Summary
여기에서, 우리는 핵분열과 신진 효모 세포의 형광 현미경 심상에 있는 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명의 MATLAB 구현을 제시합니다.
Abstract
지질 대사와 그 조절은 기본 및 응용 생명 과학 및 생명 공학 모두에 관심이 있습니다. 이와 관련하여, 다양한 효모 종은 지질 대사 연구 또는 산업 지질 생산의 모델로 사용된다. 지질 방울은 매우 동적인 저장 체이며, 그들의 세포 함량은 지질 대사 상태의 편리한 판독을 나타낸다. 형광 현미경 검사법은 널리 이용 가능한 장비에 의존하고 개별 지질 방울의 분석을 허용하기 때문에, 세포 지질 방울의 정량분석을 위한 선택의 방법입니다. 또한 현미경 이미지 분석을 자동화하여 전체 분석 처리량을 크게 높일 수 있습니다. 여기에서, 우리는 3개의 다른 모형 효모 종에 있는 개별 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명을 위한 실험및 분석 워크플로우를 기술합니다: 분열 효모 Schizosaccharomyces pombe 및 Schizosaccharomyces japonicus,그리고 신진 효모 사카로마이세스 세레비시아. 지질 방울은 BODIPY 493/503으로 시각화되고, 세포 불투과성 형광 덱젠은 세포 경계를 식별하는 데 도움이 되는 배양 배지에 첨가된다. 세포는 녹색과 청색 채널에 있는 3D epifluorescence 현미경 검사법을 복종하고 생성된 z 스택 심자는 MATLAB 파이프라인에 의해 자동적으로 처리됩니다. 이 절차는 주요 스프레드시트 또는 통계 패키지의 다운스트림 분석에 적합한 표 형식으로 셀룰러 지질 액적 함량 및 개별 지질 액적 특성에 대한 풍부한 정량적 데이터를 출력합니다. 우리는 세포 지질 대사에 영향을 미치는 다양한 조건 하에서 지질 방울 함량의 예 분석을 제공합니다.
Introduction
지질세포 에너지와 탄소 대사, 막 성분 합성, 생리활성 물질 생산에 중요한 역할을 합니다. 지질 대사는 환경 조건, 영양소 가용성 및 세포 주기 단계1에 따라 미세 조정됩니다. 인간에서는, 지질 물질 대사는 비만, 타입 II 당뇨병 및암 2와 같은 질병에 연결되었습니다. 산업에서 효모와 같은 미생물에 의해 생성 된 지질은 재생 가능한 디젤 연료의 유망한 원천을 나타냅니다3. 세포는 소위 지질 방울에 중립 지질을 저장 (LDs). 이러한 진화적으로 보존된 바디는 트리아실글리세롤, 스테릴 에스테르, 외부 인지질 단층 및관련 단백질 1로 구성된다. LDs는 자 구 체 망상에서 유래, 세포 주기 또는 성장 단계 역학을 발휘, 세포 지질 항상성에 대 한 중요한1. LD 수 및 형태는 다양한 성장 조건 하에서 지질 대사를 또는 돌연변이의 패널을 스크리닝할 때 편리한 프록시로 사용될 수 있다. 그들의 동적 특성을 감안할 때, 개별 LDs의 특성을 분석 할 수있는 기술은 지질 대사의 연구에 특히 관심이 있습니다.
다양한 효모 종은 지질 관련 대사 경로 및 이들의 조절을 기술하기 위해 사용되어 왔으며, 또는 흥미로운 화합물 또는 연료를 생산하기 위해 생명 공학에 사용되어왔다1. 또한, 신진 효모 사카로마이세스 세레비시아 또는 원거리 관련 핵분열 효모 인 Schizosaccharomyces pombe,게놈 전체 결실 균주 라이브러리와 같은 모델 효모의 경우 높은 처리량에 사용할 수 있습니다. 화면4,5. 최근 LD 조성 및 역학은 S. pombe6,7,8,9,지질 대사와 관련된 돌연변이체가 신흥 모델 효모에서 분리되어 설명되어 왔다. Schizosaccharomyces japonicus10.
LD 함량과 역학을 연구하기 위해 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 대부분은 나일 레드 또는 BODIPY 493/503과 같은 친유성 염료를 가진 LDs의 얼룩의 어떤 종류를 채택합니다. 후자는 인지질(membranes)11과반대로 보다 좁은 여기 및 방출 스펙트럼, 및 중성 지질(LDs)을 향한 특이성을 증가시키는 것을 나타낸다. 형광및 유동세포측정법은 저장지질함량12,13,14,15에영향을 미치는 유전자 및 성장조건을 밝히기 위해 다양한 곰팡이종에 성공적으로 사용되어 왔다. 이 방법은 높은 처리량 응용프로그램에 적합하더라도, 성장 조건과 유전형 사이에서 극적으로 다를 수 있는 세포에 있는 개별 적인 LDs의 수 그리고 형태를 측정할 수 없습니다. 코히런트 라만 산란 또는 디지털 홀로그램 현미경 은 LD 수준의 데이터를 산출하는 라벨없는 방법이지만, 전문 고가의 장비16,17,18이필요합니다. 형광 현미경 검사법은, 다른 한편으로는, 일반적으로 이용 가능한 계기 및 심상 분석 소프트웨어 공구를 이용하는 동안, LD 내용에 상세한 데이터를 제공할 수 있습니다. 여러 분석 워크플로우가 존재하며 이미지 데이터에서 셀/LD 검출에서 다양한 수준의 정교함과 자동화를 특징으로 하며, 큰 LDs19,20을 가진 메타조안 셀과 같은 다양한 세포 유형에 최적화되어 있습니다. , 21, 또는 신진 효모17,22,23. 이러한 방법 중 일부는 2D(예: 최대 프로젝션 이미지)에서만 작동하며, 이는 셀룰러 LD 콘텐츠를 안정적으로 설명하지 못할 수 있습니다. 우리의 지식에, 분열 효모 현미경 데이터에서 LD 내용 그리고 형태학의 측정을 위한 아무 공구도 존재하지 않습니다. 자동화되고 강력한 LD-레벨 분석의 개발은 증가된 감도와 향상된 통계적 힘을 가져다 줄 것이며, 여러 효모 종에서 이상적으로 중성 지질 함량에 대한 풍부한 정보를 제공합니다.
우리는 효모 세포의 3D 형광 현미경 심상에서 LD 내용 분석을 위한 워크플로우를 개발했습니다. 살아있는 세포는 각각 LD를 시각화하고 세포 경계를 결정하기 위해 BODIPY 493/503 및 캐스케이드 블루 덱스터넨으로 염색됩니다. 세포는 유리 슬라이드에 고정되고 표준 epifluorescence 현미경을 사용하여 z 스택 화상 진찰을 행합니다. 그런 다음 통계 분석을 위해 널리 사용되는 (상업적) 패키지인 MATLAB에서 구현된 자동화된 파이프라인에 의해 이미지가 처리됩니다. 파이프라인은 이미지 전처리, 세분화(셀 대 배경, 죽은 셀 제거) 및 LD 식별을 수행합니다. 그런 다음 LD 크기 및 형광 강도와 같은 풍부한 LD 수준 데이터가 주요 스프레드시트 소프트웨어 도구와 호환되는 테이블 형식으로 제공됩니다. 이 워크플로우는 S. pombe24에서지질 대사에 대한 질소 공급원 가용성의 영향을 결정하는 데 성공적으로 사용되었다. 우리는 지금 세포 LD 내용에 영향을 미치는 성장 조건 또는 돌연변이를 사용하여 S. pombe, S. japonicus 및 S. cerevisiae에있는 워크플로우의 기능을 보여줍니다.
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Protocol
1. 솔루션 및 미디어 준비
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지질 염색 용액을 준비하십시오.
- 스톡 지질 염색 용액을 준비하려면 무수 DMSO 10 mL에 BODIPY 493/503 10 mg을 용해하십시오 (최종 농도 1 mg / mL). 계량 중 재료 손실을 방지하기 위해 10 mg BODIPY 493/503 바이알의 전체 함량을 용해하십시오.
주의 사항: DMSO는 피부를 통과할 수 있다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. - 1 mg/mL BODIPY 493/503 스톡 용액의 100 μL과 무수 DMSO 의 900 μL(최종 농도 0.1 mg/mL)을 혼합하여 작업 지질 염색 용액을 준비합니다.
- Aliquot 재고 및 작업 솔루션, -20 °C에서 저장합니다.
참고: 용해 된 BODIPY 493/503은 -20 °C에서 몇 년 동안 안정적입니다. 그러나 용액은 습기와 빛으로부터 보호되어야 합니다.
- 스톡 지질 염색 용액을 준비하려면 무수 DMSO 10 mL에 BODIPY 493/503 10 mg을 용해하십시오 (최종 농도 1 mg / mL). 계량 중 재료 손실을 방지하기 위해 10 mg BODIPY 493/503 바이알의 전체 함량을 용해하십시오.
- 세포 경계 시각화를 위한 스톡 솔루션을 준비하려면 2.5 mL의 탈이온수(최종 농도 10 mg/mL)에 캐스케이드 블루 덱젠(전체 바이알) 25 mg을 용해합니다. Aliquot 재고 용액을 -20 °C에서 저장하여 빛으로부터 보호합니다.
- 현미경 슬라이드 코팅 용액을 준비하려면 탈이온수 5 mL (최종 농도 1 mg / mL)에 콩 렉틴 5 mg을 용해하십시오. 알리쿼트 렉틴 용액을 -80°C에서 보관한다.
참고: 렉틴 용액은 -80 °C에서 몇 년 동안 안정적입니다. 현재 사용 중인 알리쿼트는 -20°C에서 보관할 수 있다. -
재배 매체를 준비합니다.
- S. pombe 및 S. japonicus에 대한 복잡한 YES 재배 배지 400 mL을 준비하려면 효모 추출물 2 g과 SP 보충제 0.1 g (보조 영양 돌연변이에 필요한 경우)을 500 mL 병및 오토 클레이브에 탈이온 수 340 mL에 녹입니다. 무균 조건에서 별도로 오토클레이브 또는 필터 멸균 된 포도당의 20 % (w / v)의 60 mL을 추가하십시오.
- S. pombe 및 S. japonicus에 대해 정의된 EMM 재배 배지 400 mL를 준비하려면 500 mL 병 및 오토클레이브에 덱스트로오스없이 4.9 g의 EMM 국물을 360 mL의 탈이온수로 용해하십시오. 무균 조건에서 별도로 오토클레이브 또는 필터 멸균 된 포도당의 40 mL (w / v)를 추가하십시오.
참고: S. pombe 및 S. japonicus 재배에 대한 일반적인 지침은 각각25 및26을참조하십시오. - 사카로미세세스 세레비시아에대한 복합 YPAD 재배 배지 300 mL를 준비하기 위해 효모 추출물 3 g, 펩톤 6 g, 아데닌 황산염 30 mg을 270 mL의 탈이온수 500 mL 및 오토클레이브에 용해시다. 무균 조건에서 별도로 오토클레이브 또는 필터 멸균 된 포도당의 30 mL (w / v)를 추가하십시오.
- S. cerevisiae에 대해 정의된 최소 배지 300 mL을 준비하려면 500 mL 병및 오토 클레이브에 270 mL의 탈이온수에 효모 질소 염기 2 g (아미노산 제외)을 용해하십시오. 무균 조건에서 별도로 오토클레이브 또는 필터 멸균 된 포도당의 30 mL (w / v)를 추가하십시오.
참고: S. 세레비시아 재배에 대한 일반적인 지침은27을참조하십시오.
2. 세포 재배
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기하 급수적 또는 초기 고정 단계에 성장 S. pombe 또는 S. japonicus.
- 아침에, 신선한 핵분열 효모 바이오매스와 YES 배지 의 5 mL을 접종. 32 °C에서 몇 시간 동안 흔들림 (180 rpm)으로 배양하십시오.
참고: 모든 재배의 경우, 적절한 폭기를 보장하기 위해 배양량의 10배를 갖는 Erlenmeyer 플라스크를 사용하십시오. 일부 실험실은 30 °C에서 핵분열 효모를 성장하는 것을 선호하지만 재배 온도가 32 °C로 생성되어 세포에 해로운 영향없이 두 배의 시간이 짧아지므로 실험25,28을 수행하는 데 필요한 총 시간이 줄어듭니다. . - 같은 날 늦은 오후(재배 후 최소 6시간 후)에 신선한 YES 배지를 10 mL 최종 배양 부피로 희석하여 다음 날 아침 원하는 광학 밀도(OD) (또는 세포 수/mL 수)에 도달하고 32°C에서 배양합니다. (180 rpm). 희석 계수를 정확하게 결정하기 위해 사용된 각 변형균의 두 배 시간을 아는 것이 장점입니다(수학식 1 사용).
V배양이 희석에 필요한 전배양량이 있는 경우, Vfinal은 새로운 배양(표준 재배를 위한 10 mL)의 총 부피이며, OD final은 원하는 OD에 도달하게 된다. 다음 아침, OD 전류는 전배양의 현재 측정 된 OD, t는 수확까지 세포 성장의 시간, t지연은 지연 단계의 기간입니다 (실험실 조건에 따라 달라지며, 경험적으로 정의될 수 있음) 및 tDT는 변형의 두 배 시간입니다.
참고: 지수 상 세포를 분석 할 때, 이 극적으로 여러 후속 세대에 대한 세포 생리학 (LD 함량포함)을 변경으로 precultures가 고정 단계에 도달하지 못하게. - 이미징 날 아침에, 배양이 필요한 것보다 약간 더 높은 OD에 도달하면 (지수 상 세포의 경우), 신선한 YES로 희석하고 LDs의 염색 전에 적어도 두 배 더 배배 동안 배양을 계속하십시오. 염색(섹션 3).
- 아침에, 신선한 핵분열 효모 바이오매스와 YES 배지 의 5 mL을 접종. 32 °C에서 몇 시간 동안 흔들림 (180 rpm)으로 배양하십시오.
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기하급수및고정단계로 성장하는 S. 세레비시아.
- 오후에, YPAD 배지의 10 mL을 소량의 신선한 신진 효모 바이오매스로 접종하고 30 °C에서 밤새 교배하여 흔들어 (180 rpm).
- 이미징 당일 아침, YPAD 배지의 10 mL에서 OD 0.1로 배양을 희석하고 필요한 OD(예를 들어, 지수 상에 대한 OD 1)로 성장한다. 2.1.2단계에서 설명한 대로 모든 배양 희석을 수행합니다. 염색을 진행합니다(섹션 3).
3. 지질 방울 염색
- 이미지화할 각 샘플에 대해 현미경 커버 슬립을 준비합니다. 수평으로 배치된 파이펫 팁의 긴 면을 사용하여 깨끗한 커버 슬립에 슬라이드 코팅 용액 1 μL을 퍼뜨리십시오. 코팅 용액이 완전히 건조되고 커버 슬립을 먼지가 없는 환경에 보관하십시오.
참고: 필요한 경우 유리 슬라이드와 커버슬립을 사용하기 전에 청소할 수 있습니다. 세척 절차는 식기 세척 세제로 세척하고, 물로 헹구고, 3 % 염산을 하룻밤 동안 담그고, 증류수로 씻는 것으로 구성됩니다. 세척된 슬라이드와 커버슬립은 사용할 때까지 순수 에탄올에 보관됩니다. - 필요에 따라 세포 배양 또는 세포/mL 수를 측정합니다. 유사한 실험 조건을 보장하기 위해 모든 테스트 균주 중 유사한 값에 도달하려고합니다.
- 각 세포 배양액의 피펫 1 mL을 1.5 mL 의 미세원원지 튜브로 배양한다. S. 세레비시아만을 위해, 슬라이드 코팅 용액의 5 μL을 추가하고, 소용돌이를 짧게 넣고, 30°C에서 5분 동안 흔들어 서 배양한다.
- 지질 염색 용액의 1 μL을 각 배양 알리쿼트 및 소용돌이에 잠시 첨가한다. 그런 다음 세포 경계 시각화 용액의 10 μL을 잠시 추가하고 와류를 짧게 추가합니다.
참고: 이것은 BODIPY 493/503의 형광 담금질로 이끌어 내니까 두 얼룩의 미리 혼합된 해결책을 준비하지 마십시오. - 원심 분리 (1,000 x g, 3 분, RT)로 세포를 수집하고 거의 모든 상월체 (~ 950 μL)를 제거합니다. 나머지 상급의 셀을 다시 일시 중단합니다.
- 렉틴 코팅 커버 슬립에 조밀 한 세포 현탁액의 피펫 2 μL 깨끗한 현미경 슬라이드에 놓습니다. 세포는 단층을 형성해야합니다. 이미징에서 유물을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 현미경 검사법 (섹션 4)으로 진행하십시오. 한 번에 최대 두 개의 샘플을 처리합니다.
4. 현미경 및 화상 진찰을 설치하십시오
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이미징 조건을 최적화합니다.
참고: 현미경을 설정하려면 시료에 손상을 입히고 결과를 왜곡할 수 있는 강한 광원에 장시간 노출해야 합니다. 따라서 LD 정량화에 더 이상 사용되지 않는 전용 샘플 슬라이드를 사용하여 이미징 조건을 설정합니다.- 위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트(DIC)를 사용하여 셀에 초점을 맞춥니다.
참고: 위상 대비 또는 DIC 이미지를 참조하기 위해 촬영할 수 있지만 자동화된 이미지 분석 단계에서는 사용되지 않습니다. - z 스택 설정을 전체 셀 볼륨에 걸쳐 있도록 설정합니다. 총 수직 거리는 셀 크기에 따라 다릅니다. 광학 슬라이스의 수는 목표의 수치 조리개(z축의 점 분산 함수)에 따라 달라집니다. 중심 초점 평면을 기준으로 이동하도록 포커스를 설정합니다.
참고: 최적의 슬라이스 수는 종종 현미경 제어 소프트웨어에 의해 설정되며 수동으로 계산할 필요가 없습니다. 일반적인 세포 폭은 S. pombe의경우 3-5 μm, S. japonicus의경우 4-7 μm, S. cerevisiae의경우 3-7 μm입니다. - 이미지 LD를 위해, 녹색 채널에서 광 강도 및 노출 시간을 설정합니다(BODIPY의 여기 및 방출 최대값은 각각 493 및 503 nm임).
참고: BODIPY 493/503은 매우 밝은 불소입니다. 그러나, 그것은 지나치게 강한 빛 강도로 급속하 게 표백 얻을 수 있습니다. 또한 LD는 라이브 셀에서 이동하므로 노출 시간을 최소화하고 전체 녹색 채널 z 스택을 먼저 캡처하여 흐리게 아티팩트를 방지합니다. 또한 포화 픽셀을 피하기 위해 신호 강도에 대한 카메라의 선형 범위를 고려하십시오. - 셀 경계를 이미지화하려면 블루 채널에서 광 강도 및 노출 시간을 설정합니다(캐스케이드 블루 덱센의 여기 및 방출 최대값은 각각 400 및 420 nm임).
참고: 블루 채널의 신호 강도는 이미지 세분화에 필요하지만 LD 정량화 자체에는 사용되지 않습니다. 따라서 이 채널의 최적 설정은 분석에 중요하지 않습니다. - 가능하면 현미경 제어 소프트웨어에서 자동화된 실험 워크플로우를 만들어 표준화된 조건하에서 여러 시료를 쉽게 이미징할 수 있습니다.
- 위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트(DIC)를 사용하여 셀에 초점을 맞춥니다.
- 이미징 조건이 최적화되면 정량화에 사용할 이미지 샘플을 사용할 수 있습니다. 4.1단계에서 설명한 대로 셀에 초점을 맞추고 녹색 및 파란색 채널로 이미지화합니다.
참고: 샘플 간 비교를 허용하려면 동일한 설정을 사용하여 모든 이미지를 수집해야 합니다. 샘플당 여러 뷰 필드를 이미지화하여 강력한 대표 데이터를 가져옵니다. - 파란색 및 녹색 채널 z 스택 이미지를 16비트 다층 TIFF 파일(예: 뷰필드당 두 개의 파일)으로 저장합니다. 해당 파일 이름에 "녹색" 또는 "파란색"이라는 단어를 포함합니다. 이미지 분석을 진행합니다(섹션 5).
5. 이미지 분석
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획득한 이미지의 품질을 시각적으로 확인합니다.
- ImageJ29,30 또는 기타 적합한 이미지 분석 소프트웨어에서 현미경 이미지를 엽니다.
- 수집 하는 동안 이동 하는 셀의 상당한 수를 포함 하는 모든 이미지 스택을 제거 (따라서 흐리게 아티팩트를 만든).
- 청색 채널에서 고도로 형광비세포 입자를 포함하는 모든 이미지 스택을 제거합니다(예: 현미경 슬라이드 또는 커버 슬립의 먼지, 재배 매체의 불순물).
참고: 청색 채널에 있는 아주 밝은 비 세포 객체는 세포 탐지 아티팩트를 만들거나 그들의 부근에 있는 세포의 탐지를 방해할 수 있습니다. - 죽은 세포의 큰 비율을 포함하는 모든 이미지 스택을 제거 (즉, 살아있는 세포에 비해 증가 된 파란색 형광세포).
참고: 견본에 있는 죽은 세포의 작은 비율의 존재는 전형적으로 문제가 되지 않으며 이 세포는 분석 도중 자동적으로 버려지는 동안, 몇몇 죽은 또는 정지한 세포는 때때로 분할 알고리즘에 의해 살아있는 세포로 인식될 수 있고 이렇게 보고된 결과를 왜곡합니다.
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MATLAB 소프트웨어에서 이미지를 분석합니다.
- 기본 폴더를 만들고 모든 MATLAB 스크립트를 이 위치에 복사합니다.
- 하위 폴더("pombe", "cerevisiae" 또는 "japonicus")를 만들고 입력 된 TIFF 이미지 파일을 이 위치에 복사합니다.
- MATLAB을 시작하고 MAIN.m을 열고 실행합니다. 메뉴에서 분석할 효모 종을 선택하고 이미지 처리를 시작합니다.
참고: 세포 및 LD 검출에 필요한 매개 변수 중 일부는 특정 종에 대해 미리 설정되어 있으며, 다른 매개 변수는 이미지 처리 중에 자동으로 결정됩니다. 미리 설정된 값은 경험적으로 결정되었으며 객관적인 배율, 카메라 유형 및 감도 및 이미징 설정과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 필요한 경우 사용자는 실험 설정을 더 잘 반영하도록 스크립트 파일을 편집하여 유기체별 사전 설정을 변경할 수 있습니다. 즉, 셀 인식 중에 허용되는 개체 크기는 "minArea" 및 "maxArea" 매개변수에 의해 지정되고 개체 경계 내에서 채워진 볼륨의 최소 분율은 "솔리드티" 매개변수에 의해 지정됩니다. LD 인식의 경우 밝기 임계값은 "th" 매개변수(해당 값은 주로 이미지 비트 깊이 및 형광 신호 강도에 의해 영향을 됨)에 의해 주어지며, 허용되는 최대 LD 크기는 "MaxArea" 매개변수에 의해 제공됩니다. - 스프레드시트 편집기 또는 통계 패키지를 사용하여 필요에 따라 출력 파일을 검사하고 처리합니다. 워크플로는 세미콜론으로 분리된 CSV 파일과 감지된 셀 개체 및 LD가 있는 분할된 TIFF 파일을 생성합니다.
참고: 워크플로는 이미지를 배경 및 셀 개체로 분할하며, 여기서 각 셀 개체는 여러 개의 인접한 셀로 구성될 수 있습니다. 따라서 "xxxx_cells.csv" 파일의 출력은 단일 셀 데이터를 나타내지 않으며 셀 단위 단위 메트릭을 계산하는 데만 사용해야 합니다.
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Representative Results
전체 절차는 핵분열 효모에 대해 그림 1에 요약되어 있으며(신진 효모 워크플로우는 유사함), 아래는 알려진 다양한 조건하에서 3가지 다른 효모 종에서 LD 함량을 연구하는 데 워크플로우가 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 예를 제공합니다. 세포 LD 콘텐츠에 영향을 미칩니다. 각 예는 단일 생물학적 실험을 나타낸다.
그림 1: 실험 및 분석 워크플로우의 회로도. 핵분열 효모에 대한 워크플로우가 예로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
먼저, S. 폼베 세포를분석하였다(도 2). 와일드 타입(WT; h 시간 +s) 셀은 복잡한 YES 배지 또는 정의된 EMM 배지에서 지수 상으로 성장하였다. YES에 비해, EMM(도 2A-C)에서 세포 부피단위당 더적은 LDS 및 더 높은 LD 염색 강도가 검출되었다. 더욱이, EMM 배지에서 형성된 개별 LD는 더 크고 총 염색 강도증가(도2D,E)를 나타냈다. 이것은 EMM24에서성장한 세포에 있는 증가한 저장 지질 내용의 이전 사실 인정과 일치합니다. ppc1 유전자는 코엔자임 A 합성에 필요한 인산토테산-시스테인 리가제를 인코딩한다. 온도 민감성 ppc1-88 돌연변이체는 제한 온도31에서성장했을 때 LD 함량의 현저한 감소를 나타내며, 낮은 BODIPY 493/503 신호를 가진 세포의 예를 제공한다(도2A). 따라서, 야생 유형 (32 °C에서 재배)에 비해, 낮은 총 염색 강도를 가진 작은 LDs는 36 ° C (그림2D,E)로 이동 한 후 YES에서 성장 한 ppc1-88 세포에서 검출되었으며, 당 LD 수의 명백한 변화없이 셀 볼륨 단위(그림2B).
그림 2: 성장 매체와 지질 대사 돌연변이가 LD 함량에 미치는 영향 S. 폼베. 야생형(WT) 및 ppc1-88 세포는 지시된 바와 같이 복합예스 또는 정의된 EMM 배지에서 기하급수적으로 성장하였다. WT 세포는 32°C에서 성장하였다. 온도에 민감한 ppc1-88 세포는 25°C에서 성장하여 분석 전 2시간 동안 36°C로 이동했습니다. (A) BODIPY 493/503으로 염색된 LD의 대표적인 미가공 현미경 이미지. 각 조건에 대해 단일 광학 슬라이스가 도시됩니다. 반전된 파란색 채널이 있는 10% 오버레이가 추가되어 셀 경계를 더 잘 시각화했습니다. 축척 막대 = 10μm. (B) 셀 볼륨 단위당 식별된 LD수입니다. (C) 세포 부피 단위당 확인된 LDS의 형광 강도. (D) 식별된 모든 LD의 총 형광 강도 분포. ***, ####미페어링 Wilcoxon 테스트 p = 1.7 x 10-107,p = 3.7 x 10-132,각각. (E) 식별된 모든 LD의 볼륨 분포***, ####페어링되지 않은 Wilcoxon 테스트 p = 6.8 x 10-71,p = 1 x 10-64,각각. 패널 B-E의 데이터는 각각 WT YES, WT EMM 및 ppc1-88 샘플에 대한 242, 124 및 191 셀 객체로부터 유래되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다음으로, 우리는 S. japonicus 세포에서 LD함량을 정량화 (h+matsj-2017)32 YES에서 성장지수 및 초기 고정 배양으로부터 (그림3A). 고정상에 진입하는 세포는 기하급수적으로 성장하는 세포(도 3B)에 비해세포 부피 단위당 LDS 수가 현저히 감소한 반면, 부피 정규화 LD 형광 강도는 두 조건 사이에서 약간 감소하는 것으로 나타났다. 그림3C)를 참조하십시오. 초기 고정형 상 LDs는 전형적으로 크기가 적당히 크고 기하급수적으로 성장하는 세포로부터의 LD에 비해 적당히 더 높은 총 형광 강도를 가졌다(그림3D,E).
그림 3: LD 콘텐츠 에서 S. japonicus 세포는 성장 단계에 따라 변화합니다. 기하급수적으로 성장하는 (LOG) 및 초기 고정상(STAT) 세포를 분석하였다. (A) BODIPY 493/503으로 염색된 LD의 대표적인 미가공 현미경 이미지. 각 조건에 대해 단일 광학 슬라이스가 도시됩니다. 반전된 파란색 채널이 있는 10% 오버레이가 추가되어 셀 경계를 더 잘 시각화했습니다. 축척 막대는 10μm. (B) 셀 볼륨 단위당 식별된 LD수입니다. (C) 세포 부피 단위당 확인된 LDS의 형광 강도. (D) 식별된 모든 LD의 총 형광 강도 분포. *** 페어링되지 않은 Wilcoxon 테스트 p = 1.3 x 10-114. (E) 식별된 모든 LD의 볼륨 분포. *** 페어링되지 않은 Wilcoxon 테스트 p = 2.4 x 10-85. 패널 B-E의 데이터는 LOG 및 STAT 샘플에 대한 274 및 187 셀 개체로부터 각각 파생되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막으로, 우리는 널리 사용되는 BY4741 실험실 균주의 S. 세레비시아세포를 분석하였다(MATahis3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)각각 복합YPAD 배지에서 지수 및 고상으로 성장하였다. 신진 효모 세포는 전형적으로 고정된 1단계로진입시 저장 지질을 축적하고, 우리는 이 사실 인정을 되풀이할 수 있었습니다 (그림 4). 고정 된 세포는 기하 급수적으로 성장하는 세포 (도4B)에비해 부피 단위 당 다소 적은 LD를 포함하지만,하지만 그들의 부피 정규화 LD 형광 강도는 거의 두 배로 (그림4C). 전체적인 LD 함량의 급격한 증가는 고정된 단계에서 개별 LD의 형광 강도 및 부피(도4D,E)에 기인하였다.
그림 4: LD 콘텐츠 에서 S. 세레비시아 세포는 성장 단계에 따라 변화한다. 기하급수적으로 성장하는(LOG) 및 고정상(STAT) 세포를 분석하였다. (A) BODIPY 493/503으로 염색된 LD의 대표적인 미가공 현미경 이미지. 각 조건에 대해 단일 광학 슬라이스가 도시됩니다. 반전된 파란색 채널이 있는 10% 오버레이가 추가되어 셀 경계를 더 잘 시각화했습니다. 축척 막대는 10μm. (B) 셀 볼륨 단위당 식별된 LD수입니다. (C) 세포 부피 단위당 확인된 LDS의 형광 강도. (D) 식별된 모든 LD의 총 형광 강도 분포. *** 페어링되지 않은 Wilcoxon 테스트 p = 4.6 x 10-78. (E) 식별된 모든 LD의 볼륨 분포. *** 페어링되지 않은 Wilcoxon 테스트 p = 3.7 x 10-63. 패널 B-E의 데이터는 LOG 및 STAT 샘플에 대해 각각 430 및 441 개의 셀 개체로부터 파생되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
따라서, 우리의 분석 워크플로우는 세포 LD 함량에 긍정적 또는 부정적영향을 미치는 다양한 조건하에서 3가지 상이하고 형태학적으로 구별되는 효모 종에서 LD 수, 크기 및 지질 함량의 변화를 검출할 수 있다.
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Discussion
지질 대사와 그 조절에 대한 이해는 기본적인 생물학, 임상 및 생명 공학 응용 분야 모두에 중요합니다. LD 함량은 세포의 지질 대사 상태의 편리한 판독을 나타내며, 형광 현미경 검사법은 LD 함량 측정에 사용되는 주요 방법 중 하나이다. 제시된 프로토콜은 세 가지 상이하고 형태학적으로 구별되는 효모 종에서 개별 LDs의 자동 검출 및 정량적 설명을 허용합니다. 우리가 알고 있는 것은 핵분열 효모에 대해 유사한 도구가 존재하지 않습니다. 이미지 처리에 필요한 MATLAB 스크립트는 보충 파일로 포함되어 있으며, 이 원고의 모든 원시 및 처리 된 이미지 및 표 데이터와 함께 Figshare 저장소 (DOI 10.6084 / m9.figshare.7745738)에서 사용할 수 있습니다. CSV 출력 파일에 대한 자세한 설명과 다운스트림 데이터 분석 및 시각화를 위한 R 스크립트를 제공합니다. 또한 최신 버전의 MATLAB 스크립트는 GitHub(https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis)에서 사용할 수 있습니다.
성공적인 LD 분석은 얻어진 원시 형광 이미지의 품질에 크게 의존한다. 세분화 알고리즘의 최적 성능을 위해, 먼지 입자가없는 깨끗한 유리 슬라이드는 현미경 검사법에 사용되어야하며, 세포는 단층 (시야당 실제 셀 수는 중요한 매개 변수가 아님)을 형성해야하며, 죽은 세포의 큰 비율. 또한 z-스택 이미징은 약간 아래에서 시작하여 세포 보다 약간 위에 끝나야 합니다. 특정 미세한 설정에 따라 사용자는 이미지 처리 스크립트의 일부 매개 변수를 조정해야 할 수 있습니다(예: 이미지 배경 강도 임계값에 대해 "th"). 현재 방법은 분할된 셀 개체에서 개별 LD를 감지하고 설명할 수 있지만 워크플로는 모든 개별 셀을 자동으로 분리하는 데 어려움으로 인해 진정한 단일 셀 데이터를 생성하지 않습니다. 대신, 전체 샘플에 대해 일반화된 셀 부피의 단위당 LD 함량이 보고된다. 이 제한은 이기종 세포 인구의 분석에 있는 데이터 해석을 방해할 수 있습니다. 또한, 작은 분자의 변경 된 수송으로 세포와 함께 작업 할 때주의해야한다 (예를 들어, efflux 펌프 돌연변이), 이 세포 내 BODIPY에 영향을 미칠 수 로 493/503 농도 및 LD 염색, 나일 레적 지방 염료에 대한 관찰로33 , 34.
세포 불투과성 캐스케이드 블루 형광 덱젠으로 배지를 염색하는 것은 많은 효모 종에 적용 될 수있는 배경35에서세포를 구별하는 편리한 방법입니다. 또한 염색 시 파란색으로 변하기 때문에 분석에서 죽은 세포를 자동으로 제거하는 데 도움이됩니다. 살아 있는 것으로 감지된 모든 죽어가거나 아픈 셀(따라서 부분적으로 투과성) 셀은 감지된 셀 개체의 "IntensityMedianBlue" 값을 기반으로 데이터 분석 단계에서 제거될 수 있습니다. 원칙적으로, 전체 워크플로우는 DNA 복구 초점과 같은 다양한 다른 세포 구조를 검출하는 데 사용될 수 있으며, 구조가 적절한 형광포로 표지 될 수 있는 경우. 워크플로우는 다른 (효모) 종의 세포에도 적용가능하여 그 효용성을 더욱 넓혀야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 찰스 대학 보조금 PRIMUS / MED / 26, GAUK 1308217 및 SVV 260310에 의해 지원되었다. 우리는 현미경 검사법 및 이미지 분석 파이프 라인의 개발에 도움을 Ondřej Šebesta 감사합니다. 우리는 S. 세레비시아 균주에 대한 ReGenEx 실험실, 그리고 S. japonicus 균주에 대한 JapoNet과 히로노리 니키의 실험실에 감사드립니다. ppc1-88 균주는 효모 유전 자원 센터 일본에 의해 제공되었다. 현미경 검사법은 유럽 지역 개발 기금과 체코 공화국의 국가 예산에 의해 공동 으로 자금을 조달 공초점 및 형광 현미경 검사법의 실험실에서 수행되었다 (프로젝트 번호. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 및 CZ.2.16/3.1.00/21515).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) - Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| Pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| Standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
References
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