Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

9-Fenanthrol Duyarlı Katyon Akımlarının Karakterizasyonu İçin Yeni İzole Edilmiş İnsan Detrusor Düz Kas Hücrelerinin Hazırlanması ve Kullanımı

Published: January 31, 2020 doi: 10.3791/59884
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3,4
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Urology, Medical University of South Carolina, 3Department of Urology, College of Medicine, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Tennessee Health Science Center

Summary

Biz iki adım lı enzimatik prosedür istihdam insan idrar kesesi örnekleri tek taze izole detrusor düz kas hücrelerinin hazırlanması için bir yöntem açıklar. Elde edilen canlı DSM hücreleri fizyolojik ve farmakolojik özellikleri ortaya çıkarmak için açıklanan amphotericin-B patch-clamp elektrofizyolojisi de dahil olmak üzere çeşitli tek hücre teknikleri ile incelenebilir.

Abstract

İdrar kesesi duvarı içinde bulunan detrusor düz kas (DSM) hücreleri sonuçta idrar depolama ve voiding kolaylaştırmak. Canlı, taze ve izole Edilmiş DSM hücrelerinin hazırlanması, başarıları sonraki fonksiyonel ve moleküler çalışmalar için en uygun hücreleri sağlayan önemli bir teknik zorluk sunar. Burada geliştirilen ve özenle hazırlanmış ve on yılı aşkın bir süredir grubumuz tarafından başarıyla kullanılan yöntem, açık mesane ameliyatlarından elde edilen insan idrar kesesi örneklerinin diseksiyonunu, ardından DSM parçalarının enzimatik iki aşamalı tedavisini ve taze izole Edilmiş DSM hücrelerini elde etmek için mekanik triturasyonunu tanımlar. İlk adım diseksiyon mukoza (ürotelyum, lamina propria ve muscularis mukoza) ve komşu bağ, vasküler ve yağ dokuları mevcut dism asyon içerir . DSM daha sonra nominal Ca2+içeren diseksiyon/sindirim çözeltisi (DS) parçalara (2-3 mm x 4-6 mm) kesilir. DSM parçaları daha sonra adım başına 30-45 dakika boyunca ~37 °C'de papain ve kollajenaz içeren DS ile ayrı ayrı aktarılır ve sırayla işlem göredir. Enzimsiz büyükbaş hayvan serumu içeren DS ile yapılan yıkamalar ve ateşcilli pipetle tritürasyon sonrasında parçalar tek DSM hücreleri salgılar. Yeni izole Edilmiş DSM hücreleri iyon kanallarının yama-kelepçe elektrofizyolojik ve farmakolojik karakterizasyonu için idealdir. Özellikle, TRPM4 kanal bloker 9-phenanthrol amphotericin-B delikli yama-kelepçe yaklaşımı ile kaydedilen voltaj adım uyarılmış katyon akımları azaltır göstermektedir. DSM hücreleri tek hücreli RT-PCR, mikrodizi analizi, immünostokimya, yerinde yakınlık ligasyon tahlil ve Ca2+ görüntüleme gibi diğer tekniklerle de incelenebilir. Tek DSM hücrelerinin kullanılmasının en büyük avantajı yapılan gözlemlerin ortaya çıkan tek hücre özellikleriyle doğrudan ilişkili olmasıdır. Taze izole edilmiş insan DSM hücrelerinin çalışmaları, idrar kesesinde katyon geçirgenliği de dahil olmak üzere çeşitli iyon kanallarının özelliklerini karakterize eden önemli bilgiler sağlamıştır ve DSM hücresel özelliklerinin ve düzenleyici mekanizmaların aydınlatIlmesinde altın bir standart olarak devam edecektir.

Introduction

Detrusor düz kas (DSM) hücreleri idrar kesesi en bol hücre tipini oluşturur ve sonuçta idrar depolama ve gevşeme ve daralma yoluyla boşluk kontrolü, sırasıyla. DSM hücreleri bitişik bağ dokusu, sinir süreçleri, interstisyel hücreler ve diğer hücre tipleri1ile iç içe düz kas demetleri oluşturur. DSM hücrelerinin idrar kesesi fonksiyonundaki rolünün güncel anlaşılması çok düzeyli entegre bir yaklaşımla sağlanmıştır. Her deneysel yöntem - ister vitro izole tek hücreler, in vitro /ex vivo düz kas demetleri içeren doku şeritleri, ya da in vivo tayini (sitometri ve voiding fonksiyon değerlendirmeleri gibi) - DSM fizyolojik ve farmakolojik özellikleri içine önemli ve özel anlayışlar sağlar (ayrıntılar için değerlendirmeler1,2,3,4,5,6 bakınız). Ancak, izole tek hücrelerden elde edilen sonuçların yorumlanması, sonuçların özellikle tek hücre tipinin kendisine atfedilmesine olanak tanır. Bu gerçekleşme tüm kalınlıkta idrar kesesi örnekleri taze izole DSM hücreleri elde etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak için itici güç olmuştur. Diğer birçok hücre tipinin aksine, düz kas hücreleri elektrofizyolojik ve kontraktil özellikleri nde belirli değişiklikler de dahil olmak üzere kendi yerli fenotip kaybı nedeniyle güvenilir kültürlü olamaz7,8. Bu durum fizyolojik olarak aktif olan taze izole DSM hücreleri üzerinde yapılan çalışmaların önemini daha da güçlendirmektedir.

1980'lerin sonlarında ve 1990'ların başında, Isenberg grubu (Almanya) kobay idrar kesesi9,10,11,12,13 (Tablo 1)elde edilen taze izole DSM hücreleri üzerinde elektrofizyolojik çalışmalar bir dizi yayınladı. Yöntem, hayati hücrelerin elde edilmesine yardımcı olan ve diğerlerinin izlemesi için bir başlangıç kılavuzu olarak hizmet eden iki önemli gözlemin altını çizdi. Onlar 1) enzimajen tedavi öncesi Ca2 +-serbest çözelti / orta ve 2) kollajenaz içeren bir çözüm ile doku sindirimi ile izole DSM adet ön tedavi edildi. Bu iki kritik adım, DSM hücre dissosiyasyon yordamlarının sonraki tüm türevlerine dahil edilmiştir(Tablo 1). Şu anda, grubumuz iki aşamalı sıralı papain-kollajenaz dissociation yaklaşım kullanır. DSM parçaları önce papain içeren bir enzim çözeltisi ile, daha sonra kollajenaz tip II ile aynı çözeltide (DS, diseksiyon/sindirim çözeltisi) çözünür şekilde tedavi edilir. Bu yaklaşım, kobay, domuz, sıçan, fare ve daha da önemlisi insan dahil olmak üzere çeşitli türlerden tek DSM hücreleri verir(Tablo 1).

Tek DSM hücreleri birden fazla moleküler biyoloji ve fizyolojik deneyler için bir kaynak sağlar. Şimdiye kadar immünositokimya ile çalışılan protein ve mRNA ekspresyonu, veya RT-PCR/qRT-PCR tayinleri, büyük iletkenlik gerilimi ve Ca2+-aktif (BK), küçük iletkenlik Ca2+-aktif K+ tip 3 (SK 33), voltaj kapılı K+ (Kv),L tipi voltaj kapılı Ca2+ (Cav),ve geçici reseptör potansiyeli melastatin tip 4 (TRPM4) kanallarının yanı sıra Na/Ca2+ değiştirici 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Hepsinin DSM uyarılabilirliğini, hücre içi Ca2+ seviyelerini ve kontraktiliteyi kontrol ettikleri düşünülmektedir. Yama-kelepçe elektrofizyolojik yaklaşımlar, doğrudan kobay, fare, sıçan veya insan DSM hücreleri üzerinde gerçekleştirilen, L-tipi Cavbiyofiziksel ve farmakolojik özellikleri doğrudan gösteri sağlanan , Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK, ve TRPM4 kanalları17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Yaklaşımlar arasında konvansiyonel bir bütün hücre voltaj-kelepçesi, delikli voltaj-kelepçe ve tek kanallı kayıtlar (hücre bağlı, iç-dış ve dış-dış konfigürasyonlar) yer aldı. Buna ek olarak, dsm'nin akım kelepçesi kullanılarak membran potansiyeli kaydı, hedef le ilgili farmakolojik ajanların hücre uyarılabilirliğini değiştirdiğine dair kanıtlar sağlamıştır. Örneğin, TRPM4 inhibitörü 9-phenanthrol dsm hücrelerinde hiperpolarizasyon indüklenen insanlar, kobay, ve sıçan idrar kesesi19,20,22,31. Çeşitli elektrofizyolojik yöntemler arasında, amphotericin-B (ve nystatin, gramicidin ve β-escin) delikli yama-kelepçe kayıtları içsel hücre içi sinyal molekülleri ve yollarını koruyarak önemli bir avantaj sağlar. Sadece düşük molekül ağırlıklı katyonlar ve daha az ölçüde, Cl- ama protein veya Ca2 + dahil sinyal molekülleri - amfiericin-B veya nystatin32tarafından oluşturulan plazma membran gözenekleri ile geçirgen . Delikli yama-kıskaç deneylerinin başarılı sonucu, bu tekniğe özgü birçok genel değişkene bağlıdır. Burada grubumuzun15,22,33,34,35,36,37,38,39yıllarında başarıyla kullandığı amphotericin-B kullanan prosedürün ayrıntılarını açıklıyoruz.

Tartışmasız, non-selektif katyon kanalları DSM hücrelerinde en az anlaşılan kanal türlerinden biri olmaya devam etmektedir. Seçici olmayan katyon benzeri bir kanalın ilk raporu 1993 yılına dayanıyor. Wellner ve Isenberg11 tarafından kağıt iyon geçirgenlik aşağıdaki rütbe sırasını gösteren bir 33 pS streç-aktive tek kanal: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+ve Gd3 +tarafından kanal aktivitesinin inhibisyonu , non-selektif katyon kanallarının genel bir inhibitörü. Neredeyse on yıl sonra, Thorneloe ve Nelson40 fare DSM hücrelerinde Na+ geçirgen katyon akımları açıklanan, Gd tarafından inhibe3 +, bütün hücre kayıtları kullanarak. Seçici olmayan katyon kanallarının moleküler kimlikleri ve biyofiziksel karakterizasyonları belirlenmeye devam ettiği için, bu araştırma alanında ileride yapılacak araştırmalar alabı gerekmektedir. Non-selektif katyon kanalı akımlarının kaydı için burada açıklanan protokol - cs+ ,TEA+içeren hücre dışı ve pipet intrasellüler solüsyon lar kullanılarak ve nifedipin(Tablo 2) bu fizyolojik ve farmakolojik olarak Kv ve Cav akımları azaltmak - non-selektif katyon kanallarının elektrofizyolojik araştırmalarda yararlı olmuştur ve olmaya devam edecektir. Biz kobay, sıçan ve insan DSM hücrelerinde TRPM4 kanal bloker 9-phenanthrol tarafından tüm hücre katyon akımlarının inhibisyonu ölçüde belirlemek için bu özel protokolü kullandık19,20,22.

Birlikte ele alındığında, insan idrar kesesi taze izole tek DSM hücreleri elde etmek için burada açıklanan yöntem yama-kelepçe tekniği, Ca2 +görüntüleme, immünositokimya, yerinde proksimal dava tahlil ve tek hücreli RT-PCR/qRT-PCR yanı sıra mikrodizi analizi, RNA-seq, ve CHIPQ-se-se-se-se-se-se-se-se-siq çeşitli yapılandırmaları kullanarak elektrofizyolojik araştırmalar için son derece uygun canlı hücreler sağlar. Amphotericin-B delikli yama-kelepçe yönteminin kullanımı diğer konfigürasyonlardan farklı olarak yerel hücre ortamını korur. Burada özetlenen özel koşullar kullanılarak, DSM hücrelerindeki K+ ve Ca2+ akımlarının katkılarını inkâr etmek üzere tasarlanan voltaj-adım indüklenen akımlar, biyofiziksel ve farmakolojik karakterizasyonlara uygun seçici olmayan katyon akımlarının özelliklerini gösterir.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu Komiteleri (Memphis, TN, IRB # 17-05714-XP) ve Güney Carolina Tıp Üniversitesi (Charleston, SC, IRB # 00045232) tarafından onaylanmıştır. Onaylanan prosedürler tüm kalınlıkta idrar kesesi örnekleri (>1 cm by >1 cm) - mukoza, detrusor düz kas ve serosa gibi tüm katmanları içeren kan damarları ve yağ dokusu bağlı) - mesane cerrahi kısmi çıkarma geçiren hasta-donörlerden toplanacak. Hasta-donörler yetişkin (şimdiye kadar çalışılan yaş aralığı: 25-87 yaşında), ya erkek ya da kadın, aşırı aktif mesane belirtileri olan veya olmayan (Amerikan Üroloji Derneği I-PSS skoru41ile sınıflandırılır). Cerrahi işlemler ürotelyal karsinom için radikal sistektomi ve adenokarsinom dahil olmak üzere çeşitli tıbbi koşulları içerir. Bu gibi durumlarda, toplanan idrar kesesi örneği tümör bölgesinden uzaktır.

1. DSM dokularının diseksiyonu ve mukozasız DSM parçalarının hazırlanması

  1. Ameliyathaneden laboratuvara gelen idrar kesesi numunesinin tamamını soğuk diseksiyonu/sindirim çözeltisi ile dolu sıkıca kapatılmış bir kapta inceleyin (DS bileşimi içinŞekil 1 ve Tablo 2).
    NOT: Numune genellikle laboratuvara gelmeden önce birkaç saatten geceye kadar soğuk DS'de saklanır. Daha uzun depolama için, DS (Tablo 2) 1 mM CaCl2ile desteklenir.
  2. İnsanın tüm kalınlığı DSM örneğini (mukoza, DSM ve serosa dahil tüm katmanları içeren) buz gibi ds ile durulayarak ekteki enkaz ve kanı temizle.
  3. İdrar kesesi örneğini, mukozayı yukarı bakacak şekilde ve serosa aşağı, silikon enantiomer kaplı(Malzeme Tablosu)150 mm çapında buz gibi DS ile doldurulmuş yuvarlak tabağa sabitler (Şekil 1B).
  4. Mikrosksörler ve forceps kullanarak keskin diseksiyonu ile komşu yağ dokusu, kan damarları, epitel (urothelium) ve kas mukozasını numuneden çıkarın.
  5. Birkaç mukozaiçermeyen DSM parçasını (~2-3 mm uzunluğunda ve 4-6 mm genişliğinde) kesin (Şekil 1C).

2. Taze izole edilmiş tek DSM hücreleri veren DSM parçalarının enzimatik ayrışması

  1. 3 ila 6 DSM parçalarını önceden ısıtılmış (~37 °C) DS içeren bir tüpe papain ve dithiothreitol (DS-P, Tablo 2) içeren bir tüp içine yerleştirin ve DS-P'de 30-45 dakika ~37 °C'de dsm parçalarını yavaşça tlayarak tüpü (her 10-15 dakika) yerleştirin.
    NOT: Enzimtedavisi için sıcaklığı en iyi şekilde kontrol etmek için, doku parçaları ve enzim solüsyonlu tüpler, sirkülasyonlu ısıtılmış su banyosuna bağlı su yla dolu bir cam doku haznesine(Şekil 1D)veya yüksek hassasiyetli sıcaklık kontrollü sallayarak su banyosuna(Şekil 1E)yerleştirilir.
  2. DS-P'yi tüpten çıkarın, DSM parçalarını kısaca buz gibi DS ile yıkayın, tüpün alt kısmında oturan DSM parçalarını bırakarak tüpten soğuk DS atın.
  3. DSM parçaları ile tüpe DS içeren kollajenaz tip II (DS-C, Tablo 2)1 ila 2 mL ekleyin, hafifçe karıştırın; ve ~37 °C'de 25-40 dk kuluçkaya yayılarak tüpü ara sıra sallayarak (her 10-15 dk).
  4. DS-C'yi atın ve enzimle işlenmiş DSM parçalarını buz gibi DS ile 5-10 kez yıkayın.
  5. Son yıkamadan sonra, tüp içinde DS çözeltisi bırakın; tek DSM hücrelerini serbest bırakmak için ateşte cilalanmış Pasteur pipetiyle hafifçe triturate.
  6. Dağınık DSM hücrelerini içeren birkaç damla DSM çözeltisini bir cam alt haznesine veya bir kapak altına yerleştirin ve hücrelerin yapışmasını sağlamak için uygulamayı takip eden en az 5 dakika sonra mikroskop altında (20x veya 40x hedefi kullanarak) kaliteyi görsel olarak inceleyin alt.
  7. Elektrofizyolojik deneyler için hemen taze izole edilmiş DSM hücrelerini kullanın veya hücreleri ~4 °C'de ~4 °C'de veya buzdolabında kullanıma kadar (genellikle 8 saate kadar hazırlık için) içeren bir tüpte saklayın.
    NOT: Aynı hazırlık içinde hücrelerin kalitesi son derece canlı dan aşırı sindirilmiş, ölü DSM hücreleri(Şekil 2)değişir. Sıralı papain-kollajenaz yöntemi çok yüksek sayıda unviable hücre verdiğinde, hazırlık atılır ve DSM parçalarının yeni bir sindirim icra edilir ama azaltılmış kuluçka aralıkları ile. Eğer işlem DSM parçalarının sonraki sindirimi için çok az DSM hücresi yle sonuçlanırsa, kuluçka aralıkları artar. Α-düz kas aktinine pozitif immünoreaktivite DSM hücrelerinin kimliğini doğrular(Şekil 3).

3. Amphotericin-B delikli tam hücre gerilimi yama-kelepçe tekniği kullanılarak DSM hücrelerinden gerilim adımlı katyon akımlarının kaydedilmesi

  1. Pipet 0.25-1 mL hücre süspansiyonu ters bir mikroskop un sahne üzerinde oturan bir cam alt hazneüzerine ve hücrelerin cam alt yapışmasını sağlar.
  2. En az 45 dakika kuluçkadan sonra, Banyodan DS'yi çıkarınve giriş tüpü ile yerçekimi yardımıyla çözelti akışının ds'nin yerini yeni solüsyonla değiştirdiği süperfüzyon ile DS'yi vakumlu atık kabına bağlı çıkış borusu oda çözeltisini kaldırır ve taşmasını önler. E çözeltisi K+ akımları inhibe etmek için tetraethylammonium (TEA+) ve sezyum (Cs+) iyonları içerdiğini unutmayın.
  3. Dimetil sülfoksitte (DMSO) (DMSO'nun 10 μL'si 1 mg) amphotericin-B'nin çalışan bir stok çözeltisi hazırlayın. Tam amphotericin tozu eritmek için, sonicate (en az 15 dk) ve girdap çözeltiiyi.
    NOT: Bu adım genellikle 10 dakikadan az sürer. Amphotericin-B yüksek miktarlarda genellikle tüp mevcut amphotericin-B katı parçacıkların karıştırma ve eksik çözünürlük için daha uzun bir aralıkla sonuçlanan daha fazla DSMO çözücü gerektirir.
  4. 200-500 μg/mL'lik son konsantrasyonu elde etmek için pipet çözeltisindeki (P, Tablo 2)amphotericin-B stok çözeltisini çözün. Bu adım, pipet çözeltisinde amphotericin-B çökeltisi oluşumunun optimum şekilde karıştırılmasını ve önlenmesini sağlamak için adım başına ~30 ila 60 dk'lık yüksek hızlı bir ayarda (8-10/10) geniş sonication ve girdap lama gerektirir.
    NOT: Amphotericin-B zamanla çökelecektir ve ışığa duyarlıdır. Amphotericin-B içeren çalışan pipet çözeltisi çözünürlüğü kontrol edilir, pipet dolumu öncesinde elle karıştırılır ve karanlıkta tutulur.
  5. Birden fazla yama elektrotlar, yangın cilalı elektrot ipuçları çekin ve (gerekirse) diş balmumu ile ipuçları kat.
  6. Bir yama elektrotunun ucunu pipet çözeltisi (çözelti P, Tablo 2)ile amphotericin-B olmadan çözeltiye kısaca dalarak doldurun.
  7. Elektrot, amphotericin-B içeren aynı pipet çözeltisi ile doldurun.
  8. Elektrot, yama kelepçeli amplifikatör başlığına bağlı bir tutucuya monte edin.
  9. Bir mikromanipülatör kullanarak, elektrotun hücre dışı çözeltinin yüzeyinin hemen altına yerleştirin, böylece elektrotun ucu sadece batırılır.
  10. Voltaj-kelepçe modunda, tutma potansiyelini 0 mV olarak ayarlayın ve ticari amplifikatör üzerindeki pipet ofset kadranı(Malzeme Tablosu)ile akımı 0 pA olarak ayarlayın.
  11. Ticari satın alma yazılımının Membran Test penceresi/işlevini kullanarak elektrot direncini belirleyin(Malzeme Tablosu). Araçlar>Membran Testi>Play'i veya yazılımdaki kısayol simgesini etkinleştirmek için. Belirlenen elektrot direnci 2 ila 5 MΩ aralığında olmalıdır.
    NOT: Ticari alım yazılımında sağlanan Membran Testi fonksiyonu veya amplifikatör üzerindeki Mühür Testi seçeneği, voltaj adımlarını tekrar tekrar uygulayarak elektrot direncini izlemek için kullanılabilir.
  12. Elektrot un mikromanipülatörle seçilmiş bir DSM hücresine doğru ilerlerken elektrot direncini izlemeye devamedin( Şekil 4A).
    NOT: Canlı bir DSM hücresi olarak kabul edilebilmek için hücrede mil şeklindeuza dönüşlü morfoloji, hücre etrafında iyi tanımlanmış bir hale, keskin kenarlar ve yarı kontrrak (serpantin) görünüm gösterilmelidir.
  13. Membran Testi fonksiyonu ile ölçülen elektrot direncinde hızlı bir artışla gösterilen elektrot ile hücre yüzeyine dokunduğunda, boru yoluyla elektrot tutucuya hafif hızlı negatif basınç uygulayarak giga-seal oluşturur. Bu da elektrotun ucunda oluşan negatif basınçla sonuçlanır ve hücre zarını elektrot içine çekerek giga-conta oluşumuna yardımcı olan veya elektrot ile plazma zarı arasında çok sıkı bir temas(Şekil 4B).
  14. Giga-seal formları bir kez, ticari amplifikatör üzerinde hızlı ve yavaş kadranlar ayarlayarak pipet kapasitansını telafi ve Membran Testi işlevini kullanarak giga-seal stabilitesini (sızıntı akımı) izleyin.
  15. Amphotericin-B'nin pipetten aşağı yayılabilmesi ve plazma zarına eklenmesi için genellikle 30-60 dk süre verin ve öncelikle monovalent katyonlar için seçici olan gözenekleri oluşturan plazma zarına takın. Bu adımda, Membran Testi fonksiyonu ile giga-contasını izlemeye devam edin. Hücre perforasyonu arttıkça, membran testi fonksiyonu ile ölçülen kapasitans geçicilerinin genliği (sırasıyla hiçbir ve etkili hücre perforasyonu gösteren Şekil 4B ile Şekil 4C karşılaştırın) yapar.
  16. Yama perforasyonu en uygun olduğunda (genellikle 50 MΩ'un altındaki kararlı seri direnciile değerlendirildiğinde), amplifikatördeki hücre kapasitasörü ve seri direnci için kadranları ayarlayarak kapasitans geçicilerini iptal edin. Seri direnç telafisi de şu anda yapılabilir (Şekil 4D).
  17. Belirtilen protokol tarafından uyarılmış kararlı voltaj-adım indüklenen katyon akımları gözlendikten sonra, süperfüzyon ile test etmek için bir bileşik veya fizyolojik durum uygulayın ve kontrol-, test-durum ve yıkama (mümkünse) için yanıtları kaydetmek ticari satın alma yazılımı.
    1. -64 veya -74 mV'de DSM hücrelerini tutmayı ve -94'ten +96 veya +106 mV'ye kadar 400 veya 500 ms'lik 10 mV'lik artışlarda voltajı devreye sokup tutma potansiyeline dönmeyi içeren rutin voltaj adım protokolü ile akımları kaydedin.
      NOT: Membran potansiyel değerleri 14 mV likit bağlantı potansiyeli için ayarlanır (P ve E çözeltileri kullanılarak, Tablo 2). Sıvı bağlantı potansiyeli ticari satın alma yazılımında(Malzeme Tablosu)(Araçlar>Kavşak Potansiyelleri)tıklayarak ve çözelti iyon bileşenlerinin konsantrasyonlarına girilerek elde edilir. Geçerli kayıtları elde etmek için rampa protokolü de kullanılabilir.
    2. Bir deneme sırasında voltaj protokolünü ön ekleme kontrolü, test koşulu ve yıkama için akımları kaydederken sürekli ~1 dk aralıkta çalıştırın.

4. Veri analizi ve görselleştirme

  1. Dosya>Verileri Aç'ı tıklatarak ve açmak için ilgi çekici dosyaları seçerek kontrol, test durumu ve yıkama için ticari veri analizi yazılımında(Malzeme Tablosu)kayıtlı dosyaları açın.
    NOT: Analiz için genellikle her durum için üç dosya (her biri tek bir protokol çalışmasına tek bir izleme kümesi içeren) açılır ve analiz edilir. Yanıtlar daha sonra her durum için ortalama bir yanıt elde etmek için ortalama. Veri toplama için kullanılan yazılım, kullanıcı tarafından belirtilen birden çok test çalışmasının otomatik olarak toplanmasını ve alternatif olarak kullanılabilecek tek çıktı dosyası için ortalamasını alma seçeneği içerir.
  2. Her gerilimde ölçülen akım izi için son 200 ms üzerinden ortalama yanıtı alın; seçilen süre aralığı, gerilim-adım akım aktivasyonunun sabit durum düzeyini yansıtır. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Ticari analiz yazılımında(Malzeme Tablosu)analiz için ilgi çekici bir dosya seçin.
      NOT: Yazılım, en son alınan dosyayı etkin ekran penceresine yerlemektedir. Açık dosya, voltaj adımı protokolü yle elde edilen bir dizi çakışan iz görüntüler. Varsayılan olarak, etkin pencere içinde dört imleçler (vurgulanan izleme için x ve y değerleri görüntüleniyor) gösterilir.
    2. 400 veya 500 ms gerilim adımının sonunda imleç 2 ve 200 ms aralığında imleç 1'i yerleştirerek analiz aralığını seçin, böylece analiz aralığı 200 ms'dir.
    3. Analiz>Hızlı Grafik>IV (veya IV kısayol simgesi) (veri oluşturmadan önce istem penceresinde) tıklayarak her voltaj için yanıt alın (veri oluşturmadan önce istem penceresinde y ekseni (Akım) sinyal Bölge seçenekleri için "İmleçler 1..2" ve "Mean" seçilir). I-V grafiğini oluşturmak ve verileri Windows>Sonuçlar'aerişerek görüntülenebilen sonuçlar sütun sayfasına yerleştirmek için Tamam'ı tıklatın.
    4. 4.2.1 - 4.2.3 adımlarını yineleyerek ek dosyaları çözümleyin. İzleri işlerken Sonuçlar sayfasına ek veri eklemek için Analyze>Quick Graph>IV veya IV simgesi kısayolu'nu tıklatın, Değiştir yerine Append'i seçin.
    5. İlgi alan sütunları seçerek ve kopyalamak için CTRL+C tuşuna basarak verileri elektronik tabloya kopyalayın ve ctrl+V yapıştırın. Sonuçlar çalışma sayfasını ticari analiz yazılımında(Malzeme Tablosu) File>Save As'ıtıklayarak (*.rlt) formatında saklayın.
  3. Her hücre için, her üç koşuliçin de yanıtları, ön ek kontrolü için maksimum voltaj adımının değerine göre normalleştirin (formüle göre: Yanıt/YanıtKontrolü-Max)ve yanıtları gerilim ilişkilerine karşı akım (veya akım yoğunluğu) değerleri olarak grafikleştirin(Şekil 6).
    1. Çalışma sayfası işlemcisinde, kontrol, test durumu (bu örnekte, 9-phenanthrol) için ortalama yanıtları akım (pA) veya akım yoğunlukları (pA/pF) olarak belirleyin ve her gerilim adımında yıkayın.
    2. Formülü izleyen ön toplama kontrolü için en yüksek gerilimde (Şekil 6'da+96 mV) elde edilen maksimum kontrol tepkisi ile her koşulun her gerilimi (kontrol, 9-fenantrol ve yıkama) için değerleri böl: Normalleştirilmiş yanıt(x) = Yanıt(x)/ YanıtKontrolü-Max için (x).
  4. Özet analiz için, verileri görselleştirme için grafik programına (örneğin GraphPad Prism) kolayca kopyalanabilecek bir biçimde düzenleyin.

Representative Results

DSM parçalarının enzimatik ayrıştırması, yama-kelepçe elektrofizyolojisi ve immünositokimya gibi fonksiyonel ve moleküler çalışmalarda rutin olarak kullanılan sağlıklı taze izole DSM hücreleri sağlar. Şekil 1 diseksiyon adımlarını özetler ve enzimatik tedavi adımlarının sıcaklık kontrolü için kullanılan kurulumları görselleştirir. Şekil 2, her biri farklı bir hasta-donörden elde edilen üç insan idrar kesesi örneğinden elde edilen DSM hücrelerinin parlak alan görüntülerini göstermektedir. Sağlıklı tek DSM hücreleri mil şeklinde morfolojisi, keskin iyi tanımlanmış kenarlar, hücre etrafında iyi tanımlanmış bir hale ve mikroskop altında görüntülendiğinde yarı kontraktil (serpantin benzeri) görünüm ile karakterizedir (Bkz. Şekil 2'dekibeyaz oklarla işaretlenmiş DSM hücreleri). Ayrıca kaskarinik agonist karbnist karbnist karbül veya yüksek K+ (60 mM) uygulamaları gibi kasılma uyarıcı ajanlaryanıt. DSM hücreleri α-düz kas aktininin kimliklerini doğrulayan pozitif immünoreaktivite gösterdiğini göstermektedir(Şekil 3).

DSM hücreleri iyon kanalı özelliklerinin yama-kelepçe elektrofizyolojik incelemeleri için idealdir. Burada, voltaj adımlı katyon kanallarını en iyi şekilde kaydetmek için pipet ve hücre dışı çözeltiler(Tablo 2)kullanarak amphotericin-B delikli yama-kelepçe kayıt yöntemini tanımlıyoruz. Kullanılan özel koşullar altında, Kv ve L-tipi Ca2+ akımlarının cs+/TEA+ ve nifedipin ile ablukası, bu iyonik bileşenlerin tüm hücre gerilimi uyarılmış akımlara katkısının ortadan kaldırılmasını sağlamıştır. Şekil 4 ve Şekil 5, sırasıyla, amphotericin-B delikli yama-kelepçe yönteminin deneysel adımlarını ve her biri farklı bir hasta donörden olmak üzere üç farklı insan DSM hücresinde bir voltaj adımı veya rampa protokolü ile ölçülen temsili tüm hücre akımlarını göstermektedir. Kayıtların geçerli genlikler ve dışa doğru düzeltme açısından belirli bir değişkenlik derecesi gösterdiğini unutmayın. Ek deneyler, bir TRPM4 kanal inhibitörü olan 9-phenanthrol'un negatif ve pozitif gerilimlerde insan DSM katyon akımlarını etkin ve geri inhibe ettiğini ortaya koymuştur(Şekil 6). 9-fenanthrol duyarlı akım bileşeni pozitif voltaj ve dışa doğru düzeltme güçlü bir inhibisyon göstermektedir (Şekil 6C).

Figure 1
Şekil 1: Detrusor düz kas (DSM) parçalarının hazırlanması ve enzimatik dissosilasyon için kullanılan kurulum ile sonuçlanan diseksiyon adımlarının özeti. Gösterilen görüntüleri şunlardır: (A) buz gibi DS yabancı cerrahi malzeme olarak açık mesane cerrahisi sağlanan bir bütün kalınlığı insan idrar kesesi örneği, (B) kısmen parçalanmış bir DSM tabakası ile sabitleme sonra aynı hazırlık, (C) DSM tabakası ndan enzimatik sindirim (küçük parçalar) veya diğer deneysel araştırmalar (daha büyük parçalar) için hazır kesilmiş değişken boyutlarda DSM parçaları, (D, E) alternatif kurulumları oluşan DSM parçalarının enzimatik sindirim için kullanılan ya (1) su dolu büyük bir cam doku odasına boru ile bağlı bir sıcaklık kontrollü sirkülasyon su banyosu, tüpler için kauçuk tutucu, DSM parçaları içeren plastik tüpler ve diseksiyonu/sindirim çözeltisi içinde hazırlanan enzim çözeltileri (DS, DS-P veya DS-C, Tablo 2)ve sürekli izleme(D)veya (2) bir tutucu ve DSM parçaları ve enzim çözeltileri ile tüpler içeren büyük bir su dolu sıcaklık kontrollü banyo(E ). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Sıralı papain-kollajenaz sindirim yöntemi kullanılarak elde edilen insan taze izole DSM hücrelerinin temsili parlak alan görüntüleri. (A-F) Görüntülenen canlı, fizyolojik olarak aktif DSM hücrelerinin görüntüleri delikli yama-kelepçe kayıtları denemek için uygun adaylar olarak kabul edilir. (G, H) Canlı olmayan veya aşırı sindirilmiş hücrelerin görüntüleri; bu tür hücreler yama-kıskaç deneyleri için kaçınılmalıdır. Panellerde beyaz ve siyah oklar(A-H),yama-kıskaç kayıtları denemek için sırasıyla uygun ve uygun olmayan olarak kabul edilen DSM hücrelerini işaret eder. Panellerde(A, C ve G)siyah okların hücre parçalarını (dairesel parçalar) veya DSM morfolojisi olmayan küçük hücrelere işaret ettiğini ve(H)hücrelerin soluk ve genişlemiş göründüğünü unutmayın. Görüntüler üç farklı idrar kesesi örneğinden(A ve B : hasta-donör kaynak bir, C ve D : hasta-donör kaynak iki ve E-H : hasta-donör kaynak üç) vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: İmmünositokimya analizi ile tek insan DSM hücrelerinde geçici reseptör potansiyeli melastatin tip 4 (TRPM4) kanalı ve α-düz kas spesifik aktin immünoreaktivitelerinin ifadeleri. (A) Bir insan DSM hücresinde TRPM4 kanal protein ekspresyonunun immünositokimyasal saptanmasını gösteren konfokal görüntüler gösterilmiştir. Kırmızı boyama (sol altta) TRPM4 kanal proteinlerini gösterir; mavi (DAPI) boyama hücre çekirdeklerini algılar (sol üst); yeşil boyama α-düz kas aktinini gösterir (α-SMA, sağ üst); birleştirilmiş görüntü (sağ altta) üç görüntünün de çakışma larını gösterir. (B) İzole edilmiş insan DSM hücrelerinde TRPM4 spesifik rakip peptid (CP) varlığında TRPM4 kanal protein ekspresyonunun immünositokimyasal saptanmasını gösteren konfokal görüntüler. Mavi (DAPI) boyama hücre çekirdeklerini gösterir (sol üst); yeşil boyama α-düz kas aktin içindir (α-SMA, sağ üst); birleştirilmiş görüntü (sağ altta) üç görüntünün de çakışma larını gösterir. Sonuçlar dört ayrı deneyde DSM tüm doku veya dört hastadan izole edilen birden fazla DSM hücresi kullanılarak doğrulandı. Görüntüler Hristov et al. (2016)22'den ve izinli olarak kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Giga-mühür oluşumu ve insan DSM hücrelerinin amphotericin-B perforasyonu ile ilgili adımların şematik illüstrasyonu. Resimli bir amphotericin-B uzaysal pozisyonları pipet ve DSM hücre içeren ticari satın alma yazılımı(Tablo Malzemeler Tablosu)gerilim adımları değiştirerek elde edilen membran testleri için ilişkili yanıtları ile birlikte direnç belirleyen gerilim adımları (bu örnekte -10 veya -20 mV) vardır. Konfigürasyonlar şunlardır: (A) bir elektrot ile hücre yaklaşımından önce, (B) giga-mühür oluşumundan sonra pipet içeren pipetin (kırmızı nokta larla temsil edilen amphotericin-B) hücre yüzeyine konumlandırılması ve negatif basınç uygulanması ile elde edilen giga-mühür oluşumundan sonra, (C) giga-mühür oluşumundan sonra ~45 dk gösterilen hücre içi konfigürasyon, bu noktada ki amphotericin-B pipetten aşağı yayıldı ve molekülleri elektrot oluşturan katyonun ucundaki plazma zarına yerleştirildi. geçirimsiz gözenekleri, ve (D) olarak aynı yapılandırma (C) ama kapasitans geçici ile amplifikatör üzerinde tam hücre kapasitans ve seri direnç için kadranlar kullanılarak iptal. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: İnsan DSM hücrelerinde amphotericin-B delikli yama-kelepçe yöntemi ile kaydedilen tüm hücreli katyon akımları. (A) Voltaj-adım protokolünün diyagramı, -74 mV'lik bir tutma potansiyelini ve -94 ile +96 mV arasında 400 mV'lik voltaj adımlarını gösterir ve 10 mV'lik artışlarla -74 mV'ye döndürülür. (B, C) (A)'da tanımlanan gerilim-adım protokolü ile elde edilen farklı bir idrar kesesi numunesi/hasta-donörden iki farklı insan DSM hücresinin akım yoğunluğu-gerilim çizimleriyle birlikte temsil akımı izleri. (D) Rampa protokolü ile elde edilen akım izörneği (0,21 mV/ms'de 1 s'lik bir süre içinde -94'ten +116 mV'ye gerilim değişimi olarak üst insetin içinde grafikolarak temsil edilir, tutma potansiyeli -94 mV idi). Panellerde sağda(B-D),grafikler kaydedilen her DSM hücresi için akım yoğunluğu-gerilim ilişkisini görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: TRPM4 kanal blokeri 9-fenanthrol aracılı insan DSM hücrelerinde gerilim adım indüklenen katyon akımları inhibisyonu. (A) Gösterilen kontrol için Şekil 5A açıklanan gerilim-adım protokolü ile ölçülen temsili akımlar, 9-phenanthrol, ve yıkama. (B) Kontrol için gerilimkarşı normalleştirilmiş yanıtların özeti, 9-phenanthrol, ve yedi DSM hücrelerinde yıkama (yedi farklı hasta-donör). (C) 9-fenanthrol duyarlı bileşen için fark akımı 9-phenanthrol (30 μM) varlığında değerleri çıkararak elde edilen kontrol gösterilenlerden (B). (B) ve (C)'deki veriler SEM için hata çubukları ile birlikte görüntülenir, * her gerilimde kontrol vs 9-phenanthrol karşılaştırması için önemi (p<0.05, eşleştirilmiş Öğrenci testi) gösterir. (A) ve (B) panelleri Hristov et al. (2016)22'den çoğaltılmış ve izin li olarak kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tür Prosedür Detayları Başvuru
Kobay Ca2+serbest orta (mM: 100 NaCl, 10 KCl, 1.2 KH2PO4, 5 MgCl2, 20 glikoz, 50 taurin, ölçülen pCa=6 (veya 1 mM) ile durulanan DSM parçaları ve sonra parçalar halinde kesilmiş ve genellikle 90-120 dakika (30 dk 4 dönem) enzim orta (mM: 130 KOH, 20 taurin, 5 pirüvat, 5 kreatin, 10 mM HEPES, methansülfonik asit ile pH 7.4, 1 mg/ml kollajenaz, 0.2 mg/ml pronase E, 1 mg/ml yağ asidi içermeyen albumin, pCa=4.2 (63 mM) veya 3.7 (200 mM) olarak ayarlanır. Tek DSM hücreleri Kraft-Bruhe (KB)-orta (mM: 85 KCl, 30 K2PO4,5 MgSO4,5 Na2ATP, 5 K-pirüuvat, 5 kreatin, 20 taurin, 5 beta-OH-butirat, 1 mg/ml yağ asidi içermeyen albumin, KOH ile pH 7.2 olarak ayarlanmış) olarak depolandı.
Alternatif yöntem: DSM adet 10 dakika boyunca durulanır Ca2+-serbest ortamda (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1.2 MgCl2,10 glikoz, 20 taurin, 5 HEPES, NaOH ile pH 7.4'e ayarlanmıştır. Daha sonra Aynı Ca2+-serbest ortamda inkümide 5 mg kollajenaz, 2 mg pronase ve 100 μM CaCl2 2x20 dk karıştırma ile tamamlanır.		 Klockner & Isenberg (1985)13,34 Klockner & Isenberg (1986)35 Schneider ve ark. (1991)10 Bonev & Isenberg (1992)9 Weidelt & Isenberg (2000)36 Moore ve ark. (2004)14
Kobay, Landrace domuzu ve insan DSM adet önceden 5 dakika ca2 +-free Krebs çözeltisi için önceden inkübe sonra parçalar halinde kesilmiş ve enzimatik Ca2 +-0.5-2 mg/ml kollajenaz tip I ve 0.1-0.5 mg/ml pronase içeren sindirilir 20-30 dakika sürekli karıştırılır 36 °C. Bazı durumlarda, sindirilmiş parçalar daha künt uçlu pipet veya verim hücreleri kadar iplik tarafından ajite edildi. İzole hücreler modifiye Krebs çözeltisinde depolandı (Klockner & Isenberg13'tetanımlanmıştır) ve normalde 3 saat içinde kullanıldı. Krebs çözeltisinin bileşimi (mM): 140 Na+6 K+, 2 Ca2+, 1.2 Mg2+, 152.4 Cl-10 glikoz, 10 HEPES, pH 7.35-7.4 Tris ile. Ca2+-free çözümü için Ca2+ ve Mg2+ Krebs çözeltisinden çıkarıldı. Inoue & Brading (1990)37 Inoue & Brading (1991)38 Nakayama & Brading (1995)39,40
Insan Ca2+-free HEPES Tyrode çözeltisine yerleştirilen DSM parçaları (mM: 105.4 NaCl, 20.0 veya 22.3 NaHCO3, 3.6 KCl, 0.9 MgCl2, 0.4 NaH2PO4, 19.5 veya 4.9 HEPES, 5.4 veya 5.5 glikoz, 4.5 veya 5.5 Na-pyruvate) ve DSM parçaları halinde kesilmiş. Bir enzim çözeltisi (Ca2+ serbest HEPES çözeltisi ile 0.7 mg/ml kollajenaz tip I, 0.7 mg/ml papain, 1 mg/ml albumin) 4°C'de ıslatılmış DSM parçaları. Şeritler daha sonra 36.5°C'de 15-30 dk ısıtıldı, yıkandı ve taze çözeltide hafifçe triturated. Hepes Tyrode çözeltisi içeren Ca2 + depolanan yalıtılmış hücreler veya deneyler için hemen kullanılır. Montgomery & Fry (1992)24 Gallegos ve Fry (1994)41 Fry ve ark. (1994)42 Sui et al. (2001)43 Wu ve ark. (2002)44
Kobay DSM PSS parçalara kesilmiş (mM: 137 NaCl, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 0.42 KH2P04, 4.17 NaHCO3, 10 glikoz, 10 HEPES, pH 7.4 NaOH ile). Aşağıdaki sindirim çözeltisinde 10 dk'ya yerleştirilen DSM parçaları (mM: 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glukoz, 2 MgCl2, ve 0.2 CaCl2) ve sonra aynı solüsyonu içeren bir şişe transfer ama 1 mg / ml kollajenaz 2, 1 mg / ml tripsin inhibitörü (bazen atlanır), 1 mg / ml yağsız sığır albumin, ~ 70 dk için 35 ° C veya ~ 60 dk 37 C. Tek DSM hücreleri kalsiyum ve enzimler olmadan aynı çözeltide pasteur pipet ile tritürasyon ile elde edildi. Triturasyondan sonra Ca2+ (1 mM) eklendi ve hücreler 4°C'de depolandı. Hücreler hep aynı gün kullanılırdı. Bonev & Nelson (1993)53,54 Heppner et al. (1997)26 Petkov ve ark. (2001)47 Shieh et al. (2001, 2007)48,49
Kobay, fare, sıçan ve insan Protokol, Ca2+serbest sindirim çözeltisinde keskin diseksiyon sonrası iki aşamalı enzimatik dissosilasyon tedavisi ni kullanır (mM: 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glikoz ve 2 MgCl2). İlk olarak, DSM parçaları 37°C'de 25-45 dakika boyunca 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml dithioerythreitol ve 1 mg/ml sığır serum albumini ayrıştırma çözeltisinde (mM: 80 monosodyum glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, ve 10 glukoz, NaOH ile pH 7.3'e ayarlanmış) ve daha sonra DSM parçaları 1-5 mg/ml kollajenaz XI (Sigma) veya kollajenaz tip 2 içeren sindirim çözeltisine aktarılır, 1 mg/ml büyükbaş serum albumini, 0 veya 1 mg/ml tripsinör ve 100 μ CaM2+, 6-30 min için. Kuluçkadan sonra, sindirilmiş doku enzimler ve Ca 2+ olmadan sindirim çözeltisi birkaç kez yıkandı ve daha sonra yavaşça tek düz kas hücreleri verim triturated. Petkov et al. (2001)50 Thorneloe & Nelson (2003)51 Thorneloe & Nelson (2004)33 Petkov & Nelson (2005)27 Hristov et al. (2008)52 Layne et al. (2010)53 Hristov et al. (2011)15 Xin et al. (2012)54 Parajuli et al. (2012)25 Malysz et al. (2013)29 Parajuli et al. (2013)31 Lee et al. (2013)55 Malysz et al. (2014)23 Smith et al. (2013)19, (2013) 20 Hristov et al. (2016)22 Lee et al. (2017)56 Yarotskyy ve ark. (2018)57

Tablo 1: Çeşitli türlerin idrar kesesilerden tek DSM hücrelerinin izole sinde kullanılan enzimatik yaklaşımların özeti.

Çözüm Türü Kompozisyon (mM içinde)
DS (Diseksiyon/Sindirim Solüsyonu) 80 Na-glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2, ve 11 glikoz, pH 7.4 (10 M NaOH ile) ayarlanır
DS-P (Papain içeren DS) 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml dithiothreitol ve 1 mg/ml sığır serum albumini içeren DS
DS-C (Kollajenaz içeren DS) 1-2 mg/ml kollajenaz tip II, 1 mg/ml sığır serum albumini, 0 veya 1 mg/ml tripsin inhibitörü ve 100-200 μM Ca2+ içeren DS çözeltisi
P (Pipet) 110 CsOH, 110 aspartik asit, 10 NaCl, 1 MgCl2,10 HEPES, 0.05 EGTA ve 30 CsCl, pH CsOH ile 7.2'ye ayarlandı ve amphotericin-B ile desteklendi (300-500 μg/ml)
E (Hücre dışı) 10 tetraethylamonnium klorür (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES ve 10 glikoz, pH NaOH veya CsOH ile 7,3-7,4 ve 0.002-3 (2-3 mM) nifedipin

Tablo 2: Delikli yama-kelepçe deneylerinde kullanılan diseksiyon/sindirim çözeltisi (DS) ve pipet ve hücre dışı çözeltilerin bileşimleri.

Discussion

Burada açıklanan prosedürler, enzimatik sindirim kullanarak tüm kalınlıkta insan üriner mesane örneklerinden canlı, taze izole DSM hücrelerinin hazırlanmasında ve amfisellerin-B delikli yama-kelepçe yaklaşımını kullanan TRPM4 kanal inhibitörü 9-phenanthrol'a duyarlı tüm hücreli katyon akımlarının kaydedilmesinde yer alan adımları açıklar. Enzimatik prosedür, burada sıralı papain-kollajenaz sindirim yöntemi olarak adlandırılan iki aşamalı ardışık maruziyete dayanır. DSM dokuları ilk olarak papain ve dithiothreitol ile tedavi edilir (bir enzim stabilizatör ajan) nominal Ca2 +-serbest durum altında, düşük Ca varlığında kollajenaz tip II tarafından ikinci adımda takip+. Düşük Ca2 + koşulları altında papain sindirim yürütmek için mantığı düz kas hücrelerinde 1980'lerin sonlarına kadar uzanır. Papain ile hazırlanan taze izole karotis arter düz kas hücreleri uzun bir şekil gösterdi, canlılık gösterdi (Trypan Mavi alımına direnç) ve kontraktil uyaranlara yanıt (yüksek Ca2 + ve histamin)65. Yıllar sonra, bu yöntem DSM hücrelerinin hazırlanmasında uygulandı (bkz. Tablo 1). Kollajenaz tip II seçimi yerine diğer türleri nispeten yüksek proteolitik aktivite ideal DSM dahil olmak üzere düz kas dokuları için uygundur ilgilidir. Gerçekten de, kollajenaz tedavisi tek başına kapsamlı enzim maruziyeti gerektiren tek DSM hücreleri verebilir (≥60 dk)53,54. Kollajenaz aktivitesi Ca2+ bağlıdır ve enzim Ca 2+-serbest koşullar altında inaktif olduğundan, DSM parçalarının optimum enzimatik sindirim Ca2 + 66varlığını gerektirir. Bizim durumumuzda, DS-C içerir 100-200 μM [Ca2+] (Tablo 2). Enzimomatik tedaviden sonra, sindirilmiş DSM parçaları dokulara bağlı herhangi bir enzimi çıkarmak için enzimveya Ca2+ olmadan soğuk DS ile birkaç kez hafifçe yıkanır. Buz gibi DS, DSM hücre bütünlüğünün korunmasına ve kalan papain veya kollajenazın enzimatik aktivitesini sınırlamaya yardımcı olur. Son adımda, enzimle tedavi edilmiş DSM parçalarının yangın cilalı Pasteur pipeti ile tritürasyonu tek bir DSM hücresi salgılar. DSM hücreleri ya hemen yama-kıskaç çalışmaları veya diğer deney türleri için bir kayıt odasına yerleştirilir ya da aynı gün daha sonra kullanılmak üzere DS'de buz üzerinde depolanır (genellikle 8 saat içinde hazırlık, ancak hücreler 24 saate kadar canlı kalır).

Tek DSM hücrelerini başarıyla elde etmek için birçok önemli husus belirledik. Bunlardan ilki insan DSM numune kaynağı kalitesiile ilgilidir. Doku bütünlüğünü en iyi şekilde korumak için açık mesane ameliyatlarından elde edilen DSM örnekleri en kısa sürede buz gibi DS'ye yerleştirilir ve soğuk bir ortamda muhafaza edilir. Özellikle, hastadan cerrahi çıkarma üzerine, mesane örneği hemen ameliyathanede tam olarak hazırlanmış bir yan masaya yerleştirilir. Tüm numunenin brüt muayenesi (genellikle radikal veya basit sistektomi sırasında elde edilir) ve açılış ını takip eder. Görsel incelemeden sonra, numunenin tümörle ilgisi olmayan uzak bir bölgesinden tam kalınlıkta idrar merdiveni numunesi çıkarılır ve hemen soğuk (~4 °C) Diseksiyon Solüsyonu (DS)(Tablo 2)içeren bir bardağa (50 veya 100 mL) yerleştirilir ve kapakla sıkıca kapatılır. Doku hasadının planlı niteliği nedeniyle, hasat yapan ameliyathane personeli ve yardımcı personel, doku çıkarma sırasında ameliyathanede bulunan malzemelerin bulunması için cerrahi vakanın başlangıcında alarma geçirilir. İşleme adımlarının rutin, tekrarlayan doğasıyla birlikte alınan bu önlemler, doku için sıcak iskemi süresini korur - çıkarmadan DS solüsyonu ile soğutulmuş kapta yerleştirilmesine kadar - 5 dakikadan daha az. Konteyner daha sonra soğuk ortamı korumak için bir buzdolabı veya buz üzerine bir soğutucu yerleştirilir ve laboratuvara (buz gibi) taşınır. Numune laboratuvara geldiğinde diseksiyon ve enzimatik dissosilasyon adımları başlar. Enzimatik dissosilasyon sonrasında belirli bir DSM örneğinin yüksek kaliteli DSM hücreleri verip veremeyeceğini tahmin etmek çok zordur, bu nedenle enzimatik dissosilasyon adımlarını devam edeceğiz. Birçok durumda, elektrofizyolojik deneylere paralel olarak grubumuz aynı DSM örneklerinden hazırlanan DSM şeritlerinde izometrik gerilim kayıtları yapmaktadır. İzometrik daralma çalışmaları (yayınlanmamış gözlemimiz) için uygun şeritler sağlayan preparatlardan genellikle yüksek kaliteli DSM hücreleri elde edebileceğimizi bulduk.

İkinci faktör farklı enzim çok variabilities ile ilgilidir. Hem papain hem de kollajenaz tip II için, bir tedarikçiden her yeni bir enzim geldiğinde, doku sindirimi için DS'deki enzim aktivitesinin farklılık gösterebileceğini gözlemledik. Biz, bu nedenle, rutin her yeni lot için enzim konsantrasyonu ve kuluçka aralıkları optimize. Lot değişkenliği katkısını en aza indirmek için, aynı lottan daha büyük miktarlarda sipariş ve enzimlerin 2 mL aliquots stok çözümleri büyük bir toplu yapmak ve kullanıma kadar ~-20 °C onları saklayın. Ancak zamanla dondurulmuş stoklar (2 haftaya kadar depolanır) enzimatik aktivitelerini kaybedebilir. Üçüncü değişken enzim sindirim tedavilerinin sıcaklığı ile ilgilidir. Hem papain hem de kollajenaz enzimatik aktivitelerısı sıcaklık bağımlılığını gösterir. Papain ve kollajenaz tip II normal vücut fizyolojisi67,68kapsayan sıcaklık aralıklarında aktivite sergilemek . Bu nedenle, DSM hücre bütünlüğünü korumak için daha yüksek sıcaklıklardan kaçınarak ~37 °C'de enzim tedavilerini sabit tutmayı hedefliyoruz. Dördüncü göz son derece uygun (mükemmel klasik düz kas özellikleri sergileyen) sağlıksız, aşırı sindirilmiş hücrelere kadar her hazırlık içinde mevcut DSM hücrelerinin kalitesinin değişkenliği ile ilgilidir. Uzun süreli enzim kuluçka aralığı hasarlı hücrelerin yüksek sayıda elde edilmesiiçin ana nedenlerinden biridir. Aşırı enzim tedavileri de iyon kanallarının protein yapılarını bozar, reseptörler, ve taşıyıcılar, olumsuz işlevselliğini etkileyen. Enzimatik olarak elde edilen, taze izole edilmiş hücrelerden elde edilen sonuçların yorumlanması bu hususu göz önünde bulundurmalıdır. Enzim sindirim koşullarının optimizasyonu son derece canlı hücrelerin yüzdesini artırmayı amaçlamaktadır. Mikrodizi analizleri gibi daha fazla sayıda canlı hücreye dayanan deneysel yaklaşımlar, tek hücreli yama-kıskaç elektrofizyolojisi veya Ca2+ görüntüleme gibi daha az hücrede başarıyla gerçekleştirilenlerden daha sağlam optimizasyonlar gerektirir. Yukarıda belirtilen faktörlerin göz önünde bulundurulması, yüksek kaliteli tek DSM hücreleri elde edilmesinde son on yılda araştırma çabalarımıza yol açmıştır.

Delikli yama-kelepçe tekniği çeyrek yüzyılı aşkın bir süredir elektrofizyolojik bir yaklaşımdır. Çeşitli yayınlar teknik hususların ayrıntılarını sağlar69,70,71,72,73. Hücre perforasyonu amphotericin-B, nystatin, gramicidin veya β-escin ile elde edilebilir (bkz.32her birine genel bakış için). Delikli yama-kelepçe kayıtlarının diğer elektrofizyolojik yaklaşımlara göre en büyük avantajı, hücre içi hücre içi ortamın - hücre içi Ca dahil2+ve sinyal molekülleri (örneğin, cAMP, PKA, fosfatlar ve fosfodiesterazlar) - korunur. Bu teknik, bu nedenle, ideal yakın fizyolojik koşullar altında tüm hücreli iyon kanal akımları ve düzenleyici mekanizmaları araştırmak için uygundur. Önemli bir uyarı hücre içi bileşiminin konvansiyonel bütün hücre ve tek kanallı ekscised-patch (iç ve dış-dış) kayıtlar gibi diğer elektrofizyolojik yöntemlerden farklı olarak tam olarak kontrol edilemeyeceğidir. Deneyimlerimize göre, üç faktör rutin olarak amphotericin-B-delikli yama-kelepçe deneylerinin başarılı deneysel sonuçlarına katkıda bulunur. Bunlardan ilki, bir kaydı denemek için seçilen DSM hücresinin kalitesidir. DSM hücreleri, hücre yüzeyinin etrafında iyi tanımlanmış bir hale ile yarı kontraktil (serpantin benzeri), yüksek kontrastlı parlak bir görünüm sergileyen ve kayıt odasının cam dibine sıkıca iliştirilebilen yüksek kontrastlı parlak bir görünüm sergilediklerinde giga-mühür oluşumu ve hücre perforasyonu nispeten kolay gerçekleşir. Başarı için ikinci ve üçüncü faktörler, sırasıyla, kaynak kalitesi ve amphotericin-B solubilization (dimetil sülfoksit / DMSO ve hücre içi pipet çözeltisi) ile ilgilidir. Kaynak ve lot çeşitleri açısından farklı tedarikçiler arasında tutarsızlıklar gözlemledik. Her gün tozdan amphotericin-B stok çözeltisi ve ardından hücre içi pipet çözeltisinde seyreltme yeni bir çözüm hazırlıyoruz. Bu adımlar geniş sonication ve girdap gerektirir. Taze yapılmış amphotericin-B içeren pipet çözeltisi ile başarılı hücre perforasyonu (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced="">+Ca2+ve insan, kobay, fare ve/veya sıçan DSM hücrelerinden seçici olmayan katyon akımları17,21,22,23,29,30,31,35,60. Burada, insan DSM hücrelerinde seçici olmayan katyon akımlarının kaydedilmesi için koşulları açıklıyoruz. 9-Phenanthrol, TRPM4 kanallarının bir engelleyici, dsm uyarılabilirlik kontrolünde bu kanalların rolünü destekleyen gerilim adım indüklenen akımlar zayıflatılmış. Bir not olarak, genellikle en az 45 dakika bir giga-mühür elde ettikten sonra ve optimum kararlı voltaj adım non-selektif katyon akımları indüklenen kayıt perforasyon başlatılması gerektirir. Voltaj rampaları voltaj-adım protokollerine alternatif olarak da kullanılabilir30,64. Burada, eski yaklaşım voltaj bağımlı inaktivasyon etkisini en aza indirir ve bir süre boyunca uyarılmış akımın ortalama sağlar, çünkü bir hiperpolarize tutma membran potansiyelinden bir voltaj-adım protokolü bir rampa protokolü yerine tercih edildi rampa nın gerilim başına tek bir veri noktası sağladığı bir gerilim-adım. İkinci nokta özellikle insan DSM hücreleri için geçerlidir, zira akımlar gerilim adımları sırasında değişken aktivite gösterirler (Şekil 5VeŞekil 6). Amphotericin-B delikli yama-kelepçe tekniği DSM hücrelerinin ve diğer hücre türlerinin özelliklerini belirlemede gerekli olmuştur ve gelecekte yeni keşifler sağlamada yardımcı olmaya devam edecektir. Ayrıca, taze izole tek DSM hücreleri başarıyla tüm hücreli K ölçmek için kullanılabilir+Cl-ve Ca2+yama-kelepçe tekniğinin konvansiyonel moduna sahip akımlar, mevcut kelepçe ile membran potansiyel kaydı ve önceki raporlarımıztarafından örneklenen tek kanallı kayıtlar23,29,35,64.

Tek hücreli yama-kıskaç yöntemlerine ek olarak, taze izole DSM hücreleri Ca2 + görüntüleme, RT-PCR/q-RT-PCR, immünositokimya, yerinde yakınlık ligasyon testleri ve genomik yaklaşımlar (örneğin, mikrodizim, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34dahil olmak üzere diğer teknik yaklaşımlar ile incelenebilir . Tek hücreli transkripsiyon belirleme yöntemleri gelişmeye ve son derece hassas olmaya devam ettikçe, bireysel DSM hücrelerinin elektriksel veya farmakolojik özelliklerini transkripsiyon/proteom profilleriile rutin ve özel olarak birbirine bağlama yı öngörüyoruz. Bu, önce bir DSM hücresinden kaydedilmesi ve ardından mRNA veya protein alınması ve ardından transkripsiyonel/proteomik analizler ile elde edilecektir. Bu tür yöntemler zaten DSM olmayan hücrelerde test edilmiş olmasına rağmen, şu anda teknik olarak zorlu, rutin olarak kabul edilecek duyarlılık eksikliği, ve birkaç seçilmiş gen ürünleri başarılı tespiti ile sınırlıdır74. Kontrol ve hastalıklı hasta donörlerinden elde edilen idrar kesesi hücrelerinde yapılan fonksiyon-moleküler profil ekspresyonu, normal DSM fonksiyonlarını, patogenezi ve etkili yeni tedavi yaklaşımlarını belirlemek için gerekli fizyolojik süreçlere dair öngörüler sağlayacaktır.

Disclosures

Hiçbiri.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH-R01DK106964 ve P20DK123971 tarafından Georgi V. Petkov'a hibeler ile desteklenmiştir. Yazarlar makalenin eleştirel değerlendirmesi için Dr Viktor Yarotskyy ve Bayan Sarah Maxwell teşekkür ederiz. Biz de MUSC ve UTHSC üroloji personeli cerrahlar için müteşekkiriz: Dr Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter ve Anthony Patterson yanı sıra MUSC ve UTHSC Üroloji sakinleri: Dr Taylor Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata insan doku toplama ile yardım için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml polystyrene round-bottom tube Falcon 352054 Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps
9-Phenanthrol Sigma-Aldrich 211281 TRPM4 channel inhibitor
Amphotericin-B Fisher BP928-250 Used for patch/cell perforation
Amphotericin-B European Pharmacopoeia Reference Standards 5 Used for patch/cell perforation
Amphotericin-B Sigma-Aldrich A9528-100MG Used for patch/cell perforation
Analog vortex mixer VWR 58816-121
Aspartic acid Sigma-Aldrich A9006 Intracellular pipette solution
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 DS
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 Extracellular solution and DS
Capillary Glass Sutter BF150-110-7.5 Capillary for preparation of pulled patch electrodes
Cesium hydroxide hydrate Sigma-Aldrich C8518 Intracellular pipette solution
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs Axon Instruments/ Molecular Devices pCLAMP-10 Commerical software and part of patch-clamp rig setup
Collagenase type 2 Worthington Biochemical Corporation LS004177 DS-C
CsCl Sigma-Aldrich 203025 Extracellular and intracellular solutions
Dental wax Miltex Dental Wax Technologies, Inc. 18058351
Digital Thermometer with Probe Fisher Scientific 15-077-32 Placed in tissue bath to monitor temperature
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Solvent
DL-Dithiothreitol (DDT) Sigma-Aldrich D9779 Reducing agents used together with Papain
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution
Flaming/Brown micropipette puller Sutter P-97 Required to pull electrodes with very fine tips
Floating foam tube rack/holder VWR Scientific 82017-634 Used for holding tubes with enzymes for temperature control
Glucose Sigma G8270
Glutamic acid (Na salt) Sigma-Aldrich G1626 DS
HEPES Sigma-Aldrich H3375 pH Buffer
KCl Fisher Scientific BP366-1 Extracellular solution
Low Noise Data Acquisition System Axon Instruments/ Molecular Devices Digidata 1440A Part of patch-clamp rig setup
Magnetic stirrer VWR 01-442-684
MgCl2 (hexahydrate) Sigma-Aldrich M2670 Extracellular and intracellular solutions
MicroForge Narishige MF-830 Used for fire-polishing electrodes
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Extracellular and intracellular solutions
NaOH Sigma-Aldrich S8045
Nifedipine Sigma-Aldrich N7634 L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives Nikon Discontinued Part of Patch-clamp rig setup
Non-metalic syringe needle, MicroFil WPI MF-34G-5 Filling of intracellular pipette solution
Papain Worthington Biochemical Corporation LS003126 DS-P
Pasteur pipette FisherBrand 13-678-20A Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces
Patch-clamp amplifier Axon Instruments/ Molecular Devices Axon Axopatch 200B Part of patch-clamp rig setup
PC computer DELL Custom configuration Part of patch-clamp rig setup
pH Meter Aspera Instruments PH700
Polyethylene tubing Intramedic 427-436 Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber
Tetraethylammonium chloride Sigma-Aldrich T2265 Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) Thermo Scientific Discontinued Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup
Tissue bath, 100 mL Radnoti 1583-101 Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps
Vinyl tubing ColePalmer 06405-3 Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath
Water circulator bath, Haake D1 L Haake Discontinued Connected to tissue bath
Weighting scale Mettler Toledo XS64
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives Carl-Zeiss Discontinued Part of patch-clamp rig setup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andersson, K. E., Arner, A. Urinary bladder contraction and relaxation: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 84 (3), 935-986 (2004).
  2. Brading, A. F., Brain, K. L. Ion channel modulators and urinary tract function. Urinary Tract. Andersson, K. E., Michel, M. C. 202, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. Part of Handbook of Experimental Pharmacology book series 375-393 (2011).
  3. Brading, A. F. Spontaneous activity of lower urinary tract smooth muscles: correlation between ion channels and tissue function. Journal of Physiology. 570, Pt 1 13-22 (2006).
  4. Brading, A. F., Heaton, J. P., Hashitani, H. A survey of commonalities relevant to function and dysfunction in pelvic and sexual organs. International Journal of Impotence Research. 20 (1), 1-16 (2008).
  5. Petkov, G. V. Role of potassium ion channels in detrusor smooth muscle function and dysfunction. Nature Reviews Urology. 9 (1), 30-40 (2012).
  6. Andersson, K. E. Treatment-resistant detrusor overactivity--underlying pharmacology and potential mechanisms. International Journal of Clinical Practice Supplement. 151, 8-16 (2006).
  7. Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 165 (2), 627-632 (2001).
  8. Kropp, B. P., et al. Characterization of cultured bladder smooth muscle cells: assessment of in vitro contractility. Journal of Urology. 162 (5), 1779-1784 (1999).
  9. Bonev, A., Isenberg, G. Arginine-vasopressin induces mode-2 gating in L-type Ca2+ channels (smooth muscle cells of the urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 420 (2), 219-222 (1992).
  10. Schneider, P., Hopp, H. H., Isenberg, G. Ca2+ influx through ATP-gated channels increments [Ca2+]i and inactivates ICa in myocytes from guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 440, 479-496 (1991).
  11. Wellner, M. C., Isenberg, G. Properties of stretch-activated channels in myocytes from the guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 466, 213-227 (1993).
  12. Wellner, M. C., Isenberg, G. Stretch-activated nonselective cation channels in urinary bladder myocytes: importance for pacemaker potentials and myogenic response. Experientia Supplementum. 66, 93-99 (1993).
  13. Klockner, U., Isenberg, G. Action potentials and net membrane currents of isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 405 (4), 329-339 (1985).
  14. Moore, E. D., et al. Organization of Ca2+ release units in excitable smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. Biophysical Journal. 87 (3), 1836-1847 (2004).
  15. Hristov, K. L., Chen, M., Kellett, W. F., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels regulate human detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (4), 903-912 (2011).
  16. Afeli, S. A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. SK but not IK channels regulate human detrusor smooth muscle spontaneous and nerve-evoked contractions. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (4), 559-568 (2012).
  17. Hristov, K. L., et al. Kv2.1 and electrically silent Kv channel subunits control excitability and contractility of guinea pig detrusor smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (2), 360 (2012).
  18. Afeli, S. A., Malysz, J., Petkov, G. V. Molecular expression and pharmacological evidence for a functional role of Kv7 channel subtypes in Guinea pig urinary bladder smooth muscle. PLoS One. 8 (9), 75875 (2013).
  19. Smith, A. C., et al. TRPM4 channel: a new player in urinary bladder smooth muscle function in rats. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 304 (7), 918-929 (2013).
  20. Smith, A. C., et al. Novel role for the transient potential receptor melastatin 4 channel in guinea pig detrusor smooth muscle physiology. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 304 (5), 467 (2013).
  21. Hristov, K. L., Smith, A. C., Parajuli, S. P., Malysz, J., Petkov, G. V. Large-conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel regulation by protein kinase C in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306 (5), 460-470 (2014).
  22. Hristov, K. L., et al. Novel regulatory mechanism in human urinary bladder: central role of transient receptor potential melastatin 4 channels in detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310 (7), 600-611 (2016).
  23. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306 (1), 45-58 (2014).
  24. Montgomery, B. S., Fry, C. H. The action potential and net membrane currents in isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 147 (1), 176-184 (1992).
  25. Parajuli, S. P., Soder, R. P., Hristov, K. L., Petkov, G. V. Pharmacological activation of small conductance calcium-activated potassium channels with naphtho[1,2-d]thiazol-2-ylamine decreases guinea pig detrusor smooth muscle excitability and contractility. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 340 (1), 114-123 (2012).
  26. Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels regulate action potential repolarization in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (1), Pt 1 110-117 (1997).
  27. Petkov, G. V., Nelson, M. T. Differential regulation of Ca2+-activated K+ channels by beta-adrenoceptors in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288 (6), 1255-1263 (2005).
  28. Herrera, G. M., Etherton, B., Nausch, B., Nelson, M. T. Negative feedback regulation of nerve-mediated contractions by KCa channels in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 289 (2), 402-409 (2005).
  29. Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 465 (7), 965-975 (2013).
  30. Provence, A., Angoli, D., Petkov, G. V. Kv7 channel pharmacological activation by the novel activator ML213: role for heteromeric Kv7.4/Kv7.5 channels in guinea pig detrusor smooth muscle function. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 364 (1), 131-144 (2018).
  31. Parajuli, S. P., et al. Control of urinary bladder smooth muscle excitability by the TRPM4 channel modulator 9-phenanthrol. Channels (Austin). 7 (6), 537-540 (2013).
  32. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques: From Beginning to Advanced Protocols. Okada, Y. 4, Springer. Tokyo, Japan. 71-83 (2012).
  33. Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Regulation of transient receptor potential melastatin 4 channel by sarcoplasmic reticulum inositol trisphosphate receptors: Role in human detrusor smooth muscle function. Channels (Austin). 11 (5), 459-466 (2017).
  34. Hristov, K. L., et al. Suppression of human detrusor smooth muscle excitability and contractility via pharmacological activation of large conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (11), 1632-1641 (2012).
  35. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Petkov, G. V. Inhibition of phosphodiesterases relaxes detrusor smooth muscle via activation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (9), 1361-1370 (2012).
  36. Hristov, K. L., et al. Neurogenic detrusor overactivity is associated with decreased expression and function of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels. PLoS One. 8 (7), 68052 (2013).
  37. Hristov, K. L., Parajuli, S. P., Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Nongenomic modulation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels by estrogen: A novel regulatory mechanism in human detrusor smooth muscle. Physiological Reports. 5 (14), (2017).
  38. Parajuli, S. P., et al. Functional link between muscarinic receptors and large-conductance Ca2+ -activated K+ channels in freshly isolated human detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 467 (4), 665-675 (2015).
  39. Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 465 (7), 965-975 (2013).
  40. Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties of a tonically active, sodium-permeable current in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 286 (6), 1246-1257 (2004).
  41. Barry, M. J., et al. The American Urological Association symptom index for benign prostatic hyperplasia. The Measurement Committee of the American Urological Association. Journal of Urology. 148 (5), 1549-1557 (1992).
  42. Klockner, U., Isenberg, G. Calcium currents of cesium loaded isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea pig). Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 405 (4), 340-348 (1985).
  43. Klockner, U., Isenberg, G. Tiapamil reduces the calcium inward current of isolated smooth muscle cells. Dependence on holding potential and pulse frequency. European Journal of Pharmacology. 127 (3), 165-171 (1986).
  44. Weidelt, T., Isenberg, G. Augmentation of SR Ca2+ release by rapamycin and FK506 causes K+-channel activation and membrane hyperpolarization in bladder smooth muscle. British Journal of Pharmacology. 129 (7), 1293-1300 (2000).
  45. Inoue, R., Brading, A. F. The properties of the ATP-induced depolarization and current in single cells isolated from the guinea-pig urinary bladder. British Journal of Pharmacology. 100 (3), 619-625 (1990).
  46. Inoue, R., Brading, A. F. Human, pig and guinea-pig bladder smooth muscle cells generate similar inward currents in response to purinoceptor activation. British Journal of Pharmacology. 103 (4), 1840-1841 (1991).
  47. Nakayama, S., Brading, A. F. Possible contribution of long open state to noninactivating Ca2+ current in detrusor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 269 (1), Pt 1 48-54 (1995).
  48. Nakayama, S., Brading, A. F. Interaction of Ca2+ agonist and depolarization on Ca2+ channel current in guinea pig detrusor cells. Journal of General Physiology. 106 (6), 1211-1224 (1995).
  49. Gallegos, C. R., Fry, C. H. Alterations to the electrophysiology of isolated human detrusor smooth muscle cells in bladder disease. Journal of Urology. 151 (3), 754-758 (1994).
  50. JournalFry, C. H., Gallegos, C. R., Montgomery, B. S. The actions of extracellular H+ on the electrophysiological properties of isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Physiology. 480, Pt 1 71-80 (1994).
  51. Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU International Journal. 92 (4), 476 (2003).
  52. Wu, C., Sui, G., Fry, C. H. The role of the L-type Ca2+ channel in refilling functional intracellular Ca2+ stores in guinea-pig detrusor smooth muscle. Journal of Physiology. 538, Pt 2 357-369 (2002).
  53. Bonev, A. D., Nelson, M. T. Muscarinic inhibition of ATP-sensitive K+ channels by protein kinase C in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 265 (6), Pt 1 1723-1728 (1993).
  54. Bonev, A. D., Nelson, M. T. ATP-sensitive potassium channels in smooth muscle cells from guinea pig urinary bladder. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 264 (5), 1190-1200 (1993).
  55. Petkov, G. V., Heppner, T. J., Bonev, A. D., Herrera, G. M., Nelson, M. T. Low levels of KATP channel activation decrease excitability and contractility of urinary bladder. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 280 (5), 1427-1433 (2001).
  56. Shieh, C. C., et al. Functional implication of spare ATP-sensitive K+ channels in bladder smooth muscle cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 296 (3), 669-675 (2001).
  57. Shieh, C. C., et al. Characterization of a novel ATP-sensitive K+ channel opener, A-251179, on urinary bladder relaxation and cystometric parameters. British Journal of Pharmacology. 151 (4), 467-475 (2007).
  58. Petkov, G. V., et al. Beta1-subunit of the Ca2+-activated K+ channel regulates contractile activity of mouse urinary bladder smooth muscle. Journal of Physiology. 537, Pt 2 443-452 (2001).
  59. Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties and molecular basis of the mouse urinary bladder voltage-gated K+ current. Journal of Physiology. 549, Pt 1 65-74 (2003).
  60. Hristov, K. L., et al. Stimulation of beta3-adrenoceptors relaxes rat urinary bladder smooth muscle via activation of the large-conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (5), 1344-1353 (2008).
  61. Layne, J. J., Nausch, B., Olesen, S. P., Nelson, M. T. BK channel activation by NS11021 decreases excitability and contractility of urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 298 (2), 378-384 (2010).
  62. Lee, H., Koh, B. H., Peri, L. E., Sanders, K. M., Koh, S. D. Functional expression of SK channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Journal of Physiology. 591 (2), 503-513 (2013).
  63. Lee, H., et al. Premature contractions of the bladder are suppressed by interactions between TRPV4 and SK3 channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Scientific Reports. 7 (1), 12245 (2017).
  64. Yarotskyy, V., Malysz, J., Petkov, G. V. Properties of single channel and whole-cell Cl- currents in guinea pig detrusor smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 316 (5), 698-710 (2019).
  65. Driska, S. P., Porter, R. Isolation of smooth muscle cells from swine carotid artery by digestion with papain. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 251 (3), Pt 1 474-481 (1986).
  66. Seltzer, J. L., Welgus, H. G., Jeffrey, J. J., Eisen, A. Z. The function of Ca2+ in the action of mammalian collagenases. Archives of Biochemistry and Biophysics. 173 (1), 355-361 (1976).
  67. Skelton, G. S. Papaya proteinases. I. Temperature-and pH-stability curves. Enzymologia. 35 (5), 270-274 (1968).
  68. Petrova, D., Derekova, A., Vlahov, S. Purification and properties of individual collagenases from Streptomyces sp. strain 3B. Folia Microbiologica (Praha). 51 (2), 93-98 (2006).
  69. Sharpe, E. J., St Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), (2016).
  70. Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring arterial smooth muscle Kv7 potassium channel function using patch clamp electrophysiology and pressure myography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4263 (2012).
  71. Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor. Journal of Visualized Experiments. (101), e52652 (2015).
  72. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. Journal of Neuroscience Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  73. Knutson, K., et al. Whole cell electrophysiology of primary cultured murine enterochromaffin cells. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).
  74. Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. Journal of Visualized Experiments. (136), (2018).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 155 idrar kesesi düz kas detrusor hücre izolasyonu enzimatik insan yama-kelepçe amphotericin-B
9-Fenanthrol Duyarlı Katyon Akımlarının Karakterizasyonu İçin Yeni İzole Edilmiş İnsan Detrusor Düz Kas Hücrelerinin Hazırlanması ve Kullanımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malysz, J., Rovner, E. S., Wake, R., … More

Malysz, J., Rovner, E. S., Wake, R., Petkov, G. V. Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents. J. Vis. Exp. (155), e59884, doi:10.3791/59884 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter