Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Science, Charles University

Summary

Aqui, apresentamos uma implementação de MATLAB de detecção automatizada e descrição quantitativa de gotas lipídicas em imagens de microscopia de fluorescência de fissão e brotamento de células de levedura.

Abstract

O metabolismo lipídico e seu regulamento são de interesse para as Ciências da vida básica e aplicada e biotecnologia. A este respeito, várias espécies de leveduras são usadas como modelos na pesquisa metabólica lipídica ou para a produção de lipídios industriais. Gotículas lipídicas são corpos de armazenamento altamente dinâmicos e seu conteúdo celular representa uma leitura conveniente do estado metabólico lipídico. A microscopia de fluorescência é um método de escolha para a análise quantitativa de gotas lipídicas celulares, pois depende de equipamentos amplamente disponíveis e permite a análise de gotas lipídicas individuais. Além disso, a análise de imagem microscópica pode ser automatizada, aumentando consideravelmente a taxa de transferência geral. Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho experimental e analítico para a deteção automatizada e a descrição quantitativa de gotas lipídicas individuais em três espécies modelo diferentes do fermento: as leveduras da fissão Schizosaccharomyces pombe e Schizosaccharomyces japonicus, e o fermento brotamento Saccharomyces cerevisiae. As gotas do lipido são visualizadas com BODIPY 493/503, e o dextrano fluorescente Cell-impermeable é adicionado aos meios de cultura para ajudar a identificar limites da pilha. As células são submetidas à microscopia de epifluorescência 3D em canais verdes e azuis e as imagens de pilha z resultantes são processadas automaticamente por um pipeline MATLAB. O procedimento produz dados quantitativos ricos sobre o conteúdo de gotas lipídicas celulares e características individuais de gotas lipídicas em um formato tabular adequado para análises a jusante em grandes planilhas ou pacotes estatísticos. Nós fornecemos exemplos de análises de conteúdo de gotículo lipídico várias condições que afetam o metabolismo lipídico celular.

Introduction

Os lipídios desempenham papéis cruciais na energia celular e no metabolismo do carbono, na síntese dos componentes da membrana e na produção de substâncias bioativas. O metabolismo lipídico é ajustado de acordo com as condições ambientais, a disponibilidade de nutrientes e a fase1do ciclo celular. Nos seres humanos, o metabolismo lipídico tem sido ligado a doenças, tais como obesidade, diabetes tipo II e câncer2. Na indústria, os lipídios produzidos por microrganismos, como leveduras, representam uma fonte promissora de combustíveis diesel renováveis3. As células armazenam lipídios neutros nas chamadas gotículas lipídicas (LDs). Estes corpos evolutivamente conservados são compostos de triacilgliceróis, ésteres de esterilo, monocamada fosfolipídica externa e proteínas associadas1. Os LDs se originam no retículo endoplasmático, exercem dinâmicas de ciclo celular ou de fase de crescimento e são importantes para a homeostase lipídica celular1. O número e a morfologia do LD podem ser usados como um proxy conveniente ao ensaio o metabolismo do lipido várias condições de crescimento ou ao selecionar um painel dos mutantes. Dada a sua natureza dinâmica, as técnicas capazes de analisar as propriedades dos LDs individuais são de particular interesse em estudos de metabolismo lipídico.

Várias espécies de leveduras têm sido usadas para descrever as vias metabólicas relacionadas a lipídios e sua regulação, ou usadas em biotecnologia para produzir compostos ou combustíveis interessantes1. Além disso, para leveduras modelo, como a levedura brotamento Saccharomyces cerevisiae ou o fermento de fissão distante relacionados Schizosaccharomyces pombe, bibliotecas de deformação de exclusão de todo o genoma estão disponíveis que podem ser usados para alta taxa de transferência telas4,5. Recentemente a composição e a dinâmica do LD foram descritas em S. pombe6, 7,8,9, e os mutantes relativos ao metabolismo lipídico foram isolados no fermento modelo emergente Schizosaccharomyces japonicus10.

As técnicas numerosas estão disponíveis para estudar o índice e a dinâmica do LD. A maioria emprega algum tipo de coloração de LDs com corantes lipofílicos como o Nilo vermelho ou BODIPY 493/503. Este último apresenta espectros de excitação e emissão mais estreitos e especificidade aumentada em relação aos lipídios neutros (LDs) em oposição aos fosfolipídeos (membranas)11. Métodos fluimétricos e de fluxo-citometria têm sido utilizados com sucesso em várias espécies fúngicas para descobrir genes e condições de crescimento que afetam o conteúdo lipídico do armazenamento12,13,14,15. Embora esses métodos sejam adequados para aplicativos de alta taxa de transferência, eles não podem medir os números e a morfologia de LDs individuais nas células, o que pode diferir drasticamente entre as condições de crescimento e os genótipos. A dispersão coerente de Raman ou a microscopia holográfica digital são métodos Label-Free que produzem dados do LD-nível, mas exigem o equipamento caro especializado16,17,18. A microscopia de fluorescência, de um lado, pode fornecer dados detalhados no índice do LD, ao utilizar instrumentos geralmente disponíveis e ferramentas de software da análise de imagem. Existem vários fluxos de trabalho de análise que apresentam vários graus de sofisticação e automação na detecção de células/LD a partir de dados de imagem, e são otimizados para tipos de células diferentes, como células metazoários com grandes LDS19,20 , 21, ou leveduras de brotamento17,22,23. Algumas dessas abordagens só funcionam em 2D (por exemplo, em imagens de projeção máxima), o que pode não conseguir descrever de forma confiável o conteúdo de LD celular. A nosso conhecimento, nenhumas ferramentas existem para a determinação do índice do LD e da morfologia dos dados microscópicos da levedura da fissão. O desenvolvimento de análises automatizadas e robustas de nível LD traria maior sensibilidade e maior poder estatístico, e forneceria informações ricas sobre o teor de lipídios neutros, idealmente em várias espécies de leveduras.

Desenvolvemos um fluxo de trabalho para análise de conteúdo de LD a partir de imagens de microscopia de fluorescência 3D de células de levedura. Células ao vivo são manchadas com BODIPY 493/503 e Cascade Blue dextrano para visualizar os LDs e determinar os limites das células, respectivamente. As células são imobilizadas em lâminas de vidro e submetidas à imagem de pilha z usando um microscópio de epifluorescência padrão. As imagens são então processadas por um pipeline automatizado implementado no MATLAB, um pacote amplamente utilizado (comercial) para análises estatísticas. O pipeline realiza pré-processamento de imagens, segmentação (células versus fundo, remoção de células mortas) e identificação de LD. Os dados ricos do LD-nível, tais como o tamanho do LD e a intensidade da fluorescência, são fornecidos então em um formato tabular compatível com as ferramentas de software principais da folha de cálculo. O fluxo de trabalho foi utilizado com sucesso para determinar o impacto da disponibilidade da fonte de nitrogênio no metabolismo lipídico em S. pombe24. Agora Demonstramos a funcionalidade do fluxo de trabalho em s. pombe, s. japonicus e s. cerevisiae, usando condições de crescimento ou mutantes que afetam o conteúdo de LD celular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. preparação de soluções e mídia

  1. Prepare a solução de coloração lipídica.
    1. Para preparar a solução de coloração lipídica de estoque dissolva 10 mg de BODIPY 493/503 em 10 mL de DMSO anidro (concentração final de 1 mg/mL). Dissolva todo o conteúdo de um frasco para injetáveis de 10 mg BODIPY 493/503 para evitar a perda de material durante a pesagem.
      Atenção: DMSO pode passar através da pele. Use equipamento de proteção individual apropriado.
    2. Prepare a solução de coloração lipídica de trabalho misturando 100 μL da solução de estoque de 1 mg/mL BODIPY 493/503 e 900 μL de DMSO anidro (concentração final 0,1 mg/mL).
    3. Aliquot as ações e soluções de trabalho, e armazenar a-20 ° c.
      Nota: O BODIPY dissolvido 493/503 é estável por vários anos a-20 ° c. No entanto, a solução tem de ser protegida da humidade e da luz.
  2. Para preparar a solução de estoque para visualização de limite celular, dissolva 25 mg de cascata azul dextrano (frasco inteiro) em 2,5 mL de água desionizada (concentração final 10 mg/mL). Aliquot a solução de estoque e armazene a-20 ° c protegida da luz.
  3. Para preparar a solução de revestimento de slides de microscópio, dissolva 5 mg de lectina de soja em 5 mL de água desionizada (concentração final de 1 mg/mL). Aliquot a solução do lectina e armazene em-80 ° c.
    Nota: A solução de lectina é estável por vários anos a-80 ° c. As alíquotas atualmente em uso podem ser armazenadas a-20 ° c.
  4. Prepare meios de cultivo.
    1. Para preparar 400 mL de meio de cultivo complexo Sim para s. pombe e s. japonicus, dissolver 2 g de extrato de levedura e 0,1 g de suplementos de SP (se necessário para mutantes auxotróficos) em 340 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml e autoclave. Adicionar 60 mL de 20% (p/v) de glicose esterilizada ou autoclavada separadamente em condições assépticas.
    2. Para preparar 400 mL de meio de cultivo de EMM definido para s. pombe e s. japonicus, dissolver 4,9 g de caldo EMM sem dextrose em 360 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml e autoclave. Adicionar 40 mL de 20% (p/v) de glicose esterilizada ou autoclavada separadamente em condições assépticas.
      Nota: Para as orientações gerais sobre o cultivo de s. pombe e s. japonicus ver25 e26, respectivamente.
    3. Para preparar 300 mL de meio complexo de cultivo de YPAD para Saccharomyces cerevisiae, dissolver 3 g de extrato de levedura, 6 g de peptona e 30 mg de sulfato de adenina em 270 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml e autoclave. Adicione 30 mL de 20% (w/v) de glicose esterilizada separadamente ou esterilização por filtro em condições assépticas.
    4. Para preparar 300 mL de meio mínimo definido para S. cerevisiae, dissolver 2 g de base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos) em 270 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml e autoclave. Adicione 30 mL de 20% (w/v) de glicose esterilizada separadamente ou esterilização por filtro em condições assépticas.
      Nota: Para directrizes gerais no cultivation de S. cerevisiae Veja27.

2. cultivo de células

  1. Crescendo s. pombe ou s. japonicus para fase estacionária exponencial ou precoce.
    1. Pela manhã, inocular 5 mL de meio sim com biomassa de levedura de fissão fresca. Incubar a 32 ° c com agitação (180 rpm) por várias horas.
      Nota: Para todos os cultivations, use frascos de Erlenmeyer que têm 10 vezes o volume de cultura para assegurar a aeração apropriada. Alguns laboratórios preferem cultivar leveduras de fissão a 30 ° c, mas a temperatura de cultivo de 32 ° c resulta em tempos de duplicação mais curtos sem efeitos prejudiciais para as células, reduzindo assim o tempo total necessário para realizar um experimento25,28 .
    2. No final da tarde do mesmo dia (após pelo menos 6 horas de cultivo), diluir a cultura com meio Sim fresco para um volume de cultura final de 10 mL para que atinja a densidade óptica desejada (OD) (ou número de células/mL) na manhã seguinte, e incubar a 32 ° c com s haking (180 rpm). É vantajoso saber o tempo de duplicação de cada cepa usada para determinar com precisão o fator de diluição (use a equação 1).
      Equation 1
      Onde vcultura é o volume de pré-cultura necessário para a diluição, vfinal é o volume total da nova cultura (10 ml para cultivações padrão), ODfinal é o OD desejado para ser atingido o manhã seguinte, ODatual é o OD atualmente medido da pré-cultura, t é o tempo de crescimento celular até a colheita, tlag é a duração da fase lag (depende de condições de laboratório, precisa ser empiricamente definido) e tdt é o tempo de duplicação da estirpe.
      Nota: Quando as células de fase exponencial devem ser analisadas, não deixe que as pré-culturas atinjam a fase estacionária, pois isso altera drasticamente a fisiologia celular (incluindo o conteúdo de LD) para várias gerações subsequentes.
    3. Na manhã do dia da imagem latente, se a cultura alcangou um OD ligeiramente mais elevado do que exigido (em caso das pilhas da exponencial-fase), dilui-o com Sim fresco e continue a incubação pelo menos mais dois tempos de duplicação antes de manchar de LDs. caso contrário, prossiga diretamente para coloração (secção 3).
  2. Crescendo S. cerevisiae para fase exponencial e estacionária.
    1. À tarde, inocular 10 mL de meio YPAD com uma pequena quantidade de biomassa de levedura de brotamento fresco e incubar durante a noite a 30 ° c com agitação (180 rpm).
    2. A manhã do dia da imagem latente, diluir a cultura a OD 0,1 em 10 mL do meio de YPAD e crescer ao OD exigido (por exemplo, OD 1 para a fase exponencial). Realize quaisquer diluições de cultura, conforme descrito na etapa 2.1.2. Proceder à coloração (secção 3).

3. coloração do droplet do lipido

  1. Prepare um deslizamento da tampa do microscópio para que cada amostra seja imaged. Espalhe 1 μL de solução de revestimento deslizante para um deslizamento de cobertura limpo usando o lado longo de uma ponta de pipeta posicionada horizontalmente. Permita que a solução de revestimento seque completamente e armazene os deslizamentos da tampa em um ambiente Dust-Free.
    Nota: As lâminas de vidro e as coberturas podem ser limpas antes da utilização, se necessário. O procedimento de limpeza consiste em lavar com detergente para lavar louça, enxaguar com água, imersão durante a noite em ácido clorídrico a 3% e lavagem com água destilada. Os slides limpos e as coberturas são armazenadas em etanol puro até o uso.
  2. Medir o OD da cultura da célula ou número de células/mL, conforme necessário. Tente alcançar valores semelhantes entre todas as cepas testadas para garantir condições experimentais comparáveis.
  3. Pipete 1 mL de cada cultura de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Apenas para S. cerevisiae , adicione 5 μL da solução de revestimento da lâmina, vórtice brevemente e incubar a 30 ° c com agitação durante 5 min.
  4. Adicione 1 μL da solução de coloração lipídica a cada alíquota de cultura e Vortex brevemente. Em seguida, adicione 10 μL da solução de visualização de limite de célula e vórtice brevemente.
    Nota: Não Prepare soluções pre-misturadas de ambas as manchas porque esta conduz à têmpera da fluorescência de BODIPY 493/503.
  5. Recolher as células por centrifugação (1.000 x g, 3 min, RT) e remover quase todos os sobrenadantes (~ 950 μL). Ressuscitem as células no sobrenadante remanescente.
  6. Pipetar 2 μL da suspensão de células densas num deslizamento de cobertura revestido com lectina e colocar numa lâmina de microscópio limpa. As células devem formar uma monocamada. Proceder à microscopia (secção 4) o mais rapidamente possível para minimizar artefactos em imagens; processo máximo de duas amostras de cada vez.

4. Configurando o microscópio e imagem

  1. Otimize as condições de imagem.
    Nota:     a configuração do microscópio requer longas exposições a fontes de luz fortes que podem causar danos à amostra e distorcer os resultados. Portanto, configure as condições de imagem usando um slide de amostra dedicado que não será mais usado para quantificação de LD.
    1. Concentre-se nas células usando contraste de fase ou contraste de interferência diferencial (DIC).
      Nota: Contraste de fase ou imagens DIC podem ser tomadas para referência, mas eles não são usados durante a etapa de análise de imagem automatizada.
    2. Defina as configurações da pilha z para abranger todo o volume da célula. A distância vertical total depende do tamanho da célula; o número de fatias ópticas depende da abertura numérica do objetivo (função de propagação de pontos no eixo z). Defina o foco para mover em relação ao plano focal central.
      Nota: O número ideal de fatias é muitas vezes definido pelo software de controle do microscópio e não precisa ser calculado manualmente. As larguras de células típicas são 3-5 μm para s. pombe, 4-7 μm para s. japonicuse 3-7 μm para s. cerevisiae.
    3. Para imagem LDs, definir a intensidade da luz e tempo de exposição no canal verde (excitação e emissão Maxima de BODIPY são 493 e 503 nm, respectivamente).
      Nota: BODIPY 493/503 é um fluorochrome muito brilhante; Entretanto, pode começ descorado ràpida com intensidade de luz excessivamente forte. Além disso, os LDs são móveis em células ao vivo, assim minimizam o tempo de exposição e capturam a pilha z de canal verde em primeiro lugar (antes de mudar para o canal azul) para evitar desfoque de artefatos. Além disso, leve em conta o intervalo linear da câmera para a intensidade do sinal para evitar pixels saturados.
    4. Para os limites da célula de imagem, defina a intensidade da luz e o tempo de exposição no canal azul (a excitação e o Maxima de emissão do dextrano azul de cascata são 400 e 420 nm, respectivamente).
      Nota: A intensidade do sinal na canaleta azul é exigida para a segmentação da imagem, mas não é usada para a quantificação do LD própria. Portanto, as configurações ideais neste canal não são cruciais para análise.
    5. Se possível, crie um fluxo de trabalho experimental automatizado no software de controle do microscópio para facilitar a imagem latente de amostras múltiplas circunstâncias estandardizadas.
  2. Uma vez que as condições de imagem foram otimizadas, amostras de imagens a serem usadas para quantificação. Concentre-se nas células e imagem-los em canais verdes e azuis, conforme descrito na etapa 4,1.
    Nota: Todas as imagens devem ser adquiridas usando as mesmas configurações para permitir a comparação entre as amostras. Imagem vários campos de visão por amostra para obter dados robustos e representativos.
  3. Salve as imagens de pilha z de canal azul e verde como arquivos TIFF de várias camadas de 16 bits (ou seja, dois arquivos por campo de visão). Inclua palavras "verde" ou "azul" nos nomes de arquivo correspondentes. Proceder à análise da imagem (secção 5).

5. análise de imagem

  1. Verifique visualmente a qualidade das imagens adquiridas.
    1. Abra imagens microscópicas em ImageJ29,30 ou outro software de análise de imagem adequado.
    2. Remova todas as pilhas de imagens que contenham um número considerável de células que foram movidas durante a aquisição (e, portanto, criaram artefatos de desfocagem).
    3. Remova todas as pilhas da imagem que contêm partículas altamente fluorescentes da não-pilha no canal azul (por exemplo, sujeira na corrediça do microscópio ou no deslizamento da tampa, impurezas no meio do cultivo).
      Nota: Objetos não-célula muito brilhantes no canal azul podem criar artefatos de detecção de células ou podem interferir com a detecção de células em sua vizinhança.
    4. Remova todas as pilhas da imagem que contêm uma grande proporção de pilhas inoperantes (isto é, pilhas com fluorescência azul aumentada comparada às pilhas vivos).
      Nota: Enquanto a presença de uma pequena proporção de células mortas na amostra normalmente não é um problema e essas células são automaticamente descartadas durante a análise, algumas células mortas ou morrendo podem ocasionalmente ser reconhecidas como células ao vivo pelo algoritmo de segmentação e, portanto, distorcer os resultados relatados.
  2. Analise imagens no software MATLAB.
    1. Crie uma pasta principal e copie todos os scripts MATLAB para este local.
    2. Crie uma subpasta ("pombe", "cerevisiae" ou "japonicus") e copie os arquivos de imagem TIFF de entrada para este local.
    3. Inicie o MATLAB, abra o script MAIN. m e execute-o. No menu, selecione as espécies de levedura a serem analisadas e inicie o processamento da imagem.
      Nota: Alguns dos parâmetros necessários para a detecção de células e LD são pré-definidos para as espécies específicas, outros são determinados automaticamente durante o processamento de imagens. Os valores pré-estabelecidos foram determinados empiricamente e dependem de vários fatores, como ampliação objetiva, tipo de câmera e sensibilidade, e configurações de imagem. Se necessário, os usuários podem editar os arquivos de script para alterar as predefinições específicas do organismo para refletir melhor sua configuração experimental. Ou seja, durante o reconhecimento de células, os tamanhos de objetos aceitáveis são fornecidos pelos parâmetros "minArea" e "maxArea", e a fração mínima do volume preenchido dentro dos limites do objeto é dada pelo parâmetro "solidez". Para o reconhecimento LD, o limiar de luminosidade é dado pelo parâmetro "th" (o seu valor é afetado principalmente por profundidade de bits de imagem e intensidade do sinal de fluorescência), e o tamanho máximo aceitável de LD é dado pelo parâmetro "MaxArea".
    4. Inspecione e processe os arquivos de saída conforme necessário usando um editor de planilhas ou um pacote estatístico; o fluxo de trabalho produz arquivos CSV separados por ponto-e-vírgula e segmentado arquivos TIFF com objetos de célula detectados e LDs.
      Nota: O fluxo de trabalho segmenta imagens em objetos de plano de fundo e de célula, onde cada objeto de célula pode ser composto de várias células adjacentes. Portanto, a saída em arquivos "xxxx_cells. csv" não representa dados de célula única e só deve ser usada para calcular métricas de volume por unidade de célula.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Todo o procedimento é resumido na Figura 1 para as leveduras de fissão (o fluxo de trabalho de levedura de brotamento é análogo), e abaixo fornecemos exemplos de como o fluxo de trabalho pode ser usado para estudar o conteúdo de LD em três diferentes espécies de leveduras várias condições conhecidas afetar o conteúdo da LD celular. Cada exemplo representa um experimento biológico único.

Figure 1
Figura 1: diagrama esquemático do fluxo de trabalho experimental e analítico. O fluxo de trabalho para leveduras de fissão é mostrado como um exemplo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Primeiramente, foram analisadas as células de S. pombe (Figura 2). Selvagem-tipo (WT; h + s) as pilhas foram crescidas à fase exponencial no meio complexo de YES ou no meio de EMM definido. Comparado ao Sim, menos LDs e maior intensidade de coloração de LD por unidade de volume celular foram detectados no EMM (Figura 2a-C). Além disso, os LDs individuais formados em meio de EMM foram maiores e apresentaram maior intensidade de coloração total (Figura 2D, e). Isso está de acordo com achados prévios de aumento do conteúdo lipídico de armazenamento em células cultivadas em EMM24. O gene custos ppc1 codifica uma ligase de fosfopantotenato-cisteína necessária para A síntese de coenzima a. O mutante custos ppc1-88 sensível à temperatura mostra uma diminuição acentuada no teor de LD quando cultivada na temperatura restritiva31, proporcionando um exemplo de células com baixo sinal bodipy 493/503 (Figura 2a). Consequentemente, comparado ao tipo selvagem (crescido em 32 ° c), LDs menores com menor intensidade de coloração total foram detectados em custos ppc1-88 células cultivadas em Sim após uma mudança para 36 ° c (Figura 2D, E), sem qualquer alteração aparente no número LD por unidade de volume celular (Figura 2b).

Figure 2
Figura 2: impacto dos meios de crescimento e da mutação do metabolismo lipídico no teor de LD S. pombe. As células do tipo Wild (WT) e custos ppc1-88 foram cultivadas em fase exponencial no complexo Sim ou meio de EMM definido, conforme indicado. As células WT foram cultivadas a 32 ° c. As células custos ppc1-88 sensíveis à temperatura foram cultivadas a 25 ° c e deslocadas para 36 ° c por 2 horas antes da análise. (A) imagens microscópicas não processadas representativas de LDS manchadas com BODIPY 493/503. Uma única fatia óptica é mostrada para cada condição; a sobreposição de 10% com o canal azul invertido foi adicionada para visualizar melhor os limites das células. Barra de escala = 10 μm. (B) número de LDS identificados por unidade de volume celular. (C) intensidade de fluorescência de LDS identificados por unidade de volume celular. (D) distribuições de intensidades totais de fluorescência de todos os LDS identificados. * * *, # # # teste de Wilcoxon não pareado p = 1,7 x 10-107, p = 3,7 x 10-132, respectivamente. (E) distribuições de volumes de todos os LDS identificados. * * *, # # # teste de Wilcoxon não pareado p = 6,8 x 10-71, p = 1 x 10-64, respectivamente. Os dados nos painéis B-E foram derivados de 242, 124 e 191 objetos de células para as amostras WT YES, WT EMM e custos ppc1-88 , respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, quantificamos o teor de LD em células S. japonicus (h+matsj-2017)32 de culturas exponenciais e precoces cultivadas em Sim (Figura 3a). As células que entram na fase estacionária mostraram número significativamente diminuído de LDs por unidade de volume celular em comparação com células exponencialmente crescentes (Figura 3B), enquanto a intensidade de fluorescência de LD normalizada por volume diminuiu ligeiramente entre as duas condições ( Figura 3C). Os LDs de fase estacionária precoce eram tipicamente moderadamente maiores em tamanho e tinham intensidade de fluorescência total moderadamente maior em comparação com LDs de células exponencialmente crescentes (Figura 3D, E).

Figure 3
Figura 3: teor de LD em As células S. japonicus mudam com a fase de crescimento. As células de crescimento exponencialmente (LOG) e fase estacionária precoce (STAT) foram analisadas. (A) imagens microscópicas não processadas representativas de LDS manchadas com BODIPY 493/503. Uma única fatia óptica é mostrada para cada condição; a sobreposição de 10% com o canal azul invertido foi adicionada para visualizar melhor os limites das células. A barra de escala representa 10 μm. (B) número de LDS identificados por unidade de volume celular. (C) intensidade de fluorescência de LDS identificados por unidade de volume celular. (D) distribuições de intensidades totais de fluorescência de todos os LDS identificados. * * * teste de Wilcoxon não pareado p = 1,3 x 10-114. (E) distribuições de volumes de todos os LDS identificados. * * * teste de Wilcoxon não pareado p = 2,4 x 10-85. Os dados nos painéis B-E foram derivados de 274 e 187 objetos de células para as amostras LOG e STAT, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Por fim, analisamos as células de S. cerevisiae da cepa laboratorial BY4741 amplamente utilizada (mata His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), cultivadas em fase exponencial e estacionária, respectivamente, no complexo YPAD médio. As células de levedura de brotamento tipicamente acumulam lipídios de armazenamento após a entrada na fase estacionária1, e pudemos recapitular esses achados (Figura 4). As células estacionárias continham um pouco menos de LDs por unidade de volume em comparação com células exponencialmente crescentes (Figura 4B), mas sua intensidade de fluorescência de LD normalizada em volume quase duplicou (Figura 4C). Este aumento acentuado no teor de LD geral foi devido à intensidade de fluorescência muito maior e volume de LDs individuais em fase estacionária (Figura 4D, E).

Figure 4
Figura 4: teor de LD em As células S. cerevisiae mudam com a fase de crescimento. As células de crescimento exponencialmente (LOG) e fase estacionária (STAT) foram analisadas. (A) imagens microscópicas não processadas representativas de LDS manchadas com BODIPY 493/503. Uma única fatia óptica é mostrada para cada condição; a sobreposição de 10% com o canal azul invertido foi adicionada para visualizar melhor os limites das células. A barra de escala representa 10 μm. (B) número de LDS identificados por unidade de volume celular. (C) intensidade de fluorescência de LDS identificados por unidade de volume celular. (D) distribuições de intensidades totais de fluorescência de todos os LDS identificados. * * * teste de Wilcoxon não pareado p = 4,6 x 10-78. (E) distribuições de volumes de todos os LDS identificados. * * * teste de Wilcoxon não pareado p = 3,7 x 10-63. Os dados nos painéis B-E foram derivados de 430 e 441 objetos de células para as amostras LOG e STAT, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Assim, nosso fluxo de trabalho de análise pode detectar alterações no número de LD, tamanho e teor lipídico em três diferentes e morfologicamente distintas espécies de levedura várias condições que afetam positivamente ou negativamente o conteúdo celular LD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A compreensão do metabolismo lipídico e sua regulação é importante tanto para a biologia básica, quanto para aplicações clínicas e biotecnológicas. O teor de LD representa uma leitura conveniente do estado de metabolismo lipídico da célula, sendo a microscopia de fluorescência um dos principais métodos utilizados para determinação do teor de LD. O protocolo apresentado permite a deteção automatizada e a descrição quantitativa de LDs individuais em três espécies diferentes e morfològica distintas do fermento. A nosso conhecimento, nenhumas ferramentas similares existem para as leveduras da fissão. Os scripts MATLAB necessários para o processamento de imagens são incluídos como arquivos suplementares, e também estão disponíveis no repositório Figshare (DOI 10.6084/M9. figshare. 7745738) juntamente com todos os dados brutos e processados e as imagens tabulares deste manuscrito, descrições detalhadas dos arquivos de saída CSV e scripts R para análise e visualização de dados downstream. Além disso, a versão mais recente dos scripts do MATLAB está disponível no GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis).

A análise bem sucedida do LD é pela maior parte dependente da qualidade das imagens cruas da fluorescência obtidas. Para o desempenho ideal dos algoritmos de segmentação, as lâminas de vidro limpas desprovidas de partículas de poeira devem ser usadas para microscopia, as células devem formar uma monocamada (o número real de células por campo de visão não é um parâmetro crítico), e não deve conter um grande proporção de células mortas. Também, a imagem latente da z-pilha deve começar ligeiramente abaixo e terminar ligeiramente acima das pilhas. Dependendo da configuração microscópica específica, os usuários podem precisar ajustar alguns dos parâmetros nos scripts de processamento de imagem (como "th" para o limiar de intensidade de fundo da imagem). Enquanto o método atual é capaz de detectar e descrever LDs individuais nos objetos de célula segmentada, o fluxo de trabalho não produz dados verdadeiramente de célula única devido a dificuldades com separação automatizada de todas as células individuais. Em vez disso, o conteúdo de LD por unidade de volume de células generalizado para toda a amostra é relatado. Essa limitação pode dificultar a interpretação dos dados em análises de populações heterogêneas de células. Além disso, deve-se tomar cuidado ao trabalhar com células com transporte alterado de pequenas moléculas (por exemplo, mutantes da bomba de efluxo), pois isso pode afetar a concentração intracelular de BODIPY 493/503 e a coloração de LD, como observado para o corante lipofílico vermelho do Nilo33 , 34.

Manchando o meio com o dextrano fluorescente azul Cell-impermeable da cascata é uma maneira conveniente de distinguir pilhas do fundo35, que pode ser aplicado a muitas (se não todas) a espécie do fermento. Ele também ajuda com a remoção automatizada de células mortas a partir da análise, uma vez que estes vão virar azul sobre a coloração. Quaisquer células de morte ou doentes (e, portanto, parcialmente permeáveis para Dextran) detectadas como vivas podem ser removidas durante as etapas de análise de dados com base no valor "IntensityMedianBlue" dos objetos de célula detectados. Em princípio, todo o fluxo de trabalho pode ser usado para detectar várias outras estruturas celulares, como focos de reparo de DNA, desde que as estruturas possam ser rotuladas com fluoróforos adequados. O fluxo de trabalho também deve ser aplicável às células de outras espécies (leveduras), ampliando ainda mais sua utilidade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Universidade Charles concede PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 e SVV 260310. Agradecemos a Ondřej Šebesta pela ajuda com microscopia e desenvolvimento do pipeline de análise de imagem. Agradecemos ao laboratório ReGenEx por cepas de s. cerevisiae e ao laboratório Japonet e Hironori Niki para cepas de s. japonicus . A cepa custos ppc1-88 foi fornecida pelo centro de recursos genéticos de levedura do Japão. A microscopia foi realizada no laboratório de microscopia confocal e de fluorescência cofinanciada pelo Fundo Europeu de desenvolvimento regional e pelo orçamento do estado da República Tcheca (projeto n º CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 e CZ. 2.16/3.1.00/21515).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) - Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
Pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
Standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
  2. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  3. Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
  4. Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
  5. Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).
  6. Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
  7. Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
  8. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
  9. Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
  10. Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
  11. Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
  12. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
  13. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
  14. Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
  15. Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
  16. Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
  17. Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
  18. Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
  19. Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
  20. Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
  21. Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
  22. Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
  23. Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
  24. Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
  25. Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
  26. Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
  27. Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
  28. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
  29. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
  32. Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
  33. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  34. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
  35. Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).

Tags

Imunologia e infecção armazenamento lipídico neutro microscopia de fluorescência microscopia quantitativa BODIPY 493/503 Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces japonicus Saccharomyces cerevisiae
Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Princová, J., Schätz, M.,… More

Princová, J., Schätz, M., Ťupa, O., Převorovský, M. Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing. J. Vis. Exp. (149), e59889, doi:10.3791/59889 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter