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Immunology and Infection

स्वचालित छवि प्रसंस्करण का उपयोग कर विखंडन और Budding खमीर में लिपिड ड्रॉपलेट सामग्री का विश्लेषण

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Science, Charles University

Summary

यहाँ, हम स्वचालित पता लगाने और विखंडन और नवोदित खमीर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों में लिपिड बूंदों के मात्रात्मक विवरण के एक MATLAB कार्यान्वयन प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

लिपिड चयापचय और इसके विनियमन दोनों बुनियादी और लागू जीवन विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के लिए ब्याज की हैं. इस संबंध में, विभिन्न खमीर प्रजातियों लिपिड चयापचय अनुसंधान में या औद्योगिक लिपिड उत्पादन के लिए मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है. लिपिड बूंदों अत्यधिक गतिशील भंडारण निकायों रहे हैं और उनके सेलुलर सामग्री लिपिड चयापचय राज्य का एक सुविधाजनक readout का प्रतिनिधित्व करता है. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सेलुलर लिपिड बूंदों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पसंद की एक विधि है, क्योंकि यह व्यापक रूप से उपलब्ध उपकरणों पर निर्भर करता है और व्यक्तिगत लिपिड बूंदों के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा, सूक्ष्म छवि विश्लेषण स्वचालित किया जा सकता है, बहुत समग्र विश्लेषण throughput बढ़ रही है. यहाँ, हम स्वचालित का पता लगाने और तीन अलग मॉडल खमीर प्रजातियों में व्यक्तिगत लिपिड बूंदों के मात्रात्मक विवरण के लिए एक प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक कार्यप्रवाह का वर्णन: विखंडन खमीर Schizosaccharomyces pombe और शिजोसाकेरोमायस जैपोनिकस, और नवोदित खमीर सैकेरोमाइस सेरेविएस. लिपिड बूंदों BODIPY 493/503 के साथ कल्पना कर रहे हैं, और सेल-अपारगम्य फ्लोरोसेंट डेक्सट्रन सेल सीमाओं की पहचान करने में मदद करने के लिए संस्कृति मीडिया में जोड़ा जाता है। कोशिकाओं को हरे और नीले चैनलों में 3 डी epifluorscence माइक्रोस्कोपी के अधीन हैं और जिसके परिणामस्वरूप z-स्टैक छवियों एक MATLAB पाइप लाइन द्वारा स्वचालित रूप से संसाधित कर रहे हैं. प्रक्रिया प्रमुख स्प्रेडशीट या सांख्यिकीय संकुल में बहाव विश्लेषण के लिए उपयुक्त एक सारणीबद्ध प्रारूप में सेलुलर लिपिड छोटी बूंद सामग्री और व्यक्तिगत लिपिड छोटी बूंद विशेषताओं पर अमीर मात्रात्मक डेटा आउटपुट. हम विभिन्न स्थितियों है कि सेलुलर लिपिड चयापचय को प्रभावित के तहत लिपिड छोटी बूंद सामग्री का उदाहरण विश्लेषण प्रदान करते हैं.

Introduction

लिपिड सेलुलर ऊर्जा और कार्बन चयापचय, झिल्ली घटकों के संश्लेषण, और bioactive पदार्थों के उत्पादन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. लिपिड चयापचय पर्यावरण की स्थिति, पोषक तत्वों की उपलब्धता और सेल-साइकिल चरण1के अनुसार ठीक-ठाक होता है। मनुष्यों में लिपिड चयापचय को मोटापे, टाइप II मधुमेह और कैंसर2जैसे रोगों से जोड़ा गया है। उद्योग में, खमीर जैसे सूक्ष्मजीवों द्वारा उत्पादित लिपिड अक्षय डीजल ईंधन3के एक आशाजनक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाएं तथाकथित लिपिड बूंदों (एलडी) में तटस्थ लिपिड संग्रहीत करती हैं। ये विकासवादी संरक्षित निकाय ट्राइसाइल्ग्लिसरोल, स्टेरिल एस्टर, एक बाहरी फॉस्फोलिपिड मोनोलेयर और संबद्ध प्रोटीन1से बने होते हैं। एल डी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में उत्पन्न होता है, सेल-चक्र या विकास-चरण गतिशीलता लागू करता है, और सेलुलर लिपिड होमियोस्टेसिस1के लिए महत्वपूर्ण हैं। LD संख्या और आकृति विज्ञान एक सुविधाजनक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब विभिन्न विकास की स्थिति के तहत लिपिड चयापचय assaying या जब म्यूटेंट के एक पैनल स्क्रीनिंग. उनके गतिशील प्रकृति को देखते हुए, व्यक्तिगत LDs के गुणों का विश्लेषण करने में सक्षम तकनीक लिपिड चयापचय के अध्ययन में विशेष रुचि के हैं.

लिपिड से संबंधित चयापचय रास्ते और उनके विनियमन का वर्णन करने के लिए विभिन्न खमीर प्रजातियों का उपयोग किया गया है, या दिलचस्प यौगिकों या ईंधन1का उत्पादन करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी में इस्तेमाल किया। इसके अलावा, मॉडल खमीर के लिए, इस तरह के नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae या दूर से संबंधित विखंडन खमीर Schizosaccharomyces pombeके रूप में, जीनोम व्यापक विलोपन तनाव पुस्तकालयों उपलब्ध है कि उच्च-थ्रूपुट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्क्रीन4,5. हाल ही में एलडी संरचना और गतिशीलता एस pombe6,7,8,9में वर्णित किया गया है , और लिपिड चयापचय से संबंधित उत्परिवर्ती उभरते मॉडल खमीर में अलग किया गया है शिजोसाकैरोमायस जैपोनिकस10|

कई तकनीकों एलडी सामग्री और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं. अधिकांश ऐसे नील लाल या BODIPY 493/503 के रूप में lipophilic रंगों के साथ एलडी के धुंधला के कुछ प्रकार के रोजगार. बाद में अधिक संकीर्ण उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से पता चलता है, और फॉस्फोलिपिड (मेम्नेल्स)11के विपरीत तटस्थ लिपिड (एलडी) के प्रति विशिष्टता में वृद्धि हुई है। फ्लोरिमिट्रिक और फ्लो-साइटोमेट्री विधियों का उपयोग विभिन्न कवक प्रजातियों में सफलतापूर्वक किया गया है ताकि जीनों और विकास की स्थितियों को उजागर किया जा सके जो भंडारण लिपिड सामग्री12,13,14,15को प्रभावित करती हैं . जबकि इन तरीकों उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, वे संख्या और कोशिकाओं में अलग-अलग LDs की आकृति विज्ञान उपाय नहीं कर सकते, जो विकास की स्थिति और जीनोटाइप के बीच नाटकीय रूप से अलग कर सकते हैं. सुसंगत रमन प्रकीर्णन या डिजिटल होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी लेबल-मुक्त तरीके हैं जो एलडी स्तर के डेटा को प्राप्त करते हैं, लेकिन इसके लिए विशेष महंगे उपकरण16,17,18की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी, एलडी सामग्री पर विस्तृत डेटा प्रदान कर सकता है, जबकि आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग कर सकते हैं। कई विश्लेषण वर्कफ़्लोज़ मौजूद हैं जो छवि डेटा से सेल/एलडी डिटेक्शन में परिष्कार और स्वचालन के विभिन्न डिग्री की सुविधा रखते हैं, और विभिन्न सेल प्रकारों के लिए ऑप्टिमाइज़ किए जाते हैं, जैसे बड़े LDs19,20 के साथ मेटाज़ोअन कोशिकाओं , 21, या नवोदित खमीर17,22,23. इन दृष्टिकोणों में से कुछ केवल 2 डी में काम (उदा., अधिकतम प्रक्षेपण छवियों पर), जो मज़बूती से सेलुलर एलडी सामग्री का वर्णन करने में विफल हो सकता है. हमारे ज्ञान के लिए, कोई उपकरण विखंडन खमीर सूक्ष्म डेटा से एलडी सामग्री और आकृति विज्ञान के निर्धारण के लिए मौजूद हैं. स्वचालित और मजबूत एलडी स्तर के विश्लेषण के विकास में वृद्धि हुई संवेदनशीलता और बढ़ाया सांख्यिकीय शक्ति लाना होगा, और तटस्थ लिपिड सामग्री पर अमीर जानकारी प्रदान करते हैं, आदर्श रूप से कई खमीर प्रजातियों में.

हम खमीर कोशिकाओं के 3 डी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों से एलडी सामग्री विश्लेषण के लिए एक कार्यप्रवाह विकसित किया है. लाइव सेल को क्रमशः एलडी कल्पना करने और सेल सीमाओं का निर्धारण करने के लिए BODIPY 493/503 और Cascade Blue dextran के साथ दाग रहे हैं। कोशिकाओं कांच स्लाइड पर स्थिर कर रहे हैं और एक मानक epifluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर z-स्टैक इमेजिंग के अधीन. छवियाँ तो MATLAB, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया (वाणिज्यिक) पैकेज में लागू एक स्वचालित पाइप लाइन द्वारा संसाधित कर रहे हैं. पाइप लाइन छवि पूर्व प्रसंस्करण, विभाजन (कोशिकाओं बनाम पृष्ठभूमि, मृत कोशिकाओं को हटाने), और एलडी पहचान करता है। रिच एलडी-स्तर डेटा, जैसे LD आकार और फ्लोरोसेंट तीव्रता, फिर प्रमुख स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर उपकरणों के साथ संगत एक सारणीबद्ध स्वरूप में प्रदान किए जाते हैं. कार्यप्रवाह सफलतापूर्वक एस pombe24में लिपिड चयापचय पर नाइट्रोजन स्रोत की उपलब्धता के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अब हम एस pombeमें कार्यप्रवाह की कार्यक्षमता का प्रदर्शन, एस Japonicus और एस cerevisiae,विकास की स्थिति या म्यूटेंट कि सेलुलर एलडी सामग्री को प्रभावित का उपयोग कर.

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Protocol

1. समाधान और मीडिया की तैयारी

  1. लिपिड धुंधला समाधान तैयार करें।
    1. स्टॉक लिपिड धुंधला समाधान तैयार करने के लिए 10 मिलीग्राम BODIPY 493/503 में 10 एमएल में एनहाइड्रोस DMSO (अंतिम सांद्रता 1 मिलीग्राम/ वजन के दौरान सामग्री की हानि को रोकने के लिए एक 10 मिलीग्राम BODIPY 493/503 शीशी की पूरी सामग्री को भंग.
      चेतावनी: DMSO त्वचा के माध्यम से पारित कर सकते हैं. उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें।
    2. 1 मिलीग्राम/एमएल बोडीपी 493/503 स्टॉक समाधान और एनहाइड्रोस डीएमएसओ (अंतिम सांद्रता 0ण्1 मिलीग्राम/एमएल) के 900 डिग्री सेल्सियस को मिलाकर कार्य लिपिड अभिरंजन समाधान तैयार करें।
    3. अलीकोट स्टॉक और काम समाधान, और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
      नोट: भंग BODIPY 493/503 -20 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों के लिए स्थिर है। हालांकि, समाधान नमी और प्रकाश से रक्षा की जानी है।
  2. सेल सीमा दृश्य के लिए शेयर समाधान तैयार करने के लिए, deionized पानी के 2.5 एमएल में Cascade ब्लू डेक्सट्रान (पूरी शीशी) के 25 मिलीग्राम भंग (अंतिम एकाग्रता 10 mg/ अलीकोट स्टॉक समाधान और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान प्रकाश से संरक्षित।
  3. माइक्रोस्कोप स्लाइड कोटिंग समाधान तैयार करने के लिए, 5 एमएल deionized पानी में सोयाबीन लैक्टिन के 5 मिलीग्राम भंग (अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम / अलीकोट लेक्टिन समाधान और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    नोट: लेक्टिन विलयन -80 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों तक स्थिर होता है। वर्तमान में उपयोग में Alicots -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. खेती मीडिया तैयार करें।
    1. एस पोम्बे और एस जैपोनिकस के लिए जटिल हाँ खेती माध्यम के 400 एमएल तैयार करने के लिए, एक 500 एमएल बोतल और ऑटोक्लेव में deionized पानी के 340 एमएल में 2 ग्राम खमीर निकालने और 0.1 ग्राम एसपी की खुराक (यदि auxotrophic उत्परिवर्ती के लिए आवश्यक) भंग। अलग से autoclaved या फिल्टर-स्टरलाइज़्ड ग्लूकोज के 20% (w/v) के 60 एमएल aseptic स्थितियों में जोड़ें।
    2. एस पोम्बे और एस जैपोनिकस के लिए परिभाषित ईएमएम खेती माध्यम के 400 एमएल तैयार करने के लिए, 500 एमएल बोतल और ऑटोक्लेव में deionized पानी के 360 एमएल में डेक्सट्रोज के बिना 4.9 ग्राम ईएमएम शोरबा को भंग करें। अलग से autoclaved या फिल्टर-स्टरलाइज़्ड ग्लूकोज के 20% (w/v) के 40 एमएल aseptic स्थितियों में जोड़ें।
      नोट: एस पोम्बे और एस जैपोनिकस खेती पर सामान्य दिशा निर्देशों के लिए क्रमशः25 और26देखते हैं।
    3. Saccharomyces cerevisiaeके लिए जटिल YPAD खेती माध्यम के 300 एमएल तैयार करने के लिए, एक 500 एमएल बोतल और autoclave में deionized पानी के 270 एमएल में 3 ग्राम खमीर निकालने के 3 ग्राम भंग, 6 ग्राम एडेनिन सल्फेट के 270 एमएल में deionized पानी की। अलग से autoclaved या फिल्टर-स्टरलाइज़्ड ग्लूकोज के 20% (w/v) के 30 एमएल aseptic स्थितियों में जोड़ें।
    4. एस सेरेविएसिया के लिए परिभाषित न्यूनतम माध्यम के 300 एमएल तैयार करने के लिए, 500 एमएल बोतल और ऑटोक्लेव में deionized पानी के 270 एमएल में खमीर नाइट्रोजन बेस (बिना एमिनो एसिड के) के 2 0 ग्राम भंग। अलग से autoclaved या फिल्टर-स्टरलाइज़्ड ग्लूकोज के 20% (w/v) के 30 एमएल aseptic स्थितियों में जोड़ें।
      नोट: एस सेरेविसिया खेती पर सामान्य दिशा निर्देशों के लिए27देखें .

2. सेल खेती

  1. बढ़ते एस पोम्बे या एस जैपोनिकस को घातीय या प्रारंभिक स्थिर चरण के लिए।
    1. सुबह में, ताजा विखंडन खमीर बायोमास के साथ हाँ माध्यम के 5 एमएल टीका. कई घंटे के लिए मिलाते हुए (180 आरपीएम) के साथ 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: सभी खेती के लिए, उचित वातन सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति की मात्रा 10 गुना होने Erlenmeyer फ्लास्क का उपयोग करें। कुछ प्रयोगशालाएं 30 डिग्री सेल्सियस पर विखंडन खमीर विकसित करना पसंद करती हैं, लेकिन 32 डिग्री सेल्सियस की खेती के तापमान कोशिकाओं के लिए हानिकारक प्रभाव के बिना कम दोहरीकरण समय में परिणाम है, इस प्रकार एक प्रयोग करने के लिए आवश्यक कुल समय को कम करने25,28 .
    2. उसी दिन के देर से दोपहर में (खेती के कम से कम 6 घंटे के बाद), ताजा हाँ माध्यम के साथ संस्कृति को 10 एमएल अंतिम संस्कृति की मात्रा तक पतला करना ताकि यह अगले सुबह वांछित ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) (या कोशिकाओं/एमएल की संख्या) तक पहुंच जाए, और 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हैकिंग (180 आरपीएम)। यह सही कमजोर पड़ने कारक (उपयोग समीकरण 1) का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक इस्तेमाल किया तनाव के दोहरीकरण समय पता करने के लिए लाभ का है।
      Equation 1
      जहां वीसंस्कृति पूर्व कृषि मात्रा कमजोर पड़ने के लिए आवश्यक है, वीअंतिम नई संस्कृति की कुल मात्रा है (10 एमएल मानक खेती के लिए), ओडीफाइनल वांछित OD तक पहुँचा जा करने के लिए है अगली सुबह, ODवर्तमान preculture के वर्तमान में मापा ओडी है, टी फसल कटाई तक सेल विकास का समय है, टीअंतराल अंतराल चरण की अवधि है (प्रयोगशाला शर्तों पर निर्भर करता है, की जरूरत है अनुभवजन्य रूप से परिभाषित किया जा सकता है) और टीडीटी तनाव के दोहरीकरण समय है.
      नोट: जब घातीय चरण कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, precultures कई बाद की पीढ़ियों के लिए सेल शरीर क्रिया विज्ञान (एलडी सामग्री सहित) बदल के रूप में precultures स्थिर चरण तक पहुँचने नहीं है.
    3. इमेजिंग दिन की सुबह में, यदि संस्कृति आवश्यकता से थोड़ा अधिक ओडी तक पहुंच जाती है (घात-चरण कोशिकाओं के मामले में), तो इसे ताजा हां के साथ पतला करें और एलडी के धुंधला करने से पहले कम से कम दो और दोहरीकरण समय के लिए ऊष्मायन जारी रखें। अन्यथा सीधे आगे बढ़ें दाग (धारा 3)।
  2. बढ़ती एस सेरेविएसिया को घातीय और स्थिर चरण के लिए.
    1. दोपहर में, ताजा नवोदित खमीर बायोमास की एक छोटी राशि के साथ YPAD माध्यम के 10 एमएल टीका और मिलाते हुए (180 आरपीएम) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर incubate।
    2. इमेजिंग दिन की सुबह, YPAD मध्यम के 10 एमएल में OD 0.1 के लिए संस्कृति को पतला और आवश्यक OD (उदाहरण के लिए, OD 1 घातीय चरण के लिए) के लिए हो जाना. चरण 2.1.2 में वर्णित के रूप में किसी भी संस्कृति कमजोर पड़ने प्रदर्शन. धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें (धारा 3).

3. लिपिड ड्रॉपलेट दाग

  1. प्रत्येक नमूने के लिए एक माइक्रोस्कोप कवर पर्ची तैयार करने के लिए छवि. एक क्षैतिज स्थिति पिपट टिप के लंबे पक्ष का उपयोग कर एक साफ कवर पर्ची पर स्लाइड कोटिंग समाधान के 1 $L बिखरा हुआ है। कोटिंग समाधान को पूरी तरह से सूखने दें और आवरण पर्चियों को धूल-मुक्त वातावरण में संग्रहीत करें।
    नोट: ग्लास स्लाइड और coverslips यदि आवश्यक हो तो उपयोग करने से पहले साफ किया जा सकता है। सफाई प्रक्रिया dishwashing डिटर्जेंट के साथ धोने के होते हैं, पानी के साथ rinsing, रात भर 3% हाइड्रोक्लोरिक एसिड में भिगोने, और आसुत पानी के साथ धोने. साफ स्लाइड और coverslips उपयोग जब तक शुद्ध इथेनॉल में जमा हो जाती है।
  2. आवश्यकतानुसार सेल कल्चर या कक्षों/एमएल की संख्या के ओडी को मापें। तुलनीय प्रयोगात्मक स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए सभी परीक्षण उपभेदों के बीच समान मूल्यों तक पहुँचने की कोशिश करो.
  3. पिपेट 1 एमएल प्रत्येक कोशिका संस्कृति का 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए। केवल S. cerevisiae के लिए, स्लाइड कोटिंग समाधान, भंवर संक्षेप में 5 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मिलाते हुए के साथ 5 डिग्री सेल्सियस में 5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  4. कुछ समय के लिए प्रत्येक संस्कृति aliquot और भंवर के लिए लिपिड धुंधला समाधान के 1 $L जोड़ें. फिर सेल सीमा दृश्य समाधान और भंवर के 10 डिग्री एल संक्षेप में जोड़ें.
    नोट: दोनों दागों के पूर्व मिश्रित समाधान तैयार न करें क्योंकि इससे बोडीपी 493/
  5. अपकेंद्रण (1,000 x g, 3 मिनट, आरटी) द्वारा कोशिकाओं को एकत्र करें और लगभग सभी supernatant ($950 $L) को हटा दें। शेष अधिनांत में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें.
  6. पिपेट 2 डिग्री सेल्सियस एक लैक्टिन लेपित कवर स्लिप पर घने सेल निलंबन के एल और एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जगह है। कोशिकाओं को एक मोनोलेयर का निर्माण करना चाहिए। इमेजिंग में कलाकृतियों को कम करने के लिए माइक्रोस्कोपी (धारा 4) के लिए जितनी जल्दी हो सके आगे बढ़ें; एक समय में अधिकतम दो नमूनों की प्रक्रिया.

4. माइक्रोस्कोप और इमेजिंग की स्थापना

  1. इमेजिंग शर्तों का अनुकूलन करें.
    नोट:     माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए मजबूत प्रकाश स्रोतों के लिए लंबे समय से जोखिम की आवश्यकता होती है जो नमूना और विषम परिणामों को नुकसान पहुंचा सकता है। इसलिए, आगे LD परिमाणीकरण के लिए उपयोग नहीं किया जाएगा एक समर्पित नमूना स्लाइड का उपयोग कर इमेजिंग शर्तों की स्थापना की।
    1. चरण कंट्रास्ट या अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) का उपयोग करने वाले कक्षों पर ध्यान केंद्रित करें.
      नोट: चरण कंट्रास्ट या DIC छवियाँ संदर्भ के लिए लिया जा सकता है, लेकिन वे स्वचालित छवि विश्लेषण चरण के दौरान उपयोग नहीं किए जाते हैं।
    2. पूरे कक्ष वॉल्यूम को विस्तृत करने के लिए z-स्टैक सेटिंग्स सेट करें। कुल अनुलंब दूरी कक्ष आकार पर निर्भर करती है; ऑप्टिकल स्लाइस की संख्या उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर पर निर्भर करता है ( z-अक्ष में बिंदु प्रसार समारोह). केंद्रीय फोकल विमान के सापेक्ष स्थानांतरित करने के लिए ध्यान सेट करें।
      नोट: स्लाइस की इष्टतम संख्या अक्सर माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा सेट किया जाता है और मैन्युअल रूप से गणना करने की आवश्यकता नहीं है. सामान्य कोशिका चौड़ाई एस पोम्बेके लिए 3-5 डिग्री सेल्सियस , एस जैपोनिकसके लिए 4-7 डिग्री सेल्सियस और एस सेरेविएसियाके लिए 3-7 डिग्री है ।
    3. LDs छवि के लिए, हरे चैनल में प्रकाश तीव्रता और जोखिम समय सेट (उत्तेजना और BODIPY के उत्सर्जन अधिकतम हैं 493 और 503 एनएम, क्रमशः).
      नोट: BODIPY 493/503 एक बहुत उज्ज्वल फ्लोरोक्रोम है; हालांकि, यह अति मजबूत प्रकाश तीव्रता के साथ तेजी से विरंजन हो सकता है। इसके अलावा, LDs लाइव कोशिकाओं में मोबाइल हैं, इस प्रकार जोखिम समय को कम करने और पूर्ण हरी चैनल z-स्टैक पहले (नीले चैनल के लिए स्विचन से पहले) blurring कलाकृतियों को रोकने के लिए कब्जा. इसके अलावा, संतृप्त पिक्सल से बचने के लिए संकेत तीव्रता के लिए कैमरे की रैखिक रेंज खाते में ले लो.
    4. छवि सेल सीमाओं के लिए, नीले चैनल में प्रकाश तीव्रता और जोखिम समय सेट (कैस्केड ब्लू डेक्सट्रान की उत्तेजना और उत्सर्जन अधिकतम 400 और 420 एनएम, क्रमशः कर रहे हैं)।
      नोट: नीले चैनल में सिग्नल तीव्रता छवि विभाजन के लिए आवश्यक है, लेकिन यह एलडी परिमाणीकरण के लिए ही प्रयोग नहीं किया जाता है. इसलिए, इस चैनल में इष्टतम सेटिंग्स विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं।
    5. यदि संभव हो, मानकीकृत शर्तों के तहत कई नमूनों की इमेजिंग की सुविधा के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में एक स्वचालित प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह बनाएँ.
  2. एक बार इमेजिंग शर्तों अनुकूलित किया गया है, छवि नमूने परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए. चरण 4.1 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें और उन्हें हरे और नीले चैनलों में छवि।
    नोट: सभी छवियों नमूने के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर प्राप्त किया जाना चाहिए. सशक्त, प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए प्रति प्रति प्रति नमूना देखने की एकाधिक फ़ील्ड छवि करें.
  3. नीले और हरे चैनल z-स्टैक छवियों को 16-बिट बहु-परत TIFF फ़ाइलों (यानी, दृश्य के फ़ील्ड प्रति दो फ़ाइलें) के रूप में सहेजें. संबंधित फ़ाइल नामों में शब्द "हरा" या "नीला" शामिल करें. छवि विश्लेषण (धारा 5) के साथ आगे बढ़ें।

5. छवि विश्लेषण

  1. नेत्रहीन अधिग्रहीत छवियों की गुणवत्ता की जाँच करें।
    1. ImageJ29,30 या अन्य उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में खुला सूक्ष्म छवियों.
    2. अधिग्रहण के दौरान ले जाया गया है कि कोशिकाओं की एक काफी संख्या से युक्त किसी भी छवि ढेर निकालें (और इस तरह blurring कलाकृतियों बनाया).
    3. नीले चैनल में अत्यधिक फ्लोरोसेंट गैर-सेल कणों वाले किसी भी छवि ढेर को निकालें (उदा., माइक्रोस्कोप स्लाइड या कवर स्लिप पर गंदगी, खेती के माध्यम में अशुद्धियां)।
      नोट: नीले चैनल में बहुत उज्ज्वल गैर सेल वस्तुओं सेल का पता लगाने कलाकृतियों बना सकते हैं या उनके आसपास के क्षेत्र में कोशिकाओं का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
    4. मृत कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात युक्त किसी भी छवि ढेर निकालें (यानी, वृद्धि हुई नीले फ्लोरोसेंट के साथ कोशिकाओं को जीने की कोशिकाओं की तुलना में).
      नोट: जबकि नमूने में मृत कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात की उपस्थिति आम तौर पर एक समस्या नहीं है और इन कोशिकाओं को स्वचालित रूप से विश्लेषण के दौरान खारिज कर रहे हैं, कुछ मृत या मर कोशिकाओं कभी कभी विभाजन एल्गोरिथ्म द्वारा जीवित कोशिकाओं के रूप में मान्यता प्राप्त हो सकता है और इस प्रकार रिपोर्ट किए गए परिणामों को तिरछा करें.
  2. MATLAB सॉफ़्टवेयर में छवियों का विश्लेषण करें.
    1. कोई मुख्य फ़ोल्डर बनाएँ और इस स्थान पर सभी MATLAB स्क्रिप्ट की प्रतिलिपि बनाएँ.
    2. एक उप-फ़ोल्डर बनाएँ ("पोम्बे", "cerevisiae" या "जैपोनिकस") और इस स्थान के लिए इनपुट TIFF छवि फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएँ।
    3. MATLAB प्रारंभ करें, स्क्रिप्ट MAIN.m खोलें और इसे चलाएँ. मेनू में खमीर प्रजातियों का चयन करने के लिए विश्लेषण किया और छवि प्रसंस्करण शुरू.
      नोट: सेल और एलडी का पता लगाने के लिए आवश्यक मापदंडों में से कुछ विशेष प्रजातियों के लिए पूर्व निर्धारित कर रहे हैं, दूसरों छवि प्रसंस्करण के दौरान स्वचालित रूप से निर्धारित कर रहे हैं. पूर्व-निर्धारित मान अनुभव-अनुभविक रूप से निर्धारित किए गए थे और उद्देश्य आवर्धन, कैमरा प्रकार और संवेदनशीलता, और इमेजिंग सेटिंग्स जैसे कई कारकों पर निर्भर करते हैं. यदि आवश्यक हो, तो उपयोगकर्ता अपने प्रयोगात्मक सेटअप को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित करने के लिए जीव-विशिष्ट presets को बदलने के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइलों को संपादित कर सकते हैं। अर्थात्, सेल मान्यता के दौरान स्वीकार्य वस्तु आकार "minArea" और "maxArea" पैरामीटर द्वारा दिए गए हैं, और ऑब्जेक्ट सीमाओं के भीतर भरा मात्रा का न्यूनतम अंश "Solidity" पैरामीटर द्वारा दिया गया है। LD मान्यता के लिए, चमक थ्रेशोल्ड द्वारा दिया जाता है "th" पैरामीटर (अपने मूल्य छवि बिट गहराई और फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता से ज्यादातर प्रभावित होता है), और अधिकतम स्वीकार्य एलडी आकार द्वारा दिया जाता है "MaxArea" पैरामीटर.
    4. निरीक्षण और एक स्प्रेडशीट संपादक या सांख्यिकीय पैकेज का उपयोग कर के रूप में आवश्यक उत्पादन फ़ाइलों को संसाधित; वर्कफ़्लो अर्द्धविराम-अलग CSV फ़ाइलें उत्पन्न करता है, और पता लगाया कक्ष ऑब्जेक्ट और LDs के साथ TIFF फ़ाइलों को विभाजित करता है।
      नोट: वर्कफ़्लो छवियों को पृष्ठभूमि और कक्ष ऑब्जेक्ट्स में विभाजित करता है, जहाँ प्रत्येक कक्ष ऑब्जेक्ट एकाधिक सन्निकट कक्षों से बना हो सकता है. इसलिए, "xxxx]cells.csv" फ़ाइलों में आउटपुट एकल-कक्ष डेटा का प्रतिनिधित्व नहीं करता है और केवल प्रति-इकाई-की-सेल-मात्रा मैट्रिक्स की गणना करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए।

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Representative Results

पूरी प्रक्रिया विखंडन खमीर के लिए चित्र 1 में संक्षेप है (नवोदित खमीर कार्यप्रवाह अनुरूप है), और नीचे हम कैसे कार्यप्रवाह ज्ञात विभिन्न स्थितियों के तहत तीन अलग खमीर प्रजातियों में एलडी सामग्री का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के उदाहरण प्रदान करते हैं सेलुलर LD सामग्री को प्रभावित करने के लिए. प्रत्येक उदाहरण एक जैविक प्रयोग का प्रतिनिधित्व करता है.

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक कार्यप्रवाह का Schematic आरेख. विखंडन खमीर के लिए कार्यप्रवाह एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सबसे पहले, हमने एस पोम्बे कोशिकाओं का विश्लेषण किया (चित्र 2)। जंगली प्रकार (WT; ज +s) कोशिकाओं या तो जटिल हाँ मध्यम या परिभाषित EMM माध्यम में घातीय चरण के लिए बड़े हो गए थे. हाँ की तुलना में, कम एलडी और सेल वॉल्यूम की प्रति इकाई उच्च एलडी धुंधला तीव्रता ईएमएम में पाए गए (चित्र 2A-C)। इसके अलावा, ईएमएम माध्यम में बनाए गए व्यक्तिगत एलडी बड़े थे और कुल धुंधला तीव्रता में वृद्धि हुई (चित्र 2 डी,ई) प्रदर्शित किए गए। यह ईएमएम24में उगाई जाने वाली कोशिकाओं में भंडारण लिपिड सामग्री में वृद्धि के पिछले निष्कर्षों के साथ सहमत है . पीपीसी1 जीन एक फॉस्फोपेन्टोथेनेट-सिस्टीन लिगेस को एंजाइम ए संश्लेषण के लिए आवश्यक एन्कोड करता है। तापमान के प्रति संवेदनशील ppc1-88 उत्परिवर्ती प्रतिबंधात्मक तापमान31पर बड़े होने पर एलडी सामग्री में एक उल्लेखनीय कमी से पता चलता है, कम BODIPY 493/503 संकेत के साथ कोशिकाओं का एक उदाहरण प्रदान (चित्र 2A). तदनुसार, जंगली प्रकार की तुलना में (32 डिग्री सेल्सियस पर विकसित), कम कुल दाग तीव्रता के साथ छोटे LDs ppc1-88 कोशिकाओं में पाया गया 36 डिग्री सेल्सियस के लिए एक बदलाव के बाद हाँ में हो (चित्र 2 डी,ई),प्रति LD संख्या में किसी भी स्पष्ट परिवर्तन के बिना कोशिका आयतन की इकाई (चित्र 2ख) ।

Figure 2
चित्रा 2: विकास मीडिया और लिपिड चयापचय उत्परिवर्तन में एलडी सामग्री पर प्रभाव एस pombe| जंगली प्रकार (WT) और ppc1-88 कोशिकाओं जटिल हाँ या परिभाषित EMM माध्यम में घातीय चरण के लिए बड़े हो गए थे, के रूप में संकेत दिया. WT कोशिकाओं 32 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे थे। तापमान के प्रति संवेदनशील ppc1-88 कोशिकाओं 25 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे थे और विश्लेषण से पहले 2 घंटे के लिए 36 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर दिया. (क) प्रतिनिधि अप्रसंस्कृत सूक्ष्म छवियों के साथ दाग LDs 493/ प्रत्येक स्थिति के लिए एक एकल ऑप्टिकल स्लाइस दिखाया गया है; उल्टे नीले चैनल के साथ 10% ओवरले बेहतर सेल सीमाओं कल्पना करने के लिए जोड़ा गया था। स्केल बार - 10 डिग्री उ. (ठ) कोशिका आयतन की प्रति इकाई पहचान किए गए एलडी की संख्या। (ग) कोशिका आयतन की प्रति इकाई पहचान किए गए एलडी की फ्लोरोसेंट तीव्रता। (D) सभी पहचान किए गए LDs की कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता का वितरण* **, [अयुग्मित विलकॉक्सन परीक्षण च ] 1.7 x 10-107, p ] 3.7 x 10-132, क्रमशः. (ई) सभी पहचान की LDs. * * के संस्करणों के वितरण , [अयुग्मित विलकॉक्सन परीक्षण p ] 6.8 x 10-71, p ] 1 x 10-64, क्रमशः. पैनल बी-ई में डेटा क्रमशः डब्ल्यूटी हां, डब्ल्यूटी ईएमएम और पीपीसी1-88 नमूनों के लिए 242, 124 और 191 सेल ऑब्जेक्ट्स से प्राप्त किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसके बाद, हम एस जैपोनिकस कोशिकाओं में एलडी सामग्री की मात्रा निर्धारित करते हैं (ज+मैट्सजे-2017)32 से घातीय और जल्दी-स्टेशनरी संस्कृतियों से हाँ में विकसित (चित्र 3A)। स्थिर चरण में प्रवेश करने वाले कोशिकाओं ने तेजी से बढ़ रही कोशिकाओं की तुलना में सेल वॉल्यूम की प्रति इकाई एलडी की संख्या में उल्लेखनीय रूप से कमी दिखाई (चित्र 3B),जबकि मात्रा-सामान्यीकृत एलडी फ्लोरोसेंट तीव्रता दो स्थितियों के बीच थोड़ी कम हुई ( चित्र 3C). प्रारंभिक स्थिर चरण LDs आम तौर पर आकार में मामूली रूप से बड़े थे और तेजी से बढ़ कोशिकाओं से एलडी की तुलना में मामूली उच्च कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता था (चित्र 3 डी,ई) .

Figure 3
चित्र 3: LD सामग्री में एस जैपोनिकस कोशिकाओं के विकास के चरण के साथ बदलता है। एक्सपोनेंशियल रूप से बढ़ रहा है (लॉग) और जल्दी स्थिर चरण (एसटी) कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया. (क) प्रतिनिधि अप्रसंस्कृत सूक्ष्म छवियों के साथ दाग LDs 493/ प्रत्येक स्थिति के लिए एक एकल ऑप्टिकल स्लाइस दिखाया गया है; उल्टे नीले चैनल के साथ 10% ओवरले बेहतर सेल सीमाओं कल्पना करने के लिए जोड़ा गया था। स्केल बार 10 डिग्री उ. (ठ) कोशिका आयतन की प्रति इकाई पहचान किए गए एलडी की संख्या को दर्शाता है। (ग) कोशिका आयतन की प्रति इकाई पहचान किए गए एलडी की फ्लोरोसेंट तीव्रता। (घ) सभी पहचान किए गए एलडी की कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता का वितरण * * अयुग्मित विलकॉक्सन परीक्षण च ] 1.3 x 10-114. (ई) सभी पहचान की एलडी की मात्रा का वितरण * * अयुग्मित विलकोक्सन परीक्षण च ] 2.4 x 10-85. पैनल बी-ई में डेटा क्रमशः लॉग और स्टेट नमूनों के लिए 274 और 187 सेल ऑब्जेक्टों से प्राप्त किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंत में, हम व्यापक रूप से इस्तेमाल किया BY4741 प्रयोगशाला तनाव के एस cerevisiae कोशिकाओं का विश्लेषण किया (MATaउसके 3 "1 leu2]0 met15 "0 ura3]0) क्रमशः, जटिल YPAD माध्यम में, घातीय और स्थिर चरण के लिए हो गया. खमीर कोशिकाओं को आम तौर पर स्थिर चरण1में प्रवेश पर भंडारण लिपिड जमा , और हम इन निष्कर्षों recapitulate करने में सक्षम थे (चित्र 4) . स्टेशनरी कोशिकाओं में तेजी से बढ़ रही कोशिकाओं की तुलना में मात्रा की प्रति इकाई कुछ कम एलडी निहित थे (चित्र 4B), लेकिन उनकी मात्रा-सामान्यीकृत एलडी फ्लोरोसेंट तीव्रता लगभग दोगुनी हो गई (चित्र 4C)। समग्र एलडी सामग्री में यह तीव्र वृद्धि बहुत अधिक फ्लोरोसेंट तीव्रता और स्थिर चरण में अलग-अलग एलडी की मात्रा के कारण हुई थी (चित्र 4डी, ई) ।

Figure 4
चित्र 4: LD सामग्री में एस सेरेविएसिया कोशिकाएं विकास चरण के साथ बदलती हैं। एक्सपोनेंशियल रूप से बढ़ रहा है (लॉग) और स्थिर चरण (एसटी) कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया. (क) प्रतिनिधि अप्रसंस्कृत सूक्ष्म छवियों के साथ दाग LDs 493/ प्रत्येक स्थिति के लिए एक एकल ऑप्टिकल स्लाइस दिखाया गया है; उल्टे नीले चैनल के साथ 10% ओवरले बेहतर सेल सीमाओं कल्पना करने के लिए जोड़ा गया था। स्केल बार 10 डिग्री उ. (ठ) कोशिका आयतन की प्रति इकाई पहचान किए गए एलडी की संख्या को दर्शाता है। (ग) कोशिका आयतन की प्रति इकाई पहचान किए गए एलडी की फ्लोरोसेंट तीव्रता। (घ) सभी पहचान किए गए एलडी की कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता का वितरण * * अयुग्मित विलकॉक्सन परीक्षण च र् 4ण्6 x 10-78. (ई) सभी पहचान की एलडी की मात्रा का वितरण * * अयुग्मित विलकोक्सन परीक्षण च ] 3.7 x 10-63. पैनल बी-ई में डेटा क्रमशः लॉग और स्टेट नमूनों के लिए 430 और 441 सेल ऑब्जेक्टसे प्राप्त किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस प्रकार, हमारे विश्लेषण कार्यप्रवाह विभिन्न परिस्थितियों है कि सकारात्मक या नकारात्मक सेलुलर एलडी सामग्री को प्रभावित के तहत तीन अलग और morphologically अलग खमीर प्रजातियों में एलडी संख्या, आकार और लिपिड सामग्री में परिवर्तन का पता लगा सकते हैं.

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Discussion

लिपिड चयापचय और इसके विनियमन की समझ दोनों बुनियादी जीव विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है, और नैदानिक और biotechnological अनुप्रयोगों. एलडी सामग्री सेल के लिपिड चयापचय राज्य का एक सुविधाजनक रीडआउट का प्रतिनिधित्व करता है, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ एलडी सामग्री निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया प्रमुख तरीकों में से एक जा रहा है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्वचालित पता लगाने और तीन अलग और morphologically अलग खमीर प्रजातियों में व्यक्तिगत एलडी के मात्रात्मक विवरण की अनुमति देता है. हमारे ज्ञान के लिए, कोई इसी तरह के उपकरण विखंडन खमीर के लिए मौजूद हैं. छवि प्रसंस्करण के लिए आवश्यक MATLAB लिपियों अनुपूरक फ़ाइलों के रूप में शामिल किए गए हैं, और इस पांडुलिपि से सभी कच्चे और संसाधित छवि और सारणीबद्ध डेटा के साथ साथ चित्र भंडार (DOI 10.6084/m9.figshare.7745738) से भी उपलब्ध हैं, CSV आउटपुट फ़ाइलों का विस्तृत विवरण, और downstream डेटा विश्लेषण और दृश्यावलोकन के लिए R स्क्रिप्ट. इसके अलावा, MATLAB लिपियों का नवीनतम संस्करण GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis) से उपलब्ध है।

सफल एलडी विश्लेषण काफी हद तक प्राप्त कच्चे फ्लोरोसेंट छवियों की गुणवत्ता पर निर्भर है. विभाजन एल्गोरिदम के इष्टतम प्रदर्शन के लिए, धूल कणों से रहित साफ ग्लास स्लाइड माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, कोशिकाओं को एक मोनोलेयर (दृश्य के क्षेत्र प्रति कोशिकाओं की वास्तविक संख्या एक महत्वपूर्ण पैरामीटर नहीं है) के रूप में करना चाहिए, और एक शामिल नहीं होना चाहिए मृत कोशिकाओं का बड़ा अनुपात. इसके अलावा, z-स्टैक इमेजिंग थोड़ा नीचे शुरू करना चाहिए और कोशिकाओं के ऊपर थोड़ा अंत. विशेष सूक्ष्म सेटअप पर निर्भर करता है, उपयोगकर्ताओं को छवि प्रसंस्करण लिपियों में पैरामीटर के कुछ समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है (जैसे "th" छवि पृष्ठभूमि तीव्रता सीमा के लिए). जबकि वर्तमान विधि का पता लगाने और विभाजित सेल वस्तुओं में अलग-अलग LDs का वर्णन करने में सक्षम है, कार्यप्रवाह सही मायने में एकल सेल डेटा सभी अलग-अलग कोशिकाओं के स्वचालित जुदाई के साथ कठिनाइयों के कारण उत्पादन नहीं करता है। इसके बजाय, पूरे नमूने के लिए सामान्यीकृत कक्ष वॉल्यूम की प्रति इकाई LD सामग्री रिपोर्ट की गई है। यह सीमा विषमांगी कोशिका जनसंख्या के विश्लेषणों में डेटा व्याख्या को बाधित कर सकती है। इसके अलावा, छोटे अणुओं के परिवर्तित परिवहन के साथ कोशिकाओं के साथ काम करते समय देखभाल की जानी चाहिए (उदाहरण के लिए, efflux पंप म्यूटेंट), क्योंकि यह intracellular BODIPY 493/503 एकाग्रता और एलडी धुंधला को प्रभावित कर सकता है, जैसा कि नील लाल लिपोफिलिक डाई33 के लिए मनाया जाता है , 34.

सेल-अपारगम्य Cascade ब्लू फ्लोरोसेंट डेक्सट्रन के साथ माध्यम दाग पृष्ठभूमि35से कोशिकाओं को अलग करने का एक सुविधाजनक तरीका है, जो कई के लिए लागू किया जा सकता है (यदि नहीं सभी) खमीर प्रजातियों. यह भी विश्लेषण से मृत कोशिकाओं के स्वचालित हटाने के साथ मदद करता है के रूप में इन धुंधला पर नीले रंग की बारी होगी. किसी भी मर रहा है या बीमार (और इस प्रकार आंशिक रूप से dextran के लिए पारगम्य) जीवित के रूप में पता चला कोशिकाओं का पता चला सेल वस्तुओं के "IntensityMedianBlue" मूल्य के आधार पर डेटा विश्लेषण चरणों के दौरान हटाया जा सकता है. सिद्धांत रूप में, पूरे कार्यप्रवाह विभिन्न अन्य सेलुलर संरचनाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे डीएनए की मरम्मत foci, संरचनाओं उपयुक्त फ्लोरोफोर्स के साथ लेबल किया जा सकता है बशर्ते. कार्यप्रवाह भी अन्य (पूर्व) प्रजातियों के कोशिकाओं के लिए लागू होना चाहिए, आगे अपनी उपयोगिता को व्यापक.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को चार्ल्स विश्वविद्यालय अनुदान PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 और SVV 260310 द्वारा समर्थित किया गया था. हम माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण पाइप लाइन के विकास के साथ मदद के लिए Ond]ejez ज़ेबेस्टा धन्यवाद. हम एस cerevisiae उपभेदों के लिए ReGenEx प्रयोगशाला धन्यवाद, और JapoNet और हिरोनोरी Niki की प्रयोगशाला एस Japonicus उपभेदों के लिए. ppc1-88 तनाव खमीर आनुवंशिक संसाधन केंद्र जापान द्वारा प्रदान की गई थी. माइक्रोस्कोपी Confocal और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया सह यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष और चेक गणराज्य के राज्य बजट द्वारा वित्त पोषित (परियोजना नहीं. सी.जेड.1.05/4.1.00/16.0347 और सी.जेड.2.16/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) - Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
Pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
Standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 149 तटस्थ लिपिड भंडारण फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी BODIPY 493/503 Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomys जैपोनिकस Saccharomyces सेरेविसिया
स्वचालित छवि प्रसंस्करण का उपयोग कर विखंडन और Budding खमीर में लिपिड ड्रॉपलेट सामग्री का विश्लेषण
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