Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59886
Automatic Translation
1,2, 1
1Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Biodesign Institute, Arizona State University, 2Department of Pediatrics, and Biochemistry/Molecular Biology, College of Medicine, Pennsylvania State University

Summary

Ett detaljerat protokoll för generering av självmonterade humana proteinmikromatriser för screening av kinashämmare presenteras.

Abstract

Screening av kinashämmare är avgörande för att bättre förstå egenskaperna hos ett läkemedel och för att identifiera potentiellt nya mål med kliniska konsekvenser. Flera metoder har rapporterats för att utföra en sådan screening. Emellertid, var och en har sina egna begränsningar (t. ex. screening av endast ATP-analoger, begränsning till att använda renade Kinas domäner, betydande kostnader i samband med testning mer än några kinaser i taget, och bristande flexibilitet i screening protein kinaser med nya mutationer). Här, ett nytt protokoll som övervinner några av dessa begränsningar och kan användas för opartisk screening av kinashämmare presenteras. En styrka av denna metod är dess förmåga att jämföra aktiviteten av kinashämmare över flera proteiner, antingen mellan olika kinaser eller olika varianter av samma Kinas. Självmonterade proteinmikromatriser som genereras genom uttrycket av proteinkinaser av en human-baserad in vitro-transkription och översättningssystem (IVTT) används. De proteiner som visas på mikromatrisen är aktiva, vilket möjliggör mätning av effekterna av kinashämmare. Följande procedur beskriver protokoll stegen i detalj, från generering av mikromatriser och screening till dataanalys.

Introduction

Proteinkinaser är ansvariga för fosforyleringen av sina mål och kan modulera komplexa molekylära vägar som styr många cellulära funktioner (dvs. cell spridning, differentiering, celldöd och överlevnad). Avregleringen av Kinas aktivitet är förknippad med mer än 400 sjukdomar, vilket gör kinashämmare en av de viktigaste klasserna av läkemedel tillgängliga för behandling av flera sjukdomar, inklusive cancer, kardiovaskulära och neurologiska sjukdomar samt inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar1,2,3.

Med tillkomsten av precisionsmedicin, identifiering av nya terapier, särskilt kinashämmare, har stor överklagande farmaceutiskt och kliniskt. Flera metoder kan användas för att identifiera möjliga nya par av Kinas/kinashämmare, inklusive de Novo utformningen av kinashämmare och identifiering av nya mål för befintliga FDA-godkända läkemedel. Den senare är särskilt attraktiv, eftersom den tid och pengar som krävs för att genomföra dessa läkemedel i kliniker reduceras drastiskt på grund av tillgängligheten av tidigare kliniska prövningar data. Ett kanoniskt exempel på återanvändning av en kinashämmare är imatinib, initialt avsett för behandling av kronisk myeloisk leukemi (KML) genom hämning av BCR-ABL, som också kan användas framgångsrikt för behandling av c-kit överuttrycker gastrointestinala stromacellstumörer (gister)4,5,6,7.

Screening av kinashämmare kan utföras i bindande analyser eller enzymatiska-baserade analyser. Den första klassen av analyser fokuserar på protein-läkemedelsinteraktioner och kan ge information såsom ligering webbplats och samhörighet. Eftersom aktiviteten av Kinas vid tidpunkten för dessa analyser är okänd, ett antal interaktioner kan missas eller falskeligen identifieras på grund av överensstämde förändringar i proteinet. Å andra sidan, enzymatiska-baserade analyser kräver proteinkinaser att vara aktiv och ge värdefull information om inhibitoren effekt på enzymaktivitet, emellertid, denna typ av screening är i allmänhet mer tidskrävande och dyrt. För närvarande är båda typerna av analyser kommersiellt tillgängliga från flera källor. De utgör ett tillförlitligt alternativ för screening av kinashämmare med några begränsningar, inklusive: I) de flesta av metoderna innebär testning av flera kinaser individuellt, vilket kan göra screening av en stor uppsättning av proteiner kostsamma; II) den uppsättning av kinaser som ska testas är begränsad till en förteckning över förvalda, vildtyps-kinaser och flera välkända muterade versioner av vissa kinaser, vilket hindrar testning av många nya muterade isoformer.

I detta sammanhang är proteinmikromatriser en kraftfull plattform som kan övervinna några av de begränsningar som presenteras av kommersiellt tillgängliga tekniker. Det är lämpligt att utföra enzymatiska-baserade analyser i hög dataflöde screening med full längd, aktiva proteiner i någon sekvens av intresse. Den Microarrays kan genereras av en självmonterad metod som NAPPA (nukleinsyra programmerbara protein array), där proteiner uttrycks precis i tid för analyser, öka sannolikheten för att de som visas på matrisen är verkligen aktiva. De proteiner som visas på NAPPA framställs med hjälp av humana-härledda ribosomer och chaperonproteiner för att förbättra sannolikheten för naturlig vikning och aktivitet.

Proteinerna programmeras initialt genom att skriva ut cDNAs kodning för gener av intresse smält med en Capture tag, tillsammans med en Capture agent, på microarray ytan. Proteinerna produceras sedan på mikroarrayer med hjälp av en in vitro-transkription och översättning (IVTT) system, och de nyligen uttryckta proteiner immobiliseras på microarray ytan av Capture agent. Uttryckta nappa matriser kan användas för studiet av de proteiner som visas på matrisen i en opartisk, hög genomströmning sätt8,9.

Tidigare, det visades att proteiner som visas på NAPPA arrayer viks ordentligt för att interagera med kända partners10; vidare utnyttjades deras enzymatiska aktivitet först i 2018, då det visades att proteinkinaser visades på microarrayen autophosphorylate11. Hittills har nappa metodik använts för många olika tillämpningar, inklusive biomarkör upptäckt12,13,14,15,16,17, protein-protein interaktioner10,18, substrat identifiering19, och Drug screening11. Dess flexibilitet är en av plattformens viktigaste egenskaper som möjliggör anpassning till varje applikation.

Här, ett protokoll för screening av tyrosinkinashämmare i självmonterade NAPPA arrayer presenteras. Plattformen är optimerad för visning av aktiva humana proteinkinaser och för analys av proteinkinas aktivitet, med låg bakgrund och hög dynamiskt omfång. Bland de ändringar som genomförs för att använda NAPPA för screening av kinashämmare inkluderar: I) förändringar i tryck kemi, II) de-fosforylering av proteinet microarray före kinashämmare screening, och III) optimering av detektion av fosforylerade proteiner på matrisen. Detta protokoll är den första i sitt slag och ger unik information om Kinas studie i nappa Microarrays.

Protocol

1. gemensamma buffertar och lösningar som ska användas

  1. Förbered TB medium: Terrific buljong (24 g/L jästextrakt; 20 g/L Tryptone; 4 mL/L glycerol; 0,017 M KH2Po4; och 0,072 m K2HPO4). 0,017 M KH2PO 4och 0,072 m k2HPO4 -lösningar kan köpas som en 10X fosfatbuffert (0,17 m KH2Po4 och 0,72 m k2HPO4).
  2. Förbered LB medium: Luria-Bertani (5 g/L jästextrakt; 10 g/L Tryptone; och 10 g/L NaCl). Justera pH till 7,0 med 5 M NaOH.
  3. Förbered 1x TBS: Tris-buffrad saltlösning (TBS: 50 mM Tris-cl, pH = 7,5; 150 mM NaCl).
  4. Förbered 1x TBST: TBS kompletterad med 0,1% Tween 20.

2. DNA-beredning

Anmärkning: DNA utnyttjas för NAPPA matriser måste vara mycket ren; Därför rekommenderas inte kommersiell DNA mini-Preps. För närvarande används två protokoll för DNA-förberedelse: i hus hög kapacitet mini-prep (beskrivs här) eller kommersiell MIDI-eller Maxi-prep. Den genomsnittliga genomströmningen i det egna mini-prep-protokollet är 1 500 prover per dag och person.

  1. Bakterietillväxt för egen hög kapacitet mini-prep
    1. Förbered LB/agar Omni plattan. Häll 30 – 40 mL LB-agar (1,5% bakteriologisk agar i LB-Media kompletterad med antibiotika för val av positiva kloner) i varje enskild brunn.
    2. Spot glycerol lager på LB/agar plattan. Späd glycerolbeståndet i LB-media (1:300, vanligen 2 μL i 600 μL LB). Skaka i 10 min. spot 3 μL av det utspädda beståndet på LB/agar plattan. Inkubera vid 37 ° c, upp och ner, över natten.
    3. Inokulera kulturer. Med hjälp av 96-stifts enhet som var steriliserad i 80% etanol och flamma, Inokulera kulturen från agarplattan i en djup-brunn block med 1,5 mL per brunn av TB medium kompletteras med antibiotika.
    4. Inkubera kulturer. Täck blocket med en gas genomsläpplig tätning och inkubera i 22 – 24 h vid 37 ° c, 300 – 800 RPM beroende på shaker.
      Obs: Shakers inställd på 800 RPM är optimala för denna inkubering. Användning av en långsammare shaker kan resultera i mindre täta kulturer och lägre DNA-rening avkastning.
    5. Pellets kulturer. Spinn block vid 3 800 x g och 4 ° c i 30 min. Kassera supernatanten.
  2. In-House hög kapacitet mini-prep
    Obs: Flerkanalslör eller automat automater kan användas för att utföra mini-prep i egen hög kapacitet. Om du använder en automatisk dispenser, se till att rengöra systemet före användning och i mellan lösningarna.
    1. Förbered alla lösningar som används under mini-prep:
      1. Bered lösning 1: resuspension t-buffert (50 mM Tris, pH = 8,0; 10 mM EDTA, pH = 8,0; 0,1 mg/mL RNAse). Förvaras vid 4 ° c.
      2. Förbered lösning 2: NaOH/SDS lysis buffert (0,2 M NaOH; 1% SDS). För bättre resultat bör en nygjord lösning användas.
      3. Förbered lösning 3: KOAC neutraliseringsbuffert (2,8 M KOAc). Justera lösningens pH till 5,1 med koncentrerad ättiksyra. Förvaras vid 4 ° c.
      4. Bered lösning N2: equilibrationbuffert (100 mM Tris; 900 mM KCl; 15% EtOH; 0,15% Triton X-100). Justera pH-värdet för lösningen till 6,3 med fosforsyra.
      5. Förbered lösning N3: bash buffert (100 mM Tris; 1,15 M KCl; 15% EtOH). Justera pH-värdet för lösningen till 6,3 med fosforsyra.
      6. Förbered lösning N5: elutionsbuffert (100 mM Tris; 1 M KCl; 15% EtOH). Justera pH-värdet för lösningen till 8,5 med fosforsyra.
        Anmärkning: framgångsrik kontroll av DNA-bindning, tvättning och eluering under anjonbyte är mycket beroende av buffert KCl koncentration och pH-värden. Noggranna buffert komponent mätningar och pH-justering är viktiga. Små avvikelser från de beskrivna mätningarna kan resultera i betydande förlust av avkastning.
    2. Återsuspendera pellets. Tillsätt 200 μL lösning 1 och skaka vid 2 000 rpm i 5 minuter vid RT. fullständig återfjädring av pelleten är nödvändig för lyckad Lys. Virvel blocket om det behövs.
    3. Lyse bakterier. Tillsätt 200 μL lösning 2, försegla plattan med en aluminium tätning och vänd 5x. Noggrant tid detta steg från början av lösning 2 tillägg. Överskrid inte 5 min.
    4. Neutraliserar lösningen. Tillsätt 200 μL lösning 3, försegla plattan med en aluminium tätning och vänd 5x. Tätningen kan vara lös på grund av lysis/neutraliseringsbuffertar, så var försiktig när du inverterar. En partiell inversion, där lösningen aldrig vidrör tätningen, rekommenderas för att förhindra korskontamination mellan proverna.
    5. Rensa lysate. Centrifugera plattorna vid 3 800 x g och 4 ° c i 30 min.
    6. Förbered anjonbytarharts flytgödsel under lysate pulverform pelleteringsmedel centrifugering steg. Använd en 1 L flaska, fyll den med anjonbytarharts tills den når 300 mL-märket, tillsätt sedan lösning N2 upp till 900 mL.
      FÖRSIKTIGHET: detta steg bör göras i huven för att skydda mot kiseldioxid inandning.
    7. Förbered anjonbytarplattor. Stapla filter plattorna ovanpå en djup brunn block att fungera som ett avfall uppsamlingskärl. Blanda anjonutbyte flytgödsel tills det är homogen, häll sedan i ett glas tråg. Med hjälp av bred-uttråkad P1000 tips, överföra 450 μL av slam i varje brunn av filter plattorna.
    8. Centrifugera staplade plattor (harts tallrik/djup brunn plattan) vid långsam acceleration för 5 min vid 130 x g och RT. Kassera flödet genom.
    9. Överför lysate supernatanten till kåda plattan/Deep well block stackar. Snurra de staplade plattorna i 5 min vid 30 x g med långsam ramp upp hastighet.
    10. Tvätta kolonnen. Tillsätt 400 μL lösning N3 (tvättbuffert) till varje brunn. Överför kådan plattan till vakuum grenröret för att ta bort tvättbuffert. Upprepa tvätt stegen 3x. På den sista tvätten, se till att alla brunnar är ordentligt tömda. Snurra staplarna på 150 x g i 5 minuter för att ta bort eventuell kvarvarande buffert.
    11. Elute DNA. Placera kådan plattan på en ren 800 μL uppsamlings platta. Tillsätt 300 μL lösning N5 till varje brunn. Låt det sitta vid RT i 10 min, snurra sedan de staplade plattorna i 5 min vid 20 x g med långsam ramp upp hastighet. Snurra de staplade plattorna i 1 min vid 233 x g.
    12. Kvantifiera DNA och förvara plattorna vid-20 ° c tills ytterligare användning eller gå vidare direkt till DNA-nederbörd.
      Anmärkning: minst 30 μg DNA per prov är nödvändigt. Om DNA-avkastningen är låg, rekommenderas att upprepa DNA mini-prep, eller alternativt kombinera två plattor under nederbörden steg (avsnitt 2,3).
  3. DNA-nederbörd
    1. Tina ut tallrikar, Vortex att homogenisera DNA-lösning, och snurra på 230 x g för 30 s för att samla in alla lösning i botten av brunnen.
    2. Tillsätt 40 μL av 3 M NaOAc och 240 μL isopropanol till varje brunn. Täck plattan med en aluminium tätning och blanda genom att invertera 3x.
    3. Centrifugera plattorna i 30 min vid 3 800 x g och 25 ° c. Kassera supernatanten noggrant.
      Anmärkning: för att kombinera två plattor, överför DNA från den andra plattan till pelleten från den första plattan och upprepa steg 2.3.2 – 2.3.3.
    4. Tvätta och Fäll upp DNA. Tillsätt 400 μL 80% etanol till varje brunn. Tätnings plattor med aluminium tätning och skaka vid 1 000 rpm i 30 min. Centrifugera vid 3 800 x g i 30 min vid 25 ° c. Kassera supernatanten.
    5. Torka DNA pellets. Placera plattorna upp och ner i en vinkel på pappershanddukar och låt dem torka i 1 – 2 h, tills ingen alkohol är närvarande på botten av brunnen. Försegla och centrifugera vid 230 x g i 2 min för att få ner pellets.
    6. När plattorna är torra, försegla antingen med aluminium tätning och frys vid-20 ° c för senare användning eller Fortsätt att Omsuspendera DNA (steg 4,1).

3. aminosilane Skjut beläggning

  1. Placera glas rutschbanorna i metall rack. Inspektera varje bild visuellt för att säkerställa att inga repor eller brister förekommer.
  2. Submerge diabilder i beläggnings lösning (2% behandlas reagens i aceton) för 15 min medan gunga. Aminosilanlösningen kan användas för att belägga två rack med 30 bilder vardera innan den behöver kasseras.
  3. Skölj steg. Sänk ned glid stället i aceton Wash (99% aceton), skaka fram och tillbaka, sedan upp och ner snabbt 5x. Luta till ett hörn för att droppa av, sedan dränera i Ultrapure vatten upp och ner snabbt 5x. Luta för att droppa av, sedan placera på servetter.
    Anmärkning: aceton Wash kan användas två gånger, medan ultrarent vatten måste bytas varje gång.
  4. Torra diabilder med pressade luft, blåser på dem från alla vinklar i ca 3 min tills alla vattendroppar har avlägsnats. Förvara de belagda bilderna på RT i ett metall rack inuti en tättsluten låda.

4. beredning av array-prov

  1. Omsuspendera DNA-pelleten från den egna mini-prep (steg 2.3.6) i 20 μl ultrarent vatten och skaka vid 1 000 RPM för 2 h. För MIDI/Max prep-DNA, späd varje prov till en slutlig koncentration på 1,5 μg/μL och överför 20 μL till en uppsamlings platta på 800 μL.
  2. Förbered utskrifts mixen. För 1 96 väl plattan, Förbered 1 ml tryckning mix [237,5 μl av ultrarent vatten; 500 μl av poly-lysin (0,01%); 187,5 μl av BS3 (BIS-sulfosuccinimidyl, 50 mg/ml i DMSO); och 75 μl av polyklonala anti-Flag Rabbit antikropp)].
    Anmärkning: kemikalierna bör läggas till i angiven ordning för att undvika nederbörd.
  3. Tillsätt 10 μL tryck blandning till varje prov, tätnings plattor med aluminiumfolie och skaka vid RT för 90 min vid 1 000 RPM. Förvara plattorna över natten (~ 16 h) vid 4 ° c.
  4. På tryck dagen, kort virvel och snurra plattorna. Överför 28 μL av varje prov till en 384 mat ris platta. Denna överföring kan göras med hjälp av automatisering eller en flerkanalspipett. Det är viktigt att hålla reda på placeringen av proverna i 384 array plattan.
  5. Snurra plattan en kort stund för att ta bort eventuella bubblor. Försegla plattorna med folie.

5. generering av NAPPA arrayer: microarray Printing

Obs: alla utskriftsförhållanden optimerades för instrumentet som listas i tabell över utrustning och material. Om du använder en annan matris kan ytterligare optimering krävas.

  1. Arrayer städa upp. Innan du börjar, Töm alla avfallstankar och fyll på behållarna med ultrarent vatten eller 80% etanol, om det behövs. Rengör pinnarna en i taget med luddfria våtservetter och ultrarent vatten. Torka stiften med luddfria våtservetter och försiktigt placera dem tillbaka i arrayer huvudet.
  2. Arrayer set up: skriva ut specifikationer [maximalt antal stämplar per tryckfärg: 1; antal frimärken per spot: 1; tidsinställning för flera stämplar:--; stämpeltid (MS): 0 MS; pennanteckningar tid (MS): 0 MS; Skriv djups justering: 90 μm; antal touch-offs: 0]. Följ sedan sterilisering protokoll: ultrarent vatten tvätta för 2 000 MS med 0 MS av torktid och 500 ms väntetid; Upprepa dessa steg 6x; följt av tvättning med 80% etanol för 2 000 MS med 1 200 MS av tork tid och 500 ms av väntetid; Upprepa dessa steg 6x.
  3. Bild design: Ställ in arrayer med önskat försköna mönster. Designen bör ta hänsyn till flera faktorer [dvs antalet repliker för varje prov, plats och antal kontrollfunktioner, array layout (ett block, flera identiska block), antal matriser som ska skrivas ut, längden på körningen, etc.].
  4. Placera behandlas belagda diabilder (steg 3,4) på arrayer däck. Kontrollera om dammsugaren håller alla bilder säkert på plats. Starta befuktaren (den bör ställas in på 60%).
  5. Placera 384 väl plattan på arrayer däck. Starta programmet.
  6. Märk mikromatriser. När utskriften är klar placerar du bild etiketterna på den nedre (ej utskrivna) sidan av varje bild. Underhåll utskriftsordningen för bilder på däcket i nummerordning.
  7. Förvara de tryckta matriserna på RT i ett metall rack inuti en tättsluten låda med ett kvarts paket. Glidbanor som hålls i torr miljö har en hållbarhetstid på upp till ett år.
  8. (Valfritt): en andra omgång 90-bilder kan skrivas ut med samma exempel. För att göra detta, ta bort 384 väl plattan från arrayer däcket så snart utskriften av plattan är klar. Försegla och förvara plattan vid 4 ° c. Efter den första omgången av arrayer är helt klar, ta bort dem från däcket, placera nya behandlas belagda diabilder och starta en ny körning. Se till att varje 384 väl plattan är på RT för 30 min innan den används. Om fler än fyra repliker per prov skrivs ut i en bunt med bilder, rekommenderas det att dela 384 brunnen plattor i två plattor för att minska prov avdunstning genom att minska den tid som tillbringas på arrayer däcket.
    Obs: Kontrollera alla reservoarer före början av den andra körningen.

6. detektion av DNA på NAPPA diabilder

  1. Blockera bilderna. Placera bilderna i en pipettbox och tillsätt 30 mL blockeringsbuffert. Inkubera vid RT för 1 h på en gungande shaker.
  2. Färga glasen. Kassera den blockerande lösningen och tillsätt 20 mL blockerande buffert och 33 μL fluorescerande DNA-interkalerande färgämne. Inkubera i 15 minuter med agitation. Skölj sedan snabbt glasen med ultrarent vatten och torka med pressad luft. Fortsätt med skanningen (avsnitt 11).

7. uttryck av NAPPA diabilder

  1. Blockera bilderna med blockeringsbuffert på en gungshaker vid RT för 1 h. Använd cirka 30 mL i en pipettbox för fyra diabilder.
  2. Skölj glasen med ultrarent vatten och torka med filtrerad tryckluft. Applicera tätningspackning på varje bild enligt tillverkarens anvisningar.
  3. Lägg till IVTT mix. Varje bild kommer att kräva 150 μL IVTT-blandning. Späd 82,5 μL av HeLa lysate i 33 μL DEPC-vatten och komplettera med 16,5 μL av tillbehörs proteiner och 33 uL reaktions mix. Lägg till IVTT mix från den icke-etikett eller icke-preparatet slutet. Pipettera blandningen långsamt (det är acceptabelt om det pärlor upp tillfälligt vid inlopps änden). Massera varsamt tätningspackningen så att IVTT-blandningen sprider sig och täcker hela området av matrisen. Applicera de små runda port tätningarna till båda portarna.
  4. Placera bilderna på ett stöd och överföra dem till den programmerbara kylande inkubator. Inkubera i 90 min vid 30 ° c för proteinuttryck, följt av 30 min vid 15 ° c för immobilisering av fråge proteinet.
  5. Tvätta och blockera diabilderna. Ta bort tätningspackningen och sänk ned diabilderna i en pipett med cirka 30 mL 1x TBST kompletterat med 5% mjölk för proteindisplay (avsnitt 8) eller 1x TBST kompletterat med 3% bovint serumalbumin (BSA) för kinasanalyser eller läkemedels screening (avsnitt 9). Inkubera vid RT med agitation i 20 min och upprepa detta steg 2x.

8. detektion av proteiner på NAPPARRAYER

  1. Tillsätt primär antikropp. Ta bort bilderna från den blockerande lösningen (steg 7,5) och torka försiktigt baksidan (ej tryckt sida) med en pappershandduk. Placera bilderna på ett stöd och applicera 600 μL primär antikropp (mus anti-flagga) utspädd 1:200 i 1x TBST + 5% mjölk. Inkubera i 1 h vid RT.
  2. Tvätta bilderna med 1x TBST + 5% mjölk på en gungande shaker (3x för 5 min vardera).
  3. Lägg till sekundär antikropp. Ta bort bilderna från tvättlösningen och torka försiktigt baksidan med hjälp av pappershandduk. Placera glidbanorna på ett stöd och applicera 600 μL sekundär antikropp (Cy3-labbeled anti-Mouse-antikropp) utspädd 1:200 i 1x TBST + 5% mjölk. Skydda bilderna från ljus och inkubera i 1 h vid RT.
  4. Tvätta bilderna med 1x TBST på en gungshaker (3x för 5 min vardera). Spola snabbt glasen med ultrarent vatten och torka med pressade luft. Fortsätt med skanningen (avsnitt 11).

9. tyrosinkinashämmare screening på NAPPA arrayer

Obs: flera bilder kan bearbetas i samma experiment, men se till att i varje steg, en bild bearbetas i taget och att de inte torkar mellan stegen. Lägg till alla lösningar på den icke-etikett eller icke-specimen slutet av bilden.

  1. Förbered alla lösningar som används under läkemedels screening:
    1. Bered fosfatas/DNase lösning genom att kombinera följande: 1x protein Metallo-fosfataser buffert (50 mM HEPER, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,01% Brij 35 vid pH = 7,5); 1 mM MnCl2; 8 000 enheter av lambda-proteinfosfataser; och 2 enheter av DNase I. Förbered 400 μL av lösningen för varje microarray. Tillsätt fosfatas och DNase strax före användning.
    2. Göra drogen utspädning. Läkemedel bereds i DMSO till en slutlig koncentration av 10 mM. För att säkerställa att alla läkemedelskoncentrationer testas på matrisen, se till att samma volym av DMSO (ett 10 000 x lager i DMSO) skapas för varje koncentration och hålls vid-80 ° c. Vid tidpunkten för användning, läkemedel späds 1:100 i vatten.
    3. Bered läkemedel/Kinas lösning genom att kombinera följande: 1x kinasbuffert (25 mM Tris-HCl av pH = 7,5); 5 mM beta-glycerofosfat; 2 mM DTT; 0,1 mM na3VO4; 10 mM MgCl2; 500 μM ATP; och 2 μL läkemedel (utspädd 1:100 i vatten). Förbered 200 μL av lösningen för varje microarray.
  2. Utföra fosfatas och DNase behandling. Ta bort diabilder från den blockerande lösningen (steg 7,5) och torka försiktigt baksidan med pappershandduk. Placera glidbanorna på stöd och applicera 200 μL fosfatas/DNase lösning. Placera en microarray täckslip för att undvika avdunstning. Inkubera vid 30 ° c i 45 min i ugnen.
  3. Fosfatas och DNase behandling II: ta bort matriser från ugnen, kassera täckslip, ta bort överflödig lösning, och tillämpa 200 μL av nytillverkat fosfatas och DNase lösning. Täck mikromatriser med täckslip och inkubera i ytterligare 45 min vid 30 ° c i ugnen.
  4. Tvätta diabilder med 1x TBST + 0,2 M NaCl på en gungande shaker (3x för 5 min vardera).
  5. Utföra läkemedelsbehandling och Kinas reaktion. Ta bort diabilder från tvättlösningen och torka försiktigt baksidan med en pappershandduk. Placera glidbanorna på stöd och applicera 200 μL av läkemedels-/kinaslösningen. Placera en täckslip ovanpå för att undvika avdunstning. Inkubera i ugnen i 1 h vid 30 ° c.
  6. Tvätta diabilder med 1x TBST + 0,2 M NaCl på en gungande shaker (3x för 5 min vardera).
  7. Upprepa steg 8.1 – 8.4 med som primär antikropp antifosho-Tyr antikropp utspädd 1:100. Ersätt 1x TBST + 5% mjölk i alla steg med 1x TBST + 3% BSA.

10. automatiserat hybridiserings protokoll

Obs: Alternativt kan en hybridiseringsstation användas för att automatisera alla hybridiseringar och tvättar på NAPPA-matriserna (avsnitten 7 – 9) och protokollet tillhandahålls som tilläggsfil 1.

11. bild förvärv

Obs: microarray bilder bör förvärvas med en upplösning på 20 mikrometer eller högre.

  1. Fyll på mikromatriser i bild hållarens magasin med proteinerna vända uppåt. Fyll på magasinet i microarray-skannern.
  2. Välj den gröna lasern med ett 575/30 Nm emissions filter för att skanna signalen från CY-3-märkt sekundär antikropp. Om en annan fluorophore används, Välj rätt laser/våglängd för att upptäcka signalen från fluorescerande färgämne.
  3. Definiera namnet för varje bild och den plats som de ska sparas.
  4. (Valfritt): för varje ny fluorophore rekommenderas optimering av skannings förhållandena för att detektera den linjära räckvidden för signalintensiteten. För att göra detta, skanna en microarray med ett intervall av Fotomultiplikator (PMT) och Gain tills en klar bild erhålls med icke-mättad signal och låg bakgrund.
  5. Sök igenom alla mikromatriser med de optimerade inställningarna och kom ihåg att stänga av autogain.
    Anmärkning: för dataanalys ska alla mikromatriser skannas med samma skanningsinställningar. För Kinas-analyser som använder Cy3 som fluorophore, skannas bilderna med en 20% PMT, laserintensitet på 25% och 10 mikrometer upplösning, med hjälp av skannern som anges i tabellen över utrustning och material.

12. data behandling och analys

Obs: flera mjukvarupaket är tillgängliga för kvantifiering av mikromatrisens data med liknande funktioner. Det förfarande som beskrivs här utformades för programvaran som anges i tabellen av utrustning och material.

  1. Ladda TIFF-filer som ska kvantifieras, designa rutnätet för att matcha microarray layout och justera storleken på fläckarna att införliva hela signalen med minsta möjliga område. Angränsande platser bör inte överlappa varandra. Inspektera visuellt hur bra programvaran presterar och justera rutnätet manuellt om det behövs.
  2. Kvantifiera mikromatrisens signalintensitet. Inspektera fläckarna visuellt för eventuella onormala (icke-specifika bindningar, damm, etc.) och ta bort dem från dataanalysen.
  3. Korrigera bakgrunden lokalt med hjälp av signalen från angränsande områden på matrisen där ingen plats är närvarande.
  4. Normalisera data. För att jämföra signalen mellan olika arrayer måste signalintensiteten för varje mikromatris normaliseras. För att utesluta alla avvikare, normalisera data med hjälp av den trimmade medelvärdet 30% av signalen från den positiva kontrollen (IgG fläckar) av defosforylerade mikromatriser.
    Obs: signalen från IgG-punkten ändras inte under fosforylering och Defosforylering av mikromatriser och är lämplig för normalisering.
  5. Identifiera aktiva kinaser. För varje funktion som visas på mikromatrisen, beräkna förhållandet mellan den normaliserade signalintensiteten i de autophosphorylated och defosforylerade arrayer. Ange ett tröskelvärde på 1,5-faldig förändring för identifiering av de aktiva kinaser och markera alla andra funktioner som inte kan genomgå autophosphorylation (N/A).
  6. Beräkna aktiviteten för varje Kinas som identifierats i steg 12,5 som en procentsats av justerad signal (signalintensiteten hos den normaliserade positiva kontroll matrisen (DMSO) subtraberas av signalintensiteten hos den normaliserade negativa kontroll matrisen (defosforylerad).

Representative Results

Egenmonterade NAPPA Microarrays ger en solid plattform som kan användas för många olika tillämpningar, inklusive biomarkör upptäckt, protein-protein interaktioner, substrat identifiering, och Drug screening10,11 ,12,13,14,15,16,17,18,19,20.

Den övergripande metod som antagits för studier av Kinas aktivitet och screening av tyrosinkinashämmare på NAPPA-mikromatriser är schematiskt representerad i figur 1. Första, NAPPA Microarrays genereras av immobilisering av cDNA och fånga agent på belagda Microarrays. Den cDNAs används sedan som en mall för transkription och översättning av proteiner, med hjälp av en human-baserade IVTT system, och de nya syntetiserade proteiner immobiliseras av Capture agent9. Kvaliteten på den tryckta microarray kan övervakas genom att mäta nivåer av DNA (bekräftar konsekvent utskrift) eller protein som visas på matrisen (bekräftar proteinuttryck och fånga; Figur 1). För att minska bakgrunds signalen och öka experimentets dynamiska omfång behandlas mikromatriserna med 1) lambda-fosfatas för att avlägsna fosforylering från rester av ser/THR/Tyr, sedan med 2) DNase för att förenkla kemin på plats och minska bakgrund (figur 1).

Nästa steg är autophosphorylation reaktionen, där Microarrays inkuberas med Kinas buffert i avsaknad av ATP (negativ kontroll array, kallad defosforylerade mikromatriser), och Kinas buffert kompletteras med ATP (positiv kontroll, kallas för autophosphorylerade arrayer) eller ATP + DMSO (fordonskontroll). Det bör understrykas att under detta steg, ingen Kinas tillsätts; Därför är den inneboende aktiviteten hos varje Kinas som visas på mikromatrisen kvantifieras genom mätning av dess fosforylationsnivåer med hjälp av en pan anti-Phospho-tyrosin antikropp följt av en Cy3-labbeled sekundär antikropp (figur 1).

Kvalitetskontroll av NAPPA-Kinas matriser som visar en panel av humana proteinkinaser tryckta i fyrdubblat visas i figur 2. Nivåerna av immobiliserat DNA mättes genom DNA-färgning och det visade en jämn signal över microarray, vilket tyder på mängden DNA tryckt på matrisen var enhetlig. Det är också möjligt att observera flera funktioner utan DNA-färgning. Dessa funktioner motsvarar vissa kontroller där DNA uteslöts från tryck mixen [dvs. tomma fläckar (ingenting skrevs ut), vatten fläckar, renad IgG spot (poly-lysin, crosslinker och renat IgG), tryckning mix endast (komplett tryckning mix: Poly-lysin Plus crosslinker och anti-Flag antikropp, utan DNA)]. Nivåerna av protein som visas på NAPPA-Kinas mikromatriser bedömdes efter IVTT reaktion med anti-tagg antikropp.

För Kinas screening, flagga användes som taggen för val och nivån av protein som visas på microarray mättes med hjälp av en anti-Flag antikropp. Som visad, de flesta fläckar som innehåller cDNA framgångsrikt visat detekterbara nivåer av protein. Några av de kontrollpunkter utan cDNA också avslöjade signal med anti-flagga antikropp: IgG spot (används för att detektera aktiviteten hos den sekundära antikroppen) och tomma vektor fläckar (cDNA-koder för taggen endast) (figur 2). NAPPA-Kinas mikromatriser visade god reproducerbarhet bland diabilder, med korrelationen av nivåerna av protein Visa bland distinkta partier tryckning högre än 0,88 (figur 2). Inom samma parti var korrelationen ännu högre, nära 0,92 (data ej visad).

Därefter mättes den Kinas autophosphorylation aktiviteten hos de proteiner som visades på matrisen med anti-fosfortyrosinantikroppar (figur 3). Protein som visas på matrisen visade höga halter av proteinfosforylering efter uttryck (figur 3, vänster), som kan orsakas av inneboende Kinas aktivitet av proteinet som visas på matrisen eller av aktiva kinaser som finns i ivtt-blandningen. Denna fosforylering avlägsnades helt med Lambda fosfatasbehandling och dessa mikromatriser användes för kinasanalyserna. Efter Defosforylering uppvisade autophosphorylationsreaktioner som utfördes utan ATP inga signifikanta nivåer av fosforylering, som förväntat, medan mikromatriser inkuberas med Kinas buffert i närvaro av ATP visade proteinfosforylering så snabbt som 15 min ( Figur 3). För läkemedels screening, var Kinas aktivitet mätt efter 60 min av autophosphorylation reaktion att maximera antalet kinaser testas.

Jämförelsen mellan mikromatriser där fosforyleringsnivåer mättes direkt efter protein uttrycket (figur 3, vänster) och efter 60 min av autophosphorylation reaktion (figur 3, höger) visade: i) proteiner fosforyleras endast efter uttryck, vilket tyder på att de kan vara exogent fosforyleras av proteiner som finns på IVTT blandningen, men kan inte vara autophosphorylated; II) proteinfosforyleras först efter autophosphorylationsreaktionen, vilket tyder på att dessa proteiner inte var aktiva efter proteinuttryck och att de nödvändiga co-faktorerna i kinasbufferten var aktiva. eller III) proteinfosforyleras på båda matriserna, vilket tyder på att de var aktiva i båda inställningarna (figur 3).

Som ett exempel på de resultat som erhållits för screening av tyrosinkinashämmare på NAPPA-kinasmatriser användes tre kinaser-hämmare med distinkt selektivitet över proteinkinaser: staurosporine, imatinib och ibrutinib. För alla filmvisningar, var defosforylerade NAPPA Microarrays inkuberas med ökande koncentrationer av TKI (från 100 nM till 10 uM) under autophosphorylation reaktionen. Den första TKI testade var staurosporine, en global proteinkinashämmare, som visade potent Kinas hämning på microarray över nästan alla kinaser testade11.

Därefter testades imatinib, en ABL-och c-kit-hämmare som används för behandling av kronisk myelogen leukemi och gastrointestinala stromacellstumörer4,5,6,7. På NAPPA-kinasmatriser visade imatinib en signifikant reduktion av Abl1 och BCR-Abl1 aktivitet medan andra kinaser förblev mestadels opåverkade (figur 4a). Data kvantifiering för Kinas aktivitet normaliserades mot defosforylerade matrisen och representeras som en procentandel av den positiva kontrollen microarray (endast fordon). Data för TNK2 (icke relevant Kinas), Abl1 och BCR-Abl1 visas i figur 4b. Som väntat uppvisade imatinib selektiv hämning mot Abl1 och BCR-ABl1. Data för c-kit var ofullständiga på grund av bristande aktivitet på de positiva kontrollmatriser.

Slutligen testades ibrutinib, en FDA-godkänd kovalent hämmare av Brutons tyrosinkinas (BTK). Ibrutinib används för närvarande vid behandling av flera blodrelaterade cancerformer med överaktiv BTK, inklusive kronisk lymfatisk leukemi (KLL), mantelcellslymfom och Waldenströms makroglobulinemi21,22. Figur 4c, är representativt för typiska resultat som erhållits för screening av ibrutinib. Kinas aktivitet av ABL1 (icke relevant Kinas) och BTK (kanoniskt mål) och ERBB4 (potentiellt nytt mål) visas i figur 4D. Uppgifterna antyder ERBB4 kan hämmas av ibrutinib på ett dosspecifikt sätt. Denna hämning bekräftades in vitro och i cell-baserade analyser11, visar kraften i denna plattform.

Sammantaget, data tyder på att NAPPA-Kinas microarray plattform kan användas för opartisk screening av TK-hämmare. Dessutom är screening snabb och kan enkelt anpassas för att inkludera någon variant av proteinkinaser av intresse.

Figure 1
Figur 1: schematisk representation av kvalitetskontroll och screening av tyrosinkinashämmare i NAPPA-arrayer. NAPPA matriser är tryckta med cDNA kodning för protein av intresse smält med en tagg och en Capture antikropp. Under in vitro transkription och översättning reaktion (IVTT) de syntetiserade proteiner fångas på microarray ytan genom taggen av Capture antikropp. Den kvalitetskontroll (QC) av arrayer utförs genom mätning av DNA-nivåer tryckt på bilden, med hjälp av en fluorescerande DNA-intercalating färgämne, och de nivåer av protein som visas på matrisen med hjälp av taggspecifika antikroppar. För Kinas screening, mikromatriser behandlas med DNase och fosfatas, efter IVTT reaktion, att ta bort den tryckta DNA och all fosforylering som kan ha inträffat under proteinsyntesen. Den defosforylerade arrayer är nu redo att användas för drogen skärmen. För varje analys används rutinmässigt tre uppsättningar kontroller: i) defosforylerade arrayer, i vilka autophosphorylationsreaktionen utförs utan ATP. II) autophosphorylated microarrayer, där autophosphorylation reaktionen utförs i närvaro av ATP; och (III) DMSO behandlade array (fordon), där autophosphorylation reaktionen utförs med ATP och DMSO. De diabilder som behandlas med olika koncentrationen av kinashämmare följer exakt samma protokoll som används för DMSO behandlade arrayer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa resultat av kvalitetskontroll för egenmonterade NAPPA-kinasmatriser. DNA-halt mätt med fluorescerande DNA-interkalating Dye (vänster) och nivåer av protein som visas på mikromatrisen mätt med anti-Flag antikropp (mitten) visas. På höger sida är en korrelation Plot av nivåerna av protein som visas på två NAPPA-Kinase matriser tryckt i separata partier. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa resultat av Kinas aktivitet i NAPPA-kinasmatriser. Mikromatriser som visar proteinkinaser i fyrplicate användes för att studera proteinkinas aktivitet på matrisen genom mätning av proteinfosforylering med anti-pTyr-antikropp, följt av Cy3-märkt anti-mus-antikropp. Kontroll arrayer utan fosfatas/DNase behandling och utan ATP under autophosphorylation reaktionen användes för att mäta bakgrunden fosforylering efter proteinuttryck (efter uttryck). De återstående mikromatriser behandlades med fosfatas/DNA, och autophosphorylation reaktionen utfördes utan ATP (defosforylerade microarray, negativ kontroll) eller med ATP (autophosphorylated Microarrays). För de autophosphorylated mikroarrayer utfördes autophosphorylation reaktionen för 15 min, 30 min, 45 min, eller 60 min, som visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: representativa data från tyrosinkinasskärmen på NAPPA-kinasmatriser. (A) fosfatas/DNase-behandlade nappa-Kinas-matriser inkuberades i ökande koncentrationer av imatinib under autophosphorylationsreaktionen och Kinas aktivitet var en åtgärd med anti-fosfolytyr-antikropp. B) kvantifiering av Kinas aktivitet som observerats på nappa-kinasmatriser som exponerats för imatinib. Data normaliserades mot signalen från de negativa kontrollmatriserna (defosforylerade) och det visas som en procentandel av de positiva kontrollmatriserna (autophosporylationsreaktion utförd i närvaro av DMSO). Liknande data visas för screening av ibrutinib (C, D). Denna siffra har modifierats från Rauf et al.11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1. Alternativt protokoll för screening av tyrosinkinashämmare i NAPPAMATRISER med hjälp av en automatiserad hybridiserings Station. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Discussion

Ändringar och felsökning
Under optimeringsfasen av studiet av Kinas aktivitet på NAPPA matriser, en av de viktigaste källorna till bakgrund och låg dynamiskt omfång observerats var BSA används på tryckning mix. BSA tillhandahöll de primära aminer som krävdes för tvärbindning med aminosilanytan och fångade DNA och Capture antikroppen på plats. BSA är dock mycket fosforylerat, vilket gör det svårt för detektion av autophosphorylation signalen på matrisen ovanför bakgrundsljud. För att lösa detta problem, flera alternativ för BSA i Tryck blandningen testades, och Poly-lysin identifierades som bra substitut. Poly-lysin saknar någon fosforylering webbplats; Därför är bakgrunden från icke-uttryckta matriser mycket minimal. Dessutom, Microarrays tryckt med poly-lysin är reproducerbara och Visa bra nivåer av proteiner (figur 2).

Nästa kritiska modifiering utförs på standard NAPPA analysen var tillsats av ett fosfatas/DNase behandlingssteg. Behandlingen av mikromatriser med fosfatas gör det möjligt att avlägsna all fosforylering som inträffade i IVTT-blandningen under proteinsyntesen och Capture (figur 3). Källan till denna fosforylering kan vara från inneboende autophosphorylation aktivitet eller från aktiviteten av kinaser närvarande i IVTT blandningen. Avlägsnandet av all fosforylering efter uttrycket tillät enkel identifiering av de kinaser som är aktiva och kan genomgå autophosphorylation (figur 3).

Kritiska steg inom protokollet
NAPPA är en robust teknik, men som väntat finns det flera kritiska steg. Den första är förvärvet av hög kvalitet DNA i lämplig koncentration. Med hjälp av DNA av dålig kvalitet eller i låga koncentrationer kommer att generera dålig kvalitet mikromatriser med flera funktioner som inte uttrycks och visas i lämpliga nivåer, minska antalet proteiner som analyseras på matrisen. Det andra kritiska steget är uttrycket av proteiner på mikromatrisen. Användningen av ett IVTT-system som kommer att uttrycka höga halter av funktionellt protein är avgörande för att studera Kinas aktivitet på matrisen.

Nästa kritiska steg på TKI-screeningen är hur mikroarrayer hanteras. Mikroarrayer bör inte torka under något steg i protokollet, och skonsam hantering rekommenderas för att förhindra repor som kan öka bakgrunds signalen. Eftersom matriserna från hela experimentet kommer att jämföras mot varandra är det viktigt att försäkra att varje inkubering steg är jämnt över alla bilder. Till exempel bör den tid som krävs för att utföra ett steg i en enda matris beaktas när en batch med 20 matriser bearbetas för att förhindra skillnader i längden på inkubering över matriser.

Slutligen är utformningen av experimentet och införandet av både positiva och negativa kontroller avgörande för kvalitetskontroll och dataanalys. Den första uppsättningen kontroller är de som skrivs ut i varje matris och innehåller negativa kontroller [dvs tomma fläckar (utan material tryckt), vatten eller tom vektor (endast uttryckliga taggen)], samt en positiv kontroll (dvs. renat IgG, som upptäcks av sekundär antikropp och är inert mot förändring i fosforyleringsnivåer). Tillsammans mäter de bakgrundsnivåerna i mikromatrisen, möjliga överföring under utskriften och signalintensiteten hos detektionsmetoden.

Nästa uppsättning kontroller är Drug screening kontroller och inkluderar defosforylerade och autophosphorylated mikromatriser (i närvaro eller frånvaro av DMSO). Som tidigare nämnts mäter den defosforylerade mikromatrisen nivån av fosforylering efter fosfatasbehandling och därmed basnivån för alla andra experiment. Ju lägre baslinjenivå är, desto högre dynamiskt omfång av analyserna. De autophosphorylated arrayer presentera den maximala fosforylering nivåer av alla arrayer och signalen bör vara stark och tydlig. Det används för dataanalys, men också som en kontroll att alla reaktioner utfördes framgångsrikt på matrisen.

Begränsningar av tekniken
Från och med nu, en av begränsningarna i drogen screening presenteras här är dess förmåga att avskärma endast proteinkinaser som kan vara autophosphorylated. Ett möjligt sätt att övervinna detta är att skriva ut en Kinas och kända substrat på samma plats. Co-Printing av DNA för två distinkta proteiner framgångsrikt åstadkommit15, vilket tyder på genomförbarheten av detta tillvägagångssätt. Dessutom kan proteinet som visas på matrisen inte vikas korrekt vilket resulterar i ett inaktivt protein. Användningen av mänskligt baserat uttrycks system gjorde en signifikant förbättring av Kinas aktivitet mätt på matrisen; men vissa proteiner kan fortfarande inte analyseras på matrisen på grund av dess inaktivitet.

En andra begränsning är mätningen av fosforylering med hjälp av en pan anti-Phospho-Tyr antikropp. Trots dess bristande specificitet när det gäller motivet på fosforylationsstället inträffade alla uppmätta fosforyleringar på tyrosinrester, vilket lämnade efter seriner och treoniner och deras respektive kinaser. Hittills har mer än 10 Pan Phospho-ser/THR antikroppar testats utan framgång, trots flera försök att optimera inkubering och tvätt villkor. Ett nytt detektionssystem som är oberoende av antikroppar kan vara det bästa alternativet för att utöka antalet proteinkinaser som kan undersökas för läkemedelshämmande. I detta sammanhang finns några alternativ tillgängliga, inklusive radioaktivitet eller kemiska metoder som Klicka konjugering. En serie optimeringar krävs för att minimera bakgrunds signalen och ge ett bra dynamiskt omfång för analyserna.

Den tredje begränsningen är förvärvet av cDNA-kloner som ska tryckas på matrisen. CDNA-klonerna kan genereras med hjälp av alla kloningstekniker, inklusive platsspecifika återkombinations system, till exempel Creator eller gateway23. Ett annat alternativ är att köpa klonerna från DNAsu biblioteket, finns på < https://Dnasu.org/dnasu/Home.do >, där mer än 17 000 cDNAs kloner, inklusive hela mänskliga kinome, är lätt tillgänglig för att användas för byggande av NAPPA arrayer24 .

Den fjärde begränsningen är att inte varje laboratorium är utrustat med lämplig utrustning för att tillverka och avskärma sina egna NAPPA arrayer. Detta protokoll ger alternativa metoder för att generera DNA som ska skrivas ut på microarray, utan behov av hög kapacitet utrustning, och protokoll för att manuellt utföra alla hybridisering steg. Dock är tillgång till en arrayer och microarray Scanner fortfarande nödvändigt. Ett alternativ för att övervinna denna fråga är att använda NAPPA Core service och anläggning, finns på < http://nappaproteinarray.org/>, som distribuerar anpassade NAPPA Microarrays till ett icke-vinstdrivande akademiska priset. Slutligen kan de data som erhålls på matriserna, liksom i alla screeningmetoder, vara mottagliga för artefakter (antingen positiva eller negativa) och bör därför valideras med hjälp av ortogonala analyser.

Betydelse med avseende på befintliga metoder
Flera plattformar finns kommersiellt tillgängliga för screening av proteinkinaser. En metod som används rutinmässigt är bindande analyser, som kan utföras med proteinfragment, Kinas domän, större proteinfragment med Kinas domän och vissa reglerande regioner, och även fullängds proteiner. Proteinerna uttrycks vanligtvis i bakteriella system på grund av kostnaden och enkelheten i uttrycket och renings protokollen. Samspelet mellan drogen av intresse och proteinet mäts sedan med någon typ av rapport assay som fluorescens eller förekomst av taggar, till exempel. Den huvudsakliga begränsningen av denna uppsättning av metoder är det faktum att proteinet inte nödvändigtvis är aktiv under interaktionen med drogen, vilket kan resultera i identifiering av falskt positiva och falskt negativa interaktioner. Proteinfragment är särskilt sårbara för förändringar i konformation och brist på aktivitet och alla data som erhålls bör valideras med hjälp av aktiva proteiner, företrädesvis i sin fullängds form. En annan begränsning av vissa av plattformarna är förmågan att avskärma endast ATP analoger, begränsa dess övergripande användning.

De flesta av de kommersiellt tillgängliga tjänster för screening av TKIs med enzymatiska baserade metoder utnyttja endast vilda typ versioner av Kinas intresse, och ibland bara en utvald några mutanter. Att veta att läkemedelsresistens är mycket vanligt hos patienter som behandlas med TKI, det är viktigt att kunna mäta läkemedelssvar i olika mutanter, för val av den lämpligaste hämmaren. På grund av NAPPAS natur, screening av Kinas mutanter är enkel och kan lätt åstadkommas, och det enda nödvändiga verktyget är införlivandet av Kinas Mutant i NAPPA cDNA samling, som kan göras genom platsspecifika mutagenes, till exempel.

Framtida tillämpningar
En av de vanligaste formerna av behandling förflyta i cancerbehandling med kinashämmare är förvärvet av mutationer i drogen målet under en behandling kurs. Screening av dessa mutanter avseende deras svar på kinashämmare är av avgörande betydelse för valet av andra/tredje generationen av TKIs för att uppnå en personlig behandling för varje patient. Den drog screening strategi som presenteras här, ger en opartisk screening plattform där någon tyrosinkinashämmare kan testas mot en panel av tyrosinkinaser som finns i det mänskliga genomet. Eftersom proteinerna som visas på NAPPA-matriserna uttrycks in vitro från cDNA tryckt på bilden, kan alla mutanta varianter enkelt införlivas i cDNA-samlingen för att visas på matrisen. Anläggningen där Kinas mutanter kan genereras och uttryckas på matrisen, kombinerat med den höga kapaciteten hos NAPPA-tekniken, ger en unik miljö för studiet av kinasmutanter och deras respons på läkemedel, vilket gör NAPPA lämpligt för personlig drog screening, ett av målen för precisionsmedicin.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill tacka alla på LaBaer ' s Lab för deras hjälp och kritik under projektets utveckling. Detta projekt stöddes av NIH Grant U01CA117374, U01AI077883 och Virginia G. Piper Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
364 well plates (for arraying) Genetix x7020
800 µL 96-well collection plate Abgene AB-0859
96-pin device Boekel 140500
Acetic Acid Millipore-Sigma 1.00066
Acetone 99.9% Millipore Sigma 650501
Aluminum seal for 96 well plates VWR 76004-236
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) Pierce 80370
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Millipore Sigma F3165
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) Millipore Sigma F7425
ATP 10 mM Cell Signaling 9804S
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Millipore-Sigma G9422
bacteriological agar VWR 97064-336
Blocking Buffer ThermoFisher/Pierce 37535
Brij 35 ThermoFisher/Pierce BP345-500
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) ThermoFisher/Pierce 21580
BSA (bovine serum albumin) Millipore Sigma A2153
Coverslip 24 x 60 mm VWR 48393-106
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-165-150
DeepWell Block, case of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0661
DEPC water Ambion 9906
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Millipore-Sigma D8418
DNA-intercalating dye Invitrogen P11495
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
DTT Millipore-Sigma 43816
EDTA Millipore-Sigma EDS
Ethanol 200 proof Millipore-Sigma E7023
Filter plates Millipore-Sigma WHA77002804
Gas Permeable Seals, box of 50 ThermoFisher/AbGene AB-0718
Glass box Wheaton 900201
Glass slides VWR 48300-047
Glycerol Millipore-Sigma G5516
HCl (Hydrochloric acid) Millipore-Sigma H1758
HEPES Buffer Solution Millipore-Sigma 83264
Human-based IVTT system Thermo Scientific 88882
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule ThermoFisher/Pierce 31202
Isopropanol Millipore-Sigma I9516
KCl (Potassium chloride) Millipore-Sigma P9333
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) Millipore-Sigma P5655
Kinase buffer Cell Signaling 9802
KOAc (Potassium acetate) Millipore-Sigma P1190
Lambda Protein Phosphatase new england biolabs P0753
Lifterslips, 24 x 60 mm ThermoFisher Scientific 25X60I24789001LS
Metal 30-slide rack with no handles Wheaton 900234
MgCL2 (Magnesium chloride) Millipore-Sigma M8266
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) Millipore-Sigma S6508
NaCl (Sodium Chloride) Millipore-Sigma S3014
NaOAc (Sodium acetate) Millipore-Sigma S2889
NaOH (Sodium hydroxide) Millipore-Sigma S8045
NucleoBond Xtra Midi / Maxi Macherey-Nagel 740410.10 / 740414.10
Nucleoprep Anion II Macherey Nagel 740503.1
Phosphoric Acid Millipore-Sigma 79617
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) Millipore-Sigma A-005-C
Protein Phosphatase (Lambda) New England Biolabs P0753
RNAse Invitrogen 12091021
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma L6026
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Millipore-Sigma 05030
Sealing gasket Grace Bio-Labs, Inc 44904
Silica packets VWR 100489-246
Single well plate ThermoFisher/Nalge Nunc 242811
Sodium acetate (3M, pH 5.5) Millipore-Sigma 71196
TB media (Terrific Broth) Millipore-Sigma T0918
Tris IBI scientific IB70144
Triton X-100 Millipore-Sigma T8787
Tryptone Millipore-Sigma T7293
Tween 20 Millipore-Sigma P9416
Yeast Extract Millipore-Sigma Y1625
Name Company Catalog number Comments
Equipments Maker/model
Programmable chilling incubator Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling
Shaker for bacterial growth ATR Multitron shaker
Vacuum manifold with liquid waste trap MultiScreenVacuum Manifold 96 well
96 well autopippetor/liquid handler Genmate or Biomek FX
Liquid dispenser Wellmate
DNA microarrayer Genetix QArray2
Automatic hybridization station Tecan HS4800 Pro Hybridization Station
Microarray scanner Tecan PowerScanner
Microarray data quantification Tecan Array-ProAnalyzer 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nature Review Drug Discovery. 3 (12), 993-994 (2004).
  2. Patterson, H., Nibbs, R., McInnes, I., Siebert, S. Protein kinase inhibitors in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 176 (1), 1-10 (2014).
  3. Wu, P., Nielsen, T. E., Clausen, M. H. FDA-approved small-molecule kinase inhibitors. Trends Pharmacological Sciencies. 36 (7), 422-439 (2015).
  4. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2 (5), 561-566 (1996).
  5. Heinrich, M. C., et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 96 (3), 925-932 (2000).
  6. Stagno, F., et al. Imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia: frontline treatment and long-term outcomes. Expert Review Anticancer Therapy. 16 (3), 273-278 (2016).
  7. Ben Ami, E., Demetri, G. D. A safety evaluation of imatinib mesylate in the treatment of gastrointestinal stromal tumor. Expert Opinions in Drug Safety. 15 (4), 571-578 (2016).
  8. Ramachandran, N., et al. Self-assembling protein microarrays. Science. 305 (5680), 86-90 (2004).
  9. Festa, F., et al. Robust microarray production of freshly expressed proteins in a human milieu. Proteomics Clinical Applications. 7 (5-6), 372-377 (2013).
  10. Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (29), E4238-E4247 (2016).
  11. Rauf, F., et al. Ibrutinib inhibition of ERBB4 reduces cell growth in a WNT5A-dependent manner. Oncogene. 37 (17), 2237-2250 (2018).
  12. Anderson, K. S., et al. Protein microarray signature of autoantibody biomarkers for the early detection of breast cancer. Journal of Proteome Research. 10 (1), 85-96 (2011).
  13. Wang, J., et al. Plasma Autoantibodies Associated with Basal-like Breast Cancers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention. 24 (9), 1332-1340 (2015).
  14. Bian, X., et al. Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays. Journal of Proteome Research. 16 (1), 195-203 (2017).
  15. Song, L., et al. Identification of Antibody Targets for Tuberculosis Serology using High-Density Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (4 suppl 1), S277-S289 (2017).
  16. Wang, J., et al. Comparative Study of Autoantibody Responses between Lung Adenocarcinoma and Benign Pulmonary Nodules. Journal of Thoracic Oncology. 11 (3), 334-345 (2016).
  17. Montor, W. R., et al. Genome-wide study of Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein immunogenicity using self-assembling protein microarrays. Infection and Immunity. 77 (11), 4877-4886 (2009).
  18. Tang, Y., Qiu, J., Machner, M., LaBaer, J. Discovering Protein-Protein Interactions Using Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Current Protocols in Cell Biology. 74, 11-15 (2017).
  19. Yu, X., et al. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (click chemistry)-based detection of global pathogen-host AMPylation on self-assembled human protein microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (11), 3164-3176 (2014).
  20. Anderson, K. S., et al. Autoantibody signature for the serologic detection of ovarian cancer. Journal of Proteome Research. 14 (1), 578-586 (2015).
  21. Woyach, J. A., Johnson, A. J., Byrd, J. C. The B-cell receptor signaling pathway as a therapeutic target in CLL. Blood. 120 (6), 1175-1184 (2012).
  22. Smith, M. R. Ibrutinib in B lymphoid malignancies. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 16 (12), 1879-1887 (2015).
  23. Festa, F., Steel, J., Bian, X., Labaer, J. High-throughput cloning and expression library creation for functional proteomics. Proteomics. 13 (9), 1381-1399 (2013).
  24. Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Research. 42, D1253-D1260 (2014).

Tags

Biokemi självmonterade proteinmikromatriser läkemedels screening proteinkinasanalys tyrosinkinashämmare hög dataflöde screening Screen of kinashämmare NAPPA protein microarray
Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Festa, F., Labaer, J. Kinase… More

Festa, F., Labaer, J. Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (152), e59886, doi:10.3791/59886 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter