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Immunology and Infection

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Science, Charles University

Summary

Aquí, presentamos una implementación de MATLAB de detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos en imágenes de microscopía de fluorescencia de fission y células de levadura en ciernes.

Abstract

El metabolismo de los lípidos y su regulación son de interés tanto para las ciencias básicas y aplicadas de la vida como para la biotecnología. En este sentido, varias especies de levadura se utilizan como modelos en la investigación metabólica de lípidos o para la producción de lípidos industriales. Las gotas lipídicas son cuerpos de almacenamiento altamente dinámicos y su contenido celular representa una lectura conveniente del estado metabólico lipídico. La microscopía de fluorescencia es un método de elección para el análisis cuantitativo de gotas de lípidos celulares, ya que se basa en equipos ampliamente disponibles y permite el análisis de gotas de lípidos individuales. Además, el análisis microscópico de imágenes se puede automatizar, lo que aumenta considerablemente el rendimiento general del análisis. Aquí, describimos un flujo de trabajo experimental y analítico para la detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos individuales en tres especies de levaduras de modelo diferentes: las levaduras de fission Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces japonicus, y la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. Las gotas de lípidos se visualizan con BODIPY 493/503, y el dextran fluorescente impermeable a la celda se agrega a los medios de cultivo para ayudar a identificar los límites celulares. Las células se someten a microscopía de epifluorescencia 3D en canales verdes y azules y las imágenes de la pila z resultantes se procesan automáticamente mediante una canalización matlab de MATLAB. El procedimiento genera datos cuantitativos enriquecidos sobre el contenido de gotas de lípidos celulares y las características individuales de las gotas de lípidos en un formato tabular adecuado para análisis posteriores en hojas de cálculo principales o paquetes estadísticos. Proporcionamos análisis de ejemplo del contenido de gotas de lípidos bajo diversas condiciones que afectan el metabolismo celular de los lípidos.

Introduction

Los lípidos desempeñan un papel crucial en la energía celular y el metabolismo del carbono, la síntesis de componentes de membrana y la producción de sustancias bioactivas. El metabolismo de los lípidos se ajusta según las condiciones ambientales, la disponibilidad de nutrientes y la fase1del ciclo celular. En los seres humanos, el metabolismo de los lípidos se ha conectado a enfermedades, como la obesidad, la diabetes tipo II y el cáncer2. En la industria, los lípidos producidos por microorganismos, como las levaduras, representan una fuente prometedora de combustibles diésel renovables3. Las células almacenan lípidos neutros en las llamadas gotas lipídicas (LD). Estos cuerpos evolutivamente conservados se componen de triacilgliceroles, ésteres de esteril, una monocapa fosfolípido externa y proteínas asociadas1. Los LM se originan en el retículo endoplasmático, ejercen dinámicas de ciclo celular o fase de crecimiento, y son importantes para la homeostasis lipídica celular1. El número de LD y la morfología se pueden utilizar como un proxy conveniente al analizar el metabolismo de los lípidos bajo diversas condiciones de crecimiento o al examinar un panel de mutantes. Dada su naturaleza dinámica, las técnicas capaces de analizar las propiedades de los DNl individuales son de particular interés en los estudios del metabolismo lipídico.

Varias especies de levadura se han utilizado para describir las vías metabólicas relacionadas con los lípidos y su regulación, o se utilizan en la biotecnología para producir compuestos o combustibles interesantes1. Además, para levaduras modelo, tales como la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae o la levadura de fismo distantemente relacionada Schizosaccharomyces pombe, se encuentran disponibles bibliotecas de cepas de eliminación en todo el genoma que se pueden utilizar para un alto rendimiento pantallas4,5. Recientemente la composición y dinámica de LD se han descrito en S. pombe6,7,8,9, y mutantes relacionados con el metabolismo lipídico se han aislado en el modelo emergente de levadura Schizosaccharomyces japonicus10.

Numerosas técnicas están disponibles para estudiar el contenido y la dinámica de LD. La mayoría emplea algún tipo de tinción de Lutsisconlos con colorantes lipofílicos como Nile Red o BODIPY 493/503. Este último muestra espectros de excitación y emisión más estrechos, y una mayor especificidad hacia los lípidos neutros (LD) en comparación con los fosfolípidos (membranas)11. Los métodos fluorimétricos y de citometría de flujo se han utilizado con éxito en varias especies de hongos para descubrir genes y condiciones de crecimiento que afectan al contenido de lípidos de almacenamiento12,13,14,15. Si bien estos métodos son adecuados para aplicaciones de alto rendimiento, no pueden medir el número y la morfología de los D Individuales en las células, lo que puede diferir drásticamente entre las condiciones de crecimiento y los genotipos. La dispersión coherente de Raman o la microscopía holográfica digital son métodos sin etiquetas que producen datos a nivel de LD, pero requieren equipos especializados y costosos16,17,18. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, puede proporcionar datos detallados sobre el contenido de LD, al tiempo que utiliza instrumentos comúnmente disponibles y herramientas de software de análisis de imágenes. Existen varios flujos de trabajo de análisis que cuentan con varios grados de sofisticación y automatización en la detección de celdas/LD a partir de datos de imagen, y están optimizados para diferentes tipos de celdas, como células metazoanas con grandes LD19,20 , 21, o levaduras en ciernes17,22,23. Algunos de estos enfoques solo funcionan en 2D (por ejemplo, en imágenes de proyección máxima), lo que puede no describir de forma fiable el contenido de LD celular. Hasta nuestro conocimiento, no existen herramientas para la determinación del contenido de LD y la morfología a partir de datos microscópicos de levadura de fesión. El desarrollo de análisis automatizados y robustos a nivel de LD traería mayor sensibilidad y mayor potencia estadística, y proporcionaría información rica sobre el contenido de lípidos neutros, idealmente en múltiples especies de levaduras.

Hemos desarrollado un flujo de trabajo para el análisis de contenido LD a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de células de levadura. Las celdas vivas se tiñen con BODIPY 493/503 y Cascade Blue dextran para visualizar los DD y determinar los límites de las celdas, respectivamente. Las células se inmovilizan en diapositivas de vidrio y se someten a imágenes de pila z utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar. Las imágenes son procesadas por una canalización automatizada implementada en MATLAB, un paquete ampliamente utilizado (comercial) para análisis estadísticos. La canalización realiza el preprocesamiento de imágenes, la segmentación (células frente al fondo, la eliminación de celdas muertas) y la identificación de LD. Los datos enriquecidos a nivel de LD, como el tamaño de LD y la intensidad de la fluorescencia, se proporcionan en un formato tabular compatible con las principales herramientas de software de hoja de cálculo. El flujo de trabajo se utilizó con éxito para determinar el impacto de la disponibilidad de la fuente de nitrógeno en el metabolismo de los lípidos en S. pombe24. Ahora demostramos la funcionalidad del flujo de trabajo en S. pombe, S. japonicus y S. cerevisiae,utilizando condiciones de crecimiento o mutantes que afectan el contenido de LD celular.

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Protocol

1. Preparación de soluciones y medios de comunicación

  1. Prepare la solución de tinción de lípidos.
    1. Para preparar la solución de tinción de lípidos en stock disolver 10 mg de BODIPY 493/503 en 10 ml de DMSO anhidro (concentración final 1 mg/ml). Disolver todo el contenido de un vial de 10 mg de BODIPY 493/503 para evitar la pérdida de material durante el pesaje.
      PRECAUCION: La DMSO puede pasar a través de la piel. Use el equipo de protección personal adecuado.
    2. Preparar la solución de tinción de lípidos de trabajo mezclando 100 l de la solución de material de 1 mg/ml DE BODIPY 493/503 y 900 ml de DMSO anhidro (concentración final 0,1 mg/ml).
    3. Aliquot el stock y las soluciones de trabajo, y almacenar a -20 oC.
      NOTA: Disolución BODIPY 493/503 es estable durante varios años a -20 oC. Sin embargo, la solución tiene que estar protegida de la humedad y la luz.
  2. Para preparar la solución de stock para la visualización de los límites celulares, disolver 25 mg de dextran Cascade Blue (vial entero) en 2,5 ml de agua desionizada (concentración final 10 mg/ml). Aliquot la solución de stock y almacenar a -20 oC protegido de la luz.
  3. Para preparar la solución de recubrimiento deslizante del microscopio, disolver 5 mg de lectina de soja en 5 ml de agua desionizada (concentración final 1 mg/ml). Aliquot la solución de lectina y almacenar a -80 oC.
    NOTA: La solución de lectina es estable durante varios años a -80 oC. Las aliquots actualmente en uso pueden almacenarse a -20 oC.
  4. Preparar los medios de cultivo.
    1. Para preparar 400 mL de complejo medio de cultivo SI para S. pombe y S. japonicus, disolver 2 g de extracto de levadura y 0,1 g de suplementos de SP (si es necesario para mutantes auxotrópicos) en 340 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 60 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.
    2. Para preparar 400 mL de medio de cultivo EMM definido para S. pombe y S. japonicus, disolver 4,9 g de caldo EMM sin dextrosa en 360 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 40 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.
      NOTA: Para consultar las directrices generales sobre el cultivo de S. pombe y S. japonicus, véase25 y26, respectivamente.
    3. Para preparar 300 mL de complejo medio de cultivo YPAD para Saccharomyces cerevisiae,disolver 3 g de extracto de levadura, 6 g de peptona y 30 mg de sulfato de adenina en 270 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 30 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.
    4. Para preparar 300 ml de medio mínimo definido para S. cerevisiae, disolver 2 g de base de nitrógeno de levadura (sin aminoácidos) en 270 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 30 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.
      NOTA: Para consultar las directrices generales sobre el cultivo de S. cerevisiae, véase27.

2. Cultivo celular

  1. Crecimiento de S. pombe o S. japonicus a fase exponencial o estacionaria temprana.
    1. Por la mañana, inocular 5 ml de medio YES con biomasa de levadura de festeja fresca. Incubar a 32oC con agitación (180 rpm) durante varias horas.
      NOTA: Para todos los cultivos, utilice frascos Erlenmeyer que tengan 10 veces el volumen de cultivo para garantizar una aireación adecuada. Algunos laboratorios prefieren cultivar levaduras de fissión a 30 oC, pero la temperatura de cultivo de 32 oC da como resultado tiempos de duplicación más cortos sin efectos perjudiciales para las células, reduciendo así el tiempo total necesario para realizar un experimento de25,28 .
    2. A última hora de la tarde del mismo día (después de al menos 6 horas de cultivo), diluir el cultivo con medio fresco de YES a un volumen de cultivo final de 10 ml para que alcance la densidad óptica deseada (OD) (o el número de células/ml) a la mañana siguiente, e incubar a 32oC con s rey (180 rpm). Es de ventaja conocer el tiempo de duplicación de cada cepa utilizada para determinar con precisión el factor de dilución (utilice la Ecuación 1).
      Equation 1
      Donde elcultivo Ves el volumen de precultivo necesario para la dilución, Vfinal es el volumen total del nuevo cultivo (10 mL para cultivos estándar), ODfinal es la OD deseada para ser alcanzado el después de la mañana siguiente, lacorriente deOD es la DoD actualmente medida de la precultura, t es el momento del crecimiento celular hasta la cosecha, tlag es la duración de la fase de retraso (depende de las condiciones de laboratorio, se define empíricamente) y tDT es el tiempo de duplicación de la cepa.
      NOTA: Cuando se van a analizar las células de fase exponencial, no deje que los precultivos alcancen la fase estacionaria, ya que esto altera drásticamente la fisiología celular (incluido el contenido de LD) durante varias generaciones posteriores.
    3. En la mañana del día de la toma de imágenes, si el cultivo alcanzó un D.OD ligeramente más alto de lo requerido (en el caso de las células de fase exponencial), diluirlo con sies frescos y continuar la incubación durante al menos dos veces más de duplicación antes de la tinción de DDs. tinción (Sección 3).
  2. Crecimiento de S. cerevisiae a fase exponencial y estacionaria.
    1. Por la tarde, inocular 10 ml de medio YPAD con una pequeña cantidad de biomasa de levadura en ciernes frescae e incubar durante la noche a 30 oC con agitación (180 rpm).
    2. La mañana del día de la toma de imágenes, diluir el cultivo a 0,1 oD en 10 ml de medio YPAD y crecer hasta la DoD requerida (por ejemplo, OD 1 para la fase exponencial). Realice cualquier dilución de cultivo como se describe en el paso 2.1.2. Proceder a la tinción (Sección 3).

3. Tinción de gotas de lípidos

  1. Prepare un comprobante de cubierta del microscopio para cada muestra que se va a tomar una foto. Extienda 1 l de solución de recubrimiento deslizante en un resbalón de cubierta limpio utilizando el lado largo de una punta de pipeta colocada horizontalmente. Deje que la solución de recubrimiento se seque por completo y almacene los resbalones de la cubierta en un ambiente libre de polvo.
    NOTA: Los portaobjetos de vidrio y los cubreobjetos se pueden limpiar antes de su uso si es necesario. El procedimiento de limpieza consiste en lavar con detergente para lavar platos, enjuagar con agua, remojar durante la noche en ácido clorhídrico al 3% y lavar con agua destilada. Las diapositivas y los cubreobjetos limpios se almacenan en etanol puro hasta su uso.
  2. Mida el OD del cultivo celular o el número de celdas/ml, según sea necesario. Trate de alcanzar valores similares entre todas las cepas probadas para garantizar condiciones experimentales comparables.
  3. Pipetear 1 ml de cada cultivo celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Sólo para S. cerevisiae, agregue 5 sL de la solución de recubrimiento deslizante, vórtice brevemente e incubar a 30 oC con agitación durante 5 min.
  4. Añadir brevemente 1 l de la solución de tinción de lípidos a cada alícuota de cultivo y vórtice. A continuación, agregue brevemente 10 l de la solución de visualización de límites de celda y el vórtice.
    NOTA: No prepare soluciones premezcladas de ambas manchas, ya que esto conduce al enfriamiento por fluorescencia de BODIPY 493/503.
  5. Recoger las células por centrifugación (1.000 x g,3 min, RT) y eliminar casi todos los sobrenadantes (950 l). Resuspenda las células del sobrenadante restante.
  6. Pipetear 2 l de la suspensión de células densas sobre un resbalón de cubierta recubierto de lectina y colocarlo en un portaobjetos limpio del microscopio. Las celdas deben formar una monocapa. Proceder a la microscopía (Sección 4) lo más rápido posible para minimizar los artefactos en la toma de imágenes; proceso máximo de dos muestras a la vez.

4. Configuración del microscopio y las imágenes

  1. Optimice las condiciones de imagen.
    NOTA:     La configuración del microscopio requiere exposiciones prolongadas a fuentes de luz fuertes que podrían causar daños en la muestra y resultados de sesgo. Por lo tanto, configure las condiciones de creación de imágenes mediante una diapositiva de muestra dedicada que no se utilizará más para la cuantificación de LD.
    1. Concéntrese en las celdas utilizando contraste de fase o contraste de interferencia diferencial (DIC).
      NOTA: Las imágenes de contraste de fase o DIC se pueden tomar como referencia, pero no se utilizan durante el paso de análisis de imágenes automatizado.
    2. Establezca la configuración de la pila z para abarcar todo el volumen de la celda. La distancia vertical total depende del tamaño de la celda; el número de sectores ópticos depende de la apertura numérica del objetivo (función de dispersión de puntos en el eje z). Establezca el enfoque para que se mueva en relación con el plano focal central.
      NOTA: El número óptimo de rodajas a menudo es establecido por el software de control del microscopio y no necesita ser calculado manualmente. Las anchuras típicas de las células son de 3-5 m para S. pombe, 4-7 m para S. japonicus,y 3-7 m para S. cerevisiae.
    3. Para la imagen de los D, ajuste la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal verde (la excitación y el máximo de emisión de BODIPY son 493 y 503 nm, respectivamente).
      NOTA: BODIPY 493/503 es un fluorocromo muy brillante; sin embargo, puede blanquearse rápidamente con una intensidad lumínica demasiado fuerte. Además, los LU son móviles en células vivas, minimizando así el tiempo de exposición y capturando primero la pila z de canal verde completa (antes de cambiar al canal azul) para evitar artefactos borrosos. Además, tenga en cuenta el rango lineal de la cámara para la intensidad de la señal para evitar píxeles saturados.
    4. Para crear una imagen de los límites de las celdas, establezca la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal azul (la excitación y el máximo de emisión de la dextran Cascade Blue son 400 y 420 nm, respectivamente).
      NOTA: La intensidad de la señal en el canal azul es necesaria para la segmentación de la imagen, pero no se utiliza para la cuantificación LD en sí. Por lo tanto, los ajustes óptimos en este canal no son cruciales para el análisis.
    5. Si es posible, cree un flujo de trabajo experimental automatizado en el software de control del microscopio para facilitar la toma de imágenes de varias muestras en condiciones estandarizadas.
  2. Una vez optimizadas las condiciones de imagen, se utilizarán muestras de imágenes para la cuantificación. Concéntrese en las celdas e infórmelas en canales verdes y azules como se describe en el paso 4.1.
    NOTA: Todas las imágenes deben adquirirse utilizando la misma configuración para permitir la comparación entre muestras. Imagen de varios campos de visión por muestra para obtener datos sólidos y representativos.
  3. Guarde las imágenes de la pila z del canal azul y verde como archivos TIFF multicapa de 16 bits (es decir, dos archivos por campo de visión). Incluya las palabras "verde" o "azul" en los nombres de archivo correspondientes. Continúe con el análisis de imágenes (Sección 5).

5. Análisis de imagen

  1. Compruebe visualmente la calidad de las imágenes adquiridas.
    1. Abra imágenes microscópicas en ImageJ29,30 u otro software de análisis de imágenes adecuado.
    2. Elimine las pilas de imágenes que contengan un número considerable de celdas que se movieron durante la adquisición (y, por lo tanto, crearon artefactos de desenfoque).
    3. Elimine las pilas de imágenes que contengan partículas no celulares altamente fluorescentes en el canal azul (por ejemplo, suciedad en la diapositiva del microscopio o resbalón de la cubierta, impurezas en el medio de cultivo).
      NOTA: Los objetos no celulares muy brillantes en el canal azul pueden crear artefactos de detección de células o pueden interferir con la detección de celdas en sus proximidades.
    4. Elimine las pilas de imágenes que contengan una gran proporción de células muertas (es decir, células con mayor fluorescencia azul en comparación con las células vivas).
      NOTA: Mientras que la presencia de una pequeña proporción de células muertas en la muestra no suele ser un problema y estas células se descartan automáticamente durante el análisis, algunas células muertas o moribundas ocasionalmente pueden ser reconocidas como células vivas por el algoritmo de segmentación y por lo tanto sesgar los resultados reportados.
  2. Analice imágenes en el software MATLAB.
    1. Cree una carpeta principal y copie todos los scripts de MATLAB en esta ubicación.
    2. Cree una subcarpeta ("pombe", "cerevisiae" o "japonicus") y copie los archivos de imagen TIFF de entrada en esta ubicación.
    3. Inicie MATLAB, abra el script MAIN.m y ejecútelo. En el menú seleccione las especies de levadura a analizar e inicie el procesamiento de imágenes.
      NOTA: Algunos de los parámetros necesarios para la detección de celdas y LD están predefinidos para la especie en particular, otros se determinan automáticamente durante el procesamiento de imágenes. Los valores preestablecidos se determinaron empíricamente y dependen de varios factores, como la ampliación objetiva, el tipo de cámara y la sensibilidad, y la configuración de imágenes. Si es necesario, los usuarios pueden editar los archivos de script para cambiar los ajustes preestablecidos específicos del organismo para reflejar mejor su configuración experimental. Es decir, durante el reconocimiento de celdas los tamaños de objeto aceptables se indican mediante los parámetros "minArea" y "maxArea", y la fracción mínima del volumen relleno dentro de los límites del objeto se proporciona mediante el parámetro "Solidity". Para el reconocimiento de LD, el umbral de brillo se da por el parámetro "th" (su valor se ve afectado principalmente por la profundidad de bits de la imagen y la intensidad de la señal de fluorescencia), y el tamaño máximo aceptable LD lo da el parámetro "MaxArea".
    4. Inspeccione y procese los archivos de salida según sea necesario utilizando un editor de hojas de cálculo o un paquete estadístico; el flujo de trabajo genera archivos CSV separados por punto y coma y archivos TIFF segmentados con objetos de celda y LDs detectados.
      NOTA: El flujo de trabajo segmenta las imágenes en objetos de fondo y de celda, donde cada objeto de celda puede estar compuesto de varias celdas adyacentes. Por lo tanto, la salida en los archivos "xxxx_cells.csv" no representa datos de una sola celda y solo debe utilizarse para calcular métricas por unidad de volumen de celda.

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Representative Results

Todo el procedimiento se resume en la Figura 1 para las levaduras de fisión (el flujo de trabajo de levadura en ciernes es análogo), y a continuación proporcionamos ejemplos de cómo el flujo de trabajo se puede utilizar para estudiar el contenido de LD en tres especies de levadura diferentes en diversas condiciones conocidas para afectar el contenido de LD celular. Cada ejemplo representa un único experimento biológico.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático del flujo de trabajo experimental y analítico. El flujo de trabajo para levaduras de fismo se muestra como ejemplo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En primer lugar, analizamos las células de S. pombe (Figura2). Tipo salvaje (WT; h +s) las células se cultivaron a fase exponencial en el medio sí complejo o en el medio EMM definido. En comparación con Sí, se detectaron menos LD y mayor intensidad de tinción de LD por unidad de volumen de celda en EMM (Figura2A-C). Además, los DN individuales formados en el medio EMM eran más grandes y mostraban una mayor intensidad total de tinción (Figura2D,E). Esto está de acuerdo con los hallazgos previos de mayor contenido de lípidos de almacenamiento en células cultivadas en EMM24. El gen ppc1 codifica una ligasa fosfopantotenato-cisteína necesaria para la síntesis de coenzima A. El mutante ppc1-88 sensible a la temperatura muestra una marcada disminución en el contenido de LD cuando se cultiva a la temperatura restrictiva31,proporcionando un ejemplo de células con baja señal BODIPY 493/503 (Figura2A). En consecuencia, en comparación con el tipo silvestre (crecido a 32oC), se detectaron LD más pequeños con menor intensidad total de tinción en células ppc1-88 cultivadas en Sí tras un desplazamiento a 36oC (Figura2D,E), sin ningún cambio aparente en el número de LD por unidad de volumen de celda (Figura2B).

Figure 2
Figura 2: Impacto de los medios de crecimiento y la mutación del metabolismo lipídico en el contenido de LD en S. pombe. Las células de tipo salvaje (WT) y ppc1-88 se cultivaron hasta la fase exponencial en el complejo YES o el medio EMM definido, como se indica. Las células de WT se cultivaron a 32 oC. Las células ppc1-88 sensibles a la temperatura se cultivaron a 25oC y se desplazaron a 36oC durante 2 horas antes del análisis. (A) Imágenes microscópicas representativas sin procesar de los D.M. manchados con BODIPY 493/503. Se muestra un único sector óptico para cada condición; Se ha añadido una superposición del 10% con canal azul invertido para visualizar mejor los límites de las celdas. Barra de escala a 10 m. (B) Número de D.N. identificados por unidad de volumen de celda. (C) Intensidad de fluorescencia de los D.N identificados por unidad de volumen celular. (D) Distribuciones de las intensidades totales de fluorescencia de todos los D.N. identificados. ***, x desbanado Wilcoxon test p á 1,7 x 10-107, p a 3,7 x 10-132, respectivamente. (E) Distribuciones de volúmenes de todos los LU identificados. ***, prueba Wilcoxon no emparejada p á 6,8 x 10-71, p a 1 x 10-64, respectivamente. Los datos de los paneles B-E se derivaron de 242, 124 y 191 objetos celulares para las muestras WT YES, WT EMM y ppc1-88, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A continuación, cuantificamos el contenido de LD en las células de S. japonicus (h+matsj-2017)32 de cultivos exponenciales y estacionarios tempranos cultivados en Sí (Figura3A). Las células que entraron en fase estacionaria mostraron una notable disminución del número de LD por unidad de volumen celular en comparación con las células de crecimiento exponencial (Figura3B),mientras que la intensidad de fluorescencia LD normalizada por volumen disminuyó ligeramente entre las dos condiciones ( Figura 3C). Los primeros DD de fase estacionaria eran típicamente moderadamente más grandes en tamaño y tenían una intensidad de fluorescencia total moderadamente mayor en comparación con los D.D. de células de crecimiento exponencial (Figura3D,E).

Figure 3
Figura 3: Contenido de LD en S. japonicus células cambian con la fase de crecimiento. Se analizaron las células de crecimiento exponencial (LOG) y las células de fase estacionaria temprana (STAT). (A) Imágenes microscópicas representativas sin procesar de los D.M. manchados con BODIPY 493/503. Se muestra un único sector óptico para cada condición; Se ha añadido una superposición del 10% con canal azul invertido para visualizar mejor los límites de las celdas. La barra de escala representa 10 m. (B) Número de D identificados por unidad de volumen de celda. (C) Intensidad de fluorescencia de los D.N identificados por unidad de volumen celular. (D) Distribuciones de intensidades totales de fluorescencia de todos los D.M. identificados. *** Prueba Wilcoxon no emparejada p á 1,3 x 10-114. (E) Distribuciones de volúmenes de todos los D.N. identificados. *** Prueba Wilcoxon no emparejada p 2,4 x 10-85. Los datos de los paneles B-E se derivaron de 274 y 187 objetos de celda para las muestras LOG y STAT, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por último, analizamos las células de S. cerevisiae de la cepa de laboratorio BY4741 ampliamente utilizada (MATa his3 -1 leu2-0 met15-0 ura3-0) crecido a fase exponencial y estacionaria, respectivamente, en el medio yPAD complejo. Las células de levadura en ciernes suelenacumular lípidos de almacenamiento al entrar en la fase estacionaria 1, y pudimos recapitular estos hallazgos (Figura4). Las células estacionarias contenían algo menos de D DD por unidad de volumen en comparación con las células de crecimiento exponencial (Figura4B),pero su intensidad de fluorescencia LD normalizada por volumen casi se duplicó (Figura4C). Este fuerte aumento en el contenido general de LD se debió a la intensidad de fluorescencia mucho mayor y el volumen de los LD individuales en fase estacionaria (Figura4D,E).

Figure 4
Figura 4: Contenido de LD en Las células de S. cerevisiae cambian con la fase de crecimiento. Se analizaron las células de crecimiento exponencial (LOG) y las células de fase estacionaria (STAT). (A) Imágenes microscópicas representativas sin procesar de los D.M. manchados con BODIPY 493/503. Se muestra un único sector óptico para cada condición; Se ha añadido una superposición del 10% con canal azul invertido para visualizar mejor los límites de las celdas. La barra de escala representa 10 m. (B) Número de D identificados por unidad de volumen de celda. (C) Intensidad de fluorescencia de los D.N identificados por unidad de volumen celular. (D) Distribuciones de intensidades totales de fluorescencia de todos los D.M. identificados. *** Prueba Wilcoxon no emparejada p 4,6 x 10-78. (E) Distribuciones de volúmenes de todos los D.N. identificados. *** Prueba Wilcoxon no emparejada p 3,7 x 10-63. Los datos de los paneles B-E se derivaron de 430 y 441 objetos de celda para las muestras LOG y STAT, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por lo tanto, nuestro flujo de trabajo de análisis puede detectar cambios en el número de LD, tamaño y contenido de lípidos en tres especies de levadura diferentes y morfológicamente distintas bajo diversas condiciones que afectan positiva o negativamente el contenido de LD celular.

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Discussion

La comprensión del metabolismo lipídico y su regulación es importante tanto para la biología básica, como para las aplicaciones clínicas y biotecnológicas. El contenido de LD representa una lectura conveniente del estado del metabolismo de los lípidos de la célula, siendo la microscopía de fluorescencia uno de los principales métodos utilizados para la determinación del contenido de LD. El protocolo presentado permite la detección automatizada y la descripción cuantitativa de los D Individuales en tres especies de levadura diferentes y morfológicamente distintas. Hasta nuestro conocimiento, no existen herramientas similares para las levaduras de fismo. Los scripts DE MATLAB necesarios para el procesamiento de imágenes se incluyen como archivos complementarios, y también están disponibles en el repositorio de Figshare (DOI 10.6084/m9.figshare.7745738) junto con todos los datos de imágenes y tabulares en bruto y procesados de este manuscrito, descripciones detalladas de los archivos de salida CSV y scripts de R para el análisis y visualización de datos posteriores. Además, la última versión de los scripts de MATLAB está disponible en GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis).

El análisis exitoso de LD depende en gran medida de la calidad de las imágenes de fluorescencia en bruto obtenidas. Para un rendimiento óptimo de los algoritmos de segmentación, se deben utilizar diapositivas de vidrio limpio sin partículas de polvo para la microscopía, las células deben formar una monocapa (el número real de células por campo de visión no es un parámetro crítico), y no deben contener un gran proporción de células muertas. Además, la imagen de la pila z debe comenzar ligeramente por debajo y terminar ligeramente por encima de las células. Dependiendo de la configuración microscópica en particular, es posible que los usuarios necesiten ajustar algunos de los parámetros de los scripts de procesamiento de imágenes (como "th" para el umbral de intensidad de fondo de la imagen). Aunque el método actual es capaz de detectar y describir los DD individuales en los objetos de celda segmentados, el flujo de trabajo no produce datos de una sola celda debido a dificultades con la separación automatizada de todas las celdas individuales. En su lugar, se notifica el contenido de LD por unidad de volumen de celda generalizado para toda la muestra. Esta limitación puede obstaculizar la interpretación de datos en análisis de poblaciones de células heterogéneas. Además, se debe tener cuidado al trabajar con células con transporte alterado de moléculas pequeñas (por ejemplo, mutantes de la bomba de eflujo del Nilo), ya que esto podría afectar la concentración intracelular de BODIPY 493/503 y la tinción ld, como se observa para el nilo rojo tinte iofílico33 , 34.

La tinción del medio con el dextrano fluorescente Cascade Blue impermeable a la célula es una forma conveniente de distinguir las células del fondo35,que se puede aplicar a muchas especies de levaduras (si no todas). También ayuda con la eliminación automatizada de las células muertas del análisis, ya que estas se volverán azules al mancharse. Cualquier célula moribunda o enferma (y por lo tanto parcialmente permeable para dextran) detectada como viva se puede eliminar durante los pasos de análisis de datos basados en el valor "IntensityMedianBlue" de los objetos celulares detectados. En principio, todo el flujo de trabajo se puede utilizar para detectar otras estructuras celulares, como los focos de reparación de ADN, siempre que las estructuras puedan etiquetarse con fluoróforos adecuados. El flujo de trabajo también debe ser aplicable a las células de otras especies (de levadura), ampliando aún más su utilidad.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las becas de la Universidad Charles PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 y SVV 260310. Agradecemos a Ond-ej éebesta por la ayuda con la microscopía y el desarrollo de la canalización de análisis de imágenes. Agradecemos al laboratorio de ReGenEx por las cepas de S. cerevisiae, y al laboratorio de JapoNet y Hironori Niki para las cepas de S. japonicus. La cepa ppc1-88 fue proporcionada por The Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopía se realizó en el Laboratorio de Microscopía Confocal y fluorescencia cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el presupuesto estatal de la República Checa (Proyecto no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 y CZ.2.16/3.1.00/21515).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) - Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
Pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
Standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

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References

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Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes
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