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Biology

9-फेनांथ्रोल-संवेदनशील Cation धाराओं के लक्षण वर्णन के लिए हौसले से अलग मानव Detrusor चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की तैयारी और उपयोग

doi: 10.3791/59884 Published: January 31, 2020

Summary

हम मानव मूत्राशय के नमूनों से एक ताजा अलग detrusor चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन एक दो कदम एंजाइमैटिक प्रक्रिया को रोजगार । प्राप्त व्यवहार्य डीएसएम कोशिकाओं का अध्ययन विभिन्न एकल सेल तकनीकों द्वारा किया जा सकता है जिसमें वर्णित एम्फोटेरिसिन-बी पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी शामिल है ताकि शारीरिक और औषधीय गुणों को प्रकट किया जा सके।

Abstract

मूत्राशय की दीवार के भीतर मौजूद डिट्रसर चिकनी मांसपेशी (डीएसएम) कोशिकाएं अंततः मूत्र भंडारण और शून्य की सुविधा प्रदान करती हैं। व्यवहार्य, ताजा और अलग-थलग पड़ी डीएसएम कोशिकाओं की तैयारी एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करती है जिसकी उपलब्धि बाद के कार्यात्मक और आणविक अध्ययनों के लिए इष्टतम कोशिकाएं प्रदान करती है। विधि विकसित और यहां सविस्तार, सफलतापूर्वक एक दशक से अधिक के लिए हमारे समूह द्वारा इस्तेमाल किया, मानव मूत्राशय खुले मूत्राशय सर्जरी से प्राप्त नमूनों के विच्छेदन का वर्णन करता है एक एंजाइमैटिक दो डीएसएम टुकड़े और यांत्रिक trituration के कदम उपचार के बाद हौसले से अलग DSM कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए । प्रारंभिक चरण में म्यूकोसा (यूरोथेलियम, लेमिना प्रोपेरिया, और मस्कुलिस म्यूकोसा) और आसन्न संयोजी, संवहनी और मौजूद ऊतकों से डीएसएम परत (जिसे मस्कुलिस प्रोपरिया के रूप में भी जाना जाता है) को अलग करने के लिए विच्छेदन शामिल है। इसके बाद डीएसएम को नाममात्र सीए2 +में टुकड़ों (2-3 मिमी x 4-6 मिमी) में काट दिया जाता है-जिसमें विच्छेदन/पाचन समाधान (डीएस) होता है । डीएसएम टुकड़े अगले स्थानांतरित कर रहे है और क्रमिक रूप से प्रति कदम 30-45 मिन के लिए ~37 डिग्री सेल्सियस पर papain और कोलेजेनेज युक्त डीएस के साथ अलग से इलाज किया जाता है । एंजाइम-मुक्त गोजातीय सीरम और आग पॉलिश पिपेट के साथ त्रितुएं के साथ डीएस युक्त धोता के बाद, टुकड़े एकल डीएसएम कोशिकाओं को छोड़ते हैं। हौसले से अलग डीएसएम कोशिकाएं आदर्श रूप से आयन चैनलों के पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और औषधीय लक्षणों के लिए अनुकूल हैं। विशेष रूप से, हम बताते हैं कि TRPM4 चैनल अवरोधक 9-phenanthrol वोल्टेज-कदम पैदा की गई cation धाराओं को कम कर देता है जो एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप दृष्टिकोण के साथ दर्ज की गई है। डीएसएम कोशिकाओं का अध्ययन अन्य तकनीकों जैसे एकल सेल आरटी-पीसीआर, माइक्रोऐरे विश्लेषण, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, सीटू निकटता लिगामेंट परख में और सीए2 + इमेजिंग द्वारा भी किया जा सकता है। एकल डीएसएम कोशिकाओं का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि किए गए अवलोकन सीधे एकल कोशिका विशेषताओं से संबंधित हैं। हौसले से अलग मानव डीएसएम कोशिकाओं के अध्ययनों ने मूत्राशय में सेशन-चाली योग्य सहित विभिन्न आयन चैनलों के गुणों की विशेषता वाली महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है और डीएसएम सेलुलर गुणों और नियामक तंत्र ों को स्पष्ट करने में सोने के मानक के रूप में जारी रहेगा।

Introduction

Detrusor चिकनी मांसपेशी (डीएसएम) कोशिकाएं मूत्राशय में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रकार का गठन करती हैं और अंततः मूत्र भंडारण को नियंत्रित करती हैं और क्रमशः विश्राम और संकुचन के माध्यम से शून्य होती हैं। डीएसएम कोशिकाएं चिकनी मांसपेशियों के बंडल बनाती हैं जो आसन्न संयोजी ऊतक, तंत्रिका प्रक्रियाओं, इंटरस्टिशियल कोशिकाओं और अन्य कोशिकाप्रकारों केसाथ आपस में जुड़े होते हैं। मूत्राशय समारोह में डीएसएम कोशिकाओं की भूमिका की वर्तमान समझ एक बहु-स्तरीय एकीकृत दृष्टिकोण के माध्यम से हासिल की गई है। प्रत्येक प्रयोगात्मक विधि - चाहे विट्रो में अलग-अलग एकल कोशिकाओं पर आधारित हो, विट्रो/पूर्व वीवो में चिकनी मांसपेशियों के बंडलों वाले ऊतक स्ट्रिप्स, या वीवो निर्धारण (जैसे साइटोमेट्री और शून्य समारोह आकलन) में - डीएसएम के शारीरिक और औषधीय गुणों में महत्वपूर्ण और विशिष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान करता है (कृपया विवरण के लिए समीक्षा1,2,3,4,5,6 देखें)। हालांकि, अलग-थलग एकल कोशिकाओं से प्राप्त परिणामों की व्याख्या निष्कर्षों को विशेष रूप से एकल कोशिका प्रकार के लिए जिम्मेदार ठहराने की अनुमति देती है। यह बोध पूरी मोटाई मूत्राशय के नमूनों से हौसले से अलग DSM कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रजनन विधि की स्थापना के लिए प्रेरक शक्ति रहा है । कई अन्य सेल प्रकारों के विपरीत, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और अनुबंधित गुणों7,8में विशिष्ट परिवर्तन सहित उनके देशी फेनोटाइप के नुकसान के कारण मज़बूती से सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। यह तथ्य शारीरिक रूप से सक्रिय हौसले से अलग डीएसएम कोशिकाओं पर किए गए अध्ययनों के महत्व को और पुष्ट करता है।

1 9 80 के उत्तरार्ध और 1 99 0 के दशक की शुरुआत में, इसेनबर्ग के समूह (जर्मनी) ने गिनी पिग मूत्राशय9,10,11,12,13 (टेबल 1)से प्राप्त ताजा अलग-थलग डीएसएम कोशिकाओं पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों की एक श्रृंखला प्रकाशित की। विधि दो महत्वपूर्ण टिप्पणियों कि महत्वपूर्ण कोशिकाओं को प्राप्त करने में सहायता प्राप्त है और दूसरों के लिए एक प्रारंभिक दिशानिर्देश के रूप में कार्य करने के लिए पालन पर प्रकाश डाला । वे 1 थे) पूर्व सीए के साथ अलग DSM टुकड़े का इलाज+मुक्त समाधान/मध्यम एंजाइमैटिक उपचार से पहले और 2) कोलेजेनेस युक्त समाधान के साथ ऊतक पाचन । इन दो महत्वपूर्ण चरणों को डीएसएम सेल विच्छेदन प्रक्रियाओं(तालिका 1)के बाद के सभी वेरिएंट में शामिल किया गया है । वर्तमान में, हमारा समूह दो कदम अनुक्रमिक पापिन-कोलेजेनेज़ विसोशन दृष्टिकोण को नियोजित करता है। डीएसएम टुकड़ों को पहले एक एंजाइम समाधान के साथ इलाज किया जाता है जिसमें पाकिन होता है और फिर कोलेजेनेज टाइप II के साथ एक ही समाधान (डीएस, विच्छेदन/पाचन समाधान) में घुलनशील होता है। यह दृष्टिकोण गिनी सुअर, सुअर, चूहा, माउस, और महत्वपूर्ण रूप से मानव(तालिका 1)सहित विभिन्न प्रजातियों से एकल डीएसएम कोशिकाओं की पैदावार करता है।

एकल डीएसएम कोशिकाएं कई आणविक जीव विज्ञान और शारीरिक प्रयोगों के लिए एक स्रोत प्रदान करती हैं। अब तक, प्रोटीन और एमआरएनए एक्सप्रेशन ्सइम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ अध्ययन किया, या आरटी-पीसीआर/क्यूआरटी-पीसीआर निर्धारण ों ने बड़े आचरण वोल्टेज और सीए2 +-सक्रिय (बीके), छोटे आचरण सीए2 +-सक्रिय कश्मीर+ टाइप 3 (SK3) सहित विभिन्न आयन चैनलों के लिए पता लगाने के उच्च स्तर का पता चला, वोल्टेज-gated कश्मीर+ (कश्मीरv),एल प्रकार वोल्टेज gated Ca2 + (Ca v),और क्षणिक रिसेप्टर संभावित मेलेस्टोनिन प्रकार 4 (TRPM4) चैनलों, साथ ही एक Na/Ca2 + एक्सचेंजर 14,15,16,17,18,19,20,21,22. वे सभी डीएसएम एक्सीबिलिटी, इंट्रासेलर सीए2 + स्तर और संकुचन को नियंत्रित करने के लिए सोचा जाता है। पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण, गिनी पिग, माउस, चूहा, या मानव डीएसएम कोशिकाओं पर सीधे प्रदर्शन किया, एल प्रकार सीएवी,कश्मीरवी (Kv2.x.K v7), एसके, बीके, और TRPM4चैनल17,19,20,21,22,23, 24,25 के जैव भौतिक और औषधीय गुणों का प्रत्यक्ष प्रदर्शन प्रदान किया 26,27,28,29,30,31. दृष्टिकोण में एक पारंपरिक पूरे सेल वोल्टेज-क्लैंप, एक छिद्रित वोल्टेज-क्लैंप, और एकल चैनल रिकॉर्डिंग (सेल संलग्न, अंदर-बाहर और बाहर-बाहर विन्यास) शामिल थे। इसके अतिरिक्त, वर्तमान-क्लैंप का उपयोग करके डीएसएम की झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग ने सबूत प्रदान किए कि लक्ष्य-आकर्षक औषधीय एजेंट सेल एक्सीबिलिटी को बदल देते हैं। उदाहरण के लिए, टीआरपीएम4 अवरोधक 9-फेनांथरोल ने मनुष्यों, गिनी पिग और चूहे मूत्राशय19,20,22,31से प्राप्त डीएसएम कोशिकाओं में हाइपरपोलराइजेशन को प्रेरित किया। विभिन्न इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीकों में, एम्फोटेरिसिन-बी (और नास्टेटिन, ग्रामिसिडिन, और ए-एस्सिन) छिद्रित पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग आंतरिक इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग अणुओं और रास्तों को संरक्षित करके एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। केवल कम आणविक वजन के सेशन और एक हद तक,सीएल-लेकिन प्रोटीन या सीए2 + सहित संकेत अणुओं नहीं-एम्फोटेरिसिन-बी या nystatin३२द्वारा गठित प्लाज्मा झिल्ली छिद्रों के माध्यम से पारगम्य हैं । छिद्रित पैच-क्लैंप प्रयोगों का सफल परिणाम इस तकनीक के लिए अद्वितीय कई सामान्य चरों पर निर्भर करता है। यहां, हम एम्फोटेरिसिन-बी का उपयोग करने वाली प्रक्रिया के विवरणों का वर्णन करते हैं कि हमारे समूह ने वर्ष15,22,33,34,35,36,37,38,39वर्षों में सफलतापूर्वक उपयोग किया है।

यकीनन, गैर चयनात्मक cation चैनल डीएसएम कोशिकाओं में सबसे कम समझ चैनल प्रकारों में से एक रहते हैं । गैर-चयनात्मक सेशन जैसे चैनल की पहली रिपोर्ट १९९३ की तारीखें हैं । The paper by Wellner and Isenberg11 described a 33 pS stretch-activated single channel displaying the following rank order of ion permeability: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, and inhibition of channel activity by Gd3+, a general inhibitor of non-selective cation channels. लगभग एक दशक बाद, थोर्नलो और नेल्सन40 ने पूरे सेल रिकॉर्डिंग का उपयोग करके, जीडी3 +द्वारा बाधित माउस डीएसएम कोशिकाओं में एनए+ चालू cation धाराओं का वर्णन किया। चूंकि गैर-चयनात्मक cation चैनलों और उनके जैव भौतिक लक्षणों की आणविक पहचान निर्धारित की जानी बाकी है, इसलिए इस शोध क्षेत्र में भविष्य की जांच की आवश्यकता है । गैर-चयनात्मक cation चैनल धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल - सीएस+,टी+और निफेडिपाइन(तालिका 2)वाले बाह्युलर और पिपेट इंट्रासेलर समाधानों का उपयोग करके, जो शारीरिक और औषधीय रूप से Kv और Cav धाराओं को कम करता है - गैर-चयनात्मक cation चैनलों की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच में उपयोगी रहा है और जारी रहेगा। हमने इस विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग गिनी पिग, चूहा और मानव डीएसएम कोशिकाओं19,20,22में TRPM4 चैनल अवरोधक 9-फेनांथरोल द्वारा पूरे सेल cation धाराओं के अवरोध की सीमा निर्धारित करने के लिए किया है।

एक साथ लिया, मानव मूत्राशय से हौसले से अलग एकल DSM कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए यहां वर्णित विधि पैच-क्लैंप तकनीक के विभिन्न विन्यासों का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए अत्यधिक उपयुक्त व्यवहार्य कोशिकाओं को प्रदान करती है, Ca2 +-इमेजिंग, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, सीटू समीपस्थ मुकदमेबाजी परख में, और एकल सेल आरटी-पीसीआर/क्यूआरटी-पीसीआर के साथ-साथ माइक्रोरेरे एनालिसिस, आरएनए-सीक्यू और चिप-सीक्यू सहित उन्नत आणविक जीव विज्ञान तकनीकें । एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप विधि का उपयोग अन्य विन्यासों के विपरीत देशी सेल वातावरण को बरकरार रखता है। यहां उल्लिखित विशिष्ट शर्तों का उपयोग करके किए जाने पर, डीएसएम कोशिकाओं में कश्मीर+ और सीए2 + धाराओं के योगदान को नकारने के लिए डिज़ाइन किया गया, वोल्टेज-स्टेप प्रेरित धाराएं बायोफिजिकल और औषधीय लक्षणों के लिए उपयुक्त गैर-चयनात्मक cation धाराओं के गुणों को प्रदर्शित करती हैं।

Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को टेनेसी स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र (मेम्फिस, टीएन, आईआरबी # 17-05714-एक्सपी) और मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ साउथ कैरोलिना (चार्ल्सटन, एससी, आईआरबी # 00045232) की संस्थागत समीक्षा बोर्ड समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया है। अनुमोदित प्रक्रियाएं पूरी मोटाई मूत्राशय के नमूनों (>1 सेमी बाय >1 सेमी) की अनुमति देती हैं - जिसमें म्यूकोसा, डिट्रूसर चिकनी मांसपेशी, और सेरोसा सहित सभी परतें रक्त वाहिकाओं और एडीपोज ऊतक ों को भी संलग्न करती हैं- मूत्राशय की शल्य चिकित्सा आंशिक निष्कर्षण से गुजरने वाले रोगियों-दानदाताओं से एकत्र की जाती हैं। रोगी दाताओं वयस्क है (आयु सीमा अब तक अध्ययन: 25 से ८७ साल पुराने), या तो पुरुष या महिला, के साथ या अति सक्रिय मूत्राशय के लक्षणों के बिना (के रूप में अमेरिकी यूरोलॉजिकल एसोसिएशन मैं पीएसएस स्कोर४१द्वारा वर्गीकृत) । सर्जिकल प्रक्रियाओं में यूरोथेलियाल कार्सिनोमा और एडेनोकार्सिनोमा के लिए कट्टरपंथी सिस्टेक्टॉमी सहित विभिन्न प्रकार की चिकित्सा स्थितियां शामिल हैं। ऐसे मामलों में, एकत्र मूत्राशय का नमूना ट्यूमर की साइट से दूरस्थ है।

1. डीएसएम ऊतकों का विच्छेदन और म्यूकोसा-मुक्त डीएसएम टुकड़ों की तैयारी

  1. पूरी मोटाई मूत्राशय नमूना है कि एक कसकर सील ठंड विच्छेदन से भरा कंटेनर में ऑपरेटिंग कमरे से प्रयोगशाला में पहुंचे की जांच/
    नोट: नमूना आमतौर पर प्रयोगशाला में आगमन से पहले रात भर के लिए कुछ घंटों से ठंडे डीएस में रखा जाता है । लंबे भंडारण के लिए, डीएस(तालिका 2)को 1 एमएम सीएसीएल2के साथ पूरक किया जाता है।
  2. संलग्न मलबे और रक्त को धोने के लिए बर्फ-ठंडे डीएस के साथ मानव पूरी मोटाई डीएसएम नमूना (म्यूकोसा, डीएसएम और सेरोसा सहित सभी परतों को शामिल करना) को हटा दें और कुल्ला करें।
  3. मूत्राशय के नमूने को पिन करें, ऊपर की ओर और सेरोसा नीचे का सामना करना पड़ रहा म्यूकोसा, एक सिलिकॉन एन्टिओमर-लेपित(सामग्री की तालिका)150 मिमी व्यास गोल पकवान बर्फ से भरा-ठंडा डीएस(चित्रा 1बी)पर।
  4. माइक्रोकैंची और संदंश का उपयोग करके तेज विच्छेदन द्वारा नमूने से आसन्न एडीपोस ऊतक, रक्त वाहिकाओं, एपिथेलियम (मूत्र) और मस्कुलिस म्यूकोसा को हटा दें।
  5. कई म्यूकोसा-मुक्त डीएसएम टुकड़े (~ 2-3 मिमी लंबा और 4-6 मिमी चौड़ा)(चित्रा 1सी)काट ें।

2. ताजा अलग एकल DSM कोशिकाओं उपज DSM टुकड़ों की एंजाइमैटिक विसोजन

  1. 3 से 6 डीएसएम टुकड़ों को एक ट्यूब में रखें जिसमें प्री-वार्मेड (~ 37 डिग्री सेल्सियस) डीएस युक्त पैपाइन और डिथियोथ्रेनॉल (डीएस-पी, टेबल 2)युक्त 1 से 2 मिलीहुई है और डीएस-पी में इनक्यूबेट डीएसएम टुकड़े 30-45 min के लिए ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर धीरे-कभी ट्यूब मिलाते हैं (हर 10-15 00 एक बार)।
    नोट: एंजाइमैटिक उपचार के लिए तापमान को बेहतर ढंग से नियंत्रित करने के लिए, ऊतक के टुकड़ों और एंजाइम समाधानों के साथ ट्यूबों को या तो एक घूमगर्म पानी के स्नान(चित्रा 1डी)या एक उच्च सटीक तापमान नियंत्रित मिलाते हुए पानी स्नान(चित्रा 1ई)से जुड़े पानी से भरे एक ग्लास ऊतक कक्ष में रखा जाता है।
  2. ट्यूब से डीएस-पी निकालें, संक्षेप में बर्फ ठंडे डीएस के साथ डीएसएम टुकड़े धोएं, ट्यूब के नीचे बैठे डीएसएम टुकड़ों को छोड़ने वाली ट्यूब से ठंडे डीएस को त्यागें।
  3. डीएस युक्त कोलेजेनेज टाइप II (डीएस-सी, टेबल 2)के 1 से 2 मिलील को डीएसएम टुकड़ों के साथ ट्यूब में जोड़ें, धीरे-धीरे मिलाएं; और ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर 25-40 टिन के लिए इनक्यूबेट धीरे कभी-कभी (हर 10-15 टन) ट्यूब को हिलाता है।
  4. डीएस-सी को डिस्कार्ड करें और एंजाइम का इलाज डीएसएम टुकड़ों को बर्फ-ठंडा डीएस के साथ 5-10 बार धोएं।
  5. अंतिम धोने के बाद, ट्यूब के अंदर डीएस समाधान छोड़ दें; एकल डीएसएम कोशिकाओं को छोड़ने के लिए कई बार आग पॉलिश किए गए पाश्चर पिपेट के साथ धीरे-धीरे त्रिकोणीय करें।
  6. एक गिलास नीचे कक्ष या एक कवरस्लिप पर फैलाया DSM कोशिकाओं युक्त डीएस समाधान की कुछ बूंदें रखें और नेत्रहीन एक माइक्रोस्कोप के तहत गुणवत्ता के लिए निरीक्षण (एक 20x या 40x उद्देश्य का उपयोग कर) आवेदन के बाद कम से कम 5 मिन के बाद कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए नीचे।
  7. तुरंत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए हौसले से अलग DSM कोशिकाओं का उपयोग करें या एक ट्यूब में कोशिकाओं को स्टोर ~ 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएस युक्त या तो बर्फ पर या एक रेफ्रिजरेटर में उपयोग तक (आम तौर पर तैयारी के 8 घंटे तक के लिए) ।
    नोट: एक ही तैयारी के भीतर कोशिकाओं की गुणवत्ता अत्यधिक व्यवहार्य से अधिक पचाने, मृत डीएसएम कोशिकाओं(चित्रा 2)के लिए बदलता है । जब अनुक्रमिक पापिन-कोलेजेनेज़ विधि अव्यवहार्य कोशिकाओं की बहुत अधिक संख्या पैदा करती है, तो तैयारी को छोड़ दिया जाता है, और डीएसएम टुकड़ों का एक नया पाचन किया जाता है लेकिन कम ऊष्मायन अंतराल के साथ। यदि प्रक्रिया के परिणामस्वरूप बहुत कम डीएसएम कोशिकाएं होती हैं, तो डीएसएम टुकड़ों के बाद के पाचन के लिए, ऊष्मायन अंतराल बढ़ जाते हैं। α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन के लिए सकारात्मक प्रतिरक्षा गतिविधि डीएसएम कोशिकाओं(चित्रा 3)की पहचान की पुष्टि करती है।

3. रिकॉर्डिंग वोल्टेज-कदम प्रेरित ेशन धाराओं से एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पूरे सेल वोल्टेज पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग कर

  1. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण पर बैठे ग्लास बॉटम चैंबर पर सेल निलंबन का 0.25-1 mL पिपेट करें और कोशिकाओं को ग्लास बॉटम का पालन करने की अनुमति दें।
  2. कम से कम 45 मिन के लिए ऊष्मायन के बाद, स्नान से डीएस को हटा दें और सुपरफ्यूजन द्वारा ई समाधान(तालिका 2)से प्रतिस्थापित करें जहां इनलेट ट्यूबिंग धीमा के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण द्वारा सहायता प्राप्त समाधान प्रवाह डीएस को नए समाधान के साथ बदल देता है जबकि वैक्यूम अपशिष्ट पोत से जुड़े आउटलेट ट्यूबिंग कक्ष समाधान को हटा देता है और ओवरफ्लो को रोकता है। ध्यान दें कि ई समाधान में K+ धाराओं को बाधित करने के लिए टेट्राथाइलमोनियम (टीई+)और सीज़ियम (सीएस+)आयन होते हैं।
  3. डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) (डीएमएसओ) (डीएमएसओ के 1 मिलीग्राम प्रति 10 माइक्रोन) में एम्फोटेरिसिन-बी का वर्किंग स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। एम्फोटेरिसिन पाउडर को पूरी तरह से भंग करने के लिए, सोनीकेट (कम से कम 15 00) और समाधान को अच्छी तरह से भंवर करें।
    नोट: यह कदम आमतौर पर 10 से कम 10 min लेता है। 1.5 मिलीग्राम माइक्रोसेन्ट्राइज ट्यूब में डीएसएमओ के 30-40 माइक्रोन में 3-4 मिलीग्राम एम्फोटेरिसिन-बी को भंग करना अच्छी तरह से काम करता है। एम्फोटेरिसिन-बी की अधिक मात्रा में अधिक DSMO विलायक की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप आमतौर पर ट्यूब में मौजूद एम्फोटेरिसिन-बी ठोस कणों के मिश्रण और अधूरे घुलनशीलता के लिए एक लंबा अंतराल होता है।
  4. 200-500 μg/mL की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पिपेट समाधान (समाधान पी, टेबल 2)में एम्फोटेरिसिन-बी के स्टॉक समाधान को भंग करें। इस कदम के लिए एक उच्च गति सेटिंग (8-10/10) के लिए ~30 से ६० मिन प्रति कदम के लिए व्यापक ध्वनि और भंवर की आवश्यकता है इष्टतम मिश्रण और पिपेट समाधान में एम्फोटेरिसिन-बी वर्षा गठन की रोकथाम सुनिश्चित करने के लिए ।
    नोट: एम्फोटेरिसिन-बी ओवर टाइम होगा और प्रकाश-संवेदनशील है। एम्फोटेरिन-बी युक्त कामकाजी पिपेट समाधान को पिपेट भरने से पहले घुलनशीलता, हाथ से मिश्रित के लिए जांच की जाती है, और अंधेरे में रखा जाता है।
  5. कई पैच इलेक्ट्रोड, फायर पॉलिश इलेक्ट्रोड युक्तियां खींचें, और (यदि आवश्यक हो) दंत मोम के साथ सुझावों को कोट करें।
  6. समाधान में इलेक्ट्रोड को संक्षेप में डुबोकर एम्फोटेरिन-बी के बिना पिपेट समाधान (समाधान पी, टेबल 2)के साथ पैच इलेक्ट्रोड की नोक भरें।
  7. एम्फोटेरिसिन-बी वाले एक ही पिपेट समाधान के साथ इलेक्ट्रोड को बैकफिल करें।
  8. इलेक्ट्रोड को पैच-क्लैंप एम्पलीफायर हेडस्टेज से जुड़े धारक पर माउंट करें।
  9. माइक्रोजोड़क का उपयोग करके, इलेक्ट्रोड को एक्सट्रासेलुलर समाधान की सतह के ठीक नीचे रखें ताकि इलेक्ट्रोड की नोक सिर्फ जलमग्न हो जाए।
  10. वोल्टेज-क्लैंप मोड में, होल्डिंग क्षमता को 0 एमवी में सेट करें और वाणिज्यिक एम्पलीफायर(सामग्री की तालिका)पर पिपेट ऑफसेट डायल के साथ वर्तमान को 0 पीए में समायोजित करें।
  11. वाणिज्यिक अधिग्रहण सॉफ्टवेयर(सामग्रीकी तालिका) के झिल्ली परीक्षण खिड़की/समारोह का उपयोग करके इलेक्ट्रोड प्रतिरोध निर्धारित करें। क्लिक टूल्स एंड झिल्ली टेस्ट एंड जीटी प्ले या सॉफ्टवेयर में शॉर्टकट आइकन को सक्रिय करने के लिए। निर्धारित इलेक्ट्रोड प्रतिरोध 2 से 5 MΩ की सीमा में होना चाहिए।
    नोट: एम्पलीफायर पर वाणिज्यिक अधिग्रहण सॉफ्टवेयर या सील टेस्ट विकल्प में प्रदान की गई झिल्ली परीक्षण समारोह का उपयोग वोल्टेज चरणों को दोहराकर लागू करके इलेक्ट्रोड प्रतिरोध की निगरानी के लिए किया जा सकता है।
  12. माइक्रोजोड़क(चित्रा 4ए)के साथ एक चुने हुए डीएसएम सेल की ओर इलेक्ट्रोड को आगे बढ़ाते हुए इलेक्ट्रोड प्रतिरोध की निगरानी जारी रखें।
    नोट: एक व्यवहार्य डीएसएम सेल माना जाता है, सेल को धुरी के आकार का विस्तारित आकृति विज्ञान, सेल के चारों ओर एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रभामंडल, कुरकुरा किनारों, और अर्ध-अनुबंध (टेढ़ा) उपस्थिति दिखाना चाहिए।
  13. इलेक्ट्रोड के साथ सेल की सतह को छूते समय - झिल्ली परीक्षण समारोह के साथ मापा इलेक्ट्रोड प्रतिरोध में तेजी से वृद्धि से संकेत मिलता है - ट्यूबिंग के माध्यम से इलेक्ट्रोड धारक के लिए कोमल तेजी से नकारात्मक दबाव लागू करके एक गीगा-सील बनाएं। इसके परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोड की नोक पर बनाया गया नकारात्मक दबाव होता है जो कोशिका झिल्ली को गीगा-सील के गठन में सहायता करने वाले इलेक्ट्रोड में खींचता है या इलेक्ट्रोड और प्लाज्मा झिल्ली(चित्रा 4बी)के बीच एक बहुत तंग संपर्क होता है।
  14. एक बार गीगा-सील रूपों के बाद, वाणिज्यिक एम्पलीफायर पर तेज और धीमी डायल को समायोजित करके पिपेट कैपेसिबिलिटी की भरपाई करें और झिल्ली परीक्षण समारोह का उपयोग करके गीगा-सील स्थिरता (रिसाव वर्तमान) की निगरानी करें।
  15. समय की अनुमति दें, आमतौर पर 30-60 मिन, एम्फोटेरिन-बी के लिए पिपेट को फैलाना और प्लाज्मा झिल्ली में डाला जा सकता है जो मुख्य रूप से मोनोवेलेंट cations के लिए चयनात्मक छिद्रों का निर्माण करता है। इस चरण के दौरान, झिल्ली परीक्षण समारोह के साथ गीगा-सील की निगरानी जारी रखें। के रूप में सेल छिद्र बढ़ जाती है तो क्षमता यात्रियों के आयाम करता है (चित्रा 4बी बनाम चित्रा 4सी की तुलना, क्रमशः कोई और प्रभावी सेल छिद्र प्रदर्शित) झिल्ली परीक्षण समारोह के साथ मापा ।
  16. जब पैच छिद्र इष्टतम होता है (आमतौर पर 50 MΩ से नीचे स्थिर श्रृंखला प्रतिरोध द्वारा आंका जाता है), तो एम्पलीफायर पर सेल क्षमता और श्रृंखला प्रतिरोध के लिए डायल को समायोजित करके क्षमता यात्रियों को रद्द करें। श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा भी इस समय किया जा सकता है(चित्रा 4डी)
  17. एक बार निर्दिष्ट प्रोटोकॉल द्वारा पैदा की गई स्थिर वोल्टेज-स्टेप प्रेरित cation धाराओं को देखा जाता है, सुपरफ्यूजन द्वारा परीक्षण करने के लिए एक यौगिक या शारीरिक स्थिति लागू करें और नियंत्रण के लिए प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें-, परीक्षण-स्थिति, और वॉशआउट (यदि संभव हो) के साथ वाणिज्यिक अधिग्रहण सॉफ्टवेयर।
    1. एक नियमित वोल्टेज-स्टेप प्रोटोकॉल के साथ रिकॉर्ड धाराएं जिसमें डीएसएम कोशिकाओं को -64 या -74 एमवी पर रखना और 400 या 500 एमएस के लिए 10 एमवी वेतन वृद्धि में वोल्टेज को बढ़ाना शामिल है - 94 से +96 या +106 एमवी और होल्डिंग क्षमता पर लौटना।
      नोट: झिल्ली संभावित मूल्यों को 14 एमवी (पी और ई समाधान, तालिका 2)की तरल जंक्शन क्षमता के लिए समायोजित किया जाता है। तरल जंक्शन क्षमता वाणिज्यिक अधिग्रहण सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)में क्लिक करके(टूल्स एंड जीटी;जंक्शन क्षमता)और समाधान आयन घटकों की सांद्रता में प्रवेश करके प्राप्त की जाती है। वर्तमान रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक रैंप प्रोटोकॉल का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. पूर्व-अतिरिक्त नियंत्रण, परीक्षण की स्थिति और वॉशआउट के लिए धाराओं रिकॉर्डिंग करने वाले प्रयोग के दौरान निरंतर ~ 1 मिन अंतराल में वोल्टेज-प्रोटोकॉल चलाएं।

4. डेटा विश्लेषण और दृश्य

  1. फ़ाइल एंड जीटी/ओपन डेटा पर क्लिक करके और खोलने के लिए ब्याज की फाइलों का चयन करके नियंत्रण, परीक्षण की स्थिति और वॉशआउट के लिए वाणिज्यिक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)में रिकॉर्ड की गई फाइलें खोलें।
    नोट: विश्लेषण के लिए आम तौर पर तीन फ़ाइलें (प्रत्येक एक प्रोटोकॉल रन के लिए निशान का एक सेट युक्त) प्रत्येक शर्त के लिए खोला और विश्लेषण कर रहे हैं । प्रतिक्रियाओं को बाद में प्रत्येक स्थिति के लिए एक मतलब प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए औसत कर रहे हैं । डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर में उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट कई परीक्षण रन स्वचालित रूप से एकत्र करने और उन्हें एकल आउटपुट फ़ाइल के लिए औसत करने का विकल्प होता है जिसका उपयोग विकल्प के रूप में किया जा सकता है।
  2. प्रत्येक वोल्टेज पर मापा वर्तमान ट्रेस के लिए पिछले २०० एमएस पर औसत प्रतिक्रिया प्राप्त; चुनी गई अवधि अंतराल वोल्टेज-स्टेप वर्तमान सक्रियण के स्थिर-राज्य स्तर को दर्शाता है। ऐसा करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. वाणिज्यिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर(सामग्रीकी तालिका) में विश्लेषण के लिए ब्याज की एक फ़ाइल का चयन करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर अपनी सक्रिय प्रदर्शन खिड़की में सबसे हाल ही में आयातित फ़ाइल की स्थिति । खुली फ़ाइल वोल्टेज-स्टेप प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त ओवरलैपिंग निशान की एक श्रृंखला प्रदर्शित करती है। डिफ़ॉल्ट रूप से, सक्रिय विंडो के भीतर चार कर्सर (हाइलाइट किए गए ट्रेस के लिए एक्स और वाई मूल्यों को प्रदर्शित करना) दिखाए जाते हैं।
    2. विश्लेषण के लिए सीमा चुनें 400 या 500 एमएस वोल्टेज चरण के अंत में कर्सर 2 स्थिति और कर्सर 1 200 एमएस के अंतराल पर इससे पहले कि विश्लेषण सीमा 200 एमएस है।
    3. विश्लेषण और gt;त्वरित ग्राफ और gt;IV (या चतुर्थ शॉर्टकट आइकन) (डेटा पैदा करने से पहले त्वरित खिड़की में क्लिक करके प्रत्येक वोल्टेज के लिए प्रतिक्रियाएं प्राप्त करें पुष्टि करें कि वाई-एक्सिस (वर्तमान) सिग्नल क्षेत्र विकल्पों के लिए"कर्सर्स 1..2"और'मतलब"चुना जाता है)। आई-वी ग्राफ जेनरेट करने और डेटा को परिणाम स्तंभ शीट में रखने के लिए ओके पर क्लिक करें जिसे विंडोज एंड जीटी/परिणामतक पहुंचकर देखा जा सकता है।
    4. चरण 4.2.1 - 4.2.3 दोहराकर अतिरिक्त फ़ाइलों का विश्लेषण करें। एनालाइजर एंड जीटी; क्विक ग्राफ एंड जीटीआई या आईवी आइकन शॉर्टकट पर क्लिक करें, निशान प्रोसेस करते समय परिणाम शीट में अतिरिक्त डेटा जोड़ने के लिए प्रतिस्थापित करने के बजाय एफिडेंड का चयन करें।
    5. ब्याज के कॉलम का चयन करके और सीटीआरएल + सी को कॉपी करने और सीटीआरएल +V को पेस्ट करने के लिए दबाकर स्प्रेडशीट पर डेटा कॉपी करें। फाइल एंड जीटी /सेवएएस पर क्लिक करके कमर्शियल एनालिसिस सॉफ्टवेयर(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)इन (*.rlt) फॉर्मेट में रिजल्ट्स वर्कशीट स्टोर करें ।
  3. प्रत्येक कोशिका के लिए, पूर्व-अतिरिक्त नियंत्रण के लिए अधिकतम वोल्टेज चरण के मूल्य के लिए सभी तीन शर्तों के लिए प्रतिक्रियाओं को सामान्य करें (सूत्र के अनुसार: प्रतिक्रिया/प्रतिक्रियानियंत्रण-मैक्स)और प्रतिक्रियाओं को वर्तमान (या वर्तमान घनत्व) मूल्यों बनाम वोल्टेज संबंधों(चित्रा 6)के रूप में ग्राफ करें।
    1. एक वर्कशीट प्रोसेसर में, नियंत्रण, परीक्षण की स्थिति (इस उदाहरण में, 9-फेनांथ्रोल) के लिए या तो धाराओं (पीए) या वर्तमान घनत्व (पीए/पीएफ) के रूप में औसत प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करें, और प्रत्येक वोल्टेज चरण पर धोना।
    2. प्रत्येक स्थिति के प्रत्येक वोल्टेज के लिए मूल्यों को विभाजित करें (नियंत्रण, 9-फेनांथरोल, और वॉशआउट) फॉर्मूले के बाद पूर्व-अतिरिक्त नियंत्रण के लिए उच्चतम वोल्टेज (+96 एमवी इन फिगर 6)पर प्राप्त अधिकतम नियंत्रण प्रतिक्रिया द्वारा: स्थिति के लिए सामान्यीकृत प्रतिक्रिया (x) = प्रतिक्रिया (x)/प्रतिक्रियानियंत्रण-मैक्स (x) के लिए।
  4. सारांश विश्लेषण के लिए, डेटा को एक प्रारूप में व्यवस्थित करें जिसे दृश्य के लिए ग्राफिकल प्रोग्राम (जैसे ग्राफपैड चश्मे) में आसानी से कॉपी किया जा सकता है।

Representative Results

डीएसएम टुकड़ों का एंजाइमैटिक विसोशन नियमित रूप से कार्यात्मक और आणविक अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली स्वस्थ हौसले से अलग-थलग डीएसएम कोशिकाओं को प्रदान करता है जैसे: पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। चित्रा 1 विच्छेदन चरणों का सारांश देता है और एंजाइमैटिक उपचार चरणों के तापमान नियंत्रण के लिए नियोजित सेटअप की कल्पना करता है। चित्रा 2 एक अलग रोगी दाता से प्रत्येक तीन मानव मूत्र मूत्राशय नमूनों से प्राप्त DSM कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को दिखाता है । स्वस्थ एकल डीएसएम कोशिकाओं को धुरी के आकार की आकृति विज्ञान, कुरकुरा अच्छी तरह से परिभाषित किनारों, कोशिका के चारों ओर एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रभामंडल, और अर्ध-अनुबंध (टेढ़ा की तरह) उपस्थिति की विशेषता है जब माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है (चित्रा 2में सफेद तीर द्वारा डीएसएम कोशिकाओं को चिह्नित देखें)। वे मस्करिनी एगोनिस्ट कार्बाचोल या उच्च कश्मीर+ (60 एमएम) अनुप्रयोगों जैसे संकुचन उत्तेजक एजेंटों का भी जवाब देते हैं। डीएसएम कोशिकाएं उनकी पहचान(चित्रा 3)की पुष्टि करते हुए α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन के लिए सकारात्मक प्रतिरक्षागतिविधि दिखाती हैं।

डीएसएम कोशिकाएं आयन चैनल गुणों की पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए आदर्श रूप से अनुकूल हैं। यहां, हम वोल्टेज-स्टेप प्रेरित कोटेशन चैनलों को बेहतर रिकॉर्ड करने के लिए पिपेट और एक्स्ट्रासेलुलर समाधान(टेबल 2)का उपयोग करके एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग विधि का वर्णन करते हैं। नियोजित विशिष्ट शर्तों के तहत, क्रमशः सीएस + /टी+और निफेडिपाइन के साथ केवी और एल-टाइप सीए2 + धाराओं की नाकाबंदी ने पूरे सेल वोल्टेज-पैदा की गई धाराओं में इन आयनिक घटकों के योगदान को समाप्त करना सुनिश्चित किया । चित्रा 4 और चित्रा 5 शो, क्रमशः, एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप विधि और प्रतिनिधि पूरे सेल धाराओं के प्रयोगात्मक कदम या तो एक वोल्टेज कदम प्रेरित या तीन अलग मानव DSM कोशिकाओं में एक रैंप प्रोटोकॉल के साथ मापा, एक अलग रोगी दाता से प्रत्येक । ध्यान दें कि रिकॉर्डिंग वर्तमान आयाम और जावक सुधार के मामले में परिवर्तनशीलता की एक निश्चित डिग्री प्रदर्शित करते हैं । अतिरिक्त प्रयोगों से पता चला है कि 9-फेनांथरोल, एक TRPM4 चैनल अवरोधक, प्रभावी ढंग से और रिवर्सिबल नकारात्मक और सकारात्मक वोल्टेज(चित्रा 6)पर मानव डीएसएम सेशन धाराओं को बाधित करता है। 9-फेनांथ्रोल-संवेदनशील वर्तमान घटक सकारात्मक वोल्टेज और जावक सुधार(चित्रा 6सी)पर एक मजबूत अवरोध दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: विच्छेदन चरणों का सारांश जिसके परिणामस्वरूप डिट्रसर चिकनी मांसपेशी (डीएसएम) टुकड़े और एंजाइमैटिक विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले सेटअप की तैयारी होती है। दिखाया गया है की छवियां हैं:(ए)एक पूरी मोटाई मानव मूत्राशय नमूना बर्फ में बाहरी शल्य चिकित्सा सामग्री के रूप में एक खुले मूत्राशय सर्जरी से प्रदान की ठंडी डीएस,(ख)एक आंशिक रूप से विच्छेदित DSM परत के साथ लगाए जाने के बाद एक ही तैयारी,(सी)परिवर्तनीय आयामों के डीएसएम टुकड़े एंजाइमैटिक पाचन (छोटे टुकड़े) या अन्य प्रयोगात्मक जांच (बड़े टुकड़े) के लिए तैयार डीएसएम परत से काट दिया,(डी, ई)वैकल्पिक सेटअप से मिलकर DSM टुकड़ों के एंजाइमैटिक पाचन के लिए इस्तेमाल किया या तो (1) एक तापमान नियंत्रित परिसंचारी पानी स्नान एक बड़े गिलास ऊतक पानी से भरा कक्ष के लिए टयूबिंग के माध्यम से जुड़े, ट्यूबों के लिए एक रबर धारक, डीएसएम टुकड़े और एंजाइम समाधान से युक्त प्लास्टिक ट्यूब विच्छेदन/पाचन समाधान (डीएस, या तो डीएस-पी या डीएस-सी, टेबल 2)और एक तापमान जांच एक प्रदर्शन से जुड़े सतत निगरानी(डी),या (2) एक बड़े पानी से भरे तापमान नियंत्रित स्नान के लिए अनुमति देता है जिसमें डीएसएम टुकड़े और एंजाइम समाधान के साथ धारक और ट्यूब होते हैं(ई ). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अनुक्रमिक पाप-कोलेजेनेस पाचन विधि का उपयोग करके प्राप्त मानव हौसले से अलग डीएसएम कोशिकाओं के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। (ए-एफ) प्रदर्शित व्यवहार्य, शारीरिक रूप से सक्रिय डीएसएम कोशिकाओं की छवियां हैं जो छिद्रित पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के प्रयास के लिए उपयुक्त उम्मीदवार माने जाते हैं। (जी, एच) गैर-व्यवहार्य या अधिक पचाने वाली कोशिकाओं की छवियां; पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए ऐसी कोशिकाओं को टाला गया था। पैनलों में सफेद और काले तीर(ए-एच)डीएसएम कोशिकाओं को इंगित करते हैं, जो पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के प्रयास के लिए क्रमशः व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य माने जाते हैं। ध्यान दें कि पैनलों(ए, सी और जी)में काले तीर कोशिका ओं (परिपत्र टुकड़े) या डीएसएम आकृति विज्ञान की कमी वाली छोटी कोशिकाओं और(एच)में कोशिकाओं को पीला और फैला हुआ दिखाई देते हैं। छवियां तीन अलग मूत्राशय नमूनों से कर रहे है(ए और बी: रोगी दाता स्रोत एक, सी और डी: रोगी दाता स्रोत दो, और ई-एच: रोगी दाता स्रोत तीन) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: क्षणिक रिसेप्टर संभावित मेलेस्ताटिन प्रकार 4 (TRPM4) चैनल की अभिव्यक्ति और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री विश्लेषण द्वारा एकल मानव डीएसएम कोशिकाओं में α-चिकनी मांसपेशी विशिष्ट ऐक्टिन इम्यूनोडोरगतिविधियों। (A)दिखाया गया है कि मानव डीएसएम सेल में TRPM4 चैनल प्रोटीन अभिव्यक्ति का इम्यूनोसाइटोकेमिकल डिटेक्शन दिखाते हुए कॉन्फोकल छवियां हैं । लाल धुंधला (नीचे बाएं) TRPM4 चैनल प्रोटीन इंगित करता है; नीला (DAPI) धुंधला सेल नाभिक (ऊपर बाएं) का पता लगाता है; हरे रंग की धुंधलाता α-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA, शीर्ष सही) इंगित करता है; विलय छवि (नीचे सही) तीनों छवियों के ओवरलैप दिखाता है। (ख)कॉन्फोकल छवियां अलग मानव डीएसएम कोशिकाओं में टीआरपीएम4-विशिष्ट प्रतिस्पर्धी पेप्टाइड (सीपी) की उपस्थिति में टीआरपीएम4 चैनल प्रोटीन अभिव्यक्ति के इम्यूनोसाइटोकेमिकल डिटेक्शन के क्षीणहोने को दर्शाती हैं । ब्लू (DAPI) धुंधला सेल नाभिक (ऊपर बाएं) इंगित करता है; हरे रंग का धुंधला α-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA, शीर्ष सही) के लिए है; विलय छवि (नीचे सही) तीनों छवियों के ओवरलैप दिखाता है। परिणाम चार अलग प्रयोगों में डीएसएम पूरे ऊतक या कई DSM चार रोगियों से अलग कोशिकाओं का उपयोग कर सत्यापित किया गया । छवियां Hristov एट अल से कर रहे हैं । (२०१६)22 और अनुमति के साथ इस्तेमाल किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: गीगा-सील गठन और मानव डीएसएम कोशिकाओं के एम्फोटेरिसिन-बी छिद्र में शामिल चरणों का योजनाबद्ध उदाहरण। सचित्र एक एम्फोटेरिन-बी युक्त पाइपेट और एक डीएसएम सेल के स्थानिक पदों पर हैं, जिसमें वाणिज्यिक अधिग्रहण सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)में प्राप्त झिल्ली परीक्षणों के लिए संबद्ध प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ वोल्टेज चरणों में फेरबदल करके (या तो -10 या -20 एमवी इस उदाहरण में) प्रतिरोध का निर्धारण करके। विन्यास हैं:(ए)एक इलेक्ट्रोड के साथ सेल दृष्टिकोण से पहले,(बी)गीगा-सील गठन के बाद एम्फोटेरिन-बी युक्त पिपेट (लाल डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व एम्फोटेरिसिन-बी) को कोशिका की सतह पर और नकारात्मक दबाव लागू करके प्राप्त किया गया था,(C)गीगा-सील गठन के बाद ~ 45 मिन दिखाए गए ऑन-सेल कॉन्फ़िगरेशन, इस समय-बिंदु एम्फोटेरिसिन-बी ने पिपेट को कम कर दिया है और इसके अणुओं ने इलेक्ट्रोड बनाने के सेशन की नोक पर प्लाज्मा झिल्ली में डाला है पारगम्य छिद्र, और(डी)में(सी)के रूप में एक ही विन्यास लेकिन क्षमता यात्रियों के साथ एम्पलीफायर पर पूरे सेल क्षमता और श्रृंखला प्रतिरोध के लिए डायल का उपयोग कर रद्द कर दिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मानव डीएसएम कोशिकाओं में एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप विधि के साथ दर्ज की गई संपूर्ण कोशिका cation धाराएं। (A)वोल्टेज-स्टेप प्रोटोकॉल का एक आरेख -74 एमवी की होल्डिंग क्षमता और 400 एमएस अवधि के वोल्टेज-चरणों को दिखाता है -94 से +96 एमवी तक 10 एमवी वेतन वृद्धि में किया गया और फिर -74 एमवी पर लौट आया। (B, C) प्रतिनिधि वर्तमान निशान दो अलग मानव DSM कोशिकाओं से वर्तमान घनत्व-वोल्टेज भूखंडों के साथ, एक अलग मूत्राशय के नमूने से प्रत्येक/ (घ)एक रैंप प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त एक वर्तमान ट्रेस का एक उदाहरण (रेखांकन शीर्ष इनसेट में 0.21 mV/ms पर 1 एस अवधि में -94 से +116 एमवी के रूप में दर्शाया गया है, जिसमें क्षमता -94 एमवी थी)। पैनलों(बी-डी)में दाईं ओर, रेखांकन दर्ज प्रत्येक डीएसएम सेल के लिए वर्तमान घनत्व-वोल्टेज संबंध प्रदर्शित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: TRPM4 चैनल अवरोधक 9-phenanthrol-मानव डीएसएम कोशिकाओं में वोल्टेज कदम प्रेरित cation धाराओं के मध्यस्थता अवरोध । (क)दिखाया गया है प्रतिनिधि नियंत्रण के लिए अंजीर 5A में वर्णित वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल के साथ मापा धाराओं, 9-phenanthrol, और धोने । (ख)नियंत्रण के लिए वोल्टेज बनाम सामान्यीकृत प्रतिक्रियाओं का सारांश, 9-फेनांथरोल, और सात डीएसएम कोशिकाओं (सात विभिन्न रोगी-दाताओं से) में वॉशआउट। (ग)9-फिनानथॉल-संवेदनशील घटक के लिए अंतर वर्तमान जो 9-फिनानथरोल (30 माइक्रोन) की उपस्थिति में मूल्यों को घटाकर प्राप्त करता है, जो(बी)में दिखाए गए नियंत्रण से 9-फेनन्थरोल (30 माइक्रोन) की उपस्थिति में है । डेटा में(बी)और(सी)SEM के लिए त्रुटि सलाखों के साथ साधन के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं, * प्रत्येक वोल्टेज पर 9-phenanthrol बनाम 9-phenanthrol बनाम नियंत्रण की तुलना के लिए महत्व (पीएंडएलटी; ०.०५, जोड़ा छात्र परीक्षण) को दर्शाया गया है । पैनल(ए)और(बी)को Hristov et al. (२०१६)22 से पुन: पेश किया गया है और अनुमति के साथ इस्तेमाल किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रजातियां प्रक्रिया विवरण संदर्भ
गिनी पिग डीएसएम टुकड़े सीए2 +के साथ कुल्ला -मुक्त माध्यम (एमएम में: 100 NaCl, 10 KCl, 1.2 KH2पीओ4,5 MgCl2,20 ग्लूकोज, 50 टॉरिन, मापा pCa = 6 (या 1 mM) और फिर टुकड़ों में कटौती और आम तौर पर 90-120 min (30 min के 4 अवधि) एंजाइम माध्यम के साथ (mM: 130, एचएच 20 टैरिन, 5 पायरुवेट, 5 क्रिएटिन, 10 एमएम हेप्स, मेथनसल्फोनिक एसिड के साथ पीएच 7.4, 1 मिलीग्राम/एमएल कोलेजेनेस, 0.2 मिलीग्राम/एमएल प्रेसेस ई, 1 मिलीग्राम/एमएल फैटी एसिड फ्री एल्बुमिन, पीसीए =4.2 (63 एमएम) या 3.7 (200 मीटर) में समायोजित किया गया। क्राफ्ट-ब्रुहे (केबी) में सिंगल डीएसएम कोशिकाओं को संग्रहित किया गया था- मध्यम (एमएम में: 85 केसीएल, 30 के2पीओ4,5 एमजीएसओ4,5 एनए2एटीपी, 5 के-पायरुवेट, 5 क्रिएटिन, 20 टैरिन, 5 बीटा-ओह-बुटिरेट, 1 मिली/एमएल फैटी एसिड फ्री एल्बुमिन, कोह के साथ पीएच 7.2 तक समायोजित किया गया था।
वैकल्पिक विधि: डीएसएम टुकड़े एक Ca2 +में 10 min के लिए कुल्ला + -मुक्त माध्यम (एमएम में): 140 NaCl, 5 KCl, 1.2 MgCl2,10 ग्लूकोज, 20 टॉरिन, 5 HEPES, NaOH के साथ समायोजित पीएच 7.4) । फिर डीएसएम टुकड़े, एक ही सीए2 +-मुक्त माध्यम में इनक्यूबेटेड 5 मिलीग्राम% कोलेजेनेज़, 2 मिलीग्राम% प्रेनेस और 100 माइक्रोएम सीएसीएल2 के साथ 2x20 मीटर सरगर्मी के लिए पूरक हैं।
क्लॉकनर एंड आइजनबर्ग (1 9 85)13,34 क्लॉकनर एंड आइजनबर्ग (1986)35 श्नाइडर एट अल(1991)10 बोनेव एंड इसेनबर्ग (1992)9 वीडेट एंड इसेनबर्ग (2000)36 मूर एट अल (2004)14
गिनी सुअर, लैंडरेस सुअर, और मानव डीएसएम टुकड़े पूर्व सीए2 में5 मिन के लिए इनक्यूबेटेड + मुक्त Krebs समाधान तोटुकड़ों में कटौती और en.5-2 मिलीग्राम/एमएल कोलेजेनेज़ प्रकार मैं और 0.1-0.5 मिलीग्राम/एमएल pronase प्रकार मैं और 0.1-0.5 मिलीग्राम/एमएल pronase युक्त समाधान में 0.5-2 मिलीग्राम/एमएल pronase 20-30 min के लिए लगातार उभारा । कुछ मामलों में, पचाने वाले टुकड़े आगे एक कुंद इत्तला दे दी पिपेट से या कोशिकाओं उपज तक कताई द्वारा उत्तेजित हो गए थे । अलग कोशिकाओं को संशोधित क्रेब्स समाधान (क्लॉकनर और इसेनबर्ग13में वर्णित) में संग्रहीत किया गया था और आम तौर पर 3 घंटे के भीतर उपयोग किया जाता था। क्रेब्स समाधान की संरचना (एमएम): 140 एनए+,6K+,2 Ca2+,1.2 मिलीग्राम2 +, 152.4 सीएल-,10 ग्लूकोज, 10 HEPES, पीएच 7.35-7.4 ट्रिस के साथ थी। सीए2 +- मुक्त समाधान के लिए, क्रेब्स समाधान से सीए2 + और एमजी2 + को छोड़ दिया गया था। इनौई एंड ब्रैडिंग (1990)37 इनौई एंड ब्रैडिंग (1991)38 नाकायामा एंड ब्रैडिंग (1995)39,40
मानव सीए2 +-फ्री हेप्स टाइरोड के समाधान में रखे गए डीएसएम टुकड़े (एमएम में: 105.4 एनसीएल, 20.0 या 22.3 नाहको3,3.6 केसीएल, 0.9 एमजीसीएल2,0.4 एएच2पीओ4,19.5 या 4.9 हेप्स, 5.4 या 5.5 ग्लूकोज, 4.5 या 5.5 ना-पायरुवेट) और डीएसएम टुकड़ों में कटौती करें। DSM टुकड़े एक एंजाइम समाधान में लथपथ (Ca2 + मुक्त HEPES समाधान ०.७ मिलीग्राम/एमएल कोलेजेनेज प्रकार मैं, ०.७ मिलीग्राम/मिलीलीटर papain, 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर एल्बुमिन) के साथ रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर । स्ट्रिप्स तो 15 से 30 min के लिए 36.5 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया, धोया और धीरे ताजा समाधान में triturated । इक्का-दुक्का कोशिकाएं जो सीए2 + में संग्रहीत की गई थीं जिनमें हेप्स टाइरोड का समाधान था या प्रयोगों के लिए तुरंत उपयोग किया जाता था। मोंटगोमरी एंड फ्राई (1992)24 गैलेगोस एंड फ्राई (1994)41 फ्राई एट अल. (1994)42 सुई एट अल. (2001)43 वू एट अल(2002)44
गिनी पिग पीएसएस में डीएसएम टुकड़ों में कटौती (एमएम में: 137 NaCl, 5.4 KCl, 2 MgCl2,2 CaCl2,0.42 KH2P04, 4.17 NaHCO3,10 ग्लूकोज, 10 HEPES, पीएच 7.4 NaOH के साथ)। निम्नलिखित पाचन समाधान में 10 मिन के लिए रखे गए डीएसएम टुकड़े (एमएम में: 80 ना-ग्लूटामेट, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 ग्लूकोज, 2 MgCl2,और 0.2 CaCl2)और फिर एक ही समाधान युक्त एक शीशी के लिए स्थानांतरित कर दिया, लेकिन 1 मिलीग्राम के साथ/ कैल्शियम और एंजाइमों के बिना एक ही समाधान में एक पाश्चर पिपेट के माध्यम से त्रितुरीकरण द्वारा एकल डीएसएम कोशिकाओं को प्राप्त किया गया था। ट्रिट्यूरेशन के बाद, सीए2 + (1 एमएम) जोड़ा गया और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। कोशिकाओं को हमेशा एक ही दिन इस्तेमाल किया जाता था। बोनेव एंड नेल्सन (1993)53, 54 हेप्पनर एट अल. (1997)26 पेटकोव एट अल. (2001)47 शिएह एट अल. (2001, 2007)48,49
गिनी सुअर, माउस, चूहा, और मानव प्रोटोकॉल सीए2 +-मुक्त पाचन समाधान (एमएम में: 80 एनए-ग्लूटामेट, 55 नैल, 6 केसीएल, 10 एचपीईएस, 11 ग्लूकोज और 2 एमजीसीएल2)में तेज विच्छेदन के बाद दो-चरण एंजाइमैटिक विच्छेदन उपचार का उपयोग करता है। सबसे पहले, डीएसएम टुकड़ों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 25-45 मिन के लिए 1-2 मिलीग्राम/एमएल पाकिन, 1 मिलीग्राम/एमएल डिथियोरिथ्रिटोल और 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन के साथ विसोशन समाधान में इलाज किया गया (एमएम में: 80 मोनोसोडियम ग्लूटामेट, 55 एनसीएल, 6 केसीएल, 2 एमजीसीएल2,10 एचईपी, और 10 ग्लूकोज, NaOH के साथ पीएच ७.३ को समायोजित) और फिर DSM टुकड़े पाचन समाधान के लिए स्थानांतरित 1-5 मिलीग्राम/ml कोलेजेनेस ग्यारहवीं (सिग्मा) या कोलेजेनेज प्रकार 2, 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर बोवाइन सीरम एल्बुमिन, 0 या 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर ट्राइप्सिन अवरोधक और 100 माइक्रोएम सीए2 +, 6-30 min के लिए । ऊष्मायन के बाद, पचाऊतक ऊतक एंजाइमों और सीए2 + के बिना पाचन समाधान में कई बार धोया गया था और फिर धीरे से एक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को उपज के लिए त्रिकोणीकृत किया गया था । पेटकोव एट अल (2001)50 थोर्नलो और नेल्सन (2003)51 थोर्नलो और नेल्सन (2004)33 पेटकोव एंड नेल्सन (2005)27 रिस्तोव एट अल (2008)52 लेइन एट अल (2010)53 Hristov एट अल। (२०११)15 Xin एट अल . (२०१२)५४ पैराजुली एट अल । (२०१२)25 Malysz एट अल अल . (२०१३)29 पैराजुली एट अल अल ( २०१३)31 ली एट अल . (२०१३)५५ Malysz एट अल (२०१४)२३ स्मिथ एट अल (२०१३)१९ 20 Hristov एट अल (२०१६)22 ली एट अल (२०१७)५६ Yarotskyy एट अल अल (२०१८)५७

तालिका 1: विभिन्न प्रजातियों के मूत्राशय से एकल डीएसएम कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमैटिक दृष्टिकोणों का सारांश।

समाधान प्रकार रचना (एमएम में)
डीएस (विच्छेदन/पाचन समाधान) 80 एनए-ग्लूटामेट, 55 एनसीएल, 6 केसीएल, 10 हेप्स, 2 एमजीसीएल2और 11 ग्लूकोज, पीएच को 7.4 (10 एम नाओएच के साथ) समायोजित किया गया
डीएस-पी (पापिन युक्त डीएस) 1-2 मिलीग्राम/मिलीलीटर पाकिन, 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर डिथियोथ्रेइटॉल और 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर गोजातीय सीरम एल्बुमिन युक्त डीएस
डीएस-सी (कोलेजेनेस युक्त डीएस) 1-2 मिलीग्राम/एमएल कोलेजेनेज टाइप II, 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन, 0 या 1 मिलीग्राम/एमएल ट्राइप्सिन अवरोधक और 100-200 माइक्रोएम सीए2 + युक्त डीएस समाधान
पी (पिपेट) 110 CsOH, 110 एस्पार्टिक एसिड, 10 NaCl, 1 MgCl2,10 HEPES, 0.05 EGTA, और 30 CsCl, पीएच CsOH के साथ 7.2 को समायोजित, और एम्फोटेरिसिन-बी (300-500 μg/ml) के साथ पूरक
ई (एक्स्ट्रासेलुलर) 10 टेट्राथाइलममोनियम क्लोराइड (टीई), 6 सीएससीएल, 124 एनसीएल, 1 एमजीसीएल2,2 सीएसीएल2,10 हेप्स, और 10 ग्लूकोज, पीएच को नाओएच या सीएसओएच के साथ 7.3-7.4 और 0.002-3 (2-3 एम) निफेडिपाइन के साथ समायोजित किया गया

तालिका 2: विच्छेदन/पाचन समाधान (डीएस) की रचनाएं, और छिद्रित पैच-क्लैंप प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले पिपेट और बाह्युलर समाधान।

Discussion

यहां वर्णित प्रक्रियाओं पूरी मोटाई मानव मूत्राशय के नमूनों से व्यवहार्य, हौसले से अलग DSM कोशिकाओं की तैयारी में शामिल कदम ों की व्याख्या एंजाइमैटिक पाचन का उपयोग कर और पूरे सेल cation TRPM4 चैनल अवरोधक 9-phenanthrol के प्रति संवेदनशील धाराओं की रिकॉर्डिंग में एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप दृष्टिकोण को रोजगार । एंजाइमैटिक प्रक्रिया एक दो कदम अनुक्रमिक जोखिम पर निर्भर करता है जो अनुक्रमिक पापाइन-कोलेजेनेज़ पाचन विधि के रूप में इसके लिए संदर्भित किया जाता है। डीएसएम ऊतकों को पहले नाममात्र सीए2 +-मुक्त स्थिति के तहत पाकिन और डिथियोथ्रेइटॉल (एक एंजाइम स्थिर एजेंट) के साथ इलाज किया जाता है, जिसके बाद कम सीए2 +की उपस्थिति में कोलेजेनेज टाइप II द्वारा दूसरे चरण में पीछा किया जाता है। चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में कम सीए2 + स्थितियों के तहत पापपाचन को बाहर ले जाने का तर्क 1 9 80 के दशक के उत्तरार्ध में है। पाकिन के साथ तैयार ताजा अलग-थलग कैरोटिड धमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं ने एक लम्बी आकार प्रदर्शित किया, व्यवहार्यता (ट्राइपैन ब्लू तेज करने के लिए प्रतिरोध) दिखाया और संकुचन उत्तेजनाओं (उच्च सीए2 + और हिस्टामाइन)65का जवाब दिया। वर्षों बाद, इस विधि को डीएसएम कोशिकाओं की तैयारी में लागू किया गया था (तालिका 1देखें)। अन्य प्रकारों के बजाय कोलेजेनेज प्रकार II का चुनाव इसकी अपेक्षाकृत उच्च प्रोटेलोलिटिक गतिविधि से संबंधित है जो डीएसएम सहित चिकनी मांसपेशियों के ऊतकों के लिए आदर्श रूप से अनुकूल है। दरअसल, अकेले कोलेजेनेस उपचार एकल डीएसएम कोशिकाओं को उपज सकता है, हालांकि व्यापक एंजाइम एक्सपोजर (60 मिन)53,54की आवश्यकता होती है। चूंकि कोलेजेनेज़ गतिविधि सीए2 + पर निर्भर करती है और एंजाइम सीए2 +-मुक्त स्थितियों के तहत निष्क्रिय है, इसलिए डीएसएम टुकड़ों के इष्टतम एंजाइमीय पाचन के लिए सीए 2+ 66की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। हमारे मामले में, डीएस-सी में 100-200 माइक्रोन [सीए2+](तालिका 2)शामिल हैं। एंजाइमों के उपचार के बाद, पचाने वाले डीएसएम टुकड़ों को ऊतकों से बंधे किसी भी एंजाइम को हटाने के लिए एंजाइमों या सीए2 + के बिना ठंडे डीएस के साथ कई बार धीरे-धीरे धोया जाता है। बर्फ ठंडा डीएस डीएसएम सेल अखंडता को संरक्षित करने और किसी भी शेष पाकिन या कोलेजेनेस की एंजाइमैटिक गतिविधि को सीमित करने में मदद करता है। अंतिम चरण में, एंजाइम का इलाज डीएसएम टुकड़ों का त्रिचरन एक आग पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ एकल डीएसएम सेल जारी करता है। डीएसएम कोशिकाओं को या तो तुरंत पैच-क्लैंप अध्ययन या अन्य प्रकार के प्रयोग के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष पर रखा जाता है या उसी दिन बाद में उपयोग के लिए डीएस में बर्फ पर संग्रहीत किया जाता है (आमतौर पर तैयारी के 8 बजे के भीतर, लेकिन कोशिकाएं 24 घंटे तक व्यवहार्य रहती हैं)।

हमने एकल डीएसएम कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए कई महत्वपूर्ण विचारों की पहचान की। पहला मानव डीएसएम नमूना स्रोत गुणवत्ता से संबंधित है। ऊतक अखंडता को बेहतर ढंग से संरक्षित करने के लिए, खुले मूत्राशय की सर्जरी से प्राप्त डीएसएम नमूनों को जितनी जल्दी हो सके बर्फ-ठंडे डीएस में रखा जाता है और ठंडे वातावरण में बनाए रखा जाता है। विशेष रूप से, रोगी से सर्जिकल निष्कर्षण पर, मूत्राशय का नमूना तुरंत ऑपरेटिंग रूम में पूरी तरह से तैयार साइड टेबल पर रखा जाता है। पूरे नमूने की सकल परीक्षा (आमतौर पर कट्टरपंथी या सरल सिस्टेक्टॉमी के दौरान प्राप्त) और इसके उद्घाटन का पालन करें। दृश्य निरीक्षण के बाद, पूरे मोटाई मूत्र सीढ़ी नमूने का एक टुकड़ा ट्यूमर के साथ अत्यधिक शामिल नमूने के एक दूरदराज के क्षेत्र से हटा दिया जाता है और तुरंत एक कप (या तो ५० या १०० मिलील) में रखा जाता है जिसमें ठंड (~4 डिग्री सेल्सियस) विच्छेदन समाधान (डीएस)(तालिका 2)होता है और फिर ढक्कन के साथ कसकर बंद हो जाता है। ऊतक की कटाई की नियोजित प्रकृति के कारण, ऑपरेटिंग रूम कर्मियों और सहायक कर्मचारियों को कटाई कर रहे हैं, जो ऊतक निष्कर्षण के समय ऑपरेटिंग रूम में सामग्री उपलब्ध कराने के लिए शल्य चिकित्सा मामले की शुरुआत में सतर्क हो जाते हैं। प्रसंस्करण चरणों की दिनचर्या, दोहराव प्रकृति के साथ ये सावधानियां ऊतक के लिए गर्म इस्केमिया समय रखते हैं - डीएस समाधान के साथ ठंडा कंटेनर में निष्कर्षण से प्लेसमेंट तक - 5 से कम मिन तक। इसके बाद कंटेनर को ठंडे वातावरण को बनाए रखने के लिए कूलर में फ्रिज में या बर्फ पर रखा जाता है और प्रयोगशाला में (बर्फ-ठंड) ले जाया जाता है। एक बार नमूना प्रयोगशाला में आता है, विच्छेदन और एंजाइमैटिक विच्छेदन कदम शुरू करते हैं । यह भविष्यवाणी करना बहुत मुश्किल है कि क्या दिए गए डीएसएम नमूने से एंजाइमैटिक वियोजन के बाद उच्च गुणवत्ता वाली डीएसएम कोशिकाएं निकलेंगी, इसलिए हम एंजाइमैटिक विच्छेदन चरणों के साथ आगे बढ़ें। कई मामलों में, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के समानांतर, हमारा समूह एक ही डीएसएम नमूनों से तैयार डीएसएम स्ट्रिप्स पर आइसोमेट्रिक तनाव रिकॉर्डिंग आयोजित करता है। हमने पाया है कि हम आमतौर पर तैयारी से उच्च गुणवत्ता वाले डीएसएम कोशिकाओं को प्राप्त कर सकते हैं जो आइसोमेट्रिक संकुचन अध्ययन (हमारे अप्रकाशित अवलोकन) के लिए व्यवहार्य स्ट्रिप्स भी प्रदान करते हैं।

दूसरा कारक विभिन्न एंजाइम लॉट वेरिएबिलिटी से संबंधित है। हमने देखा कि पाकिन और कोलेजेनेज़ टाइप II दोनों के लिए, हर बार एक आपूर्तिकर्ता से एक नया बहुत एंजाइम आता है, ऊतक पाचन के लिए डीएस में एंजाइम गतिविधि भिन्न हो सकती है। इसलिए, हम नियमित रूप से प्रत्येक नई बहुत कुछ के लिए एंजाइम एकाग्रता और ऊष्मायन अंतराल का अनुकूलन करते हैं। बहुत परिवर्तनशीलता योगदान को कम करने के लिए, हम एक ही बहुत बड़ी मात्रा में आदेश और एंजाइमों के 2 mL aliquots में स्टॉक समाधान का एक बड़ा बैच बनाने के लिए और उपयोग तक ~-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । समय के साथ, हालांकि, जमे हुए स्टॉक (2 सप्ताह तक संग्रहीत) अपनी एंजाइमैटिक गतिविधि खो सकते हैं। तीसरा चर एंजाइम पाचन उपचार के तापमान से संबंधित है। पाकिन और कोलेजेनेज़ दोनों की एंजाइमैटिक गतिविधियां तापमान-निर्भरता प्रदर्शित करते हैं। पाकिन और कोलेजेनेज़ प्रकार-2 सामान्य शरीर के शरीर के शरीर विज्ञान67,68को शामिल करते हुए तापमान पर्वतमाला में गतिविधि प्रदर्शित करते हैं । इसलिए, हमारा उद्देश्य डीएसएम सेल अखंडता को संरक्षित करने के लिए उच्च तापमान से बचने के लिए ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम उपचार स्थिर बनाए रखना है। चौथा विचार उच्च व्यवहार्य (उत्कृष्ट शास्त्रीय चिकनी मांसपेशियों की विशेषताओं का प्रदर्शन) से लेकर गैर-स्वस्थ, अधिक पचाने वाली कोशिकाओं तक प्रत्येक तैयारी के भीतर मौजूद डीएसएम कोशिकाओं की गुणवत्ता की परिवर्तनशीलता से संबंधित है। एक लंबे समय तक एंजाइम ऊष्मायन अंतराल क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की एक उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए मुख्य कारणों में से एक है । अत्यधिक एंजाइम उपचार आयन चैनलों, रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टरों की प्रोटीन संरचनाओं को भी ख़राब करते हैं, जिससे उनकी कार्यक्षमता पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है। एंजाइमैटिक रूप से प्राप्त परिणामों की व्याख्या, हौसले से अलग-थलग कोशिकाओं को इस विचार को ध्यान में रखना चाहिए। एंजाइम पाचन स्थितियों के अनुकूलन का उद्देश्य अत्यधिक व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत को बढ़ाना है। सूक्ष्म सरणी विश्लेषण जैसी व्यवहार्य कोशिकाओं की अधिक संख्या पर निर्भर प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों को एकल-कोशिका पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या सीए2 + इमेजिंग जैसी कम कोशिकाओं पर सफलतापूर्वक किए गए लोगों की तुलना में अधिक मजबूत अनुकूलन की आवश्यकता होती है। उपर्युक्त कारकों पर विचार उच्च गुणवत्ता वाले एकल डीएसएम कोशिकाओं को प्राप्त करने में पिछले दशक में हमारे अनुसंधान प्रयासों का मार्गदर्शन किया गया है ।

छिद्रित पैच-क्लैंप तकनीक एक शताब्दी के एक चौथाई से अधिक के लिए एक मुख्य आधार इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण रहा है। कई प्रकाशन तकनीकी विचारों का विवरण प्रदान करते हैं69,70,71,72,73. सेल छिद्र एम्फोटेरिसिन-बी, नायस्टेटिन, ग्रामिसिडिन, या एसिसिन के साथ प्राप्त किया जा सकता है (संदर्भ देखें32प्रत्येक के अवलोकन के लिए)। अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोणों पर छिद्रित पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का मुख्य लाभ यह है कि देशी इंट्रासेलर वातावरण - जिसमें इंट्रासेलर सीए भी शामिल है2+और संकेत अणुओं (जैसे, सीएमपी, पीकेए, फॉस्फेट, और फॉस्फोडिस्टेरेस) - संरक्षित है। इसलिए, यह तकनीक आदर्श रूप से शारीरिक परिस्थितियों के तहत पूरे सेल आयन चैनल धाराओं और उनके नियामक तंत्र की जांच के लिए अनुकूल है। एक प्रमुख चेतावनी यह है कि इंट्रासेलर सेल संरचना को पारंपरिक संपूर्ण सेल और एकल-चैनल उत्पादशुल्क-पैच (अंदर और बाहर-बाहर) रिकॉर्डिंग जैसे अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीकों के विपरीत ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, तीन कारक नियमित रूप से एम्फोटेरिसिन-बी-छिद्रित पैच-क्लैंप प्रयोगों के सफल प्रयोगात्मक परिणामों में योगदान देते हैं। पहला डीएसएम सेल की गुणवत्ता है जो रिकॉर्डिंग का प्रयास करने के लिए चुना गया है। जब डीएसएम कोशिकाएं अर्ध-संकुचन (टेढ़ा-जैसे) को प्रदर्शित करने के लिए अत्यधिक व्यवहार्य होती हैं, तो सेल सतह के चारों ओर एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रभामंडल के साथ उच्च-विपरीत चमकदार उपस्थिति होती है और रिकॉर्डिंग कक्ष के ग्लास बॉटम को कसकर संलग्न करती है तो गीगा-सील गठन और सेल छिद्र अपेक्षाकृत आसान होते हैं। सफलता के लिए दूसरा और तीसरा कारक क्रमशः, स्रोत की गुणवत्ता और एम्फोटेरिसिन-बी (डाइमेथिल सल्फाक्साइड/डीएमएसओ और इंट्रासेलुलर पिपेट समाधान में) के घुलनशीलीकरण से संबंधित है । हमने स्रोत और बहुत भिन्नताओं के मामले में विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं के बीच विसंगतियों का अवलोकन किया। प्रत्येक दिन हम पाउडर से एम्फोटेरिसिन-बी स्टॉक समाधान का एक नया समाधान तैयार करते हैं जिसके बाद इंट्रासेलुलर पिपेट समाधान में इसका कमजोर पड़ना होता है। इन चरणों में व्यापक ध्वनि और भंवर की आवश्यकता होती है। हौसले से बनाया एम्फोटेरिसिन-बी युक्त पिपेट समाधान के साथ, सफल सेल छिद्र (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced="">+Ca2+, और मानव, गिनी सुअर, माउस, और/या चूहा DSM कोशिकाओं से गैर चयनात्मक cation धाराओं17,21,22,23,29,30,31,35,60. यहां, हम मानव डीएसएम कोशिकाओं में गैर-चयनात्मक cation धाराओं को रिकॉर्ड करने के लिए शर्तों का वर्णन करते हैं। 9-फेनांथ्रोल, TRPM4 चैनलों के अवरोधक, DSM एक्सीबिलिटी के नियंत्रण में इन चैनलों की भूमिका का समर्थन करने वाले वोल्टेज-स्टेप प्रेरित धाराओं को तनु । एक नोट के रूप में, यह आमतौर पर एक गीगा-सील और छिद्र की शुरुआत प्राप्त करने के लिए इष्टतम स्थिर वोल्टेज कदम प्रेरित गैर चयनात्मक cation धाराओं को प्राप्त करने के बाद कम से कम 45 मेंस की आवश्यकता होती है। वोल्टेज रैंप भी वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है30,64. यहां, एक हाइपरपोलाइज्ड होल्डिंग झिल्ली क्षमता से एक वोल्टेज-कदम प्रोटोकॉल को रैंप प्रोटोकॉल के बजाय पसंद किया गया था क्योंकि पूर्व दृष्टिकोण वोल्टेज-निर्भर निष्क्रियता के प्रभाव को कम करता है और एक अवधि में पैदा किए गए वर्तमान के औसत के लिए अनुमति देता है एक वोल्टेज-चरण का जहां रैंप प्रति वोल्टेज एक डेटा पॉइंट प्रदान करता है। उत्तरार्द्ध बिंदु विशेष रूप से मानव डीएसएम कोशिकाओं पर लागू होता है क्योंकि धाराएं वोल्टेज चरणों के दौरान चर गतिविधि दिखाती हैं (चित्रा 5औरचित्रा 6). डीएसएम कोशिकाओं और अन्य सेल प्रकारों के गुणों की पहचान करने में एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित पैच-क्लैंप तकनीक आवश्यक रही है और भविष्य में उपन्यास खोजों को प्रदान करने में सहयोगी बनी रहेगी। इसके अलावा, हौसले से अलग एकल DSM कोशिकाओं को सफलतापूर्वक पूरे सेल कश्मीर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है+Cl-, और सीए2+पैच-क्लैंप तकनीक के पारंपरिक मोड के साथ धाराएं, वर्तमान क्लैंप के साथ झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग, और हमारी पूर्व रिपोर्टों द्वारा उदाहरण के रूप में एकल चैनल रिकॉर्डिंग23,29,35,64.

एकल सेल पैच-क्लैंप विधियों के अलावा, ताजा रूप से अलग-थलग पड़ी डीएसएम कोशिकाओं का अध्ययन सीए2 + इमेजिंग, आरटी-पीसीआर/क्यू-आरटी-पीसीआर, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, सीटू निकटता लिगेशन परख में, और जीनोमिक दृष्टिकोण (जैसे, माइक्रोऐरे, आरएनए-सीक्यू, चिप-एसईक्यू)15, 18,30,33,सहित अन्य तकनीकी दृष्टिकोणों के साथ किया जा सकता है। के रूप में एकल सेल प्रतिलेखन दृढ़ संकल्प तरीकों को विकसित करने और अत्यधिक संवेदनशील हो जारी है, हम एक भविष्य के लिए नियमित रूप से और विशेष रूप से अपने प्रतिलेखन के साथ व्यक्तिगत DSM कोशिकाओं के विद्युत या औषधीय गुणों को जोड़ने की क्षमता में कल्पना/ यह एक डीएसएम सेल से पहले रिकॉर्डिंग और फिर mRNA या प्रोटीन निकालने के बाद ट्रांसक्रिप्टोमिक/प्रोटेओमिक विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया जाएगा । हालांकि इस तरह के तरीकों को पहले से ही गैर-डीएसएम कोशिकाओं में परीक्षण किया गया है, वे वर्तमान में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, नियमित माने जाने वाली संवेदनशीलता की कमी है, और कुछ चयनित जीन उत्पादों74का सफल पता लगाने तक सीमित है। क्रिया-आणविक प्रोफ़ाइल अभिव्यक्ति अध्ययन को जोड़ने जब नियंत्रण और रोगग्रस्त रोगी से प्राप्त मूत्राशय से प्राप्त DSM कोशिकाओं पर किया-दाताओं शारीरिक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा सामांय DSM कार्यों, रोगजनन ड्राइविंग के लिए आवश्यक है, और प्रभावी उपंयास चिकित्सकीय दृष्टिकोण की पहचान करने में ।

Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच-आर01डीके 106964 और पी20डीके 123971 अनुदान जॉर्जी वी पेटकोव द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक पांडुलिपि के महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए डॉ विक्टर यारोटस्की और सुश्री सारा मैक्सवेल का शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी MUSC और UTHSC में यूरोलॉजी स्टाफ सर्जन के लिए आभारी हैं: Drs. थॉमस Keane, हैरी क्लार्क, स्टीफन Savage, रॉस Rames, संदीप प्रसाद, जोनाथन Picard, क्रिस्टोफर Ledbetter, और एंथनी पैटरसन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से MUSC और UTHSC यूरोलॉजी निवासियों: Drs. टेलर वॉन, सैमुअल वॉकर निकल्स, मैथ्यू यंग, आयन बर्न्स, जस्टिन एलेट, रयान लेवे, ऑस्टिन यंग, मार्क क्यूरिन, निमा बारार्टन, ओलुगबेमिसोला मैककॉय, ट्रेसी टिप्टन, ब्राइस वायाट, एलिसा ग्रीमैन, सारा स्टारोस्टा, हारून ब्लोच, क्रिस्टीन कॉलवे, ल्यूसिले कॉक्स, क्रिश्चियन दीवान, आयन हेटमैन, ब्रैडली ह्यूस्टन, स्टीफन लेग, रॉबर्ट एस लिब्बी, कोल लॉकलर, क्रिस्टन मार्ले, मोनिका ओ हैनलॉन, पैट्रिक प्रोबस्ट, सिंथिया शार्डिन, एलिजाबेथ टूरविले, डेनियल जपाटा मानव ऊतक संग्रह के साथ उनकी मदद के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml polystyrene round-bottom tube Falcon 352054 Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps
9-Phenanthrol Sigma-Aldrich 211281 TRPM4 channel inhibitor
Amphotericin-B Fisher BP928-250 Used for patch/cell perforation
Amphotericin-B European Pharmacopoeia Reference Standards 5 Used for patch/cell perforation
Amphotericin-B Sigma-Aldrich A9528-100MG Used for patch/cell perforation
Analog vortex mixer VWR 58816-121
Aspartic acid Sigma-Aldrich A9006 Intracellular pipette solution
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 DS
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 Extracellular solution and DS
Capillary Glass Sutter BF150-110-7.5 Capillary for preparation of pulled patch electrodes
Cesium hydroxide hydrate Sigma-Aldrich C8518 Intracellular pipette solution
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs Axon Instruments/ Molecular Devices pCLAMP-10 Commerical software and part of patch-clamp rig setup
Collagenase type 2 Worthington Biochemical Corporation LS004177 DS-C
CsCl Sigma-Aldrich 203025 Extracellular and intracellular solutions
Dental wax Miltex Dental Wax Technologies, Inc. 18058351
Digital Thermometer with Probe Fisher Scientific 15-077-32 Placed in tissue bath to monitor temperature
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Solvent
DL-Dithiothreitol (DDT) Sigma-Aldrich D9779 Reducing agents used together with Papain
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution
Flaming/Brown micropipette puller Sutter P-97 Required to pull electrodes with very fine tips
Floating foam tube rack/holder VWR Scientific 82017-634 Used for holding tubes with enzymes for temperature control
Glucose Sigma G8270
Glutamic acid (Na salt) Sigma-Aldrich G1626 DS
HEPES Sigma-Aldrich H3375 pH Buffer
KCl Fisher Scientific BP366-1 Extracellular solution
Low Noise Data Acquisition System Axon Instruments/ Molecular Devices Digidata 1440A Part of patch-clamp rig setup
Magnetic stirrer VWR 01-442-684
MgCl2 (hexahydrate) Sigma-Aldrich M2670 Extracellular and intracellular solutions
MicroForge Narishige MF-830 Used for fire-polishing electrodes
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Extracellular and intracellular solutions
NaOH Sigma-Aldrich S8045
Nifedipine Sigma-Aldrich N7634 L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives Nikon Discontinued Part of Patch-clamp rig setup
Non-metalic syringe needle, MicroFil WPI MF-34G-5 Filling of intracellular pipette solution
Papain Worthington Biochemical Corporation LS003126 DS-P
Pasteur pipette FisherBrand 13-678-20A Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces
Patch-clamp amplifier Axon Instruments/ Molecular Devices Axon Axopatch 200B Part of patch-clamp rig setup
PC computer DELL Custom configuration Part of patch-clamp rig setup
pH Meter Aspera Instruments PH700
Polyethylene tubing Intramedic 427-436 Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber
Tetraethylammonium chloride Sigma-Aldrich T2265 Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) Thermo Scientific Discontinued Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup
Tissue bath, 100 mL Radnoti 1583-101 Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps
Vinyl tubing ColePalmer 06405-3 Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath
Water circulator bath, Haake D1 L Haake Discontinued Connected to tissue bath
Weighting scale Mettler Toledo XS64
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives Carl-Zeiss Discontinued Part of patch-clamp rig setup

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9-फेनांथ्रोल-संवेदनशील Cation धाराओं के लक्षण वर्णन के लिए हौसले से अलग मानव Detrusor चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की तैयारी और उपयोग
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Malysz, J., Rovner, E. S., Wake, R., Petkov, G. V. Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents. J. Vis. Exp. (155), e59884, doi:10.3791/59884 (2020).More

Malysz, J., Rovner, E. S., Wake, R., Petkov, G. V. Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents. J. Vis. Exp. (155), e59884, doi:10.3791/59884 (2020).

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