetoffsetwijzerplaat op de commerciële versterker(Table of Materials).
- Bepaal de elektrodeweerstand met behulp van het membrane testvenster/-functie van de commerciële acquisitiesoftware (Tabel met materialen). Klik op Extra>Membraantest>Afspelen of een snelpictogram in de software. De vastgestelde elektrodeweerstand moet zich tussen 2 en 5 MΩ bevinden.
OPMERKING: Membraantestfunctie in de commerciële acquisitiesoftware of Seal Test-optie op de versterker kan worden gebruikt om de elektrodeweerstand te monitoren door spanningsstappen herhaaldelijk toe te passen. - Blijf elektrodeweerstand monitoren terwijl u de elektrode naar een gekozen DSM-cel doorzet met een micromanipulator(figuur 4A).
OPMERKING: Om als een levensvatbare DSM-cel te worden beschouwd, moet de cel spindelvormige langwerpige morfologie, een goed gedefinieerde halo rond de cel, scherpe randen en semi-contractiele (serpentine) verschijning vertonen. - Bij het aanraken van het celoppervlak met de elektrode - aangegeven door een snelle toename van de elektrodeweerstand gemeten met de Membraantestfunctie - vorm je een giga-afdichting door zachte snelle negatieve druk op de elektrodehouder via buizen toe te passen. Dit resulteert in negatieve druk die ontstaat aan de punt van de elektrode die het celmembraan in elektrode trekt en helpt bij de vorming van een giga-afdichting of een zeer nauw contact tussen de elektrode en het plasmamembraan (figuur 4B).
- Zodra de giga-seal zich vormt, compenseert u pipetcapaciteit door snelle en langzame wijzerplaten op de commerciële versterker aan te passen en de giga-afdichtingsstabiliteit (lekstroom) te monitoren met behulp van de Membrane Test-functie.
- Laat tijd, meestal 30-60 min, voor amphotericin-B te verspreiden vaststelling van de pipet en worden ingevoegd in het plasma membraan vormen poriën voornamelijk selectief monovalent kationen. Tijdens deze stap u de giga-afdichting met de Membraantestfunctie blijven monitoren. Naarmate de celperforatie toeneemt, neemt ook de amplitude van de capacitantietransiënten (vergelijk figuur 4B versus figuur 4C, waarbij respectievelijk geen en effectieve celperforatie wordt weergegeven) gemeten met de functie Membraantest.
- Wanneer de patchperforatie optimaal is (beoordeeld op stabiele serieweerstand meestal onder de 50 MΩ), annuleer t.a.v. de capaciteitvan voorbijgaande aard door de wijzerplaten aan te passen voor celcapaciteit en serieweerstand op de versterker. Series weerstand compensatie kan ook worden uitgevoerd op dit moment(figuur 4D).
- Zodra stabiele spanningsstep geïnduceerde kationstromen die door het gespecificeerde protocol worden opgeroepen, een samengestelde of fysiologische toestand toepassen om te testen door superfusie en de reacties op de controle-, testconditie en washout (indien mogelijk) met de commerciële acquisitiesoftware.
- Record stromen met een routine voltage-step protocol dat dsm-cellen op -64 of -74 mV houdt en de spanning in stappen van 10 mV voor 400 of 500 ms van -94 tot +96 of +106 mV moet opvoeren en terug te keren naar het houdpotentieel.
OPMERKING: De membraanpotentiële waarden worden aangepast voor een vloeibaar verbindingspotentieel van 14 mV (met behulp van P- en E-oplossingen, tabel 2). Het vloeistofverbindingspotentieel wordt verkregen in de commerciële acquisitiesoftware ( Table ofMaterials) door te klikken op (Tools>Junction Potentials) en de concentraties van oplossingsionencomponenten in te voeren. Een ramp protocol kan ook worden gebruikt om de huidige opnames te verkrijgen. - Voer het spanningsprotocol uit in continu ~1 min-interval tijdens een experiment met het opnemen van stromen voor pre-toevoegingscontrole, testconditie en washout.
- Record stromen met een routine voltage-step protocol dat dsm-cellen op -64 of -74 mV houdt en de spanning in stappen van 10 mV voor 400 of 500 ms van -94 tot +96 of +106 mV moet opvoeren en terug te keren naar het houdpotentieel.
4. Gegevensanalyse en visualisatie
- Open opgenomen bestanden in de commerciële data-analysesoftware(Tabel met materialen)voor de besturing, testconditie en washout door op Bestand>Gegevens te openen en bestanden van belang te selecteren voor het openen.
OPMERKING: Voor analyse worden meestal drie bestanden (elk met één set traces naar één protocolrun) voor elke voorwaarde geopend en geanalyseerd. De antwoorden worden vervolgens gemiddeld om een gemiddelde reactie voor elke voorwaarde te verkrijgen. De software die wordt gebruikt voor het verkrijgen van gegevens bevat een optie om automatisch door de gebruiker opgegeven meerdere testruns te verzamelen en deze te gemiddelde voor een enkel uitvoerbestand dat als alternatief kan worden gebruikt. - De gemiddelde respons over de laatste 200 ms verkrijgen voor het huidige spoor gemeten bij elke spanning; het gekozen duurinterval weerspiegelt een steady-state niveau van spanningsstap stroomactivering. Volg hiervoor de onderstaande stappen.
- Selecteer een bestand van belang voor analyse in de commerciële analysesoftware (Tabel met materialen).
OPMERKING: De software plaatst het meest recent geïmporteerde bestand in het actieve weergavevenster. Het open bestand toont een reeks overlappende sporen verkregen met een voltage-step protocol. In het actieve venster worden standaard vier cursors (x- en y-waarden voor de gemarkeerde tracering weergegeven). - Kies het bereik voor analyse door cursor 2 aan het einde van de spanningsstap van 400 of 500 ms en cursor 1 te positioneren met een interval van 200 ms daarvoor, zodat het analysebereik 200 ms bedraagt.
- Reacties voor elke spanning verkrijgen door te klikken op Analyseren>Snelle grafiek>IV (of het itemiaal-snelkoppelingspictogram) (in het promptvenster voordat gegevens worden verzameld, bevestigen dat voor y-axis (Current) signal Region opties "Cursors 1..2" en "Mean" zijn geselecteerd). Klik op OK om de I-V-grafiek te genereren en de gegevens in een kolomblad resultaten te plaatsen dat kan worden weergegeven door toegang te krijgen tot Windows>Resultaten.
- Analyseer extra bestanden door de stappen 4.2.1 - 4.2.3 te herhalen. Klik op Analyseren>Snelle grafiek>IV of de snelkoppeling iv-pictogram, selecteer Toevoegen in plaats van Vervangen om extra gegevens toe te voegen aan het deelvenster Resultaten bij het verwerken van de sporen.
- Kopieer gegevens naar een spreadsheet door de kolommen met interesse te selecteren en druk op Ctrl+C om te kopiëren en Ctrl+V om te plakken. Sla het werkblad Resultaten op in de indeling Commerciële analysesoftware(Tabel met materialen)in de indeling (*.rlt) door op Bestand>Opslaan alste klikken.
- Selecteer een bestand van belang voor analyse in de commerciële analysesoftware (Tabel met materialen).
- Normaliseer voor elke cel de antwoorden voor alle drie de omstandigheden op de waarde van de maximale spanningsstap voor de pre-addition controle (volgens de formule: Response/ResponseControl-Max)en grafiek de antwoorden als huidige (of huidige dichtheid) waarden versus spanningsverhoudingen(figuur 6).
- Bepaal in een werkbladprocessor de gemiddelde antwoorden als stromen (pA) of huidige dichtheden (pA/pF) voor controle, testconditie (in dit voorbeeld 9-fenanthrol) en washout bij elke spanningsstap.
- Verdeel waarden voor elke spanning van elke toestand (controle, 9-fenanthrol en washout) door de maximale controlerespons verkregen bij de hoogste spanning (+96 mV in figuur 6)voor de pre-toevoeging sturing volgens de formule: Genormaliseerde respons voor conditie(x) = Respons(x)/ ResponseControl-Max voor (x).
- Voor overzichtsanalyse u de gegevens in een indeling rangschikken die eenvoudig naar een grafisch programma (bijvoorbeeld GraphPad Prism) kan worden gekopieerd voor visualisatie.
Representative Results
Enzymatische dissociatie van DSM-stukken zorgt voor gezonde vers geïsoleerde DSM-cellen die routinematig worden gebruikt in functionele en moleculaire studies zoals: patch-clamp elektrofysiologie en immunocytochemie. Figuur 1 vat de dissectiestappen samen en visualiseert de opstellingen die worden gebruikt voor temperatuurregeling van enzymatische behandelingsstappen. Figuur 2 illustreert heldere veldbeelden van DSM-cellen verkregen uit drie menselijke urineblaasmonsters die elk afkomstig zijn van een andere patiënt-donor. Gezonde enkele DSM-cellen worden gekenmerkt door spindelvormige morfologie, scherpe goed gedefinieerde randen, een goed gedefinieerde halo rond de cel en semi-contractiele (serpentine-achtige) verschijning wanneer ze onder de microscoop worden bekeken (zie DSM-cellen gemarkeerd door witte pijlen in figuur 2). Ze reageren ook op contractie stimulerende middelen zoals de muscarinische agonist carbachol of hoge K+ (60 mM) toepassingen. DSM-cellen vertonen positieve immunoreactiviteit voor α-gladde spieractine die hun identiteit bevestigt (figuur 3).
DSM-cellen zijn bij uitstek geschikt voor fragment-klem elektrofysiologische onderzoeken van ionenkanaaleigenschappen. Hier beschrijven we de geperforeerde patchklemregistratiemethode met behulp van pipet- en extracellulaire oplossingen(tabel 2)om de geïnduceerde catiekanalen van voltage-step optimaal vast te leggen. Onder de gebruikte specifieke omstandigheden zorgde de blokkade van kv- en L-type Ca2+ stromen met respectievelijk Cs+/TEA+ en nifedipine ervoor dat de bijdrage van deze ionische componenten aan de hele celspanningsstromen werd uitgeschakeld. Figuur 4 en figuur 5 tonen respectievelijk de experimentele stappen van de geperforeerde patchklemmethode amphotericin-B en representatieve hele celstromen gemeten met een geïnduceerde spanningstrap of een opspringingsprotocol in drie verschillende menselijke DSM-cellen, elk van een andere donor van patiënten. Houd er rekening mee dat de opnames een zekere mate van variabiliteit vertonen in termen van huidige amplitudes en uitgaande rectificatie. Aanvullende experimenten toonden aan dat 9-fenanthrol, een TRPM4-kanaalremmer, effectief en reversibly geremdmenselijke DSM kation stromen bij negatieve en positieve spanningen (Figuur 6). De 9-fenanthrolgevoelige stroomcomponent illustreert een sterkere remming bij positieve spanningen en uitgaande rectificatie(figuur 6C).
Figuur 1: Samenvatting van dissectiestappen die resulteren in de voorbereiding van detrusor gladde spier (DSM) stukken en setup gebruikt voor enzymatische dissociatie. Getoond zijn beelden van: (A) een hele dikte menselijke urineblaas specimen voorzien van een open blaasoperatie als vreemd chirurgisch materiaal in ijskoude DS, (B) dezelfde voorbereiding na pinning met een gedeeltelijk ontleed DSM laag, (C) DSM stukken van variabele afmetingen uitgesneden uit de DSM laag klaar voor enzymatische spijsvertering (kleinere stukken) of andere experimentele onderzoeken (grotere stukken), (D, E) alternatieve opstellingen die worden gebruikt voor enzymatische spijsvertering van DSM stukken bestaande uit een van beide (1) een temperatuurgestuurd circulerend waterbad dat via buizen is verbonden met een grote glazen weefselkamer gevuld met water; een rubberen houder voor buizen, kunststof buizen die DSM-stukken en enzymoplossingen bevatten die zijn bereid in dissectie-/spijsverteringsoplossing (DS, DS-P of DS-C, tabel 2) en een temperatuursonde die is gekoppeld aan een display dat continue bewaking mogelijk maakt (D), of (2) een groot met water gevuld temperatuurgestuurd bad met een houder en buizen met DSM-stukken en enzymoplossingen (E ). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve heldere veldbeelden van menselijke vers geïsoleerde DSM-cellen verkregen met behulp van de sequentiële papain-collagenase vergistingsmethode. (A-F) Weergegeven zijn beelden van levensvatbare, fysiologisch actieve DSM-cellen die als geschikte kandidaten worden beschouwd voor het proberen van geperforeerde patchklemmen. (G, H) Afbeeldingen van niet-levensvatbare of oververteerde cellen; dergelijke cellen werden vermeden voor patch-klem experimenten. Witte en zwarte pijlen in panelen(A-H)wijzen naar DSM-cellen die als levensvatbaar en niet-levensvatbaar worden beschouwd, respectievelijk voor het proberen van patch-clamp-opnames. Merk op dat de zwarte pijlen in panelen (A, C en G) wijzen op celfragmenten (cirkelvormige stukken) of kleine cellen die dsm morfologie missen en in (H)de cellen bleek en verwijd lijken. Beelden zijn afkomstig van drie verschillende urineblaasmonsters(A en B : patiënt-donorbron één, C en D : patiënt-donorbron twee en E-H : patiënt-donorbron drie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Expressies van voorbijgaande receptor potentiële melastatine type 4 (TRPM4) kanaal en α-gladde spierspecifieke actine immunoreactivities in enkele menselijke DSM-cellen door immunocytochemie analyse. (A) Getoond zijn confocale beelden die immunocytochemische detectie van TRPM4 kanaal eiwitexpressie in een menselijke DSM-cel. Rode vlekken (linksonder) geeft TRPM4-kanaaleiwitten aan; blauwe (DAPI) kleuring detecteert celkernen (linksboven); groene kleuring geeft α-gladde spieractine (α-SMA, rechtsboven); de samengevoegde afbeelding (rechtsonder) illustreert de overlap van alle drie de afbeeldingen. (B) Confocale beelden ter illustratie van demping van immunocytochemische detectie van TRPM4-kanaaleiwitexpressie in aanwezigheid van een TRPM4-specifiek concurrerend peptide (CP) in geïsoleerde menselijke DSM-cellen. Blauwe (DAPI) kleuring duidt op celkernen (linksboven); groene kleuring is voor α-gladde spieractine (α-SMA, rechtsboven); de samengevoegde afbeelding (rechtsonder) illustreert de overlap van alle drie de afbeeldingen. De resultaten werden geverifieerd in vier afzonderlijke experimenten met DSM-heel weefsel of meerdere DSM-cellen geïsoleerd van vier patiënten. Beelden zijn van Hristov et al. (2016)22 en gebruikt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Schematische illustratie van stappen die betrokken zijn bij giga-zeehondenvorming en amphotericine-B perforatie van menselijke DSM-cellen. Geïllustreerd zijn ruimtelijke posities van een amphotericine-B met pipet en een DSM-cel, samen met bijbehorende reacties voor membraantests verkregen in de commerciële acquisitiesoftware(Tabel met materialen)door spanningsstappen (ofwel -10 of -20 mV in dit voorbeeld) te wijzigen die weerstand bepalen. Configuraties zijn: (A) voorafgaand aan de celbenadering met een elektrode, (B) na giga-seal formatie verkregen door het positioneren van de amphotericine-B bevattende pipet (amphotericine-B vertegenwoordigd door rode stippen) op het celoppervlak en het toepassen van negatieve druk, (C) de on-cell configuratie weergegeven ~ 45 min na giga-seal vorming, op dit moment-punt amphotericin-B diffuus langs de pipet en de moleculen hebben ingevoegd in het plasma membraan op het punt van de elektrodevorming doorlaatbare poriën, en (D) dezelfde configuratie als in (C),maar met capaciteit transiënten geannuleerd met behulp van wijzerplaten voor hele cel capaciteit en serie weerstand op de versterker. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Hele cel kationstromen geregistreerd met amphotericine-B geperforeerde patch-klem methode in menselijke DSM cellen. (A) Een diagram van het spannings-stepprotocol illustreert een houdpotentieel van -74 mV en spanningsstappen van 400 ms duur van -94 tot +96 mV uitgevoerd in stappen van 10 mV en vervolgens teruggegeven aan -74 mV. b,C) Representatieve huidige sporen, samen met de huidige dichtheid-spanning percelen van twee verschillende menselijke DSM-cellen, elk van een andere urineblaas specimen / patiënt-donor verkregen met de voltage-step protocol beschreven in (A). (D) Een voorbeeld van een huidig spoor verkregen met een hellingsprotocol (grafisch weergegeven in de bovenste set als spanningsverandering van -94 naar +116 mV over een duur van 1 s op 0,21 mV/ms, met een vermogen -94 mV). Aan de rechterkant in panelen(B-D)geven de grafieken de huidige dichtheidsspanningsverhouding voor elke DSM-cel weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: TRPM4-kanaalblokker 9-fenanthrol-gemedieerde remming van spanningsstep geïnduceerde kationstromen in menselijke DSM-cellen. (A) Getoond zijn representatieve stromingen gemeten met het in fig. 5A beschreven spanningsprotocol voor controle, 9-fenanthrol en washout. (B) Samenvatting van genormaliseerde reacties versus spanning voor controle, 9-fenanthrol, en washout in zeven DSM-cellen (van zeven verschillende patiënt-donoren). (C) Verschil stroom voor 9-fenanthrol-gevoelige component verkregen door het aftrekken van de waarden in aanwezigheid van 9-fenanthrol (30 μM) van die van de controle in (B). Gegevens in (B) enCworden weergegeven als middel met foutbalken voor SEM, * toont betekenis (p<0,05, gekoppelde Student's test) voor de vergelijking van de controle vs 9-fenanthrol bij elke spanning. Panelen (A) en (B) zijn gereproduceerd van Hristov et al. (2016)22 en gebruikt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Soort(en) | Proceduredetails | Verwijzingen | |
| Cavia | DSM-stukken gespoeld met Ca2+-vrij medium (in mM: 100 NaCl, 10 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 MgCl2, 20 glucose, 50 taurine, gemeten pCa=6 (of 1 mM) en vervolgens in stukken gesneden en meestal 90-120 min (4 perioden van 30 min) behandeld met enzymmedium (in mM: 130 KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, 20 taurine, 5 pyruvaat, 5 creatine, 10 mM HEPES, aangepast met methansulfoonzuur tot pH 7.4, 1 mg/ml collagenase, 0,2 mg/ml pronase E, 1 mg/ml vetzuurvrij albumine, pCa=4.2 (63 mM) of 3.7 (200 mM). Enkele DSM-cellen werden opgeslagen in Kraft-Bruhe (KB)-medium (in mM: 85 KCl, 30 K2PO4, 5 MgSO4, 5 Na2ATP, 5 K-pyruvaat, 5 creatine, 20 taurine, 5 bèta-OH-butyrate, 1 mg/ml vetzuurvrij albumine, aangepast met KOH tot pH 7.2). Alternatieve methode: DSM-stukken gespoeld voor 10 min in een Ca2+-vrij medium (in mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glucose, 20 taurine, 5 HEPES, aangepast met NaOH tot pH 7.4). Dan DSM stukken, geïncubeerd in dezelfde Ca2 +-vrij medium aangevuld met 5 mg% collagenase, 2 mg% pronase en 100 μM CaCl2 voor 2x20 min roeren. |
Klockner & Isenberg (1985)13,34 Klockner & Isenberg (1986)35 Schneider et al. (1991)10 Bonev & Isenberg (1992)9 Weidelt & Isenberg (2000)36 Moore et al. (2004)14 | |
| Proefkonijn, Landras varken, en menselijk | DSM-stukken die vooraf zijn geïncubeerd voor 5 min in Ca2+-vrije Krebs-oplossing, vervolgens in stukken gesneden en enzymatisch verteerd in Ca2+-vrije Krebs-oplossing met 0,5-2 mg/ml collageentype I en 0,1-0,5 mg/ml pronase bij 36°C gedurende 20-30 min constant geroerd. In sommige gevallen werden verteerdstukken verder geagiteerd door een botte pipetten of door te spinnen tot het opleveren van cellen. Geïsoleerde cellen werden opgeslagen in gewijzigde Krebs-oplossing (beschreven in Klockner & Isenberg13)en werden normaal gesproken binnen 3 uur gebruikt. De samenstelling van de Krebs oplossing was (mM): 140 Na+, 6 K+, 2 Ca2+, 1,2 Mg2+, 152,4 Cl-, 10 glucose, 10 HEPES, pH 7.35-7.4 met Tris. Voor Ca2+-vrije oplossing werden Ca2+ en Mg2+ weggelaten uit de Krebs-oplossing. | Inoue & Brading (1990)37 Inoue & Brading (1991)38 Nakayama & Brading (1995)39,40 | |
| Menselijke | DSM-stukken geplaatst in ca2+-vrije HEPES Tyrode's oplossing (in mM: 105.4 NaCl, 20.0 of 22.3 NaHCO3, 3.6 KCl, 0.9 MgCl2, 0.4 NaH2PO4, 19.5 of 4.9 HEPES, 5.4 of 5.5 glucose, 4.5 of 5.5 Na-pyruvaat) en gesneden in DSM stukken. DSM-stukken gedrenkt in een enzymoplossing (Ca2+ vrije HEPES-oplossing met 0,7 mg/ml collageentype I, 0,7 mg/ml papaïne, 1 mg/ml albumine) 's nachts bij 4°C. De reepjes werden vervolgens verwarmd op 36,5°C gedurende 15 tot 30 min, gewassen en voorzichtig triturated in verse oplossing. Geïsoleerde cellen die werden opgeslagen in Ca2+ met de oplossing van HEPES Tyrode of onmiddellijk worden gebruikt voor experimenten. | Montgomery & Fry (1992)24 Gallegos en Fry (1994)41 Fry et al. (1994)42 Sui et al. (2001)43 Wu et al. (2002)44 | |
| Cavia | DSM in stukken gesneden in PSS (in mM: 137 NaCl, 5,4 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 0,42 KH2P04, 4.17 NaHCO3, 10 glucose, 10 HEPES, pH 7.4 met NaOH). DSM-stukken geplaatst voor 10 min in de volgende verteringsoplossing (in mM: 80 Na-glutamaat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glucose, 2 MgCl2en 0,2 CaCl2) en vervolgens overgebracht naar een flacon met dezelfde oplossing, maar met 1 mg/ml collagenase 2, 1 mg/ml trypsineremmer (soms weggelaten), 1 mg/ml vetvrije runderalbumine, voor ~ 70 min bij 35°C of ~60 min bij 37°C. Enkele DSM-cellen werden verkregen door trituratie via een Pasteur pipet in dezelfde oplossing zonder calcium en enzymen. Na trituratie werd Ca2+ (1 mM) toegevoegd en werden de cellen opgeslagen bij 4°C. De cellen werden altijd op dezelfde dag gebruikt. | Bonev & Nelson (1993)53,54 Heppner et al. (1997)26 Petkov et al. (2001)47 Shieh et al. (2001, 2007)48,49 | |
| Cavia, muis, rat en mens | Protocol maakt gebruik van een twee-staps enzymatische dissociatie behandeling na scherpe dissectie in Ca2 +-vrije spijsvertering oplossing (in mM: 80 Na-glutamaat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glucose, en 2 MgCl2). In de eerste plaats werden DSM-stukken behandeld voor 25-45 min bij 37°C met 1-2 mg/ml papaïne, 1 mg/ml dithioerythreitol en 1 mg/ml runderserumalbumine in dissociatieoplossing (in mM: 80 monoglutnatriumamaat; 55 NaCl, 6 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES en 10 glucose, aangepast aan pH 7.3 met NaOH) en vervolgens DSM-stukken overgebracht naar spijsverteringsoplossing met 1-5 mg/ml collagenase XI (Sigma) of collageentype 2, 1 mg/ml runderserum albumine, 0 of 1 mg/ml trypsineremmer en 100 μM Ca2+, voor 6-30 min. Na incubatie werd het verteerdweefsel meerdere malen gewassen in de spijsverteringsoplossing zonder enzymen en Ca2+ en vervolgens voorzichtig triturated om enkele gladde spiercellen op te leveren. | Petkov et al. (2001)50 Thorneloe & Nelson (2003)51 Thorneloe & Nelson (2004)33 Petkov & Nelson (2005)27 Hristov et al. (2008)52 Layne et al. (2010)53 Hristov et al. (2011)15 Xin et al. (2012)54 Parajuli et al. (2012)25 Malysz et al. (2013)29 Parajuli et al. (2013)31 Lee et al. (2013)55 Malysz et al. (2014)23 Smith et al. (2013)19, 20 Hristov et al. (2016)22 Lee et al. (2017)56 Yarotskyy et al. (2018)57 | |
Tabel 1: Samenvatting van enzymatische benaderingen die worden gebruikt voor het isoleren van enkele DSM-cellen van urineblazen van verschillende soorten.
| Oplossingstype | Samenstelling (in mM) |
| DS (Dissectie/Spijsverteringsoplossing) | 80 Na-glutamaat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2en 11 glucose, pH aangepast aan 7,4 (met 10 M NaOH) |
| DS-P (Papain-bevattend DS) | DS met 1-2 mg/ml papaïne, 1 mg/ml dithiothreitol en 1 mg/ml runderserumalbumine |
| DS-C (Collagenase-bevattende DS) | DS-oplossing met 1-2 mg/ml collageentype II, 1 mg/ml runderserumalbumine, 0 of 1 mg/ml trypsineremmer en 100-200 μM Ca2+ |
| P (Pipette) | 110 CsOH, 110 aspartic acid, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA, and 30 CsCl,pH adjusted to 7.2 with CsOH, and supplemented with amphotericin-B (300-500 μg/ml) |
| E (Extracellular) | 10 tetraethylammoniumchloride (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES en 10 glucose, pH aangepast aan 7,3-7,4 met NaOH of CsOH, en 0,002-3 (2-3 mM) nifedipine |
Tabel 2: Samenstellingen van dissectie/spijsverteringsoplossing (DS) en pipet- en extracellulaire oplossingen die worden gebruikt in geperforeerde patchklemmen.
Discussion
De hier beschreven procedures verklaren de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van levensvatbare, vers geïsoleerde DSM-cellen uit menselijke urineblaasmonsters met hele dikte met behulp van enzymatische spijsvertering en bij de registratie van hele celkationstromen die gevoelig zijn voor de TRPM4-kanaalremmer 9-fenanthrol met behulp van de geperforeerde patchklembenadering van amphotericin-B. De enzymatische procedure is gebaseerd op een sequentiële blootstelling in twee stappen die hierin wordt aangeduid als de sequentiële papain-collagenase vergistingsmethode. DSM weefsels worden eerst behandeld met papaïne en dithiothreitol (een enzym stabiliserende agent) onder een nominale Ca2 +-vrije toestand, gevolgd in de tweede stap door collagenase type II in aanwezigheid van lage Ca2 +. De reden voor het uitvoeren van papaïne spijsvertering onder lage Ca2 + voorwaarden in gladde spiercellen dateert uit de late jaren 1980. Vers geïsoleerde halsslagader gladde spiercellen bereid met papaïne weergegeven een langwerpige vorm, toonde levensvatbaarheid (weerstand tegen Trypan Blue opname) en reageerde op contractiele stimuli (hogere Ca2 + en histamine)65. Jaren later werd deze methode toegepast bij de bereiding van DSM-cellen (zie tabel 1). De keuze van collageen type II in plaats van andere soorten heeft betrekking op de relatief hoge proteolytische activiteit bij uitstek geschikt voor gladde spierweefsels, waaronder DSM. De behandeling van collageen kan immers alleen maar enkele DSM-cellen opleveren, zij het dat uitgebreide enzymblootstelling (≥60 min)53,54vereist. Aangezien collageenactiviteit afhankelijk is van Ca2+ en het enzym inactief is onder de Ca2+-vrije omstandigheden, vereist een optimale enzymatische vertering van DSM-stukken de aanwezigheid van Ca2+ 66. In ons geval bevat DS-C 100-200 μM [Ca2+] (Tabel 2). Na enzymatische behandeling worden verteerde DSM-stukken een aantal keren voorzichtig gewassen met koude DS zonder enzymen of Ca2+ om een enzym gebonden aan weefsels te verwijderen. De ijskoude DS helpt de dsm-celintegriteit te behouden en enzymatische activiteit van een resterende papaïne of collageenase te beperken. In de laatste stap, trituratie van enzym-behandelde DSM stukken met een brand gepolijst Pasteur pipet releases enkele DSM cel. DSM-cellen worden onmiddellijk op een opnamekamer geplaatst voor patch-clamp studies of andere soorten experimenten of opgeslagen op ijs in DS voor gebruik later op dezelfde dag (meestal binnen 8 uur na de voorbereiding, maar de cellen blijven levensvatbaar voor maximaal 24 uur).
We hebben een aantal belangrijke overwegingen geïdentificeerd voor het succesvol verkrijgen van enkele DSM-cellen. De eerste heeft betrekking op de menselijke DSM specimen bron kwaliteit. Om de weefselintegriteit optimaal te bewaren, worden DSM-monsters die zijn verkregen uit open blaasoperaties zo snel mogelijk in ijskoude DS geplaatst en in een koude omgeving onderhouden. Met name bij chirurgische extractie van de patiënt wordt het blaasmonster onmiddellijk op een volledig voorbereide bijzettafel in de operatiekamer geplaatst. Bruto onderzoek van het hele monster (meestal verkregen tijdens radicale of eenvoudige cystectomie) en de opening volgen. Na visuele inspectie wordt een stuk van hele dikte urineladder specimen verwijderd uit een afgelegen gebied van het monster schromelijk niet betrokken bij tumor en onmiddellijk geplaatst in een beker (50 of 100 mL) met koude (~ 4 °C) Dissectie Solution (DS) (Tabel 2) en vervolgens stevig gesloten met een deksel. Vanwege de geplande aard van de oogst van het weefsel worden het personeel van de operatiekamer en het hulppersoneel dat de oogst uitvoert aan het begin van de chirurgische zaak gewaarschuwd om de materialen beschikbaar te hebben in de operatiekamer op het moment van weefselextractie. Deze voorzorgsmaatregelen samen met de routine, repetitieve aard van de verwerking stappen houden de warme ischemie tijd voor het weefsel - van extractie tot plaatsing in de gekoelde container met DS-oplossing - tot minder dan 5 min. De container wordt vervolgens in een koelkast of op ijs in een koeler geplaatst om de koude omgeving te behouden en (ijskoud) naar het laboratorium te vervoeren. Zodra het monster in het laboratorium aankomt, beginnen dissectie en enzymatische dissociatiestappen. Het is zeer moeilijk te voorspellen of een bepaald DSM-exemplaar DSM-cellen van hoge kwaliteit zal opleveren na enzymatische dissociatie, dus gaan we verder met de enzymatische dissociatiestappen. In veel gevallen voert onze groep, parallel aan elektrofysiologische experimenten, isometrische spanningsopnamen uit op DSM-strips die zijn opgesteld uit dezelfde DSM-exemplaren. We hebben ontdekt dat we meestal dsm-cellen van hoge kwaliteit kunnen verkrijgen uit preparaten die ook met succes levensvatbare strips leveren voor isometrische contractiestudies (onze ongepubliceerde observatie).
De tweede factor heeft betrekking op verschillende enzymlotvariabiliteiten. We merkten op dat voor zowel papaïne als collageen type II, telkens wanneer er een nieuw enzym van een leverancier aankomt, de enzymactiviteit in DS voor weefselvertering kan variëren. Wij optimaliseren daarom routinematig de enzymconcentratie en incubatieintervallen voor elke nieuwe partij. Om de bijdrage van de partijvariabiliteit te minimaliseren, bestellen we grotere hoeveelheden van dezelfde partij en maken we een grote partij voorraadoplossingen in 2 mL aliquots enzymen en slaan ze op ~-20 °C tot het gebruik. Na verloop van tijd kunnen bevroren voorraden (opgeslagen tot 2 weken) echter hun enzymatische activiteit verliezen. De derde variabele heeft betrekking op de temperatuur van enzymspijsverteringsbehandelingen. Enzymatische activiteiten van zowel papaïne als collageen ase tonen temperatuurafhankelijkheid. Papaïne en collageen type II vertonen activiteit in de temperatuurbereiken die de normale lichaamsfysiologieomvatten 67,68. Daarom streven we ernaar om de enzymbehandelingen stabiel te houden bij ~ 37 °C om hogere temperaturen te vermijden om de dsm-celintegriteit te behouden. De vierde overweging betreft de variabiliteit van de kwaliteit van DSM-cellen die aanwezig zijn in elk preparaat, variërend van zeer levensvatbaar (vertonen uitstekende klassieke gladde spierkenmerken) tot niet-gezonde, oververteerde cellen. Een langdurig enzym incubatieinterval is een van de belangrijkste redenen voor het verkrijgen van een hoog aantal beschadigde cellen. Overmatige enzymbehandelingen schaden ook de eiwitstructuren van ionenkanalen, receptoren en transporters, die hun functionaliteit negatief beïnvloeden. Interpretatie van de resultaten verkregen uit enzymatisch verkregen, vers geïsoleerde cellen moet rekening houden met deze overweging. Optimalisatie van enzymvertering voorwaarden is gericht op het verhogen van het percentage van zeer levensvatbare cellen. Experimentele benaderingen die afhankelijk zijn van een hoger aantal levensvatbare cellen, zoals microarray-analyses, vereisen robuustere optimalisaties dan die met succes worden uitgevoerd op minder cellen, zoals eencellige patch-clamp elektrofysiologie of Ca2+ beeldvorming. De aandacht voor de bovengenoemde factoren heeft onze onderzoeksinspanningen in de afgelopen tien jaar geleid bij het verkrijgen van hoogwaardige enkele DSM-cellen.
De geperforeerde patch-klem techniek is al meer dan een kwart eeuw een steunpilaar elektrofysiologische benadering. Verschillende publicaties geven details over de technische overwegingen69,70,71,72,73. Celperforatie kan worden verkregen met amphotericine-B, nystatine, gramicidine of β-escine (zie referentie32voor overzicht van elk). Het belangrijkste voordeel van geperforeerde patch-klem opnames over andere elektrofysiologische benaderingen is dat de inheemse intracellulaire omgeving - met inbegrip van intracellulaire Ca2+en signaalmoleculen (bijvoorbeeld cAMP, PKA, fosfaten en fosfodiesterases) - worden bewaard. Deze techniek is dus bij uitstek geschikt voor het onderzoeken van hele cel ionenkanaalstromen en hun regulerende mechanismen onder bijna fysiologische omstandigheden. Een belangrijk voorbehoud is dat intracellulaire celsamenstelling niet precies kan worden gecontroleerd in tegenstelling tot andere elektrofysiologische methoden zoals conventionele whole-cell en single-channel excised-patch (binnen- en buiten-out) opnames. In onze ervaring dragen drie factoren routinematig bij aan succesvolle experimentele resultaten van geamputeerde patch-clamp experimenten. De eerste is de kwaliteit van de DSM-cel die is gekozen om een opname te proberen. Wanneer DSM-cellen zeer levensvatbaar zijn met een semi-contractiele (serpentine-achtige), hoog contrast glanzende verschijning met een goed gedefinieerde halo rond het celoppervlak en hechten strak aan de glazen bodem van de opnamekamer dan giga-seal vorming en cel perforatie optreden relatief eenvoudig. De tweede en derde factoren voor succes hebben respectievelijk betrekking op de kwaliteit van de bron en de oplosbaarheid van amphotericine-B (in dimethylsulfoxide/DMSO en intracellulaire pipetoplossing). We constateerden verschillen tussen verschillende leveranciers in termen van bron- en lotvariabiliteit. Elke dag bereiden we een nieuwe oplossing van amphotericine-B voorraad oplossing uit poeder, gevolgd door de verdunning in intracellulaire pipet oplossing. Deze stappen vereisen uitgebreide sonicatie en vortexing. Met vers gemaakte amphotericine-B-bevattende pipetoplossing, succesvolle celperforatie (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced="">+Ca2+, en niet-selectieve kationstromen uit menselijke, cavia's, muizen- en/of ratten-DSM-cellen17,21,22,23,29,30,31,35,60. Hier beschrijven we voorwaarden voor het registreren van niet-selectieve kationstromen in menselijke DSM-cellen. 9-Phenanthrol, een blokker van TRPM4 kanalen, verzwakte spanning-stap geïnduceerde stromen ter ondersteuning van de rol van deze kanalen in de controle van DSM prikkelbaarheid. Als opmerking, het vereist meestal ten minste 45 min na het verkrijgen van een giga-afdichting en initiatie van perforatie om een optimale stabiele spanning-stap geïnduceerde niet-selectieve kation stromen record. Spanningshellingen kunnen ook worden gebruikt als alternatief voor voltage-step protocollen30,64. Hier, een voltage-step protocol van een hypergepolariseerde bedrijf membraan potentieel werd de voorkeur in plaats van een helling protocol, omdat de voormalige aanpak minimaliseert het effect van spanning-afhankelijke inactivering en zorgt voor het gemiddelde van opgeroepen stroom over een duur van een spanningsstap waarbij de helling een enkel gegevenspunt per spanning biedt. Dit laatste punt geldt vooral voor menselijke DSM-cellen, omdat de stromen variabele activiteit vertonen tijdens spanningsstappen (Figuur 5EnFiguur 6). De geperforeerde patchklemtechniek van amphotericin-B is essentieel geweest bij het identificeren van de eigenschappen van DSM-cellen en andere celtypen en zal blijven helpen bij het bieden van nieuwe ontdekkingen in de toekomst. Bovendien kunnen vers geïsoleerde enkele DSM-cellen met succes worden gebruikt voor het meten van+Cl-, en Ca2+stromen met de conventionele modus van de patch-clamp techniek, membraan potentiële opname met de huidige klem, en single channel opnames zoals geïllustreerd door onze eerdere rapporten23,29,35,64.
Naast single cell patch-clamp methoden, vers geïsoleerde DSM cellen kunnen worden bestudeerd met andere technische benaderingen, waaronder Ca2 + imaging, RT-PCR/q-RT-PCR, immunocytochemie, in situ nabijheid ligatie test, en genomische benaderingen (bijvoorbeeld microarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Aangezien single cell transcriptome bepalingsmethoden blijven evolueren en zeer gevoelig worden, zien we ons in een toekomstige mogelijkheid om routinematig en specifiek elektrische of farmacologische eigenschappen van individuele DSM-cellen te koppelen aan hun transcriptoom/proteomeprofielen. Dit zal worden bereikt door eerst opname uit een DSM-cel en vervolgens het extraheren van mRNA of eiwit, gevolgd door transcriptomische / proteomische analyses. Hoewel dergelijke methoden al in niet-DSM-cellen zijn getest, zijn ze momenteel technisch uitdagend, gebrek aan gevoeligheid om als routine te worden beschouwd en beperkt tot een succesvolle detectie van een paar geselecteerde genproducten74. Functie-moleculaire profielexpressie koppelen studies wanneer gedaan op DSM cellen verkregen uit urineblazen afgeleid van controle en zieke patiënt-donoren zal inzicht geven in fysiologische processen die essentieel zijn voor het besturen van normale DSM-functies, pathogenese, en bij het identificeren van effectieve nieuwe therapeutische benaderingen.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-R01DK106964 en P20DK123971 subsidies aan Georgi V. Petkov. De auteurs danken Dr Viktor Yarotskyy en Mevrouw Sarah Maxwell voor kritische evaluatie van het manuscript. We zijn ook dankbaar voor urologie staf chirurgen bij MUSC en UTHSC: Drs. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, en Anthony Patterson evenals de MUSC en UTHSC Urologie bewoners: Drs. Taylor Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata voor hun hulp bij menselijke weefselinzameling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
| 9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
| Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
| Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
| Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
| Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
| Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
| Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
| Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
| Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
| Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
| Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
| DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
| Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
| Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
| Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
| MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
| MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
| Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
| Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
| Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
| PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
| pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
| Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
| Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
| Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
| Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
| Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
| Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |
References
- Andersson, K. E., Arner, A. Urinary bladder contraction and relaxation: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 84 (3), 935-986 (2004).
- Brading, A. F., Brain, K. L. Ion channel modulators and urinary tract function. Urinary Tract. Andersson, K. E., Michel, M. C. 202, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. Part of Handbook of Experimental Pharmacology book series 375-393 (2011).
- Brading, A. F. Spontaneous activity of lower urinary tract smooth muscles: correlation between ion channels and tissue function. Journal of Physiology. 570, Pt 1 13-22 (2006).
- Brading, A. F., Heaton, J. P., Hashitani, H. A survey of commonalities relevant to function and dysfunction in pelvic and sexual organs. International Journal of Impotence Research. 20 (1), 1-16 (2008).
- Petkov, G. V. Role of potassium ion channels in detrusor smooth muscle function and dysfunction. Nature Reviews Urology. 9 (1), 30-40 (2012).
- Andersson, K. E. Treatment-resistant detrusor overactivity--underlying pharmacology and potential mechanisms. International Journal of Clinical Practice Supplement. 151, 8-16 (2006).
- Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 165 (2), 627-632 (2001).
- Kropp, B. P., et al. Characterization of cultured bladder smooth muscle cells: assessment of in vitro contractility. Journal of Urology. 162 (5), 1779-1784 (1999).
- Bonev, A., Isenberg, G. Arginine-vasopressin induces mode-2 gating in L-type Ca2+ channels (smooth muscle cells of the urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 420 (2), 219-222 (1992).
- Schneider, P., Hopp, H. H., Isenberg, G. Ca2+ influx through ATP-gated channels increments [Ca2+]i and inactivates ICa in myocytes from guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 440, 479-496 (1991).
- Wellner, M. C., Isenberg, G. Properties of stretch-activated channels in myocytes from the guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 466, 213-227 (1993).
- Wellner, M. C., Isenberg, G. Stretch-activated nonselective cation channels in urinary bladder myocytes: importance for pacemaker potentials and myogenic response. Experientia Supplementum. 66, 93-99 (1993).
- Klockner, U., Isenberg, G. Action potentials and net membrane currents of isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 405 (4), 329-339 (1985).
- Moore, E. D., et al. Organization of Ca2+ release units in excitable smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. Biophysical Journal. 87 (3), 1836-1847 (2004).
- Hristov, K. L., Chen, M., Kellett, W. F., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels regulate human detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (4), 903-912 (2011).
- Afeli, S. A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. SK but not IK channels regulate human detrusor smooth muscle spontaneous and nerve-evoked contractions. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (4), 559-568 (2012).
- Hristov, K. L., et al. Kv2.1 and electrically silent Kv channel subunits control excitability and contractility of guinea pig detrusor smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (2), 360 (2012).
- Afeli, S. A., Malysz, J., Petkov, G. V. Molecular expression and pharmacological evidence for a functional role of Kv7 channel subtypes in Guinea pig urinary bladder smooth muscle. PLoS One. 8 (9), 75875 (2013).
- Smith, A. C., et al. TRPM4 channel: a new player in urinary bladder smooth muscle function in rats. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 304 (7), 918-929 (2013).
- Smith, A. C., et al. Novel role for the transient potential receptor melastatin 4 channel in guinea pig detrusor smooth muscle physiology. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 304 (5), 467 (2013).
- Hristov, K. L., Smith, A. C., Parajuli, S. P., Malysz, J., Petkov, G. V. Large-conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel regulation by protein kinase C in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306 (5), 460-470 (2014).
- Hristov, K. L., et al. Novel regulatory mechanism in human urinary bladder: central role of transient receptor potential melastatin 4 channels in detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310 (7), 600-611 (2016).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306 (1), 45-58 (2014).
- Montgomery, B. S., Fry, C. H. The action potential and net membrane currents in isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 147 (1), 176-184 (1992).
- Parajuli, S. P., Soder, R. P., Hristov, K. L., Petkov, G. V. Pharmacological activation of small conductance calcium-activated potassium channels with naphtho[1,2-d]thiazol-2-ylamine decreases guinea pig detrusor smooth muscle excitability and contractility. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 340 (1), 114-123 (2012).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels regulate action potential repolarization in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (1), Pt 1 110-117 (1997).
- Petkov, G. V., Nelson, M. T. Differential regulation of Ca2+-activated K+ channels by beta-adrenoceptors in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288 (6), 1255-1263 (2005).
- Herrera, G. M., Etherton, B., Nausch, B., Nelson, M. T. Negative feedback regulation of nerve-mediated contractions by KCa channels in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 289 (2), 402-409 (2005).
- Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 465 (7), 965-975 (2013).
- Provence, A., Angoli, D., Petkov, G. V. Kv7 channel pharmacological activation by the novel activator ML213: role for heteromeric Kv7.4/Kv7.5 channels in guinea pig detrusor smooth muscle function. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 364 (1), 131-144 (2018).
- Parajuli, S. P., et al. Control of urinary bladder smooth muscle excitability by the TRPM4 channel modulator 9-phenanthrol. Channels (Austin). 7 (6), 537-540 (2013).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques: From Beginning to Advanced Protocols. Okada, Y. 4, Springer. Tokyo, Japan. 71-83 (2012).
- Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Regulation of transient receptor potential melastatin 4 channel by sarcoplasmic reticulum inositol trisphosphate receptors: Role in human detrusor smooth muscle function. Channels (Austin). 11 (5), 459-466 (2017).
- Hristov, K. L., et al. Suppression of human detrusor smooth muscle excitability and contractility via pharmacological activation of large conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (11), 1632-1641 (2012).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Petkov, G. V. Inhibition of phosphodiesterases relaxes detrusor smooth muscle via activation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (9), 1361-1370 (2012).
- Hristov, K. L., et al. Neurogenic detrusor overactivity is associated with decreased expression and function of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels. PLoS One. 8 (7), 68052 (2013).
- Hristov, K. L., Parajuli, S. P., Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Nongenomic modulation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels by estrogen: A novel regulatory mechanism in human detrusor smooth muscle. Physiological Reports. 5 (14), (2017).
- Parajuli, S. P., et al. Functional link between muscarinic receptors and large-conductance Ca2+ -activated K+ channels in freshly isolated human detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 467 (4), 665-675 (2015).
- Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 465 (7), 965-975 (2013).
- Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties of a tonically active, sodium-permeable current in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 286 (6), 1246-1257 (2004).
- Barry, M. J., et al. The American Urological Association symptom index for benign prostatic hyperplasia. The Measurement Committee of the American Urological Association. Journal of Urology. 148 (5), 1549-1557 (1992).
- Klockner, U., Isenberg, G. Calcium currents of cesium loaded isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea pig). Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 405 (4), 340-348 (1985).
- Klockner, U., Isenberg, G. Tiapamil reduces the calcium inward current of isolated smooth muscle cells. Dependence on holding potential and pulse frequency. European Journal of Pharmacology. 127 (3), 165-171 (1986).
- Weidelt, T., Isenberg, G. Augmentation of SR Ca2+ release by rapamycin and FK506 causes K+-channel activation and membrane hyperpolarization in bladder smooth muscle. British Journal of Pharmacology. 129 (7), 1293-1300 (2000).
- Inoue, R., Brading, A. F. The properties of the ATP-induced depolarization and current in single cells isolated from the guinea-pig urinary bladder. British Journal of Pharmacology. 100 (3), 619-625 (1990).
- Inoue, R., Brading, A. F. Human, pig and guinea-pig bladder smooth muscle cells generate similar inward currents in response to purinoceptor activation. British Journal of Pharmacology. 103 (4), 1840-1841 (1991).
- Nakayama, S., Brading, A. F. Possible contribution of long open state to noninactivating Ca2+ current in detrusor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 269 (1), Pt 1 48-54 (1995).
- Nakayama, S., Brading, A. F. Interaction of Ca2+ agonist and depolarization on Ca2+ channel current in guinea pig detrusor cells. Journal of General Physiology. 106 (6), 1211-1224 (1995).
- Gallegos, C. R., Fry, C. H. Alterations to the electrophysiology of isolated human detrusor smooth muscle cells in bladder disease. Journal of Urology. 151 (3), 754-758 (1994).
- JournalFry, C. H., Gallegos, C. R., Montgomery, B. S. The actions of extracellular H+ on the electrophysiological properties of isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Physiology. 480, Pt 1 71-80 (1994).
- Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU International Journal. 92 (4), 476 (2003).
- Wu, C., Sui, G., Fry, C. H. The role of the L-type Ca2+ channel in refilling functional intracellular Ca2+ stores in guinea-pig detrusor smooth muscle. Journal of Physiology. 538, Pt 2 357-369 (2002).
- Bonev, A. D., Nelson, M. T. Muscarinic inhibition of ATP-sensitive K+ channels by protein kinase C in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 265 (6), Pt 1 1723-1728 (1993).
- Bonev, A. D., Nelson, M. T. ATP-sensitive potassium channels in smooth muscle cells from guinea pig urinary bladder. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 264 (5), 1190-1200 (1993).
- Petkov, G. V., Heppner, T. J., Bonev, A. D., Herrera, G. M., Nelson, M. T. Low levels of KATP channel activation decrease excitability and contractility of urinary bladder. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 280 (5), 1427-1433 (2001).
- Shieh, C. C., et al. Functional implication of spare ATP-sensitive K+ channels in bladder smooth muscle cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 296 (3), 669-675 (2001).
- Shieh, C. C., et al. Characterization of a novel ATP-sensitive K+ channel opener, A-251179, on urinary bladder relaxation and cystometric parameters. British Journal of Pharmacology. 151 (4), 467-475 (2007).
- Petkov, G. V., et al. Beta1-subunit of the Ca2+-activated K+ channel regulates contractile activity of mouse urinary bladder smooth muscle. Journal of Physiology. 537, Pt 2 443-452 (2001).
- Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties and molecular basis of the mouse urinary bladder voltage-gated K+ current. Journal of Physiology. 549, Pt 1 65-74 (2003).
- Hristov, K. L., et al. Stimulation of beta3-adrenoceptors relaxes rat urinary bladder smooth muscle via activation of the large-conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (5), 1344-1353 (2008).
- Layne, J. J., Nausch, B., Olesen, S. P., Nelson, M. T. BK channel activation by NS11021 decreases excitability and contractility of urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 298 (2), 378-384 (2010).
- Lee, H., Koh, B. H., Peri, L. E., Sanders, K. M., Koh, S. D. Functional expression of SK channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Journal of Physiology. 591 (2), 503-513 (2013).
- Lee, H., et al. Premature contractions of the bladder are suppressed by interactions between TRPV4 and SK3 channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Scientific Reports. 7 (1), 12245 (2017).
- Yarotskyy, V., Malysz, J., Petkov, G. V. Properties of single channel and whole-cell Cl- currents in guinea pig detrusor smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 316 (5), 698-710 (2019).
- Driska, S. P., Porter, R. Isolation of smooth muscle cells from swine carotid artery by digestion with papain. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 251 (3), Pt 1 474-481 (1986).
- Seltzer, J. L., Welgus, H. G., Jeffrey, J. J., Eisen, A. Z. The function of Ca2+ in the action of mammalian collagenases. Archives of Biochemistry and Biophysics. 173 (1), 355-361 (1976).
- Skelton, G. S. Papaya proteinases. I. Temperature-and pH-stability curves. Enzymologia. 35 (5), 270-274 (1968).
- Petrova, D., Derekova, A., Vlahov, S. Purification and properties of individual collagenases from Streptomyces sp. strain 3B. Folia Microbiologica (Praha). 51 (2), 93-98 (2006).
- Sharpe, E. J., St Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), (2016).
- Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring arterial smooth muscle Kv7 potassium channel function using patch clamp electrophysiology and pressure myography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4263 (2012).
- Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor. Journal of Visualized Experiments. (101), e52652 (2015).
- Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. Journal of Neuroscience Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
- Knutson, K., et al. Whole cell electrophysiology of primary cultured murine enterochromaffin cells. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).
- Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. Journal of Visualized Experiments. (136), (2018).
