Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse av lipid dråpe innhold i fisjon og spirende gjær bruker automatisert image processing

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Science, Charles University

Summary

Her presenterer vi en MATLAB implementering av automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av lipid dråper i fluorescens mikroskopi bilder av fisjon og spirende gjærceller.

Abstract

Lipid metabolisme og regulering er av interesse for både grunnleggende og anvendt biovitenskap og bioteknologi. I denne forbindelse er ulike gjær arter brukes som modeller i lipid metabolsk forskning eller for industriell lipid produksjon. Lipid dråper er svært dynamisk lagring organer og deres mobilnettet innhold representerer en praktisk avlesning av lipid metabolske tilstand. Fluorescens mikroskopi er en metode for valg for kvantitativ analyse av cellulære lipid dråper, som det er avhengig av allment tilgjengelig utstyr og tillater analyse av individuelle lipid dråper. Videre kan mikroskopisk bildeanalyse være automatisert, i stor grad øke samlet analyse gjennomstrømming. Her beskriver vi en eksperimentell og analytisk arbeidsflyt for automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av individuelle lipid dråper i tre forskjellige modell gjær arter: den fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe og Schizosaccharomyces japonicus, og den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. Lipid dråper er visualisere med BODIPY 493/503, og celle-ugjennomtrengelig fluorescerende dextran er lagt til kulturen Media for å identifisere celle grenser. Celler utsettes for 3D-epifluorescence mikroskopi i grønne og blå kanaler, og de resulterende z-stack-bildene behandles automatisk av en MATLAB-pipeline. Prosedyren utganger rike kvantitative data på mobilnettet lipid dråpe innhold og individuelle lipid dråpe egenskaper i tabellformat egnet for nedstrøms analyser i store regneark eller statistiske pakker. Vi gir eksempel analyser av lipid dråpe innhold under ulike forhold som påvirker mobilnettet lipid metabolisme.

Introduction

Lipider spiller avgjørende roller i cellulær energi og karbon metabolisme, syntese av membran komponenter, og produksjon av bioaktive stoffer. Lipid metabolisme er finjustert i henhold til miljømessige forhold, næringsstoffer tilgjengelighet og celle-syklus fase1. Hos mennesker, lipid metabolisme har vært koblet til sykdommer, som fedme, type II diabetes og kreft2. I industrien, lipider produsert av mikroorganismer, slik som gjær, representerer en lovende kilde til fornybar diesel brensel3. Celler lagrer nøytrale lipider i såkalte lipid dråper (LDs). Disse evolutionarily bevarte organer er sammensatt av triacylglyceroler, steryl estere, en ytre fosfolipid monolag og tilhørende proteiner1. LDs opprinnelse i endoplasmatiske retikulum, utøve celle-syklus eller vekst-fase dynamikk, og er viktig for mobilnettet lipid homeostase1. LD-nummer og morfologi kan brukes som en praktisk proxy når assaying lipid metabolisme under ulike vekstforhold eller når screening et panel av mutanter. Gitt deres dynamiske natur, teknikker i stand til å analysere egenskapene til enkelte LDs er av spesiell interesse for studier av lipid metabolisme.

Ulike gjær arter har blitt brukt til å beskrive lipid-relaterte metabolske trasé og deres regulering, eller brukes i bioteknologi til å produsere interessante forbindelser eller brensel1. Videre, for modell gjær, slik som spirende gjær Saccharomyces cerevisiae eller fjernt relaterte fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe, Genova-Wide sletting belastning bibliotekene er tilgjengelige som kan brukes for høy gjennomstrømming skjermer4,5. Nylig ld sammensetning og dynamikk har blitt beskrevet i S. pombe6,7,8,9, og mutanter relatert til lipid metabolisme har blitt isolert i den nye modellen gjær Schizosaccharomyces japonicus10.

Det finnes mange teknikker for å studere LD-innhold og dynamikk. De fleste ansetter en slags farging av LDs med lipofile fargestoffer som Nile Red eller BODIPY 493/503. Sistnevnte viser mer smale eksitasjon og utslipp Spectra, og økt spesifisitet mot nøytrale lipider (LDs) i motsetning til fosfolipider (membraner)11. Fluorimetric og Flow-flowcytometri metoder har blitt brukt med hell i ulike fungal arter for å avdekke gener og vekstforhold som påvirker lagring lipid innhold12,13,14,15. Selv om disse metodene er egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømming, kan de ikke måle tallene og morfologi av individuelle LDs i celler, noe som kan variere dramatisk mellom vekstforhold og genotyper. Sammenhengende Raman spredning eller digital holografisk mikroskopi er Label-frie metoder som gir ld-nivå data, men krever spesialisert dyrt utstyr16,17,18. Fluorescens mikroskopi kan derimot gi detaljerte data om LD-innhold, samtidig som de bruker allment tilgjengelige instrumenter og verktøy for bildeanalyse. Det finnes flere analyse arbeidsflyter som har ulike grader av raffinement og automatisering i celle/ld-gjenkjenning fra bildedata, og er optimalisert for ulike celletyper, for eksempel metazoan-celler med stor LDs19,20 , 21, eller spirende gjær17,22,23. Noen av disse tilnærmingene fungerer bare i 2D (for eksempel på maks projeksjons bilder), som kan unnlate å beskrive det cellulære LD-innholdet på en pålitelig måte. Til vår kunnskap finnes det ingen verktøy for bestemmelse av LD-innhold og morfologi fra fisjon gjær mikroskopiske data. Utvikling av automatiserte og robuste LD-nivå analyser vil gi økt følsomhet og forbedret statistisk kraft, og gi rik informasjon om nøytralt lipid innhold, ideelt i flere gjær arter.

Vi har utviklet en arbeidsflyt for LD-innhold analyse fra 3D fluorescens mikroskopi bilder av gjærceller. Levende celler er farget med BODIPY 493/503 og Cascade Blue dextran å visualisere LDs og bestemme celle grenser, henholdsvis. Celler er immobilisert på glass lysbilder og utsatt for z-stack Imaging ved hjelp av et standard epifluorescence mikroskop. Bilder blir deretter behandlet av en automatisert rørledning implementert i MATLAB, en mye brukt (kommersiell) pakke for statistiske analyser. Rørledningen utfører forbehandling av bilder, segmentering (celler i forhold til bakgrunn, fjerning av døde celler) og LD-identifikasjon. Rike data på LD-nivå, for eksempel LD-størrelse og fluorescens intensitet, blir deretter gitt i tabellformat som er kompatible med viktige verktøy for regnearkprogrammer. Arbeidsflyten ble brukt med hell for å bestemme virkningen av nitrogen kilde tilgjengelighet på lipid metabolisme i S. pombe24. Vi viser nå funksjonaliteten til arbeidsflyten i s. pombe, s. japonicus og s. cerevisiae, ved hjelp av vekstforhold eller mutanter som påvirker mobilt ld-innhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av løsninger og Media

  1. Forbered lipid farging løsning.
    1. For å forberede lager lipid farge løsning oppløse 10 mg BODIPY 493/503 i 10 mL vannfri DMSO (endelig konsentrasjon 1 mg/mL). Løs opp hele innholdet i et 10 mg BODIPY 493/503 hetteglass for å forhindre tap av materiale under veiing.
      Forsiktig: DMSO kan passere gjennom huden. Bruk egnet personlig verneutstyr.
    2. Forbered arbeider lipid farge løsning ved å blande 100 μL av 1 mg/mL BODIPY 493/503 lagerløsning og 900 μL av vannfri DMSO (endelig konsentrasjon 0,1 mg/mL).
    3. Alikvot lager-og arbeids løsningene og oppbevares ved-20 ° c.
      Merk: Oppløst BODIPY 493/503 er stabilt i flere år ved-20 ° c. Imidlertid, oppløsningen har å bli beskyttet fra fuktighet og lyset.
  2. For å forberede lagerløsning for cellegrense visualisering, oppløse 25 mg Cascade Blue dextran (hele hetteglasset) i 2,5 mL deionisert vann (endelig konsentrasjon 10 mg/mL). Alikvot lager løsningen og oppbevar ved-20 ° c beskyttet mot lys.
  3. For å forberede mikroskopet Slide belegg løsning, oppløse 5 mg soyabønner Lektiner i 5 mL deionisert vann (endelig konsentrasjon 1 mg/mL). Alikvot den Lektiner løsningen og oppbevar ved-80 ° c.
    Merk: Den Lektiner løsningen er stabil i flere år ved-80 ° c. Alikvoter som for øyeblikket er i bruk, kan oppbevares ved-20 ° c.
  4. Forbered dyrking medier.
    1. For å forberede 400 mL kompleks Ja dyrking medium for S. pombe og s. japonicus, oppløse 2 g gjærekstrakt og 0,1 g av SP kosttilskudd (hvis nødvendig for auxotrophic mutanter) i 340 ml deionisert vann i en 500 ml flaske og autoklav. Tilsett 60 mL på 20% (w/v) separat autoklaveres eller filter sterilisert glukose under aseptisk forhold.
    2. For å fremstille 400 mL av definert EMM-medium for s. pombe og s. japonicus, OPPLØSES 4,9 g av EMM buljong uten druesukker i 360 ml deionisert vann i en 500 ml flaske og autoklav. Tilsett 40 mL på 20% (w/v) separat autoklaveres eller filter sterilisert glukose under aseptisk forhold.
      Merk: For generelle retningslinjer om s. pombe og s. japonicus dyrking se25 og26, henholdsvis.
    3. For å forberede 300 mL kompleks YPAD dyrking medium for Saccharomyces cerevisiae, oppløse 3 g gjærekstrakt, 6 g peptone og 30 mg adenine sulfat i 270 ml deionisert vann i en 500 ml flaske og autoklav. Tilsett 30 mL 20% (w/v) separat autoklaveres eller filter-sterilisert glukose under aseptisk forhold.
    4. For å forberede 300 mL av definert minimalt medium for S. cerevisiae, oppløses 2 g gjær nitrogen Base (uten aminosyrer) i 270 ml deionisert vann i en 500 ml flaske og autoklav. Tilsett 30 mL 20% (w/v) separat autoklaveres eller filter-sterilisert glukose under aseptisk forhold.
      Merk: For generelle retningslinjer om S. cerevisiae dyrking se27.

2. celle dyrking

  1. Økende S. pombe eller s. japonicus til eksponentiell eller tidlig stasjonær fase.
    1. I morgen, vaksinere 5 mL av Ja medium med fersk fisjon gjær biomasse. Ruge ved 32 ° c med risting (180 RPM) i flere timer.
      Merk: For alle dyrket, bruk Erlenmeyer kanner har 10 ganger volumet av kulturen for å sikre riktig lufting. Noen laboratorier foretrekker å vokse fisjon gjær ved 30 ° c, men dyrking temperatur på 32 ° c resulterer i kortere dobling ganger uten skadelige effekter på cellene, og dermed redusere den totale tiden som kreves for å utføre et eksperiment25,28 .
    2. På sen ettermiddag samme dag (etter minst 6 timers dyrking), fortynne kulturen med friskt Ja medium til en 10 mL endelig kultur volum slik at den når ønsket optisk tetthet (OD) (eller antall celler/mL) neste morgen, og ruge ved 32 ° c med s Haking (180 RPM). Det er av fordel å vite dobling tiden av hver brukt belastning å nøyaktig bestemme fortynning faktor (bruk ligning 1).
      Equation 1
      Der v-kulturen er det preculture volumet som trengs for fortynning, er VFinal det totale volumet av den nye kulturen (10 ml for standard DYRKET), ODfinalen er den ønskede OD som skal nås neste morgen, ODstrøm er for tiden målt OD av preculture, t er tidspunktet for cellevekst før høsting, tlag er varigheten av lag fasen (avhengig av laboratorieforhold, må være empirisk definert) og tdt er dobling tid av belastningen.
      Merk: Når eksponentiell fase celler skal analyseres, ikke la precultures nå den stasjonære fase som dette dramatisk endrer celle fysiologi (inkludert LD innhold) for flere påfølgende generasjoner.
    3. Om morgenen Imaging dag, hvis kulturen nådde litt høyere OD enn nødvendig (i tilfelle av eksponentiell fase celler), fortynne det med friskt Ja og fortsette inkubasjons i minst to dobling ganger før farging av LDs. ellers gå direkte til farging (avsnitt 3).
  2. Økende S. cerevisiae til eksponentiell og stasjonær fase.
    1. På ettermiddagen vaksinere 10 mL YPAD medium med en liten mengde fersk spirende gjær biomasse og ruge over natten ved 30 ° c med risting (180 RPM).
    2. Morgen av tenkelig dag, fortynne kulturen å OD 0,1 inne 10 mL av YPAD medium og avle å det krevde OD (e.g., OD 1 for eksponentiell Phase). Utfør alle kultur fortynninger som beskrevet i trinn 2.1.2. Fortsett til farging (avsnitt 3).

3. lipid dråpe farging

  1. Gjør et mikroskop deksel slip for hver prøve å bli avbildet. Spre 1 μL av Slide belegg løsning på en ren deksel slip bruke langsiden av en horisontalt plassert pipette spissen. La belegget løsningen tørke helt og oppbevar dekselet slips i et støvfritt miljø.
    Merk: Glass lysbilder og coverslips kan rengjøres før bruk om nødvendig. Rengjøringsprosedyren består av vask med oppvaskmiddel, skylling med vann, over natten soaking i 3% saltsyre, og vask med destillert vann. Renset lysbilder og coverslips er lagret i ren etanol til bruk.
  2. Mål OD av cellekultur eller antall celler/mL, etter behov. Prøv å nå lignende verdier blant alle testede stammer for å sikre sammenlignbare eksperimentelle forhold.
  3. Pipetter 1 mL av hver cellekultur til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube. For S. cerevisiae bare tilsett 5 μL av raset belegg løsningen, Vortex kort, og ruge ved 30 ° c med risting i 5 min.
  4. Tilsett 1 μL av lipid farge løsning til hver kultur alikvot og Vortex kort. Legg deretter til 10 μL av cellegrense visualisering løsning og Vortex kort.
    Merk: Ikke Forbered pre-blandede løsninger av begge flekker som dette fører til fluorescens slukke av BODIPY 493/503.
  5. Samle cellene ved sentrifugering (1 000 x g, 3 min, RT) og fjern nesten alle supernatanten (~ 950 μL). Resuspend cellene i de resterende supernatanten.
  6. Pipetter 2 μL av tett celle oppheng på et Lektiner deksel slip og plasser på et rent mikroskop. Cellene skal danne en monolag. Fortsett til mikroskopi (seksjon 4) så raskt som mulig for å minimere artefakter i bildebehandling; behandle maksimalt to prøver om gangen.

4. sette opp mikroskopet og bildebehandling

  1. Optimaliser bildeforhold.
    Merk:     å sette opp mikroskopet krever lange eksponeringer til sterke lyskilder som kan forårsake skade på prøven og skew-resultatene. Derfor må du sette opp bilde forholdene ved hjelp av et dedikert eksempel lysbilde som ikke vil bli videre brukt for LD-kvantifisering.
    1. Fokuser på cellene ved hjelp av fase kontrast eller differensial forstyrrelser kontrast (DIC).
      Merk: Fase kontrast eller DIC bilder kan tas for referanse, men de brukes ikke under automatiserte bildet analyse trinn.
    2. Angi innstillinger for z-stakk for å dekke hele celle volumet. Den totale vertikale avstanden avhenger av cellestørrelsen; antall optiske skiver avhenger av den numeriske blenderåpningen til målsettingen (punkt sprednings funksjonen i z-aksen). Sett fokus til å flytte i forhold til det sentrale fokalplanet.
      Merk: Det optimale antallet skiver stilles ofte av Kontrollprogramvaren for mikroskopet, og trenger ikke å beregnes manuelt. De typiske celle breddene er 3-5 μm for s. pombe, 4-7 μm for s. japonicusog 3-7 μm for s. cerevisiae.
    3. Til bilde LDs, sette lys intensitet og eksponeringstid i den grønne kanalen (eksitasjon og utslipp Maxima av BODIPY er 493 og 503 NM, henholdsvis).
      Merk: BODIPY 493/503 er en veldig lys fluorokromkonjugert; Det kan imidlertid bli bleket raskt med altfor sterk lys intensitet. Videre er LDs Mobile i levende celler, og dermed minimere eksponeringstid og fange hele grønn-kanals z-stakken først (før du bytter til den blå kanalen) for å hindre uskarphet gjenstander. Også ta hensyn til den lineære rekkevidden av kameraet for signal intensitet for å unngå mettede piksler.
    4. Til bilde celle grenser, angi lys intensitet og eksponeringstid i den blå kanalen (eksitasjon og utslipp Maxima av Cascade Blue dextran er 400 og 420 NM, henholdsvis).
      Merk: Signal intensitet i den blå kanalen kreves for bilde segmentering, men den brukes ikke for LD-kvantifisering. Derfor er optimale innstillinger i denne kanalen ikke avgjørende for analyse.
    5. Hvis mulig, opprette en automatisert eksperimentell arbeidsflyt i mikroskopet kontrollprogramvare for å lette bildebehandling av flere prøver under standardiserte forhold.
  2. Når bilde forholdene er optimalisert, skal bilde prøvene brukes til kvantifisering. Fokuser på cellene og bilde dem i grønne og blå kanaler som beskrevet i trinn 4,1.
    Merk: Alle bilder må anskaffes ved hjelp av de samme innstillingene for å tillate sammenligning mellom eksempler. Bilde av flere visningsfelt per prøve for å oppnå robuste, representative data.
  3. Lagre de blå og grønne kanalen z-stakk bilder som 16-bits multi-Layer TIFF-filer (dvs. to filer per synsfelt). Ta med ordene "grønn" eller "blå" i de tilsvarende filnavnene. Fortsett med bildeanalyse (avsnitt 5).

5. image analyse

  1. Sjekk kvaliteten på de oppnådde bildene visuelt.
    1. Åpne mikroskopiske bilder i ImageJ eller annen egnet bildeanalyse programvare.
    2. Fjern eventuelle bilde stabler som inneholder et betydelig antall celler som ble flyttet under anskaffelsen (og dermed skapte objekter som ikke blir uskarpe).
    3. Fjern alle bilde stabler som inneholder svært fluorescerende ikke-celle partikler i den blå kanalen (for eksempel smuss på objektglass eller deksel seddel, urenheter i dyrking medium).
      Merk: Veldig lyse ikke-celle objekter i den blå kanalen kan skape celle deteksjon gjenstander eller kan forstyrre påvisning av celler i nærheten.
    4. Fjern eventuelle bilde stabler som inneholder en stor andel av døde celler (dvs. celler med økt blå fluorescens sammenlignet med levende celler).
      Merk: Mens tilstedeværelsen av en liten andel av døde celler i prøven er vanligvis ikke et problem, og disse cellene blir automatisk forkastet under analyse, noen døde eller døende celler kan noen ganger bli gjenkjent som levende celler av segmentering algoritmen og dermed å forskyve de rapporterte resultatene.
  2. Analyser bilder i MATLAB-programvaren.
    1. Opprette en hovedavdeling brosjyre og avskrift alle MATLAB manuskripter å denne plasseringen.
    2. Opprette en sub-brosjyre ("pombe", "cerevisiae" eller "japonicus") og avskrift input TIFF Image fil-størrelse å denne plasseringen.
    3. Start MATLAB, åpne skriptet MAIN. m og kjøre den. I menyen velger gjær arter som skal analyseres og starte bildebehandling.
      Merk: Noen av parametrene som kreves for celle og LD deteksjon er forhåndsinnstilt for den bestemte arten, andre bestemmes automatisk under bildebehandling. De forhåndsinnstilte verdiene ble fastslått empirisk og avhenger av flere faktorer, for eksempel objektiv forstørrelse, kameratype og følsomhet, og bildeinnstillinger. Hvis det er nødvendig, kan brukerne redigere skriptfiler for å endre organisme-spesifikke forhåndsinnstillinger for å bedre gjenspeile deres eksperimentelle oppsett. Nemlig, under celle gjenkjennelse akseptable objekt størrelser er gitt av "minArea" og "maxArea" parametere, og minimum brøkdel av fylt volum innenfor objektgrensene er gitt av "soliditet" parameter. For LD-gjenkjenning er lysstyrketerskelen gitt av parameteren "th" (verdien påvirkes hovedsakelig av bilde bit dybde og fluorescens signal intensitet), og maksimal akseptabel LD-størrelse er gitt av "MaxArea"-parameteren.
    4. Inspiser og behandle utdatafiler etter behov ved hjelp av en regneark Editor eller statistisk pakke; arbeidsflyten produserer semikolon-separerte CSV-filer, og segmentert TIFF-filer med oppdagede celle objekter og LDs.
      Merk: Arbeidsflyten segmenter bilder i bakgrunnen og celle objekter, der hvert celleobjekt kan være sammensatt av flere tilstøtende celler. Utdataene i "xxxx_cells. csv"-filer representerer derfor ikke enkelt celledata og bør bare brukes til å beregne målinger per enhet av celle volum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele prosedyren er oppsummert i figur 1 for fisjon gjær (den spirende gjær arbeidsflyten er analogt), og nedenfor gir vi eksempler på hvordan arbeidsflyten kan brukes til å studere ld innhold i tre forskjellige gjær arter under ulike forhold kjent for å påvirke mobilt LD-innhold. Hvert eksempel representerer et enkelt biologisk eksperiment.

Figure 1
Figur 1: skjematisk diagram av eksperimentell og analytisk arbeidsflyt. Arbeidsflyten for fisjon gjær er vist som et eksempel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Først analyserte vi S. pombe celler (figur 2). Vill-type (WT; h + s) celler ble dyrket til eksponentiell fase i enten komplekse Ja medium eller definert EMM medium. Sammenlignet med Ja, ble færre LDs og høyere LD farge intensitet per enhet av celle volum oppdaget i EMM (fig. 2a-C). Videre var den enkelte LDs dannet i EMM medium større og vist økt total farging intensitet (figur 2D, E). Dette er i samråd med tidligere funn av økt lagring lipid innhold i celler vokst i EMM24. Den ppc1 genet koder en phosphopantothenate-cystein ligase kreves for koenzym en syntese. Den temperaturfølsomme ppc1-88- mutant viser en markert reduksjon i ld-innhold når det dyrkes ved den restriktive temperaturen31, noe som gir et eksempel på celler med lavt BODIPY 493/503-signal (figur 2a). Tilsvarende, sammenlignet med vill type (vokst ved 32 ° c), ble mindre LDs med lavere total farge intensitet påvist i ppc1-88 celler VOKST i Yes etter et skifte til 36 ° c (figur 2D, E), uten noen åpenbar endring i ld nummer per enhet av celle volum (figur 2b).

Figure 2
Figur 2: effekt av vekst medier og lipid metabolisme mutasjon på ld-innhold i S. pombe. Wild type (WT) og ppc1-88 celler ble dyrket til eksponentiell fase i komplekse Ja eller definert EMM medium, som indikert. WT celler ble dyrket ved 32 ° c. Temperaturfølsomme ppc1-88 celler ble dyrket ved 25 ° c og flyttet til 36 ° c i 2 timer før analyse. (A) representative ubehandlede mikroskopiske bilder av LDs BEISET med BODIPY 493/503. Det vises en enkelt optisk sektor for hver betingelse. 10% overlegg med invertert blå kanal ble lagt til bedre visualisere celle grenser. Scale bar = 10 μm. (B) Antall identifiserte LDs per enhet av celle volum. (C) fluorescens intensitet av identifiserte LDs per enhet av celle volum. (D) distribusjoner av totalt fluorescens intensitet av alle identifiserte LDs. * * *, # # # ikke sammenkoblet Wilcoxon test p = 1,7 x 10-107, p = 3,7 x 10-132, henholdsvis. (E) distribusjoner av volumer av alle identifiserte LDs. * * *, # # # ikke sammenkoblet Wilcoxon test p = 6,8 x 10-71, p = 1 x 10-64, henholdsvis. Data i panelene B-E ble utledet fra henholdsvis 242, 124 og 191 celle objekter for WT YES, WT EMM og ppc1-88 samples. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Deretter kvantifisert vi ld innhold i S. japonicus celler (h+matsj-2017)32 fra eksplosive og tidlige stasjonære kulturer dyrket i Ja (figur 3a). Celler inn i stasjonær fase viste markant redusert antall LDs per enhet av celle volum sammenlignet med eksponentielt voksende celler (figur 3b), mens volum normalisert ld fluorescens intensitet redusert litt mellom de to forholdene ( Figur 3c). Den tidlige stasjonære-fase LDs var vanligvis moderat større i størrelse og hadde moderat høyere total fluorescens intensitet i forhold til LDs fra eksponentielt voksende celler (figur 3D, E).

Figure 3
Figur 3: ld-innhold i S. japonicus celler endres med vekstfase. Eksponentielt voksende (LOG) og tidlig stasjonær fase (STAT) celler ble analysert. (A) representative ubehandlede mikroskopiske bilder av LDs BEISET med BODIPY 493/503. Det vises en enkelt optisk sektor for hver betingelse. 10% overlegg med invertert blå kanal ble lagt til bedre visualisere celle grenser. Skala bar representerer 10 μm. (B) Antall identifiserte LDs per enhet av celle volum. (C) fluorescens intensitet av identifiserte LDs per enhet av celle volum. (D) distribusjoner av totalt fluorescens intensitet av alle identifiserte LDs. * * * ikke sammenkoblet Wilcoxon test p = 1,3 x 10-114. (E) distribusjoner av volumer av alle identifiserte LDs. * * * ikke sammenkoblet Wilcoxon test p = 2,4 x 10-85. Data i panelene B-E ble utledet fra henholdsvis 274 og 187 celle objekter for LOG og STAT-prøvene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Til slutt analyserte vi S. cerevisiae celler av den mye brukte BY4741 laboratoriet belastning (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) vokst til eksponentiell og stasjonær fase, henholdsvis i komplekse YPAD medium. Spirende gjærceller vanligvis akkumulere lagring lipider ved inntreden i stasjonær fase1, og vi var i stand til å recapitulate disse funnene (Figur 4). Stasjonære celler inneholdt noe færre LDs per volum enhet sammenlignet med eksponentielt voksende celler (figur 4b), men deres volum normalisert ld fluorescens intensitet nesten doblet (figur 4c). Denne kraftige økningen i samlet LD-innhold skyldtes den mye høyere fluorescens intensiteten og volumet av den enkelte LDs i stasjonær fase (figur 4d, E).

Figure 4
Figur 4: ld-innhold i S. cerevisiae celler endres med vekstfase. Eksponentielt voksende (LOG) og stasjonær fase (STAT) celler ble analysert. (A) representative ubehandlede mikroskopiske bilder av LDs BEISET med BODIPY 493/503. Det vises en enkelt optisk sektor for hver betingelse. 10% overlegg med invertert blå kanal ble lagt til bedre visualisere celle grenser. Skala bar representerer 10 μm. (B) Antall identifiserte LDs per enhet av celle volum. (C) fluorescens intensitet av identifiserte LDs per enhet av celle volum. (D) distribusjoner av totalt fluorescens intensitet av alle identifiserte LDs. * * * ikke sammenkoblet Wilcoxon test p = 4,6 x 10-78. (E) distribusjoner av volumer av alle identifiserte LDs. * * * ikke sammenkoblet Wilcoxon test p = 3,7 x 10-63. Data i panelene B-E ble utledet fra henholdsvis 430 og 441 celle objekter for LOG og STAT-prøvene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dermed kan vår analyse arbeidsflyt oppdage endringer i LD-nummer, størrelse og lipid-innhold i tre forskjellige og morfologisk distinkte gjær arter under ulike forhold som positivt eller negativt påvirke Cellular LD innhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelsen av lipid metabolisme og dens regulering er viktig for både grunnleggende biologi, og kliniske og bioteknologisk applikasjoner. LD innhold representerer en praktisk avlesning av lipid metabolisme tilstand av cellen, med fluorescens mikroskopi være en av de viktigste metodene som brukes for LD innhold besluttsomhet. Den presenterte protokollen tillater automatisert oppdagelse og kvantitativ beskrivelse av individuelle LDs i tre forskjellige og morfologisk distinkte gjær arter. Til vår kunnskap, finnes det ingen lignende verktøy for fisjon gjær. MATLAB-skript som kreves for bildebehandling er inkludert som tilleggsfiler, og er også tilgjengelig fra Figshare repository (DOI 10.6084/M9. Figshare. 7745738) sammen med alle rå og bearbeidet bilde og tabelldata fra dette manuskriptet, detaljerte beskrivelser av CSV output filer, og R-skript for nedstrøms dataanalyse og visualisering. Den nyeste versjonen av MATLAB-skriptene er også tilgjengelig fra GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis).

Vellykket LD-analyse er i stor grad avhengig av kvaliteten på de rå fluorescens bildene som er innhentet. For optimal ytelse av segmentering algoritmer, rent glass lysbilder blottet for støvpartikler bør brukes for mikroskopi, bør cellene danne en monolag (det faktiske antall celler per synsfelt er ikke en kritisk parameter), og bør ikke inneholde en stor andel av døde celler. Dessuten bør z-stack Imaging starte litt under og ender litt over cellene. Avhengig av det bestemte mikroskopiske oppsettet, kan det hende at brukerne må justere noen av parameterne i bildebehandlings skriptene (for eksempel "th" for intensitet terskel for bildets bakgrunn). Mens den gjeldende metoden er i stand til å oppdage og beskrive individuelle LDs i segmentert celle objekter, produserer arbeidsflyten ikke virkelig enkelt celledata på grunn av problemer med automatisert separasjon av alle individuelle celler. I stedet rapporteres LD-innhold per enhet av celle volumet generalisert for hele eksemplet. Denne begrensningen kan hemme data tolkning i analyser av heterogene celle populasjoner. I tillegg bør forsiktighet utvises når du arbeider med celler med endret transport av små molekyler (f. eks, utstrømming pumpe mutanter), da dette kan påvirke intracellulære BODIPY 493/503 konsentrasjon og LD flekker, som observert for Nilen Red lipofile fargestoff33 , i 34.

Farging mediet med celle-ugjennomtrengelig Cascade Blue fluorescerende dextran er en praktisk måte å skille celler fra bakgrunnen35, som kan brukes på mange (om ikke alle) gjær arter. Det hjelper også med automatisert fjerning av døde celler fra analysen da disse vil bli blå på farging. Alle døende eller syk (og således delvis gjennomtrengelig for dextran) celler oppdaget idet i Live kan fjernet i løpet av dataanalyse skritt basert på det "IntensityMedianBlue" salgsverdi av det oppdaget cellen emner. I prinsippet kan hele arbeidsflyten brukes til å oppdage ulike andre cellulære strukturer, slik som DNA-reparasjon fokus, forutsatt at strukturene kan merkes med egnede fluorophores. Arbeidsflyten bør også være gjeldende for celler av andre (gjær) arter, ytterligere utvide sin nytte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 og SVV 260310. Vi takker Ondřej Šebesta for hjelp med mikroskopi og utvikling av bildet analyse rørledningen. Vi takker ReGenEx laboratoriet for s. cerevisiae stammer, og JapoNet og Hironori Niki ' s Lab for s. japonicus stammer. Den ppc1-88 stamme ble levert av gjær genetisk Resource Center Japan. Mikroskopi ble utført i laboratoriet for Konfokalmikroskopi og fluorescens mikroskopi co-finansiert av det europeiske Regional Development Fund og statsbudsjettet til den tsjekkiske republikk (Project no. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 og CZ. 2.16/3.1.00/21515).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) - Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
Pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
Standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
  2. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  3. Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
  4. Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
  5. Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).
  6. Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
  7. Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
  8. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
  9. Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
  10. Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
  11. Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
  12. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
  13. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
  14. Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
  15. Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
  16. Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
  17. Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
  18. Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
  19. Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
  20. Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
  21. Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
  22. Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
  23. Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
  24. Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
  25. Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
  26. Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
  27. Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
  28. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
  29. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
  32. Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
  33. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  34. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
  35. Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).

Tags

Immunologi og infeksjon nøytral lipid lagring fluorescens mikroskopi kvantitativ mikroskopi BODIPY 493/503 Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces japonicus Saccharomyces cerevisiae
Analyse av lipid dråpe innhold i fisjon og spirende gjær bruker automatisert image processing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Princová, J., Schätz, M.,… More

Princová, J., Schätz, M., Ťupa, O., Převorovský, M. Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing. J. Vis. Exp. (149), e59889, doi:10.3791/59889 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter