Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse af lipid dråbe indhold i fission og spirende gær ved hjælp af automatiseret billedbehandling

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Science, Charles University

Summary

Her præsenterer vi en MATLAB implementering af automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af lipid dråber i Fluorescens mikroskopi billeder af fission og spirende gærceller.

Abstract

Lipid metabolisme og dens regulering er af interesse for både grundlæggende og anvendt biovidenskab og bioteknologi. I denne forbindelse anvendes forskellige gærarter som modeller i lipid metaboliske forskning eller til industriel lipid produktion. Lipid dråber er meget dynamiske opbevarings organer og deres cellulære indhold repræsenterer en bekvem aflæsning af lipid metaboliske tilstand. Fluorescens mikroskopi er en metode til valg af kvantitativ analyse af cellulære lipid dråber, da den er afhængig af bredt tilgængeligt udstyr og giver mulighed for analyse af individuelle lipid dråber. Desuden kan mikroskopisk billedanalyse automatiseres, hvilket i høj grad øger den samlede analysekapacitet. Her beskriver vi en eksperimentel og analytisk arbejdsgang for automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af individuelle lipid dråber i tre forskellige model gærarter: fissions gær Schizosaccharomyces pombe og Schizosaccharomyces japonicus, og den spirende gær Saccharomyces cerevisiae. Lipid dråber visualiseret med BODIPY 493/503, og celle-impermeable fluorescerende dextran tilsættes til kultur medierne for at hjælpe med at identificere cellegrænser. Cellerne udsættes for 3D-epifluorescens mikroskopi i grønne og blå kanaler, og de resulterende z-stack-billeder behandles automatisk af en MATLAB-rørledning. Proceduren udsender rige kvantitative data om cellulære lipid dråbe indhold og individuelle lipid dråbe egenskaber i et tabelformat, der egner sig til downstream-analyser i større regneark eller statistiske pakker. Vi giver eksempel analyser af lipid dråbe indhold under forskellige forhold, der påvirker cellulære lipid metabolisme.

Introduction

Lipiderne spiller afgørende roller i cellulære energi og kulstof metabolisme, syntese af membran komponenter, og produktion af bioaktive stoffer. Lipid metabolisme er finjusteret i henhold til miljømæssige forhold, næringsstof tilgængelighed og celle-cyklus fase1. Hos mennesker, lipid metabolisme har været forbundet med sygdomme, såsom fedme, type II diabetes og kræft2. I industrien udgør lipider fremstillet af mikroorganismer, såsom gær, en lovende kilde til vedvarende dieselolie3. Cellerne lagrer neutrale lipiderne i såkaldte lipid-dråber (LDs). Disse evolutionært bevaret organer er sammensat af triacylglyceroler, steryl estere, en ydre phospholipid enkeltlags og tilhørende proteiner1. LDs har oprindelse i endoplasmatiske reticulum, udøver celle-cyklus eller vækst-fase dynamik, og er vigtige for cellulære lipid homøostase1. LD nummer og morfologi kan bruges som en bekvem proxy, når bestemmelse lipid metabolisme under forskellige vækstbetingelser eller når screening et panel af mutanter. I betragtning af deres dynamiske karakter, teknikker i stand til at analysere egenskaberne af de enkelte LDs er af særlig interesse i undersøgelser af lipid metabolisme.

Forskellige gærarter er blevet brugt til at beskrive lipid-relaterede metaboliske veje og deres regulering, eller anvendes i bioteknologi til at producere interessante forbindelser eller brændstoffer1. Endvidere, for model gær, såsom spirende gær Saccharomyces cerevisiae eller den fjernt relateret fission gær Schizosaccharomyces pombe, Genome-Wide sletning stamme biblioteker er tilgængelige, der kan bruges til high-gennemløb skærmbilleder4,5. For nylig ld sammensætning og dynamik er blevet beskrevet i S. pombe6,7,8,9, og mutanter relateret til lipid metabolisme er blevet isoleret i den spirende model gær Schizosaccharomyces japonicus10.

Der findes talrige teknikker til undersøgelse af LD-indhold og-dynamik. De fleste ansætte en form for farvning af LDs med lipofile farvestoffer såsom Nilen rød eller BODIPY 493/503. Sidstnævnte viser mere smalle excitation og emission spektre, og øget specificitet mod neutrale lipiderne (LDs) i modsætning til fosfolipider (membraner)11. Fluorimetriske og flow-cytometri metoder er blevet anvendt med succes i forskellige svampearter til at afdække gener og vækstbetingelser, der påvirker opbevaring lipid indhold12,13,14,15. Disse metoder egner sig til applikationer med høj kapacitet, men de kan ikke måle antallet og morfologien af individuelle LDs i celler, som kan variere dramatisk mellem vækstbetingelser og genotyper. Sammenhængende Raman spredning eller digital holografisk mikroskopi er label-fri metoder, der giver ld-niveau data, men kræver specialiseret dyrt udstyr16,17,18. Fluorescens mikroskopi, på den anden side, kan give detaljerede data om LD indhold, samtidig udnytte almindeligt tilgængelige instrumenter og billedanalyse software værktøjer. Flere analyse arbejdsgange findes, der har forskellige grader af raffinement og automatisering i celle/ld detektion fra billeddata, og er optimeret til forskellige celletyper, såsom metazoiske celler med store LDs19,20 , 21, eller spirende gær17,22,23. Nogle af disse tilgange virker kun i 2D (f. eks. på maksimale projektion billeder), som kan ikke pålideligt beskrive cellulært LD indhold. Til vores viden, findes der ingen værktøjer til bestemmelse af LD indhold og morfologi fra fission gær mikroskopiske data. Udvikling af automatiserede og robuste LD-niveau analyser vil give øget følsomhed og øget statistisk effekt, og give rig information om neutralt lipid indhold, ideelt i flere gærarter.

Vi har udviklet en arbejdsgang for LD-indholdsanalyse fra 3D Fluorescens mikroskopi billeder af gærceller. Levende celler er farvet med BODIPY 493/503 og Cascade Blue dextran at visualisere LDs og bestemme cellegrænser, hhv. Cellerne er immobiliseret på glas slides og udsat for z-stack Imaging ved hjælp af en standard epifluorescens mikroskop. Billeder behandles derefter af en automatiseret pipeline implementeret i MATLAB, en meget brugt (kommerciel) pakke til statistiske analyser. Pipelinen udfører billedforbehandling, segmentering (celler vs. baggrund, fjernelse af døde celler) og LD-identifikation. Fyldige data på LD-niveau, såsom LD-størrelse og fluorescens intensitet, leveres derefter i et tabelformat, der er kompatibelt med større regnearkssoftware værktøjer. Arbejdsprocessen blev brugt med succes til at bestemme virkningen af kvælstof kilde tilgængelighed på lipid metabolisme i S. pombe24. Vi demonstrerer nu funktionaliteten af arbejdsprocessen i s. pombe, s. japonicus og s. cerevisiaeved hjælp af vækstbetingelser eller mutanter, der påvirker cellulært LD-indhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af løsninger og medier

  1. Forbered lipid farvning opløsning.
    1. For at forberede bestanden lipid farvningsopløsning opløses 10 mg BODIPY 493/503 i 10 mL vandfri DMSO (slutkoncentration 1 mg/mL). Hele indholdet af et 10 mg BODIPY 493/503-hætteglas opløses for at forhindre tab af materiale under vejning.
      Forsigtig: DMSO kan passere gennem huden. Bær passende personlige værnemidler.
    2. Forbered fungerende lipid-farvningsopløsning ved at blande 100 μL af 1 mg/mL BODIPY 493/503 stamopløsning og 900 μL vandfri DMSO (endelig koncentration 0,1 mg/mL).
    3. Af Stam-og arbejdsopløsninger og opbevares ved-20 °C.
      Bemærk: Opløst BODIPY 493/503 er stabil i flere år ved-20 °C. Opløsningen skal dog beskyttes mod fugt og lys.
  2. For at tilberede stamopløsning til celle grænse visualisering, opløses 25 mg Cascade Blue dextran (hele hætteglas) i 2,5 mL deioniseret vand (slutkoncentration 10 mg/mL). Alikvot stamopløsningen og opbevares ved-20 °C beskyttet mod lys.
  3. For at tilberede mikroskop slide belægning opløsning, opløses 5 mg sojabønne lektin i 5 ml deioniseret vand (slutkoncentration 1 mg/ml). Alikvot lektin-opløsningen og opbevares ved-80 °c.
    Bemærk: Lektin-opløsningen er stabil i flere år ved-80 °c. Aktuelle aliquoter kan opbevares ved-20 °C.
  4. Forbered dyrkningsmedier.
    1. For at forberede 400 mL af komplekse ja dyrkningsmedium for s. pombe og s. japonicus, opløses 2 g gær ekstrakt og 0,1 g SP kosttilskud (hvis det kræves for auxotrof mutanter) i 340 ml afioniseret vand i en 500 ml flaske og autoklave. Tilsæt 60 mL 20% (w/v) separat autoklave eller filter steriliseret glucose under aseptiske forhold.
    2. For at tilberede 400 mL af det definerede EMM dyrkningsmedium for s. pombe og s. japonicus, opløses 4,9 g EMM bouillon uden dextrose i 360 ml afioniseret vand i en 500 ml flaske og autoklave. Tilsæt 40 mL 20% (w/v) separat autoklave eller filter steriliseret glucose under aseptiske forhold.
      Bemærk: For generelle retningslinjer for dyrkning af s. pombe og s. japonicus , se henholdsvis25 og26.
    3. Til tilberedning af 300 mL komplekst YPAD-dyrkningsmedium til Saccharomyces cerevisiaeopløses 3 g gærekstrakt, 6 g pepton og 30 mg adenin sulfat i 270 ml afioniseret vand i en 500 ml flaske og autoklave. Tilsæt 30 mL 20% (w/v) separat autoklave eller filter steriliseret glucose under aseptiske forhold.
    4. For at forberede 300 mL af defineret minimal medium for S. cerevisiae, opløses 2 g gær nitrogen base (uden aminosyrer) i 270 ml afioniseret vand i en 500 ml flaske og autoklave. Tilsæt 30 mL 20% (w/v) separat autoklave eller filter steriliseret glucose under aseptiske forhold.
      Bemærk: For generelle retningslinjer for dyrkning af S. cerevisiae Se27.

2. celledyrkning

  1. Vokser s. pombe eller s. japonicus til eksponentiel eller tidlig stationær fase.
    1. Om morgenen, inokulere 5 mL ja medium med frisk fission gær biomasse. Inkuber ved 32 °C med omrystning (180 rpm) i flere timer.
      Bemærk: For alle dyrkningsformer anvendes Erlenmeyer-kolber med 10 gange kultur mængden for at sikre korrekt luftning. Nogle laboratorier foretrækker at dyrke fissions gær ved 30 °c, men dyrknings temperaturen på 32 °c resulterer i kortere fordoblings tider uden skadelige virkninger på cellerne, hvilket reducerer den samlede tid, der kræves for at udføre et eksperiment25,28 .
    2. I slutningen af eftermiddagen samme dag (efter mindst 6 timers dyrkning), fortyndes kulturen med frisk ja medium til en 10 mL endelig kultur volumen, så den når den ønskede optiske tæthed (OD) (eller antal celler/mL) den følgende morgen, og Inkuber ved 32 °C med s haking (180 rpm). Det er en fordel at kende fordoblings tiden for hver brugt stamme for nøjagtigt at bestemme fortyndingsfaktoren (brug ligning 1).
      Equation 1
      Hvor v-kulturen er den prækultur mængde, der er nødvendig til fortynding, er v-finalen den samlede mængde af den nye kultur (10 ml til standard dyrkning), ODFinal er den ønskede OD, der skal nås efter morgen, ODnuværende er den aktuelt målte OD af preculture, t er tidspunktet for cellevækst indtil høst, tlag er varigheden af lag fase (afhænger af laboratorieforhold, behov for at empirisk defineret), og tdt er fordoblings tiden for stammen.
      Bemærk: Når eksponentielle fase celler skal analyseres, lad ikke prekulturer nå den stationære fase, da dette dramatisk ændrer celle fysiologi (herunder LD indhold) for flere efterfølgende generationer.
    3. Om morgenen på billedbehandlings dagen, hvis kulturen nåede lidt højere OD end nødvendigt (i tilfælde af eksponentiel-fase celler), fortyndes det med frisk ja og fortsætte inkubation i mindst to flere fordoblings tider før farvning af LDs. ellers gå direkte til farvning (afsnit 3).
  2. Dyrkning S. cerevisiae til eksponentiel og stationær fase.
    1. Om eftermiddagen inokulerer 10 mL YPAD medium med en lille mængde frisk spirende gær biomasse og Inkuber natten over ved 30 °C med omrystning (180 rpm).
    2. Om morgenen på billedbehandlings dagen fortyndes kulturen til OD 0,1 i 10 mL YPAD medium og vokser til den ønskede OD (f. eks. OD 1 for eksponentiel fase). Udfør alle dyrknings fortyndinger som beskrevet i trin 2.1.2. Fortsæt til farvning (afsnit 3).

3. lipid dråbe farvning

  1. Forbered en mikroskop Cover seddel for hver prøve, der skal imældes. Spred 1 μL slide belægnings opløsning på en ren dækseddel med den lange side af en vandret placeret pipettespids. Lad belægnings opløsningen tørre helt og opbevar dæksedlen i et støvfrit miljø.
    Bemærk: Glas rutsjebaner og dæksedler kan rengøres før brug, hvis det er nødvendigt. Rengøringsproceduren består af vask med opvaskemiddel, skylning med vand, natblødning i 3% saltsyre og vask med destilleret vand. Rensede slides og dæksedler opbevares i ren ethanol indtil brug.
  2. Mål OD cellekulturen eller antallet af celler/mL efter behov. Prøv at nå tilsvarende værdier blandt alle testede stammer for at sikre sammenlignelige forsøgsbetingelser.
  3. 1 mL af hver cellekultur afpipetteres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. For S. cerevisiae kun tilsættes 5 μl af slide belægnings opløsningen, vortex kortvarigt, og Inkuber ved 30 °c med rystning i 5 min.
  4. Tilsæt 1 μL lipid-Farvningsopløsningen til hver kultur-alikvot og vortex kortvarigt. Tilsæt derefter 10 μL af celle grænse visualiserings opløsningen og vortex kortvarigt.
    Bemærk: Forbered ikke præ-blandede opløsninger af begge pletter, da dette fører til fluorescens dæmper af bodipy 493/503.
  5. Saml cellerne ved centrifugering (1.000 x g, 3 min, RT) og fjern næsten alle supernatanten (~ 950 μl). Resuspendere cellerne i den resterende supernatant.
  6. Der afpipetteres 2 μL af den tætte cellesuspension på en Lectin-belagt Cover seddel og placeres på et rent mikroskop slide. Cellerne skal danne en monolayer. Fortsæt til mikroskopi (afsnit 4) så hurtigt som muligt for at minimere artefakter i billeddannelse; proces maksimum på to prøver ad gangen.

4. opsætning af mikroskop og billeddannelse

  1. Optimer billedbehandlings forholdene.
    Bemærk:     opsætning af mikroskopet kræver lange eksponeringer mod stærke lyskilder, der kan forårsage beskadigelse af prøven og skråtstille resultater. Derfor skal du opsætte billedbehandlings betingelserne ved hjælp af et dedikeret prøve dias, der ikke vil blive yderligere anvendt til LD-kvantificering.
    1. Fokuser på cellerne ved hjælp af fasekontrast eller differens interferens kontrast (DIC).
      Bemærk: Fasekontrast eller DIC-billeder kan tages som reference, men de bruges ikke under det automatiserede billedanalyse trin.
    2. Indstil z-stack indstillinger for at spænde hele celle volumen. Den samlede lodrette afstand afhænger af cellestørrelsen. antallet af optiske skiver afhænger af den numeriske blænde for målet (punkt Spread funktion i z-aksen). Indstil fokus til at bevæge sig i forhold til det centrale brændplan.
      Bemærk: Det optimale antal udsnit indstilles ofte af softwaren til mikroskop kontrol og behøver ikke at blive beregnet manuelt. De typiske cellebredder er 3-5 μm for s. pombe, 4-7 μm for s. japonicusog 3-7 μm for s. cerevisiae.
    3. Til billede LDs, Indstil lysintensitet og eksponeringstid i den grønne kanal (excitation og emission Maxima af BODIPY er henholdsvis 493 og 503 nm).
      Bemærk: BODIPY 493/503 er en meget lys fluorochrome; Men, det kan blive bleget hurtigt med alt for stærk lysintensitet. Desuden er LDs mobile i levende celler, hvilket minimerer eksponeringstid og fanger hele den grønne kanal z-stack først (før du skifter til den blå kanal) for at forhindre udviskning af artefakter. Også tage hensyn til det lineære område af kameraet for signalintensitet for at undgå mættede pixels.
    4. Til billed cellegrænser, Indstil lysintensitet og eksponeringstid i den blå kanal (excitation og emission Maxima af Cascade Blue dextran er henholdsvis 400 og 420 nm).
      Bemærk: Signal intensiteten i den blå kanal er påkrævet for billedsegmentering, men anvendes ikke til selve LD-kvantificering. Derfor er optimale indstillinger i denne kanal ikke afgørende for analyse.
    5. Hvis det er muligt, skal du oprette en automatiseret eksperimentel arbejdsproces i mikroskop styringssoftwaren for at lette billeddannelse af flere prøver under standardiserede betingelser.
  2. Når billedbehandlings forholdene er blevet optimeret, skal der anvendes billed prøver til kvantificering. Fokuser på cellerne, og billede dem i grønne og blå kanaler som beskrevet i trin 4,1.
    Bemærk: Alle billeder skal erhverves ved hjælp af de samme indstillinger for at tillade sammenligning mellem prøver. Billede flere synsfelter pr prøve for at opnå robuste, repræsentative data.
  3. Gem de blå og grønne kanal z-stak billeder som 16-bit flerlags TIFF-filer (dvs. to filer pr. synsfelt). Medtag ordene "grøn" eller "blå" i de tilsvarende filnavne. Fortsæt med billedanalyse (afsnit 5).

5. billedanalyse

  1. Visuelt kontrollere kvaliteten af erhvervede billeder.
    1. Åbn mikroskopiske billeder i ImageJ29,30 eller anden egnet billedanalyse software.
    2. Fjern alle billedstakke, der indeholder et betydeligt antal celler, der bevægede sig under anskaffelsen (og dermed skabte udviskning af artefakter).
    3. Fjern alle billedstakke, der indeholder meget fluorescerende ikke-celle partikler i den blå kanal (f. eks. snavs på mikroskop glide-eller dækseddel, urenheder i dyrkningsmediet).
      Bemærk: Meget lyse ikke-celle objekter i den blå kanal kan oprette celle detekterings artefakter eller kan forstyrre påvisning af celler i deres nærhed.
    4. Fjern alle billedstakke, der indeholder en stor del af døde celler (dvs. celler med øget blå fluorescens sammenlignet med levende celler).
      Bemærk: Mens tilstedeværelsen af en lille andel af døde celler i prøven typisk ikke er et problem, og disse celler automatisk kasseres under analysen, kan nogle døde eller døende celler lejlighedsvis genkendes som levende celler ved segmenterings algoritmen og dermed skew de rapporterede resultater.
  2. Analysér billeder i MATLAB-softwaren.
    1. Opret en hovedmappe, og Kopiér alle MATLAB-scripts til denne placering.
    2. Opret en undermappe ("pombe", "cerevisiae" eller "japonicus"), og kopier input TIFF-billedfiler til denne placering.
    3. Start MATLAB, Åbn script MAIN. m og Kør det. I menuen Vælg den gær arter, der skal analyseres og starte billedbehandling.
      Bemærk: Nogle af de parametre, der kræves for celle-og LD-detektion, er forudindstillet for de enkelte arter, mens andre bestemmes automatisk under billedbehandling. De forudindstillede værdier blev fastlagt empirisk og afhænger af flere faktorer såsom objektivforstørrelse, kameratype og følsomhed samt billedbehandlings indstillinger. Hvis det er nødvendigt, brugere kan redigere script filer til at ændre organismen-specifikke presets til bedre at afspejle deres eksperimentelle setup. Nemlig, under celle genkendelse acceptable objekt størrelser er givet af "minArea" og "maxArea" parametre, og den mindste brøkdel af fyldt volumen inden for objektgrænser er givet ved "soliditet" parameter. For LD-genkendelse angives lysstyrke tærsklen ved parameteren "th" (dens værdi påvirkes mest af billed bitdybden og fluorescens signalintensitet), og den maksimale acceptable LD-størrelse er givet ved parameteren "MaxArea".
    4. Undersøg og Behandl output filerne efter behov ved hjælp af en regnearks editor eller en statistisk pakke. arbejdsprocessen producerer semikolonseparerede CSV-filer og segmenterede TIFF-filer med fundne celle objekter og LDs.
      Bemærk: Arbejdsproces segmenterne billeder i baggrunds-og celle objekter, hvor hvert celle objekt kan bestå af flere tilstødende celler. Derfor repræsenterer outputtet i "xxxx_cells. csv"-filer ikke enkelt celledata og bør kun bruges til at beregne målinger pr. enhed af celle volumen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele proceduren er opsummeret i figur 1 for fissions gær (den spirende gær workflow er analog), og nedenfor giver vi eksempler på, hvordan arbejdsprocessen kan bruges til at studere ld-indhold i tre forskellige gærarter under forskellige forhold, der er kendt at påvirke cellulært LD-indhold. Hvert eksempel repræsenterer et enkelt biologisk eksperiment.

Figure 1
Figur 1: skematisk diagram over den eksperimentelle og analytiske arbejdsgang. Arbejdsgangen for fissions gær vises som et eksempel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Først analyserede vi S. pombe celler (figur 2). Vildtype (WT; h + s) celler blev dyrket til eksponentiel fase i enten det komplekse ja medium eller defineret EMM medium. Sammenlignet med ja blev der påvist færre LDs og højere LD-farvnings intensitet pr. enhed af celle volumen i EMM (figur 2a-C). Desuden var individuelle LDs dannet i EMM medium større og viste øget total farvnings intensitet (figur 2D, E). Dette er i enighed med tidligere resultater af øget opbevaring lipid indhold i celler dyrket i EMM24. Ppc1 -genet koder en fosfopantothenat-cystein-ubiquitinligase, der kræves til coenzym a-syntese. Den temperaturfølsomme ppc1-88- mutant viser et markant fald i ld-indholdet, når det dyrkes ved den restriktive temperatur31, hvilket giver et eksempel på celler med lavt bodipy 493/503-signal (figur 2a). Sammenlignet med vildtype (dyrket ved 32 °C) blev der derfor påvist mindre LDs med lavere total farvnings intensitet i ppc1-88 celler dyrket i ja efter et skift til 36 °C (figur 2D, E) uden nogen åbenbar ændring i ld-nummeret pr. enhed af celle volumen (figur 2b).

Figure 2
Figur 2: effekt af vækstmedier og lipid metabolisme mutation på ld-indhold i S. pombe. Wild type (WT) og ppc1-88 celler blev dyrket til eksponentiel fase i komplekset ja eller defineret EMM medium, som angivet. WT-cellerne blev dyrket ved 32 °C. De temperaturfølsomme ppc1-88 celler blev dyrket ved 25 °c og skiftede til 36 °c i 2 timer før analyse. A) repræsentative uforarbejdede mikroskopiske billeder af LDs farvet med bodipy 493/503. En enkelt optisk skive vises for hver betingelse; 10% overlay med omvendt blå kanal blev tilføjet for bedre at visualisere cellegrænser. Skala bar = 10 μm. (B) antallet af identificerede LDs per enhed af celle volumen. C) Fluorescens intensitet af identificerede LDs pr. enhed af celle volumen. D) fordeling af samlede fluorescens intensiteter for alle identificerede LDs. * * *, # # # uparret Wilcoxon test p = 1,7 x 10-107, p = 3,7 x 10-132, hhv. E) fordeling af mængder af alle identificerede LDs. * * *, # # # uparret Wilcoxon test p = 6,8 x 10-71, p = 1 x 10-64, hhv. Data i paneler B-E blev afledt af henholdsvis 242, 124 og 191 celle objekter for de WT ja, WT EMM og ppc1-88 prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Dernæst kvantificerede vi ld-indhold i S. japonicus -celler (h+matsj-2017)32 fra eksponentielle og tidligt stationære kulturer, som dyrkes i ja (figur 3a). Celler, som kommer ind i den stationære fase, viste markant nedsat antal LDs pr. celle enhed sammenlignet med eksponentielt voksende celler (figur 3b), mens volumen NORMALISERET ld-fluorescens intensitet faldt en anelse mellem de to betingelser ( Figur 3c). De tidlige stationære-fase-LDs var typisk moderat større og havde moderat højere total fluorescens intensitet sammenlignet med LDs fra eksponentielt voksende celler (figur 3D, E).

Figure 3
Figur 3: ld-indhold i S. japonicus celler ændringer med vækstfase. Eksponentielt voksende (LOG) og tidlige stationære fase (STAT) celler blev analyseret. A) repræsentative uforarbejdede mikroskopiske billeder af LDs farvet med bodipy 493/503. En enkelt optisk skive vises for hver betingelse; 10% overlay med omvendt blå kanal blev tilføjet for bedre at visualisere cellegrænser. Scale bar repræsenterer 10 μm.B) antal identificerede LDs pr. enhed af celle volumen. C) Fluorescens intensitet af identificerede LDs pr. enhed af celle volumen. D) fordeling af samlede fluorescens intensiteter for alle identificerede LDs. * * * uparret Wilcoxon test p = 1,3 x 10-114. E) fordeling af mængder af alle identificerede LDs. * * * uparret Wilcoxon test p = 2,4 x 10-85. Data i paneler B-E blev afledt af henholdsvis 274 og 187 celle objekter til LOG-og STAT-prøverne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Endelig, vi analyserede S. cerevisiae celler af den udbredte BY4741 laboratorie stamme (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) vokset til eksponentiel og stationær fase, henholdsvis i det komplekse YPAD medium. Spirende gærceller akkumulerer typisk opbevarings lipider ved indtræden i stationær fase1, og vi var i stand til at rekapitulere disse fund (figur 4). Stationære celler indeholdt noget færre LDs pr. volumenenhed sammenlignet med eksponentielt voksende celler (figur 4b), men deres volumen NORMALISEREDE ld-fluorescens intensitet blev næsten fordoblet (figur 4c). Denne kraftige stigning i det samlede LD-indhold skyldtes den meget højere fluorescens intensitet og mængden af individuelle LDs i stationær fase (figur 4d, E).

Figure 4
Figur 4: ld-indhold i S. cerevisiae celler ændringer med vækstfase. Eksponentielt voksende (LOG) og stationære fase (STAT) celler blev analyseret. A) repræsentative uforarbejdede mikroskopiske billeder af LDs farvet med bodipy 493/503. En enkelt optisk skive vises for hver betingelse; 10% overlay med omvendt blå kanal blev tilføjet for bedre at visualisere cellegrænser. Scale bar repræsenterer 10 μm.B) antal identificerede LDs pr. enhed af celle volumen. C) Fluorescens intensitet af identificerede LDs pr. enhed af celle volumen. D) fordeling af samlede fluorescens intensiteter for alle identificerede LDs. * * * uparret Wilcoxon test p = 4,6 x 10-78. E) fordeling af mængder af alle identificerede LDs. * * * uparret Wilcoxon test p = 3,7 x 10-63. Data i paneler B-E blev afledt af henholdsvis 430 og 441 celle objekter til LOG-og STAT-prøverne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Således kan vores analyse workflow registrere ændringer i LD-nummer, størrelse og lipid-indhold i tre forskellige og morfologiske særskilte gærarter under forskellige forhold, der positivt eller negativt påvirker cellulært LD-indhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelsen af lipid metabolisme og dens regulering er vigtig for både grundlæggende biologi, og kliniske og bioteknologiske anvendelser. LD-indhold repræsenterer en bekvem aflæsning af lipid metabolisme tilstand af cellen, med Fluorescens mikroskopi er en af de vigtigste metoder, der anvendes til LD indhold bestemmelse. Den præsenterede protokol giver mulighed for automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af individuelle LDs i tre forskellige og morfologisk adskilte gærarter. Til vores viden findes der ingen lignende værktøjer til fissions gærsvampe. De MATLAB-scripts, der kræves til billedbehandling, er inkluderet som supplerende filer og er også tilgængelige fra Figshare-lageret (DOI 10.6084/M9. figshare. 7745738) sammen med alle rå og forarbejdede billed-og tabeldata fra dette manuskript, detaljerede beskrivelser af CSV-output filer og R-scripts til downstream-dataanalyse og visualisering. Den nyeste version af MATLAB-scripts er også tilgængelig fra GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis).

En vellykket LD-analyse afhænger i høj grad af kvaliteten af de rå fluorescensbilleder, der opnås. For at opnå optimal ydeevne af segmenterings algoritmerne bør der anvendes rene glas skred uden støvpartikler til mikroskopi, cellerne bør danne et enkeltlags (det faktiske antal celler pr. synsfelt er ikke en kritisk parameter) og bør ikke indeholde en stor del af døde celler. Også, z-stack Imaging bør starte lidt under og ende lidt over cellerne. Afhængigt af den særlige mikroskopiske opsætning, kan brugerne nødt til at justere nogle af parametrene i billedet behandling scripts (såsom "th" for billedet baggrund intensitet tærskel). Mens den nuværende metode er i stand til at detektere og beskrive individuelle LDs i segmenterede celle objekter, producerer arbejdsprocessen ikke ægte enkelt celledata på grund af problemer med automatiseret adskillelse af alle individuelle celler. I stedet rapporteres LD-indhold pr. enhed af celle volumen generaliseret for hele prøven. Denne begrænsning kan hæmme data fortolkningen i analyser af heterogene cellepopulationer. Der skal også udvises forsigtighed, når man arbejder med celler med ændret transport af små molekyler (f. eks. effluks-pumpe mutanter), da dette kan påvirke den intracellulære bodipy 493/503-koncentration og ld-farvning, som observeret for Nilens røde lipofile farvestof33 , 34.

Farvning af mediet med cellen-uigennemtrængelig Cascade blå fluorescerende dextran er en bekvem måde at skelne celler fra baggrunden35, som kan anvendes til mange (hvis ikke alle) gærarter. Det hjælper også med automatiseret fjernelse af døde celler fra analysen, da disse vil blive blå ved farvning. Enhver døende eller syg (og dermed delvist gennemtrængelig for dextran) celler detekteret som levende kan fjernes under dataanalyse trin baseret på "IntensityMedianBlue" værdien af de fundne celle objekter. I princippet kan hele arbejdsprocessen bruges til at detektere forskellige andre cellulære strukturer, såsom DNA reparation Foci, forudsat at strukturerne kan mærkes med egnede fluorophorer. Arbejdsprocessen bør også gælde for celler af andre (gær) arter, yderligere udvide dens nytte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 og SVV 260310. Vi takker Ondřej Šebesta for hjælp med mikroskopi og udvikling af billedet analyse pipeline. Vi takker ReGenEx Lab for s. cerevisiae stammer, og Japonet og Hironori niki's Lab for s. japonicus stammer. Ppc1-88 stammen blev leveret af gær genetiske ressource center Japan. Mikroskopi blev udført i laboratoriet for Konfokal-og Fluorescens mikroskopi, der var medfinansieret af den europæiske fond for regional udvikling og Den Tjekkiske Republiks statsbudget (projekt nr. CZ. 1,05/4.1.00/16.0347 og CZ. 2.16/3.1.00/21515).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) - Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
Pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
Standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
  2. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  3. Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
  4. Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
  5. Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).
  6. Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
  7. Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
  8. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
  9. Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
  10. Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
  11. Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
  12. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
  13. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
  14. Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
  15. Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
  16. Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
  17. Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
  18. Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
  19. Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
  20. Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
  21. Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
  22. Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
  23. Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
  24. Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
  25. Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
  26. Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
  27. Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
  28. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
  29. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
  32. Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
  33. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  34. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
  35. Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).

Tags

Immunologi og infektion neutral Lipid opbevaring Fluorescens mikroskopi kvantitativ mikroskopi BODIPY 493/503 Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces japonicus Saccharomyces cerevisiae
Analyse af lipid dråbe indhold i fission og spirende gær ved hjælp af automatiseret billedbehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Princová, J., Schätz, M.,… More

Princová, J., Schätz, M., Ťupa, O., Převorovský, M. Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing. J. Vis. Exp. (149), e59889, doi:10.3791/59889 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter