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Biochemistry

Kinase अवरोधक स्क्रीनिंग में स्वयं इकट्ठे मानव प्रोटीन Microarrays

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59886
Automatic Translation
1,2, 1
1Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Biodesign Institute, Arizona State University, 2Department of Pediatrics, and Biochemistry/Molecular Biology, College of Medicine, Pennsylvania State University

Summary

kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए स्वयं इकट्ठे मानव प्रोटीन microarrays की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.

Abstract

kinase inhibitors की स्क्रीनिंग एक दवा के गुणों को बेहतर समझने के लिए और नैदानिक प्रभाव के साथ संभावित नए लक्ष्यों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसी स्क्रीनिंग को पूरा करने के लिए कई तरीकों की सूचना दी गई है। हालांकि, प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं (उदाहरण के लिए, केवल एटीपी एनालॉग की स्क्रीनिंग, शुद्ध kinase डोमेन का उपयोग करने के लिए प्रतिबंध, एक समय में कुछ kinases से अधिक परीक्षण के साथ जुड़े महत्वपूर्ण लागत, और प्रोटीन kinases स्क्रीनिंग में लचीलेपन की कमी के साथ उपन्यास उत्परिवर्तन). यहाँ, एक नया प्रोटोकॉल है कि इन सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने और kinase inhibitors के निष्पक्ष स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रस्तुत किया है. इस विधि की एक ताकत कई प्रोटीन भर में kinase inhibitors की गतिविधि की तुलना करने की क्षमता है, या तो अलग kinases या एक ही kinase के विभिन्न वेरिएंट के बीच. एक मानव आधारित इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रणाली (IVTT) द्वारा प्रोटीन kinases की अभिव्यक्ति के माध्यम से उत्पन्न स्वयं इकट्ठे प्रोटीन microarrays कार्यरत हैं. microarray पर प्रदर्शित प्रोटीन सक्रिय हैं, kinase inhibitors के प्रभाव की माप के लिए अनुमति देता है. निम्न कार्यविधि प्रोटोकॉल चरणों का विस्तार से वर्णन करती है, माइक्रोरेरे जनरेशन और स्क्रीनिंग से डेटा विश्लेषण तक.

Introduction

प्रोटीन kinases अपने लक्ष्य के फॉस्फोरिलेशन के लिए जिम्मेदार हैं और जटिल आणविक रास्ते है कि कई सेलुलर कार्यों को नियंत्रित (यानी, सेल प्रसार, भेदभाव, सेल मौत और अस्तित्व) को नियंत्रित मोड्यूल कर सकते हैं। kinase गतिविधि के विनियमन 400 से अधिक रोगों के साथ जुड़ा हुआ है, kinase inhibitors कैंसर, हृदय और तंत्रिका संबंधी विकारों के साथ ही भड़काऊ सहित कई रोगों के उपचार के लिए उपलब्ध दवाओं के मुख्य वर्गों में से एक बना और ऑटोम्यून्यून रोग1,2,3.

सटीक चिकित्सा के आगमन के साथ, नए उपचार की पहचान, विशेष रूप से kinase inhibitors, महान अपील दवा और चिकित्सकीय है. काइनेज इनहिबिटर ोंके डे नोवो डिजाइन और मौजूदा एफडीए-अनुमोदित औषधियों के लिए नए लक्ष्यों की पहचान सहित काइनेज/किनेस इनहिबिटरों के संभावित नए जोड़े की पहचान के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। बाद विशेष रूप से आकर्षक है, के बाद से समय और पैसे क्लीनिक में इन दवाओं को लागू करने के लिए आवश्यक काफी पिछले नैदानिक परीक्षण डेटा की उपलब्धता के कारण कम कर रहे हैं. एक kinase अवरोध करनेवाला के repurposing का एक विहित उदाहरण imatinib है, शुरू में बीसीआर-Abl के निषेध के माध्यम से पुरानी myelogenous ल्यूकेमिया (सीएमएल) के उपचार के लिए डिजाइन, जो भी सफलतापूर्वक सी-किट के उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अधिक-व्यक्त जठरांत्र stromal ट्यूमर (GISTs)4,5,6,7.

काइनेज अवरोधकों की स्क्रीनिंग बाध्यकारी परख या एंजाइमी आधारित परख में की जा सकती है। परख के प्रथम श्रेणी प्रोटीन दवा बातचीत पर केंद्रित है और इस तरह के ligation साइट और आत्मीयता के रूप में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. चूंकि इन परख के समय kinase की गतिविधि अज्ञात है, बातचीत के एक नंबर याद किया जा सकता है या गलत प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तन के कारण पहचान की. दूसरी ओर, एंजाइमी आधारित परख प्रोटीन kinases सक्रिय होने की आवश्यकता है और एंजाइम गतिविधि पर अवरोध करनेवाला के प्रभाव के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं, तथापि, स्क्रीनिंग के इस प्रकार आम तौर पर अधिक समय लगता है और महंगा है. वर्तमान में, परख के दोनों प्रकार के कई स्रोतों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. वे कुछ सीमाओं के साथ kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए एक विश्वसनीय विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं, सहित: मैं) तरीकों के अधिकांश कई kinases व्यक्तिगत रूप से परीक्षण शामिल है, जो प्रोटीन का एक बड़ा सेट की स्क्रीनिंग महंगा कर सकते हैं; II) परीक्षण किया जा करने के लिए kinases के सेट preselected, जंगली प्रकार kinases और कुछ kinases के कई प्रसिद्ध उत्परिवर्तित संस्करणों की एक सूची तक ही सीमित है, कई नए उत्परिवर्तित isoforms के परीक्षण में बाधा.

इस संदर्भ में, प्रोटीन microarrays व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तकनीकों द्वारा प्रस्तुत सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने में सक्षम एक शक्तिशाली मंच हैं. यह ब्याज के किसी भी अनुक्रम के पूर्ण लंबाई, सक्रिय प्रोटीन का उपयोग कर उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग में एंजाइमी आधारित परख प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त है। microarrays NAPPA (न्यूक्लिक एसिड प्रोग्राम प्रोटीन सरणी) की तरह एक आत्म इकट्ठे दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है, जिसमें प्रोटीन सिर्फ परख के लिए समय में व्यक्त कर रहे हैं, संभावना है कि सरणी पर प्रदर्शित उन वास्तव में सक्रिय हैं बढ़ रही है. NAPPA पर प्रदर्शित प्रोटीन प्राकृतिक तह और गतिविधि की संभावना में सुधार करने के क्रम में मानव व्युत्पन्न राइबोसोम और chaperone प्रोटीन का उपयोग कर उत्पादन कर रहे हैं.

प्रोटीन शुरू में एक कब्जा टैग के साथ जुड़े ब्याज के जीन के लिए कोडिंग cDNAs मुद्रण द्वारा क्रमादेशित रहे हैं, एक कब्जा एजेंट के साथ, microarray सतह पर. प्रोटीन तो एक इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद (IVTT) प्रणाली का उपयोग कर microarrays पर उत्पादित कर रहे हैं, और ताजा व्यक्त प्रोटीन कब्जा एजेंट द्वारा microarray सतह पर स्थिर कर रहे हैं. व्यक्त एनपीए सरणियों का उपयोग सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीनों के अध्ययन के लिए एक निष्पक्ष, उच्च थ्रूपुट तरीके से किया जा सकताहै 8,9.

पहले, यह दिखाया गया था कि NAPPA सरणियों पर प्रदर्शित प्रोटीन ठीक से मोड़ रहे हैं ज्ञात भागीदारों के साथ बातचीत करने के लिए10; इसके अलावा, उनकी एंजाइमी गतिविधि पहली बार 2018 में शोषण किया गया था, जब यह दिखाया गया था कि प्रोटीन kinases microarray autophosphorylate11पर प्रदर्शित . आज तक, नेपा पद्धति का उपयोग कई विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए किया गया है , जिनमें बायोमार्कर खोज12,13,14,15,16,17, प्रोटीन प्रोटीन बातचीत10,18, सब्सट्रेट पहचान19, और दवा स्क्रीनिंग11. इसका लचीलापन मंच की प्रमुख विशेषताओं में से एक है जो प्रत्येक आवेदन के लिए अनुकूलन की अनुमति देता है।

यहाँ, स्वयं इकट्ठे NAPPA सरणियों में tyrosine kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. मंच सक्रिय मानव प्रोटीन kinases के प्रदर्शन के लिए और प्रोटीन kinase गतिविधि के विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, कम पृष्ठभूमि और उच्च गतिशील रेंज के साथ. kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए NAPPA का उपयोग करने के लिए लागू संशोधनों में शामिल हैं: मैं) मुद्रण रसायन विज्ञान में परिवर्तन, द्वितीय) kinase अवरोधक स्क्रीनिंग से पहले प्रोटीन microarray के de-फॉस्फोरिलेशन, और III) का पता लगाने का अनुकूलन सरणी पर फॉस्फोरीयुक्त प्रोटीन. यह प्रोटोकॉल अपनी तरह का पहला प्रोटोकॉल है और एनपीए माइक्रोरेरेसिस में काइनाज अध्ययन के बारे में अद्वितीय जानकारी प्रदान करता है।

Protocol

1. आम बफ़र्स और समाधान का इस्तेमाल किया जा करने के लिए

  1. टीबी माध्यम तैयार करें: भयानक शोरबा (24 g/L खमीर निकालने; 20 g/L tryptone; 4 mL/L ग्लिसरॉल; 0.017 M KH2PO4; और 0.072 M K2HPO4) . 0.017 एम केएच2पीओ4 और 0.072 एम के2एचपीओ4 समाधान एक 10x फॉस्फेट बफर के रूप में खरीदा जा सकता है (0.17 एम KH2पीओ4 और 0.72 एम के2एचपीओ4) .
  2. LB माध्यम तैयार करें: Luria-Bertani (5 g/L खमीर निकालने; 10 g/L tryptone; और 10 g/L NaCl). 5 M NaOH के साथ 7.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
  3. 1x टीबीएस तैयार करें: Tris-buffered नमकीन (टीबीएस: 50 एमएम Tris-Cl, पीएच ] 7.5; 150 एमएम NaCl).
  4. तैयार 1x TBST: टीबीएस 0.1% ट्वीन 20 के साथ पूरक.

2. डीएनए की तैयारी

नोट: NAPPA सरणियों के लिए उपयोग डीएनए अत्यधिक शुद्ध होना चाहिए; इसलिए, वाणिज्यिक डीएनए मिनी preps की सिफारिश नहीं कर रहे हैं. वर्तमान में, डीएनए तैयार करने के लिए दो प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है: घर में उच्च-थ्रूपुट मिनी-प्री (यहाँ वर्णित) या वाणिज्यिक मिडी- या मैक्सी-प्रीप। घर में मिनी तैयारी प्रोटोकॉल के औसत थ्रूपुट प्रति व्यक्ति 1,500 नमूने एक दिन है.

  1. घर में उच्च थ्रूपुट मिनी-प्री के लिए जीवाणु विकास
    1. LB/Agar omni प्लेट तैयार करें। प्रत्येक एक अच्छी थाली में 30-40 एमएल एलबी agar (1.5% बैक्टीरियोलॉजिकल agar को सकारात्मक क्लोन के चयन के लिए एंटीबायोटिक के साथ पूरक एलबी मीडिया में डालदें)।
    2. LB/agar प्लेट पर स्पॉट ग्लिसरॉल स्टॉक। LB मीडिया में Dilute ग्लिसरॉल स्टॉक (1:300, आमतौर पर 2 $L में 600 LB). 10 मिनट के लिए हिलाओ. LB/agar प्लेट पर पतला स्टॉक के 3 डिग्री एल स्पॉट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, ऊपर से नीचे, रात भर।
    3. टीका संस्कृतियों. 96-पिन डिवाइस है कि 80% इथेनॉल और लौ में बाँझ था का उपयोग करना, एक गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में agar प्लेट से संस्कृति inoculate टीबी मध्यम एंटीबायोटिक के साथ पूरक प्रति अच्छी तरह से 1.5 एमएल के साथ.
    4. इनक्यूबेट संस्कृतियों. ब्लॉक को गैस पारगम्य मुहर के साथ कवर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 22-24 ज के लिए इनक्यूबेट करें, शेकर के आधार पर 300-800 आरपीएम।
      नोट: 800 आरपीएम पर सेट शेकर्स इस ऊष्मायन के लिए इष्टतम हैं। धीमी गति शेकर का उपयोग कम घने संस्कृतियों और कम डीएनए शुद्धि पैदावार में परिणाम हो सकता है.
    5. गोली संस्कृतियों. 30 मिनट के लिए 3,800 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ब्लॉक। सुपरनेंट को त्यागें।
  2. घर में उच्च-थ्रूपुट मिनी-प्रीप
    नोट: मल्टी चैनल pipettors या स्वत: dispensers घर में उच्च throughput मिनी तैयारी प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि एक स्वचालित मशीन का उपयोग कर, उपयोग करने से पहले और समाधान के बीच में प्रणाली को साफ करने के लिए सुनिश्चित करें.
    1. मिनी तैयारी के दौरान इस्तेमाल सभी समाधान तैयार करें:
      1. समाधान 1: TE resuspension बफर (50 mM Tris, pH ] 8.0; 10 m EDTA, pH ] 8.0; 0.1 mg/mL RNAse). 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      2. समाधान तैयार करें 2: NaOH/SDS lysis बफर (0.2 M NaOH; 1% एसडीएस).। बेहतर परिणामों के लिए, एक ताजा बनाया समाधान इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
      3. समाधान 3 तैयार करें: KOAC तटस्थीकरण बफ़र (2.8 M KOAC). हिमनदीय एसिटिक अम्ल के साथ 5-1 के समाधान का चह समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      4. समाधान N2 तैयार करें: साम्य बफर (100 एमएम ट्रिस; 900 एमएम केसीएल; 15% EtOH; 0.15% ट्राइटन एक्स-100)। फॉस्फोरिक अम्ल के साथ 6ण्3 के विलयन का चह समायोजित की जाइए।
      5. तैयारी समाधान N3: बैश बफर (100 mM Tris; 1.15 M KCl; 15% EtOH). फॉस्फोरिक अम्ल के साथ 6ण्3 के विलयन का चह समायोजित की जाइए।
      6. हल N5 तैयार करें: इल्यूशन बफर (100 एमएम ट्रिस; 1 M KCl; 15% EtOH).। फॉस्फोरिक अम्ल के साथ 8-5 विलयन का चह समायोजित की जाइए।
        नोट: anion विनिमय के दौरान डीएनए बंधन, धोने, और elution के सफल नियंत्रण बफर KCl एकाग्रता और पीएच मूल्यों पर अत्यधिक निर्भर है. सावधान बफर घटक माप और पीएच समायोजन आवश्यक हैं. वर्णित माप से छोटे विचलन पैदावार की महत्वपूर्ण हानि में परिणाम कर सकते हैं.
    2. फिर से निलंबित गोली. समाधान 1 के 200 $L जोड़ें और आरटी पर 5 मिनट के लिए 2,000 आरपीएम पर हिलाएं। गोली का पूरा पुन: निलंबन सफल lysis के लिए आवश्यक है। यदि आवश्यक हो तो ब्लॉक भंवर.
    3. Lyse बैक्टीरिया. समाधान 2 के 200 $L जोड़ें, एक एल्यूमीनियम सील और उलटा 5x के साथ थाली सील. सावधानी से समाधान 2 इसके अलावा के आरंभ से इस चरण को समय दें। 5 मिनट से अधिक नहीं है।
    4. समाधान को निष्प्रभावी करदें. समाधान 3 के 200 $L जोड़ें, एक एल्यूमीनियम सील और उलटा 5x के साथ थाली सील. सील lysis/neutralization बफ़र्स के कारण ढीला हो सकता है, इसलिए व्युत्क्रमन करते समय सावधानी बरतें। एक आंशिक उलटा, जिसमें समाधान सील को कभी नहीं छूता है, नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए सिफारिश की जाती है।
    5. स्पष्ट lysate. 30 मिनट के लिए 3,800 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. lysate पेलेटिंग सेंट्रीफ्यूगेशन चरण के दौरान anion विनिमय राल घोल तैयार करें। एक 1 एल बोतल का उपयोग करना, यह anion विनिमय राल के साथ भरने जब तक यह 300 एमएल निशान तक पहुँच जाता है, तो समाधान N2 900 एमएल तक जोड़ें.
      चेतावनी: यह कदम हुड में सिलिका इनहेलेशन के खिलाफ की रक्षा के लिए किया जाना चाहिए।
    7. anion विनिमय राल प्लेटें तैयार करें. एक अपशिष्ट संग्रह पोत के रूप में कार्य करने के लिए एक गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक के शीर्ष पर फिल्टर प्लेटें ढेर। यह सजातीय है जब तक anion विनिमय घोल मिक्स, तो एक गिलास गर्त में डालना. व्यापक-बोर P1000 सुझावों का उपयोग करना, फिल्टर प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से घोल के 450 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण।
    8. सेंट्रीफ्यूज स्टैक्ड प्लेट्स (रेसिन प्लेट/गहरी अच्छी प्लेट) धीमी त्वरण पर 130 x ग्राम पर 5 मिनट और RT. प्रवाह को छोड़ दें।
    9. राल प्लेट / गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक ढेर करने के लिए lysate supernatant स्थानांतरण। धीमी गति से रैंप-अप गति के साथ 30 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए खड़ी प्लेटों स्पिन।
    10. स्तंभ को धोएं. प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान N3 (धोने बफर) के 400 $L जोड़ें. धोने बफर को दूर करने के लिए वैक्यूम कई गुना करने के लिए राल प्लेट स्थानांतरण। धोने के कदम 3x दोहराएँ. पिछले धोने पर, सुनिश्चित करें कि सभी कुओं ठीक से खाली कर रहे हैं. किसी भी अवशिष्ट बफर को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर स्टैक प्लेटस्पिन करें।
    11. एल्यूट डीएनए. राल प्लेट को एक साफ 800 डिग्री सेल्सियस संग्रह प्लेट पर रखें। प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान N5 के 300 $L जोड़ें. यह 10 मिनट के लिए आर टी पर बैठते हैं, तो धीमी गति से रैंप-अप गति के साथ 20 x g पर 5 मिनट के लिए खड़ी प्लेटों स्पिन। 233 x gपर 1 मिनट के लिए खड़ी प्लेटें स्पिन .
    12. आगे का उपयोग करें या डीएनए वर्षा के लिए सीधे आगे बढ़ने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए और स्टोर प्लेटों की मात्रा।
      नोट: प्रति नमूना डीएनए के 30 डिग्री ग्राम की एक न्यूनतम आवश्यक है. यदि डीएनए उपज कम है, यह डीएनए मिनी तैयारी दोहराने के लिए सिफारिश की है, या वैकल्पिक रूप से वर्षा कदम के दौरान दो प्लेटें गठबंधन (अनुभाग 2.3).
  3. डीएनए वर्षण
    1. प्लेटों बाहर Thaw, डीएनए समाधान homogenize करने के लिए भंवर, और स्पिन 230 x ग्राम के लिए 30 s के लिए अच्छी तरह से नीचे में सभी समाधान इकट्ठा करने के लिए.
    2. प्रत्येक कुएं में 3 एम नाओएसी के 40 डिग्री सेल्सियस और आइसोप्रोपेनोल के 240 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। एक एल्यूमीनियम सील के साथ थाली कवर और 3x उलटा द्वारा मिश्रण.
    3. 30 मिनट के लिए 3,800 x g और 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें। ध्यान से supernatant त्याग दें.
      नोट: दो प्लेटों गठबंधन करने के लिए, पहली प्लेट से गोली में दूसरी प्लेट से डीएनए हस्तांतरण और चरणों को दोहराने 2.3.2-2.3.3.
    4. डीएनए को धोकर वेग दें। प्रत्येक अच्छी तरह से 80% इथेनॉल के 400 $L जोड़ें. एल्यूमीनियम सील के साथ सील प्लेटें और 30 मिनट सेंट्रीफ्यूज के लिए 1,000 आरपीएम पर हिला 3,800 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर। महादलित को त्याग दें।
    5. डीएनए छर्रों सूखी. प्लेटों को कागज तौलिए पर एक कोण पर ऊपर-नीचे रखें और उन्हें 1-2 ज के लिए सूखने दें, जब तक कि कुएं के नीचे कोई अल्कोहल मौजूद न हो। सील और 2 मिनट के लिए 2 30 x ग्राम पर अपकेंद्रण किसी भी छर्रों नीचे लाने के लिए.
    6. एक बार प्लेटें सूखी हैं, या तो एल्यूमीनियम सील के साथ सील और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज या डीएनए (चरण 4.1) को फिर से निलंबित करने के लिए जारी है।

3. एमिनोसिलेन स्लाइड कोटिंग

  1. धातु रैक में कांच स्लाइड प्लेस. कोई खरोंच या खामियों मौजूद हैं आश्वासन देने के लिए प्रत्येक स्लाइड का निरीक्षण नेत्रहीन।
  2. कोटिंग समाधान में स्लाइड डूब (2% aminosilane एएजेंट एसीटोन में) 15 मिनट के लिए जबकि कमाल. Aminosilane समाधान 30 स्लाइड के दो रैक कोट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इससे पहले कि इसे खारिज करने की जरूरत है.
  3. कदम कुल्ला. एसीटोन धोने (99% एसीटोन) में स्लाइड रैक डूब, आगे और पीछे हिला, तो ऊपर और नीचे जल्दी से 5x. बंद ड्रिप करने के लिए एक कोने के लिए झुकाव, तो Ultrapure पानी में डूब और जल्दी से 5x नीचे। बंद ड्रिप करने के लिए झुकाव, तो नैपकिन पर जगह है।
    नोट: एसीटोन धोने दो बार इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि ultrapure पानी हर बार बदला जाना चाहिए।
  4. सूखी स्लाइड दबाव हवा का उपयोग कर, के बारे में 3 मिनट के लिए सभी कोणों से उन पर उड़ाने जब तक सभी पानी की बूंदों को हटा दिया गया है. आरटी पर लेपित स्लाइड को एक कसकर सील बॉक्स के अंदर धातु के रैक में स्टोर करें।

4. सरणी नमूना तैयारी

  1. घर में मिनी तैयारी से डीएनए गोली resuspend (कदम 2.3.6) ultrapure पानी के 20 डिग्री एल में और 2 एच के लिए 1,000 आरपीएम पर हिला. मिडी/अधिकतम प्रस्तुत डीएनए के लिए, प्रत्येक नमूने को 1.5 ग्राम/जेडएल की अंतिम सांद्रता में पतला कर दें और 20 डिग्री सेल्सियस को 800 डिग्री एल संग्रह प्लेट में स्थानांतरित कर दें।
  2. मुद्रण मिश्रण तैयार करें. एक 96 अच्छी प्लेट के लिए, 1 एमएल प्रिंटिंग मिश्रण तैयार करें [237.5 ]L अल्ट्राप्यूर पानी; 500 डिग्री पॉली-लाइसिन (0.01%); 187.5 [L के बीएस 3 (बिस-सल्फोसिकिनिमिडिल, 50 मिलीग्राम/एमएल डी एम एस ओ में); और 75 डिग्री पॉलीक्लोनल एंटी-रैबिट एंटीबॉडी के।
    नोट: वर्षा से बचने के लिए निर्दिष्ट क्रम में रसायनों को जोड़ा जाना चाहिए।
  3. प्रत्येक नमूना करने के लिए मुद्रण मिश्रण के 10 डिग्री एल जोड़ें, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सील प्लेटें, और 1,000 आरपीएम पर 90 मिनट के लिए आरटी पर हिला. प्लेटों को रात भर ($16 ज) को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. मुद्रण के दिन, संक्षेप में भंवर और प्लेटों स्पिन. प्रत्येक नमूने के 28 डिग्री सेल्सियस को 384 सरणी प्लेट में स्थानांतरित करें. इस हस्तांतरण स्वचालन या एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग किया जा सकता है. यह 384 सरणी प्लेट में नमूनों की स्थिति का ट्रैक रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
  5. किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए प्लेट को संक्षेप में स्पिन करें। पन्नी के साथ प्लेटों को सील करें।

5. NAPPA सरणियों की पीढ़ी: microarray मुद्रण

नोट: सभी मुद्रण शर्तों उपकरण और सामग्रीकी तालिका में सूचीबद्ध साधन के लिए अनुकूलित किया गया. यदि किसी भिन्न सरणी का उपयोग कर रहे हैं, तो आगे ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है.

  1. आरेयर साफ करें। शुरू करने से पहले, सभी अपशिष्ट टैंक खाली करें और जरूरत पड़ने पर जलाशयों को अल्ट्राप्योर पानी या 80% इथेनॉल के साथ फिर से भरें। लिंट-मुक्त पोंछे और अल्ट्रापुरे पानी के साथ एक-एक करके साफ पिन। लिंट मुक्त पोंछे के साथ पिन सूखी और ध्यान से उन्हें वापस arrayer सिर में जगह है.
  2. Arrayer सेट अप: मुद्रण विनिर्देशों [प्रति स्याही टिकटों की अधिकतम संख्या: 1; प्रति स्थान टिकटों की संख्या: 1; बहु-स्टाम्प समय: -; स्टाम्प समय (ms): 0 ms; इंकिंग समय (ms): 0 ms; प्रिंट गहराई समायोजन: 90 microns; स्पर्श-offs की संख्या: 0]. नसबंदी प्रोटोकॉल: सुखाने के समय के 0 एमएस और प्रतीक्षा समय के 500 एमएस के साथ 2,000 एमएस के लिए अल्ट्रापुरे पानी धोने; इन चरणों को दोहराएँ 6x; सुखाने के समय के 1,200 एमएस और प्रतीक्षा समय के 500 एमएस के साथ 2,000 एमएस के लिए 80% इथेनॉल के साथ धोने के बाद; इन चरणों को दोहराएँ 6x.
  3. स्लाइड डिजाइन: वांछित arraying पैटर्न के साथ arrayer की स्थापना की. डिजाइन को कई कारकों को ध्यान में रखना चाहिए [यानी, प्रत्येक नमूना, स्थान और नियंत्रण सुविधाओं की संख्या, सरणी लेआउट (एक ब्लॉक, कई समान ब्लॉक), मुद्रित होने वाली सरणियों की संख्या, रन की लंबाई, आदि के लिए प्रतिकृतियों की संख्या।
  4. एरिनोसिलेन लेपित स्लाइड (चरण 3.4) को अर्यर डेक पर रखें। यह देखने के लिए जांचें कि वैक्यूम सभी स्लाइड्स को सुरक्षित रूप से रख रहा है या नहीं। humidifier शुरू (यह 60% पर सेट किया जाना चाहिए).
  5. 384 अच्छी तरह से प्लेट arrayer डेक पर रखें. प्रोग्राम प्रारंभ करें।
  6. माइक्रोरेरेको लेबल। मुद्रण पूर्ण होने पर, प्रत्येक स्लाइड के निचले भाग (गैर-मुद्रित) ओर स्लाइड लेबल रखें. संख्यात्मक क्रम में डेक पर स्लाइड मुद्रण क्रम बनाए रखें।
  7. आरटी पर मुद्रित सरणियों को एक सिलिका पैकेट के साथ एक कसकर सील बॉक्स के अंदर एक धातु रैक में स्टोर करें। एक शुष्क वातावरण में रखा स्लाइड एक वर्ष के लिए एक शेल्फ जीवन है.
  8. (वैकल्पिक): 90 स्लाइड्स का दूसरा बैच एक ही नमूने का उपयोग कर मुद्रित किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, प्लेट की छपाई के रूप में जल्द ही arrayer डेक से 384 अच्छी तरह से प्लेट निकालें। प्लेट को सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। arrays के पहले बैच पूरी तरह से किया जाता है के बाद, उन्हें डेक से हटा दें, नए aminosilane लेपित स्लाइड जगह है और एक नया रन शुरू करते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक 384 अच्छी तरह से प्लेट इसके उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए आरटी पर है. यदि प्रति नमूना चार से अधिक प्रतिकृतियां स्लाइड्स के एक बैच में मुद्रित होते हैं, तो यह 384 अच्छी तरह से प्लेटें दो प्लेटों में विभाजित करने के लिए सिफारिश की है कि अनुरेखक डेक पर खर्च किए गए समय की मात्रा को कम करके नमूना वाष्पीकरण कम करने के लिए.
    नोट: दूसरे रन की शुरुआत से पहले सभी जलाशयों की जाँच करें.

6. NAPPA स्लाइड पर डीएनए की जांच

  1. स्लाइड्स ब्लॉक करें. एक पिपेट बॉक्स में स्लाइड प्लेस और बफर अवरुद्ध के 30 एमएल जोड़ें. एक कमाल शेकर पर 1 एच के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
  2. स्लाइड दाग. अवरुद्ध समाधान को छोड़ दें और बफर को अवरुद्ध करने के 20 एमएल और फ्लोरोसेंट डीएनए-इंटरकेलेटिंग डाई के 33 डिग्री एल जोड़ें। आंदोलन के साथ 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट। फिर, जल्दी से ultrapure पानी के साथ स्लाइड कुल्ला और दबाव हवा के साथ सूखी. स्कैनिंग (अनुभाग 11) के साथ आगे बढ़ें.

7. NAPPA स्लाइड की अभिव्यक्ति

  1. 1 ज के लिए RT पर एक रॉकिंग शेकर पर बफर ब्लॉक के साथ स्लाइड ब्लॉक. चार स्लाइड के लिए एक पिपेट बॉक्स में लगभग 30 एमएल का उपयोग करें।
  2. अल्ट्राप्योर पानी के साथ स्लाइड कुल्ला और फ़िल्टर्ड संपीड़ित हवा के साथ सूखी। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक स्लाइड पर सीलिंग गैस्केट लागू करें।
  3. IVTT मिश्रण जोड़ें. प्रत्येक स्लाइड IVTT मिश्रण के 150 $L की आवश्यकता होगी. डीपीसी के पानी के 33 डिग्री सेल्सियस में हेला lysate के 82.5 $L और सहायक प्रोटीन के 16.5 $L और प्रतिक्रिया मिश्रण के 33 यूएल के साथ पूरक। गैर लेबल या गैर-जाति अंत से IVTT मिश्रण जोड़ें. यह प्रवेश अंत में अस्थायी रूप से मोती अगर धीरे धीरे (यह स्वीकार्य है) में मिश्रण Pipette. धीरे से सील गैसकेट मालिश इतना है कि IVTT मिश्रण बाहर फैलता है और सरणी के पूरे क्षेत्र को शामिल किया गया. दोनों पोर्ट के लिए छोटे दौर पोर्ट सील लागू करें।
  4. एक समर्थन पर स्लाइड प्लेस और प्रोग्रामेबल द्रुतशीतन इनक्यूबेटर के लिए उन्हें हस्तांतरण। प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट, क्वेरी प्रोटीन के स्थिरीकरण के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के बाद।
  5. स्लाइड्स को धोकर ब्लॉक करें. सील गैसकेट निकालें और 1x TBST के लगभग 30 एमएल के साथ एक पिपेट बॉक्स में स्लाइड विसर्जित प्रोटीन प्रदर्शन के लिए 5% दूध के साथ पूरक (अनुभाग 8) या 1x TBST के साथ पूरक 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) kinase परख या दवा स्क्रीनिंग के लिए (अनुभाग 9). 20 मिनट के लिए आंदोलन के साथ आरटी में इनक्यूबेट और इस चरण 2x दोहराने।

8. NAPPA सरणियों पर प्रोटीन की जांच

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. अवरुद्ध समाधान (चरण 7.5) से स्लाइड निकालें और धीरे से पीछे की ओर (गैर मुद्रित पक्ष) एक कागज तौलिया का उपयोग कर सूखी. एक समर्थन पर स्लाइड प्लेस और प्राथमिक एंटीबॉडी के 600 $L लागू (माउस विरोधी झंडा) पतला 1:200 में 1x TBST + 5% दूध. आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
  2. 1x TBST + 5% दूध के साथ एक कमाल शेकर (3x के लिए 5 मिनट प्रत्येक) के साथ स्लाइड धो लें.
  3. माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें. धोने के समाधान से स्लाइड निकालें और धीरे कागज तौलिया का उपयोग कर वापस पक्ष सूखी. एक समर्थन पर स्लाइड प्लेस और माध्यमिक एंटीबॉडी के 600 $L लागू (cy3-labbeled विरोधी माउस एंटीबॉडी) पतला 1:200 में 1x TBST + 5% दूध. आरटी में 1 एच के लिए प्रकाश और इनक्यूबेट से स्लाइड को सुरक्षित रखें।
  4. एक कमाल शेकर (3x के लिए 5 मिनट प्रत्येक) पर 1x TBST के साथ स्लाइड धो लें. अल्ट्राप्यूर पानी के साथ स्लाइड जल्दी कुल्ला और दबाव हवा का उपयोग कर सूखी। स्कैनिंग (अनुभाग 11) के साथ आगे बढ़ें.

9. नेपा सरणियों पर Tyrosine kinase अवरोधक स्क्रीनिंग

नोट: एकाधिक स्लाइड्स एक ही प्रयोग में संसाधित किया जा सकता है, हालांकि, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चरण में, एक स्लाइड एक समय में संसाधित किया जाता है और यह कि वे चरणों के बीच सूखा नहीं है। स्लाइड के गैर-लेबल या गैर-सेंसल अंत में सभी समाधान जोड़ें.

  1. दवा स्क्रीनिंग के दौरान इस्तेमाल सभी समाधान तैयार करें:
    1. निम्नलिखित के संयोजन से फॉस्फेटेस/DNase समाधान तैयार करें: 1x प्रोटीन मेटलो-फॉस्फेटस बफर (50 एमएम हैप, 100 एमएम नैक्ल, 2 एमएम डीटीटी, 0.01% बृज 35 पर पीएच $ 7.5); 1 mM MnCl2; लैम्ब्डा प्रोटीन फॉस्फेटस की 8,000 इकाइयां; और DNase I की 2 इकाइयों प्रत्येक microarray के लिए समाधान के 400 $L तैयार करें. उपयोग करने से ठीक पहले फॉस्फेटऔर और DNase जोड़ें.
    2. दवा कमजोर पड़ने बनाओ. दवाओं 10 एमएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए DMSO में पुनर्गठन कर रहे हैं. आश्वस्त करने के लिए कि सभी दवा सांद्रता सरणी पर परीक्षण किया, सुनिश्चित करें कि DMSO की एक ही मात्रा (DMSO में एक 10,000x स्टॉक) प्रत्येक एकाग्रता के लिए बनाया गया है और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा. उपयोग के समय, दवाओं को पानी में पतला कर दिया जाता है।
    3. निम्नलिखित के संयोजन से दवा/kinase समाधान तैयार करें: 1x kinase बफर (25 m Tris-HCl के pH ] 7.5; 5 एमएम बीटा-ग्लिसरोफॉस्फेट; 2 एमएम डीटीटी; 0.1 एमएम ना3VO4; 10 एमएम एमजीसीएल2; 500 डिग्री एम एटीपी; और दवा के 2 डिग्री एल (पानी में 1:100 पतला). प्रत्येक माइक्रोरेरे के लिए विलयन का 200 डिग्री सेल्सियस तैयार की जा सकता है।
  2. फॉस्फेट और DNase उपचार प्रदर्शन करते हैं। अवरुद्ध समाधान (चरण 7.5) से स्लाइड निकालें और धीरे कागज तौलिया का उपयोग कर पीठ सूखी. आगे की स्लाइड्स को सपोर्ट पर रखें और फॉस्फेटस/DNase समाधान के 200 $L लागू करें। वाष्पीकरण से बचने के लिए एक माइक्रोरे कवरस्लिप रखें। ओवन में 45 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. Phosphatase और DNase उपचार द्वितीय: ओवन से सरणियों को हटाने, कवरस्लिप को त्यागें, अतिरिक्त समाधान निकालें, और ताजा बनाया फॉस्फेट और DNase समाधान के 200 $L लागू होते हैं। ओवन में 30 डिग्री सेल्सियस पर एक और 45 मिनट के लिए कवरस्लिप और इनक्यूबेट के साथ microarrays कवर।
  4. 1x TBST + 0.2 M NaCl के साथ स्लाइड एक कमाल शेकर पर धो (3x 5 मिनट प्रत्येक के लिए).
  5. दवा उपचार और kinase प्रतिक्रिया प्रदर्शन. धोने के समाधान से स्लाइड निकालें और धीरे एक कागज तौलिया का उपयोग कर पीठ सूखी. समर्थन पर स्लाइड प्लेस और दवा के 200 $L लागू / वाष्पीकरण से बचने के लिए शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें। ओवन में 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
  6. 1x TBST + 0.2 M NaCl के साथ स्लाइड एक कमाल शेकर पर धो (3x 5 मिनट प्रत्येक के लिए).
  7. दोहराएँ चरण 8.1-8.4 प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी phosho-Tyr एंटीबॉडी पतला 1:100 के रूप में उपयोग कर. 1x TBST + 5% दूध 1x TBST + 3% बीएसए के साथ सभी चरणों में बदलें।

10. स्वचालित हाइब्रिडाइजेशन प्रोटोकॉल

नोट: वैकल्पिक रूप से, एक हाइब्रिडेशन स्टेशन सभी हाइब्रिडाइजेशन और washes NAPPA सरणियों पर (अनुभाग 7-9) को स्वचालित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और प्रोटोकॉल अनुपूरक फ़ाइल 1के रूप में प्रदान किया गया है।

11. छवि अधिग्रहण

नोट: Microarray छवियों 20 microns या उच्चतर के एक संकल्प पर प्राप्त किया जाना चाहिए.

  1. ऊपर का सामना करना पड़ प्रोटीन के साथ स्लाइड धारक पत्रिका में microarrays लोड. माइक्रोरे स्कैनर में पत्रिका लोड करें।
  2. एक 575/30 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ हरी लेजर का चयन करने के लिए cy-3 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी से संकेत स्कैन. यदि किसी भिन्न फ्लोरोफोर का उपयोग किया जाता है, तो फ्लोरोसेंट डाई से संकेत का पता लगाने के लिए सही लेजर/तरंग दैर्ध्य का चयन करें।
  3. प्रत्येक छवि और स्थान है कि वे सहेजा जाएगा के लिए नाम निर्धारित करें।
  4. (वैकल्पिक): प्रत्येक नए फ्लोरोफोर के लिए, स्कैनिंग शर्तों के अनुकूलन संकेत तीव्रता के रैखिक रेंज का पता लगाने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. ऐसा करने के लिए, photopliplier (PMT) की एक श्रृंखला का उपयोग कर एक microarray स्कैन और एक स्पष्ट छवि गैर संतृप्त संकेत और कम पृष्ठभूमि के साथ प्राप्त की है जब तक लाभ.
  5. अनुकूलित सेटिंग्स के साथ सभी microarrays स्कैन और autogain बंद करने के लिए याद है.
    नोट: डेटा विश्लेषण के लिए, सभी microarrays एक ही स्कैनिंग सेटिंग्स का उपयोग कर स्कैन किया जाना चाहिए. एक fluorophore के रूप में cy3 का उपयोग कर kinase assays के लिए, छवियों के साथ स्कैन कर रहे हैं एक 20% PMT, लेजर तीव्रता 25%, और संकल्प के 10 microns, उपकरण और सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध स्कैनर का उपयोग कर.

12. डेटा प्रसंस्करण और विश्लेषण

नोट: कई सॉफ्टवेयर संकुल समान क्षमताओं के साथ microarray डेटा के परिमाणीकरण के लिए उपलब्ध हैं. यहाँ वर्णित प्रक्रिया उपकरण और सामग्रीतालिका में सूचीबद्ध सॉफ्टवेयर के लिए डिजाइन किया गया था.

  1. TIFF फ़ाइलों को मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए लोड, microarray लेआउट मैच और संभव न्यूनतम क्षेत्र के साथ पूरे संकेत को शामिल करने के लिए स्पॉट के आकार को समायोजित करने के लिए ग्रिड डिजाइन. पड़ोसी स्थानों ओवरलैप नहीं करना चाहिए. नेत्रहीन निरीक्षण कितनी अच्छी तरह सॉफ्टवेयर प्रदर्शन कर रहा है और ग्रिड मैन्युअल रूप से समायोजित करें, यदि आवश्यक हो तो.
  2. माइक्रोरेरे के सिग्नल की तीव्रता को परिमाणित करें। नेत्रहीन किसी भी असामान्यता (गैर विशिष्ट बाध्यकारी, धूल, आदि) के लिए स्थानों का निरीक्षण और उन्हें डेटा विश्लेषण से हटा दें.
  3. जिसमें कोई स्थान मौजूद नहीं है सरणी पर पड़ोसी क्षेत्रों के संकेत का उपयोग कर स्थानीय रूप से पृष्ठभूमि को सही करें।
  4. डेटा को सामान्य करें. विभिन्न सरणियों में संकेत की तुलना करने के लिए, प्रत्येक microarray के संकेत तीव्रता सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। किसी भी outliers को बाहर करने के लिए, छंटनी का उपयोग कर डेटा सामान्य मतलब 30% सकारात्मक नियंत्रण से संकेत (आईजीजी स्पॉट) dephosphorylated microarrays के.
    नोट: आईजीजी स्थान से संकेत माइक्रोरेरेडीएस के फॉस्फोरिलेशन और डेफॉस्फोरिलेशन के दौरान नहीं बदलता है और सामान्यीकरण के लिए उपयुक्त है।
  5. सक्रिय काइनेस की पहचान करें। माइक्रोरेरे पर प्रदर्शित प्रत्येक सुविधा के लिए, ऑटोफॉस्फोरीलेटेड और डेफॉस्फोरीलेटेड सरणियों में सामान्यीकृत संकेत तीव्रता के बीच अनुपात की गणना करें। सक्रिय काइनेस की पहचान के लिए 1.5 गुना परिवर्तन की एक सीमा निर्धारित करें और अन्य सभी विशेषताओं को ऑटोफॉस्फोरिलेशन (एन/ए) से गुजरने में असमर्थ के रूप में चिह्नित करें।
  6. समायोजित संकेत के प्रतिशत के रूप में 12.5 चरण में पहचाने गए प्रत्येक काइनेज की गतिविधि की गणना करें (सामान्यीकृत धनात्मक नियंत्रण सरणी (डीएमएसओ) की संकेत तीव्रता द्वारा घटाए गए सामान्यीकृत ऋण नियंत्रण सरणी (डेफॉस्फोरिलेट) के संकेत तीव्रता के कारण।

Representative Results

स्वयं इकट्ठे NAPPA microarrays एक ठोस मंच है कि biomarker खोज, प्रोटीन प्रोटीन बातचीत, सब्सट्रेट पहचान, और दवा स्क्रीनिंग10,11 सहित कई अलग अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करते हैं ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.

नेपा माइक्रोएरेरे पर काइनेज गतिविधि के अध्ययन और टायरोसिन काइनेस अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए अपनाई गई समग्र पद्धति को योजनाबद्ध रूप से चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है . सबसे पहले, NAPPA microarrays cDNA के अचलीकरण और लेपित microarrays पर एजेंट पर कब्जा द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. सीडीएनए का उपयोग मानव-आधारित आईवीटीटी प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रोटीन के प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाता है, और नए संश्लेषित प्रोटीन को कैप्चर एजेंट9द्वारा स्थिर किया जाता है। मुद्रित microarray की गुणवत्ता डीएनए के स्तर को मापने के द्वारा नजर रखी जा सकती है (संगत मुद्रण की पुष्टि) या सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीन (प्रोटीन अभिव्यक्ति और कब्जा की पुष्टि; चित्र 1) . पृष्ठभूमि संकेत को कम करने और प्रयोग की गतिशील रेंज को बढ़ाने के लिए, microarrays के साथ इलाज कर रहे हैं 1) Lambda फॉस्फेटसे से सेर / पृष्ठभूमि (चित्र 1)।

अगला चरण ऑटोफॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया है, जिसमें माइक्रोरेरेस को एटीपी (नकारात्मक नियंत्रण सरणी, जिसे डेफॉस्फोरिलेटेड माइक्रोरेरेस के रूप में संदर्भित किया जाता है) की अनुपस्थिति में काइनेज बफर के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, और काइनेस बफर को एटीपी (सकारात्मक नियंत्रण, autophosphorylated सरणियों के रूप में संदर्भित) या एटीपी + DMSO (वाहन नियंत्रण). इस बात पर बल दिया जाना चाहिए कि इस चरण के दौरान कोई काइनाज नहीं जोड़ा जाता है; अतः माइक्रोरेरे पर प्रदर्शित प्रत्येक काइनेज की आंतरिक गतिविधि को पैन एंटी-फॉस्फो-टायरोसिन एंटीबॉडी का उपयोग करके इसके फॉस्फोरिलेशन स्तरों की माप के माध्यम से परिमाणित किया जाता है जिसके बाद साइ3-लैबल द्वितीयक एंटीबॉडी(चित्र 1)।

चारपाई में मुद्रित मानव प्रोटीन किनेस के पैनल को प्रदर्शित करने वाली एनपीए-किनेस सरणियों का गुणवत्ता नियंत्रण चित्र 2में दर्शाया गया है। स्थिर डीएनए के स्तर डीएनए धुंधला द्वारा मापा गया था और यह microarray भर में एक भी संकेत दिखाया, सरणी पर मुद्रित डीएनए की मात्रा का सुझाव एक समान था. यह भी किसी भी डीएनए धुंधला बिना कई सुविधाओं का निरीक्षण करने के लिए संभव है. इन सुविधाओं में कुछ नियंत्रण है जिसमें डीएनए मुद्रण मिश्रण से छोड़ा गया था के अनुरूप है यानी, खाली धब्बे (कुछ भी नहीं मुद्रित किया गया था), पानी के धब्बे, शुद्ध आईजीजी स्पॉट (पॉली-lysine, crosslinker और शुद्ध आईजीजी), मुद्रण मिश्रण केवल (पूर्ण मुद्रण मिश्रण: पाली-lysine प्लस crosslinker और विरोधी झंडा एंटीबॉडी, किसी भी डीएनए के बिना)]. NAPPA-kinase microarrays पर प्रदर्शित प्रोटीन के स्तर विरोधी टैग एंटीबॉडी का उपयोग कर IVTT प्रतिक्रिया के बाद मूल्यांकन किया गया.

kinase स्क्रीनिंग के लिए, झंडा पसंद के टैग के रूप में इस्तेमाल किया गया था और microarray पर प्रदर्शित प्रोटीन के स्तर को एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग कर मापा गया था. के रूप में दिखाया गया है, CDNA युक्त स्थानों के बहुमत सफलतापूर्वक प्रोटीन का पता लगाने योग्य स्तर प्रदर्शित किया. CDNA के बिना नियंत्रण स्थानों में से कुछ भी विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ संकेत से पता चला: आईजीजी स्पॉट (माध्यमिक एंटीबॉडी की गतिविधि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया) और खाली वेक्टर स्पॉट (केवल टैग के लिए cDNA कोड) (चित्र 2). NAPPA-kinase microarrays स्लाइड के बीच अच्छा reproducibility दिखाया, अलग मुद्रण बैचों के बीच प्रोटीन प्रदर्शन के स्तर के सहसंबंध के साथ 0.88 से अधिक (चित्र 2). एक ही बैच के भीतर सहसंबंध भी अधिक था, 0.92 के करीब (डेटा नहीं दिखाया गया).

इसके बाद, सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीनों की काइनेज स्वफॉस्फोरिलेशन क्रियाकलाप को एंटी-फॉस्फो-टायरोसिन एंटीबॉडी(चित्र 3)का उपयोग करके मापा गया। सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन के उच्च स्तर से पता चला (चित्र 3, बाएँ), जो सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीन की आंतरिक काइनेस गतिविधि के कारण हो सकता है या IVTT मिश्रण में मौजूद सक्रिय काइनेस द्वारा. इस फॉस्फोरिलेशन को लैम्ब्डा फॉस्फेटस उपचार के साथ पूरी तरह से हटा दिया गया था और इन माइक्रोरेरेस का उपयोग कानेज परख के लिए किया गया था। डेफॉस्फोरिलेशन के बाद, एटीपी के बिना प्रदर्शन किए गए ऑटोफॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रियाओं में फॉस्फोरिलेशन का कोई महत्वपूर्ण स्तर नहीं दिखाया गया, जैसा कि अपेक्षित था, जबकि एटीपी की उपस्थिति में किनेज बफर के साथ इनक्यूबेट किए गए माइक्रोरेसे ने प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन को 15 मिनट के रूप में तेजी से दिखाया ( चित्र 3) . दवा स्क्रीनिंग के लिए, kinase गतिविधि का परीक्षण kinases की संख्या को अधिकतम करने के लिए autophosphorylation प्रतिक्रिया के 60 मिनट के बाद मापा गया था.

माइक्रोरेरेया के बीच तुलना जिसमें फॉस्फोरिलेशन स्तर प्रोटीन अभिव्यक्ति के ठीक बाद मापा गया था (चित्र 3, बाएँ) और ऑटोफॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया के 60 मिनट के बाद (चित्र 3, दायाँ) से पता चला: i) प्रोटीन फॉस्फोरिलेट केवल अभिव्यक्ति के बाद, सुझाव है कि वे exogenously आईवीटीटी मिश्रण पर मौजूद प्रोटीन द्वारा exogenously फॉस्फोरिलेट किया जा सकता है, लेकिन autophosphorlated नहीं किया जा सकता है; ii) प्रोटीन फॉस्फोरिलेट केवल ऑटोफॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया के बाद, सुझाव है कि इन प्रोटीन प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद सक्रिय नहीं थे और kinase बफर में मौजूद आवश्यक सह-कारक सक्रिय होने के लिए; अथवा पपप) दोनों सरणियों पर फास्फोरिलेट प्रोटीन यह सुझाव देता है कि वे दोनों सेटिंग्स में सक्रिय थे (चित्र 3)।

NAPPA-kinase सरणियों पर tyrosine kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए प्राप्त परिणामों का एक उदाहरण के रूप में प्रोटीन kinases भर में अलग चयनात्मकता के साथ तीन kinases inhibitors इस्तेमाल किया गया: staurosporine, imatinib और ibrutinib. सभी स्क्रीनिंग के लिए, ऑटोफॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया के दौरान डीफॉस्फोरीलेटेड एनपीए माइक्रोएरेसिस को टीकेआई की बढ़ती सांद्रता (100 एनएम से 10 उम तक) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। पहले TKI परीक्षण staurosporine, एक वैश्विक प्रोटीन kinase अवरोध करनेवाला था, कि लगभग सभी kinases परीक्षण11भर में microarray पर शक्तिशाली kinase अवरोध दिखाया गया था.

अगले, imatinib परीक्षण किया गया था, एक ABL और सी-किट अवरोध करनेवाला पुरानी myelogenous ल्यूकेमिया और जठरांत्र stromal ट्यूमर4,5,6,7के इलाज के लिए इस्तेमाल किया. NAPPA-kinase सरणियों पर imatinib Abl1 और BCR-Abl1 गतिविधि में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाई जबकि अन्य kinases ज्यादातर अप्रभावित रहे (चित्र 4A) . kinase गतिविधि के लिए डेटा परिमाणीकरण dephosphorylated सरणी के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था और सकारात्मक नियंत्रण microarray के प्रतिशत के रूप में प्रतिनिधित्व (केवल वाहन). TNK2 (गैर-संबंधित kinase), Abl1 और BCR-Abl1 के लिए डेटा चित्र 4Bमें दिखाया गया है। जैसा कि उम्मीद थी, imatinib Abl1 और BCR-ABl1 की ओर चयनात्मक अवरोध दिखाया. सी-किट के लिए डेटा सकारात्मक नियंत्रण सरणियों पर गतिविधि की कमी के कारण अनिर्णायक था।

अंत में, ibrutinib, एक एफडीए को मंजूरी दे दी है Bruton tyrosine kinase (BTK) के सहसंयोजक अवरोध करनेवाला, परीक्षण किया गया था. Ibrutinib वर्तमान में अति सक्रिय BTK के साथ कई रक्त से संबंधित कैंसर के उपचार में प्रयोग किया जाता है, पुरानी लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया (CLL), मेंटल सेल लिंफोमा, और Waldenstrm के मैक्रोग्लोबुलिनिया21,22सहित. चित्र 4C, ibrutinib स्क्रीनिंग के लिए प्राप्त विशिष्ट परिणामों का प्रतिनिधि है. ABL1 (गैर प्रासंगिक kinase) और BTK (कैनोनिकल लक्ष्य) और ERBB4 (संभावित नए लक्ष्य) की kinase गतिविधि चित्र 4Dमें दिखाया गया है. डेटा पता चलता है ERBB4 एक खुराक विशिष्ट फैशन में ibrutinib द्वारा बाधित किया जा सकता है. इस निषेध इन विट्रो में और सेल आधारित assisays11में पुष्टि की गई थी, इस मंच की शक्ति का प्रदर्शन.

एक साथ लिया, डेटा सुझाव है कि NAPPA-kinase microarray मंच टी के inhibitors की निष्पक्ष स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, स्क्रीनिंग तेजी से है और आसानी से ब्याज की प्रोटीन kinases के किसी भी भिन्नता शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1: गुणवत्ता नियंत्रण और NAPPA सरणियों में tyrosine kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के Schematic प्रतिनिधित्व. NAPPA सरणियाँ एक टैग और एक कब्जा एंटीबॉडी के साथ जुड़े ब्याज के प्रोटीन के लिए cDNA कोडिंग के साथ मुद्रित कर रहे हैं. इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रिया के दौरान (IVTT) संश्लेषित प्रोटीन कब्जा एंटीबॉडी द्वारा टैग के माध्यम से microarray सतह पर कब्जा कर रहे हैं. सरणियों की गुणवत्ता नियंत्रण (QC) स्लाइड पर मुद्रित डीएनए के स्तर की माप द्वारा किया जाता है, एक फ्लोरोसेंट डीएनए-इंटरकलिंग डाई का उपयोग कर, और टैग-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीन के स्तर. kinase स्क्रीनिंग के लिए, microarrays DNase और फॉस्फेट के साथ इलाज कर रहे हैं, IVTT प्रतिक्रिया के बाद, मुद्रित डीएनए और सभी फॉस्फोरिलेशन कि प्रोटीन संश्लेषण के दौरान हुई हो सकता है हटाने के लिए. dephosphorylated सरणियां अब दवा स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं. प्रत्येक परख के लिए, नियंत्रण के तीन सेट नियमित रूप से उपयोग किया जाता है: (मैं) dephosphorylated सरणियां, जिसमें autophosphorylation प्रतिक्रिया एटीपी के बिना किया जाता है; (II) ऑटोफॉस्फोरिलेटाइज्ड माइक्रोरेरेरेसेस, जिसमें एटीपी की उपस्थिति में ऑटोफॉस्फोरिलेशन अभिक्रिया की जाती है; और (III) DMSO इलाज सरणी (वाहन), जिसमें autophosphorylation प्रतिक्रिया एटीपी और DMSO के साथ किया जाता है. kinase inhibitors के विभिन्न एकाग्रता के साथ इलाज स्लाइड ेंके गए सटीक एक ही प्रोटोकॉल DMSO इलाज सरणियों के लिए प्रयोग किया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: आत्म इकट्ठे NAPPA-kinase सरणियों के लिए गुणवत्ता नियंत्रण के प्रतिनिधि परिणाम. डीएनए सामग्री एक फ्लोरोसेंट डीएनए-इंटरकेलेटिंग डाई द्वारा मापा (बाएं) और विरोधी Flag एंटीबॉडी (मध्य) द्वारा मापा microarray पर प्रदर्शित प्रोटीन के स्तर दिखाए जाते हैं. दाईं ओर अलग बैचों में मुद्रित दो NAPPA-kinase सरणियों पर प्रदर्शित प्रोटीन के स्तर का एक सहसंबंध साजिश है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: NAPPA-kinase सरणियों में kinase गतिविधि के प्रतिनिधि परिणाम| चौपाया में प्रोटीन किनेस प्रदर्शित करने वाले माइक्रोरेरे का उपयोग एंटी-पीटायर एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन की माप के माध्यम से सरणी पर प्रोटीन काइनेस गतिविधि का अध्ययन करने के लिए किया गया था, जिसके बाद साइ3-लेबल एंटी-माउस एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। फॉस्फेट/DNase उपचार के बिना नियंत्रण सरणियों और autophosphorylation प्रतिक्रिया के दौरान एटीपी के बिना प्रोटीन अभिव्यक्ति (पोस्ट-अभिव्यक्ति) के बाद पृष्ठभूमि फॉस्फोरिलेशन को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया। शेष माइक्रोरेरे का उपचार फॉस्फेटेज/डीएनए के साथ किया गया था, और ऑटोफॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया एटीपी (डेफॉस्फोरीलेटाड माइक्रोरेरे, नकारात्मक नियंत्रण) या एटीपी (ऑटोफॉस्फोरीलेटाड माइक्रोरेरे) के बिना की गई थी। ऑटोफॉस्फोरीलेटेड माइक्रोरेनेस के लिए ऑटोफॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया 15 मिनट, 30 मिनट, 45 मिनट या 60 मिनट के लिए की गई थी, जैसा कि दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: NAPPA-kinase सरणियों पर tyrosine kinase स्क्रीन से प्रतिनिधि डेटा| (ए) फॉस्फेटस/डीनेस उपचारित नपा-किनेस सरणियों को स्व-फॉस्फोरिफॉरिलेशन प्रतिक्रिया के दौरान इमेटिनब की सांद्रता बढ़ाने में इनक्यूबेट किया गया था और किनेस क्रिया-प्रति-फॉस्फो-टायर एंटीबॉडी के साथ मापी गई थी। (ख)नेपा-किनेस सरणियों पर पाई जाने वाली काइनेस गतिविधि का क्वांटायीकरण, जो इमेटिनब के संपर्क में है। डेटा नकारात्मक नियंत्रण सरणियों के संकेत के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था (dephosphorylated) और यह सकारात्मक नियंत्रण सरणियों के प्रतिशत के रूप में दिखाया गया है (autophosporylation प्रतिक्रिया DMSO की उपस्थिति में प्रदर्शन किया). इसी तरह के डेटा ibrutinib की स्क्रीनिंग के लिए दिखाया गया है (सी, डी). यह आंकड़ा रऊफ एट अल11से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फाइल 1. एक स्वचालित संकरीकरण स्टेशन का उपयोग कर NAPPA सरणियों में tyrosine kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

संशोधन और समस्या निवारण
NAPPA सरणियों पर kinase गतिविधि के अध्ययन के अनुकूलन चरण के दौरान, पृष्ठभूमि और कम गतिशील रेंज के मुख्य स्रोतों में से एक मनाया बीएसए मुद्रण मिश्रण पर इस्तेमाल किया गया था. बीएसए अमीनों की सतह से क्रॉसलिंकिंग के लिए आवश्यक प्राथमिक अमीन उपलब्ध करा रहे थे और मौके पर ही डीएनए और कैप्चर एंटीबॉडी को फंसा रहे थे। हालांकि, बीएसए अत्यधिक फॉस्फोरीलेटेड है, जिससे पृष्ठभूमि शोर के ऊपर सरणी पर ऑटोफॉस्फोरिलेशन सिग्नल का पता लगाने के लिए यह मुश्किल हो जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए, मुद्रण मिश्रण में बीएसए के लिए कई विकल्पों का परीक्षण किया गया था, और पाली-lysine अच्छा विकल्प के रूप में पहचान की गई थी। पाली-लाइसिन में फॉस्फोरिलेशन साइट का अभाव है; इसलिए, गैर-एक्सप्रेस्ड सरणियों से पृष्ठभूमि बहुत कम है। इसके अतिरिक्त, पॉली-लाइसिन के साथ मुद्रित माइक्रोरेरेस पुन: उत्पादनीय होते हैं और प्रोटीन के अच्छे स्तर प्रदर्शित करते हैं (चित्र 2)।

मानक NAPPA पर प्रदर्शन अगले महत्वपूर्ण संशोधन एक Phosphatase / फॉस्फेटके के साथ माइक्रोरेरेसिस का उपचार प्रोटीन संश्लेषण और ग्रहण के दौरान आईवीटीटी मिश्रण में हुई किसी भी फॉस्फोरिलेशन को हटाने की अनुमति देता है (चित्र 3) । इस फॉस्फोरिलेशन का स्रोत आंतरिक स्वाफॉस्फोरिलेशन क्रिया कला से अथवा आईवीटीटी मिश्रण में उपस्थित किनासे की गतिविधि से हो सकता है। सभी फॉस्फोरिलेशन पोस्ट-एक्सप्रेशन को हटाने से सक्रिय किनियों की आसान पहचान की अनुमति दी जाती है और वे ऑटोफॉस्फोरिलेशन से गुजर सकते हैं (चित्र 3)।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
NAPPA एक मजबूत तकनीक है, लेकिन जैसा कि उम्मीद है, वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम हैं. पहले उचित एकाग्रता में उच्च गुणवत्ता डीएनए के अधिग्रहण है. गरीब गुणवत्ता के डीएनए का उपयोग करना या कम सांद्रता में कई सुविधाओं के साथ गरीब गुणवत्ता microarrays उत्पन्न होगा व्यक्त नहीं किया जा रहा है और उचित स्तर में प्रदर्शित, सरणी पर विश्लेषण प्रोटीन की संख्या कम. दूसरा महत्वपूर्ण कदम microarray पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति है. एक IVTT प्रणाली है कि कार्यात्मक प्रोटीन के उच्च स्तर को व्यक्त करेंगे का उपयोग सरणी पर kinase गतिविधि का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है.

TKI स्क्रीनिंग पर अगले महत्वपूर्ण कदम है कि microarrays कैसे संभाला जाता है. microarrays प्रोटोकॉल के किसी भी कदम के दौरान सूखी नहीं होना चाहिए, और कोमल हैंडलिंग खरोंच है कि पृष्ठभूमि संकेत बढ़ा सकते हैं को रोकने के लिए सिफारिश की है. चूंकि पूरे प्रयोग की सरणियों की तुलना एक-दूसरे से की जाएगी, इसलिए यह आश्वस्त करना महत्वपूर्ण है कि सभी स्लाइड्स में हर ऊष्मायन चरण भी है. उदाहरण के लिए, जब 20 सरणियों का एक बैच सरणीओं में इनक्यूबेशन की लंबाई में अंतर को रोकने के लिए संसाधित किया जाता है, तो किसी एकल सरणी में एक चरण निष्पादित करने के लिए आवश्यक समय को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

अंत में, प्रयोग का डिज़ाइन और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण दोनों को शामिल करना गुणवत्ता नियंत्रण और डेटा विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. नियंत्रण का पहला सेट उन प्रत्येक सरणी में मुद्रित कर रहे हैं और नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं [यानी, खाली धब्बे (किसी भी सामग्री मुद्रित के बिना), पानी या खाली वेक्टर (केवल टैग एक्सप्रेस)], साथ ही साथ एक सकारात्मक नियंत्रण (यानी, शुद्ध IgG, कि द्वारा पता चला है द्वितीयक एंटीबॉडी और फॉस्फोरिलेशन स्तर में परिवर्तन करने के लिए निष्क्रिय है। सामूहिक रूप से, वे microarray की पृष्ठभूमि के स्तर को मापने, मुद्रण के दौरान संभव carryover और पता लगाने की विधि के संकेत तीव्रता.

नियंत्रण के अगले सेट दवा स्क्रीनिंग नियंत्रण कर रहे हैं और dephosphorylated और autophosphorylated microarrays शामिल हैं (DMSO की उपस्थिति या अनुपस्थिति में). जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, डेफॉस्फोरिलेटाइन्ड माइक्रोरेरे फॉस्फेटेज उपचार के बाद फॉस्फोरिलेशन के स्तर को मापते हैं और इसलिए अन्य सभी प्रयोगों के लिए आधारभूत स्तर होते हैं। कम आधाररेखा स्तर है, उच्च assays के गतिशील रेंज. ऑटोफॉस्फोरीलेटेड सरणियां सभी सरणियों के अधिकतम फॉस्फोरिलेशन स्तर मौजूद हैं और संकेत मजबूत और स्पष्ट होना चाहिए। यह डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन यह भी एक नियंत्रण है कि सभी प्रतिक्रियाओं को सफलतापूर्वक सरणी पर प्रदर्शन किया गया के रूप में।

तकनीक की सीमाएं
अब के रूप में, यहाँ प्रस्तुत दवा स्क्रीनिंग की सीमाओं में से एक केवल प्रोटीन kinases कि autophosphorylated किया जा सकता है स्क्रीन करने की क्षमता है. इस पर काबू पाने के लिए एक संभव तरीका एक ही स्थान में एक kinase और ज्ञात सब्सट्रेट मुद्रित करने के लिए है। दो अलग प्रोटीन के लिए डीएनए के सह मुद्रण सफलतापूर्वक15पूरा किया गया था, इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का सुझाव. इसके अलावा, सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीन सही ढंग से एक निष्क्रिय प्रोटीन में जिसके परिणामस्वरूप जोड़ नहीं किया जा सकता है. मानव आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग ने सरणी पर मापी गई काइनेज़ गतिविधि में महत्वपूर्ण सुधार किया; हालांकि, कुछ प्रोटीन अभी भी अपनी निष्क्रियता के कारण सरणी पर विश्लेषण नहीं किया जा सकता है.

एक दूसरी सीमा एक पैन विरोधी फॉस्फो-टायर एंटीबॉडी का उपयोग कर फॉस्फोरिलेशन की माप है। फॉस्फोरिलेशन साइट की आकृति के बारे में अपनी गैर-विशिष्टता के बावजूद, सभी मापा फॉस्फोरिलेशन टायरोसिन अवशेषों पर हुई, serines और threonines और उनके संबंधित kinases पीछे छोड़ने. आज तक, ऊष्मायन और धुलाई की स्थिति को अनुकूलित करने के कई प्रयासों के बावजूद, सफलता के बिना 10 से अधिक पैन फॉस्फो-सेर/थ्र एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया है। एंटीबॉडी से स्वतंत्र एक नई पहचान प्रणाली प्रोटीन kinases कि दवा निषेध के लिए जांच की जा सकती है की संख्या का विस्तार करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है. इस संदर्भ में, कुछ विकल्प रेडियोधर्मिता या क्लिक संयोजन जैसे रासायनिक दृष्टिकोण सहित उपलब्ध हैं. अनुकूलन की एक श्रृंखला पृष्ठभूमि संकेत को कम करने और परख के लिए एक अच्छा गतिशील रेंज प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं.

तीसरी सीमा cDNA क्लोन के अधिग्रहण सरणी पर मुद्रित किया जा करने के लिए है. CDNA क्लोन ऐसे निर्माता या गेटवे23के रूप में साइट विशेष पुनर्संयोजन प्रणाली, सहित किसी भी क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है। एक अन्य विकल्प के लिए DNAsu पुस्तकालय से क्लोन खरीद रहा है, पर पाया और lt;https://dnasu.org/DNASU/Home.do,जहां 17,000 से अधिक cDNAs क्लोन, पूरे मानव kinome सहित, आसानी से उपलब्ध है NAPPA सरणियों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए24 .

चौथी सीमा यह है कि हर प्रयोगशाला में अपने स्वयं के एनपीए सरणियों को बनाने और स्क्रीन करने के लिए उपयुक्त उपकरण ों की सुविधा नहीं है। इस प्रोटोकॉल के लिए उच्च throughput उपकरण की आवश्यकता के बिना, microarray पर मुद्रित किया जा करने के लिए डीएनए उत्पन्न करने के लिए वैकल्पिक तरीके प्रदान करता है, और प्रोटोकॉल मैन्युअल रूप से सभी संकरीकरण कदम प्रदर्शन करने के लिए. हालांकि, एक arrayer और microarray स्कैनर के लिए उपयोग अभी भी आवश्यक है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए एक विकल्प के लिए NAPPA कोर सेवा और सुविधा का उपयोग करने के लिए है, पर पाया और http://nappaproteinarray.org/gt;, जो एक गैर लाभ शैक्षणिक मूल्य पर अनुकूलित NAPPA microarrays वितरित करता है. अंत में, किसी भी स्क्रीनिंग पद्धति के रूप में, सरणियों पर प्राप्त डेटा कलाकृतियों होने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं (या तो सकारात्मक या नकारात्मक) और इसलिए orthogonal परख का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिए.

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
प्रोटीन kinases की स्क्रीनिंग के लिए व्यावसायिक रूप से कई प्लेटफार्मों उपलब्ध हैं. एक दृष्टिकोण नियमित रूप से इस्तेमाल किया बाध्यकारी assays है, जो प्रोटीन टुकड़े, kinase डोमेन, kinase डोमेन और कुछ नियामक क्षेत्रों के साथ बड़ा प्रोटीन टुकड़े के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, और यहां तक कि पूर्ण लंबाई प्रोटीन. प्रोटीन आमतौर पर लागत और अभिव्यक्ति और शोधन प्रोटोकॉल में सादगी के कारण जीवाणु प्रणालियों में व्यक्त कर रहे हैं. ब्याज और प्रोटीन की दवा के बीच बातचीत तो फ्लोरोसेंट या टैग की उपस्थिति की तरह रिपोर्ट परख के कुछ प्रकार के साथ मापा जाता है, उदाहरण के लिए. दृष्टिकोण के इस सेट की मुख्य सीमा तथ्य यह है कि प्रोटीन दवा के साथ बातचीत के दौरान जरूरी सक्रिय नहीं है, जो झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक बातचीत की पहचान में परिणाम हो सकता है. प्रोटीन टुकड़े विशेष रूप से रचना और गतिविधि की कमी में परिवर्तन के लिए कमजोर कर रहे हैं और सभी प्राप्त डेटा सक्रिय प्रोटीन का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिए, अधिमानतः उनके पूर्ण लंबाई के रूप में. प्लेटफार्मों में से कुछ की एक और सीमा केवल एटीपी एनालॉग स्क्रीन करने की क्षमता है, इसके समग्र उपयोग को सीमित.

एंजाइमी आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर TKIs की स्क्रीनिंग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेवाओं के अधिकांश ब्याज की kinase के केवल जंगली प्रकार के संस्करणों का उपयोग, और कभी कभी केवल एक चयनित कुछ म्यूटेंट. यह जानते हुए कि दवा प्रतिरोध TKI के साथ इलाज रोगियों में बहुत आम है, यह सबसे उपयुक्त अवरोध करनेवाला के चयन के लिए, विभिन्न म्यूटेंट में दवा की प्रतिक्रिया को मापने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है। NAPPA की प्रकृति के कारण, kinase म्यूटेंट की स्क्रीनिंग सरल है और आसानी से पूरा किया जा सकता है, और केवल आवश्यक उपकरण NAPPA CDNA संग्रह में kinase उत्परिवर्ती का समावेश है, जो साइट-विशिष्ट mutagenesis द्वारा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए.

भविष्य अनुप्रयोगों
कैंसर चिकित्सा में कैंसर चिकित्सा में कैंसर के सबसे आम रूपों में से एक का इलाज पाठ्यक्रम के दौरान दवा के लक्ष्य में उत्परिवर्तनों का अधिग्रहण है। प्रत्येक रोगी के लिए एक व्यक्तिगत उपचार प्राप्त करने के लिए टीकेआई की दूसरी/तीसरी पीढ़ी के चयन के लिए काइनेज अवरोधकों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के संबंध में इन म्यूटेंटों की स्क्रीनिंग महत्वपूर्ण महत्व की है। यहाँ प्रस्तुत दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण, एक निष्पक्ष स्क्रीनिंग मंच प्रदान करता है जिसमें किसी भी टायरोसिन किनेस अवरोधक मानव जीनोम में मौजूद टायरोसिन kinases के एक पैनल के खिलाफ परीक्षण किया जा सकता है। चूंकि NAPPA सरणियों पर प्रदर्शित प्रोटीन स्लाइड पर मुद्रित cDNA से इन विट्रो में व्यक्त कर रहे हैं, किसी भी उत्परिवर्ती संस्करण आसानी से सरणी पर प्रदर्शित करने के लिए cDNA संग्रह में शामिल किया जा सकता है. सुविधा जिसमें kinase म्यूटेंट उत्पन्न किया जा सकता है और सरणी पर व्यक्त, NAPPA तकनीक के उच्च throughput शक्ति के साथ संयुक्त, kinase म्यूटेंट के अध्ययन और दवाओं के लिए उनकी प्रतिक्रिया के लिए एक अनूठा वातावरण प्रदान करता है, NAPPA के लिए उपयुक्त बनाने व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग, सटीक चिकित्सा के लक्ष्यों में से एक.

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक परियोजना के विकास के दौरान उनकी मदद और आलोचना के लिए LaBaer प्रयोगशाला में सभी को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना NIH अनुदान U01CA117374, U01AI077883 और वर्जीनिया जी पाइपर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
364 well plates (for arraying) Genetix x7020
800 µL 96-well collection plate Abgene AB-0859
96-pin device Boekel 140500
Acetic Acid Millipore-Sigma 1.00066
Acetone 99.9% Millipore Sigma 650501
Aluminum seal for 96 well plates VWR 76004-236
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) Pierce 80370
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Millipore Sigma F3165
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) Millipore Sigma F7425
ATP 10 mM Cell Signaling 9804S
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Millipore-Sigma G9422
bacteriological agar VWR 97064-336
Blocking Buffer ThermoFisher/Pierce 37535
Brij 35 ThermoFisher/Pierce BP345-500
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) ThermoFisher/Pierce 21580
BSA (bovine serum albumin) Millipore Sigma A2153
Coverslip 24 x 60 mm VWR 48393-106
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-165-150
DeepWell Block, case of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0661
DEPC water Ambion 9906
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Millipore-Sigma D8418
DNA-intercalating dye Invitrogen P11495
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
DTT Millipore-Sigma 43816
EDTA Millipore-Sigma EDS
Ethanol 200 proof Millipore-Sigma E7023
Filter plates Millipore-Sigma WHA77002804
Gas Permeable Seals, box of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0718
Glass box Wheaton 900201
Glass slides VWR 48300-047
Glycerol Millipore-Sigma G5516
HCl (Hydrochloric acid) Millipore-Sigma H1758
HEPES Buffer Solution Millipore-Sigma 83264
Human-based IVTT system Thermo Scientific 88882
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule ThermoFisher/Pierce 31202
Isopropanol Millipore-Sigma I9516
KCl (Potassium chloride) Millipore-Sigma P9333
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) Millipore-Sigma P5655
Kinase buffer Cell Signaling 9802
KOAc (Potassium acetate) Millipore-Sigma P1190
Lambda Protein Phosphatase new england biolabs P0753
Lifterslips, 24 x 60 mm ThermoFisher Scientific 25X60I24789001LS
Metal 30-slide rack with no handles Wheaton 900234
MgCL2 (Magnesium chloride) Millipore-Sigma M8266
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) Millipore-Sigma S6508
NaCl (Sodium Chloride) Millipore-Sigma S3014
NaOAc (Sodium acetate) Millipore-Sigma S2889
NaOH (Sodium hydroxide) Millipore-Sigma S8045
NucleoBond Xtra Midi / Maxi Macherey-Nagel 740410.10 / 740414.10
Nucleoprep Anion II Macherey Nagel 740503.1
Phosphoric Acid Millipore-Sigma 79617
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) Millipore-Sigma A-005-C
Protein Phosphatase (Lambda) New England Biolabs P0753
RNAse Invitrogen 12091021
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma L6026
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma 05030
Sealing gasket Grace Bio-Labs, Inc 44904
Silica packets VWR 100489-246
Single well plate ThermoFisher/Nalge Nunc 242811
Sodium acetate (3M, pH 5.5) Millipore-Sigma 71196
TB media (Terrific Broth) Millipore-Sigma T0918
Tris IBI scientific IB70144
Triton X-100 Millipore-Sigma T8787
Tryptone Millipore-Sigma T7293
Tween 20 Millipore-Sigma P9416
Yeast Extract Millipore-Sigma Y1625
Name Company Catalog number Comments
Equipments Maker/model
Programmable chilling incubator Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling
Shaker for bacterial growth ATR Multitron shaker
Vacuum manifold with liquid waste trap MultiScreenVacuum Manifold 96 well
96 well autopippetor/liquid handler Genmate or Biomek FX
Liquid dispenser Wellmate
DNA microarrayer Genetix QArray2
Automatic hybridization station Tecan HS4800 Pro Hybridization Station
Microarray scanner Tecan PowerScanner
Microarray data quantification Tecan Array-ProAnalyzer 6.3

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References

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Kinase अवरोधक स्क्रीनिंग में स्वयं इकट्ठे मानव प्रोटीन Microarrays
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Festa, F., Labaer, J. Kinase… More

Festa, F., Labaer, J. Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (152), e59886, doi:10.3791/59886 (2019).

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