Summary
在这里,我们介绍了在裂变和萌芽酵母细胞的荧光显微镜图像中自动检测和脂液滴定量描述的MATLAB实现。
Abstract
脂质代谢及其调节对基础科学和应用生命科学和生物技术都十分有益。在这方面,各种酵母品种被用作脂质代谢研究或工业脂质生产的模型。脂液滴是高度动态的存储体,其细胞含量代表脂质代谢状态的方便读出。荧光显微镜是细胞脂滴定量分析的首选方法,因为它依赖于广泛可用的设备,并允许分析单个脂液滴。此外,微观图像分析可以自动化,大大提高了整体分析吞吐量。在这里,我们描述了一个实验和分析工作流程,用于自动检测和定量描述三个不同模型酵母物种中的单个脂液滴:裂变酵母schizoscharis pombe和希佐萨卡莫西斯贾波尼丘斯,和萌芽的酵母糖精塞雷维西亚。脂液滴通过BODIPY 493/503进行可视化,并且细胞不透水荧光dextran被添加到培养基中,以帮助识别细胞边界。细胞在绿色和蓝色通道中接受3D荧光显微镜,产生的z堆栈图像由MATLAB管道自动处理。该程序以表格格式输出丰富的细胞脂滴含量和单个脂滴特征的定量数据,适用于主要电子表格或统计包中的下游分析。我们提供影响细胞脂质代谢的各种条件下脂滴含量的实例分析。
Introduction
脂质在细胞能量和碳代谢、膜组分合成和生物活性物质的生产中起着至关重要的作用。脂质代谢根据环境条件、营养供应和细胞周期第1阶段进行微调。在人类中,脂质代谢与肥胖、II型糖尿病和癌症2等疾病有关。在工业中,由微生物(如酵母)生产的脂质是可再生柴油的一个有前途的来源3。细胞在所谓的脂滴 (LDs) 中储存中性脂质。这些进化保存的身体由三甲苯甘油、固基酯、外磷脂单层和相关蛋白质1组成。LD起源于内质视网膜,施加细胞周期或生长阶段动力学,对细胞脂质平衡1非常重要。当检测各种生长条件下的脂质代谢或筛选一组突变体时,LD数和形态可作为方便的代理。鉴于其动态性质,能够分析单个LD特性的技术对脂质代谢的研究特别感兴趣。
各种酵母品种已被用来描述与脂质相关的代谢途径及其调节,或用于生物技术生产有趣的化合物或燃料1。此外,对于模型酵母,如萌芽酵母糖精或远亲裂变酵母Schizoscharmys pombe,全基因组的缺失菌株库可用于高通量屏幕4,5.最近LD成分和动力学在S.pombe6,7,8,9中被描述,与脂质代谢有关的突变体在新兴的模型酵母中被分离出来希佐萨卡莫西斯贾波尼库斯10。
有许多技术可用于研究 LD 内容和动力学。大多数使用某种染色的LD与亲脂染料,如尼罗河红或BODIPY 493/503。后者显示更窄的激发和发射光谱,并增加对中性脂质(LDs)的特异性,而不是磷脂(膜)11。荧光和流式细胞测定方法已成功地应用于各种真菌物种,以发现影响储存脂质含量12、13、14、15的基因和生长条件。虽然这些方法适用于高通量应用,但它们无法测量细胞中单个 LD 的数量和形态,这些在生长条件和基因型之间可能有很大差异。相干拉曼散射或数字全息显微镜是无标签的方法,产生LD级数据,但需要专门的昂贵的设备16,17,18。另一方面,荧光显微镜可以提供LD含量的详细数据,同时利用常用仪器和图像分析软件工具。存在多个分析工作流,这些工作流在图像数据的单元/LD 检测中具有不同程度的复杂性和自动化,并且针对不同的细胞类型进行了优化,例如具有大 LD 的元群细胞19、20,21,或萌芽酵母17,22,23。其中一些方法仅在 2D 中工作(例如,在最大投影图像上),可能无法可靠地描述蜂窝 LD 内容。据我们所知,没有工具从裂变酵母微观数据中确定LD含量和形态。开发自动化和强大的LD级分析将带来更高的灵敏度和增强的统计能力,并提供丰富的中性脂质含量信息,最好是在多个酵母品种中。
我们开发了一个工作流程,用于从酵母细胞的3D荧光显微镜图像进行LD含量分析。活细胞分别被BODIPY 493/503和级联蓝色dextran染色,以可视化LD和确定细胞边界。细胞固定在玻璃玻片上,并使用标准的荧光显微镜进行 z 堆栈成像。然后,图像由在 MATLAB 中实现的自动化管道进行处理,MATLAB 是一个广泛使用的统计分析(商业)包。管道执行图像预处理、分段(细胞与背景、删除死细胞)和 LD 标识。然后,以与主要电子表格软件工具兼容的表格格式提供丰富的 LD 级数据,如 LD 大小和荧光强度。该工作流程成功地用于确定氮源可用性对S.pombe24的脂质代谢的影响。现在,我们使用生长条件或影响细胞LD含量的突变体,在S.pombe、S.japonicus和S.cerevisae中演示工作流程的功能。
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Protocol
1. 解决方案和媒体的准备
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准备脂质染色溶液。
- 准备库存脂质染色溶液,在10mL无水DMSO(最终浓度1mg/mL)中溶解10毫克BODIPY 493/503。溶解 10 mg BODIPY 493/503 小瓶的全部含量,以防止在称重过程中材料丢失。
警告:DMSO 可能穿过皮肤。穿戴适当的个人防护装备。 - 通过混合 1 mg/mL 493/503 库存溶液的 100 μL 和 900 μL 无水 DMSO(最终浓度 0.1 mg/mL)来制备工作脂质染色溶液。
- 对库存和工作解决方案进行比分,并储存在-20°C。
注:溶解的BODIPY 493/503在-20°C下稳定数年。然而,溶液必须防止潮湿和光线。
- 准备库存脂质染色溶液,在10mL无水DMSO(最终浓度1mg/mL)中溶解10毫克BODIPY 493/503。溶解 10 mg BODIPY 493/503 小瓶的全部含量,以防止在称重过程中材料丢失。
- 为细胞边界可视化准备库存溶液,在2.5 mL的去离子水(最终浓度10mg/mL)中溶解25毫克的级联蓝dextran(全小瓶)。对库存溶液进行加法,并储存在-20°C,防止光线照射。
- 要制备显微镜滑动涂层溶液,在5 mL的去离子水中溶解5毫克大豆叶酸(最终浓度为1mg/mL)。对叶酸溶液进行比分,并储存在-80°C。
注:叶酸溶液在-80°C下稳定数年。目前使用的等分可以储存在-20°C。 -
准备栽培介质。
- 为S.pombe和S.japonicus制备400 mL复合YES培养基,在500 mL瓶和高压灭菌器中溶解2克酵母提取物和0.1克SP补充剂(如果需要辅助营养突变体),在340 mL的去离子水中溶解。在无菌条件下加入60 mL的20%(w/v)单独灭菌或过滤灭菌葡萄糖。
- 为S.pombe和S.japonicus制备400 mL的已定义的EMM培养剂,在500 mL瓶和高压灭菌器中,在360 mL的去离子水中溶解4.9克EMM肉汤,无脱酸玫瑰。在无菌条件下加入40 mL的20%(w/v)单独灭菌或过滤灭菌葡萄糖。
注:关于S.pombe和S.japonicus栽培的一般准则,见分别为25和26。 - 为糖精霉菌制备300mL复合YPAD培养基,在500mL瓶和高压灭菌器中溶解3克酵母提取物、6克肽和30毫克亚硫酸盐。在无菌条件下加入单独灭菌或过滤灭菌葡萄糖的30 mL 20%(w/v)。
- 为S.cerevisae制备300 mL的最小介质,在500 mL瓶和高压灭菌器中,将2克酵母氮碱(不含氨基酸)溶解在270 mL的去离子水中。在无菌条件下加入单独灭菌或过滤灭菌葡萄糖的30 mL 20%(w/v)。
注:有关S.cerevisae栽培的一般准则,见27。
2. 细胞培养
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生长S. pombe或S. japonicus到指数或早期固定相。
- 早晨,用新鲜的裂变酵母生物量接种5mL的YES介质。在 32°C 下孵育,摇动(180 rpm)几个小时。
注:对于所有栽培,使用Erlenmeyer烧瓶的培养量是10倍,以确保适当的曝气。一些实验室喜欢在30°C下种植裂变酵母,但32°C的培养温度可以缩短倍增时间,而不会对细胞造成有害影响,从而减少了进行实验所需的总时间25,28. - 当天下午晚些时候(经过至少6小时的培养),用新鲜的YES培养基稀释至10 mL的最终培养体积,使其在第二天早上达到所需的光密度(OD)(或细胞/mL数),并在32°C下孵育。抖转(180 rpm)。了解每个使用应变的倍增时间以准确确定稀释因子(使用公式 1)是有好处的。
其中V培养是稀释所需的预培养量,V final是新培养的总量(标准培养为 10 mL),OD最终是达到所需的 OD次日上午,OD电流是目前测得的前期培养的OD,t是细胞生长的时间,直到收获,t滞后是滞后阶段的持续时间(取决于实验室条件,需要经验定义),t DT是应变的倍增时间。
注:当指数相细胞进行分析时,不要让预培养达到固定阶段,因为这将显著改变细胞生理学(包括LD含量)的后代。 - 在成像日的早晨,如果培养达到略高于要求的OD(在指数相细胞的情况下),用新鲜的YES稀释它,并在染色前继续孵育至少两倍。否则直接进行染色(第 3 节)。
- 早晨,用新鲜的裂变酵母生物量接种5mL的YES介质。在 32°C 下孵育,摇动(180 rpm)几个小时。
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成长到指数和固定相。
- 下午,用少量新鲜发芽的酵母生物量接种10mL的YPAD介质,并在30°C下孵育过夜,摇动(180rpm)。
- 成像当天的早晨,将培养基稀释至 YPAD 介质 10 mL 中的 OD 0.1,并增长到所需的 OD(例如,指数相的 OD 1)。执行步骤 2.1.2 中描述的任何区域性稀释。继续染色(第 3 节)。
3. 脂滴染色
- 为要成像的每个样品准备显微镜盖玻片。使用水平定位移液器尖端的长侧,将 1 μL 的滑动涂层溶液涂到干净的盖玻片上。让涂层溶液完全干燥,并将盖滑件存放在无尘环境中。
注:如果需要,在使用前可以清洁玻璃滑片和盖玻片。清洗程序包括洗碗洗涤剂、用水冲洗、隔夜浸泡3%盐酸和蒸馏水洗涤。清洁的幻灯片和盖玻片储存在纯乙醇中,直到使用。 - 根据需要测量细胞培养的OD或细胞/mL的数量。尝试在所有测试菌株中达到相似值,以确保类似的实验条件。
- 将每个细胞培养液移1mL至1.5 mL微离心管。仅适用于S. cereviiae,加入 5 μL 的滑动涂层溶液,短暂涡旋,并在 30°C 下孵育,摇动 5 分钟。
- 将1μL的脂质染色溶液加入每个培养液等分和涡流。然后加入10μL的细胞边界可视化溶液和涡旋。
注:不要准备两个污渍的预混合溶液,因为这将导致BODIPY 493/503的荧光淬火。 - 通过离心收集细胞(1,000 x g,3分钟,RT),并去除几乎所有上清液(+950 μL)。 在剩余的上清液中重新悬浮细胞。
- 移液器 2 μL 的致密细胞悬架在镀结涂层盖上滑动并放置在干净的显微镜幻灯片上。细胞应该形成一个单层。尽快进行显微镜(第 4 节),以尽量减少成像中的人工制品;一次最多处理两个样本。
4. 设置显微镜和成像
-
优化成像条件。
注:设置显微镜需要长时间暴露在强光源上,从而对样品造成损坏并造成扭曲结果。因此,使用专用的样品幻灯片设置成像条件,该幻灯片不会进一步用于 LD 量化。- 使用相位对比度或差分干扰对比度 (DIC) 聚焦细胞。
注:可以采用相位对比度或 DIC 图像作为参考,但在自动图像分析步骤中不使用它们。 - 将 z 堆栈设置设置为跨整个单元格卷。总垂直距离取决于像元大小;光学切片的数量取决于目标的数值孔径(z 轴中的点扩散函数)。将焦点设置为相对于中央焦点平面移动。
注:最佳切片数通常由显微镜控制软件设置,无需手动计算。典型的细胞宽度为S.pombe的3-5 μm,S.japonicus的典型宽度为4-7 μm,S.cerevisae为3-7 μm。 - 要对 LD 进行成像,在绿色通道中设置光强度和曝光时间(BODIPY 的激励和发射最大值分别为 493 和 503 nm)。
注:BODIPY 493/503 是一种非常明亮的氟铬;然而,它可能会迅速漂白与过强的光强。此外,LD 在活细胞中是可移动的,因此可最大限度地减少曝光时间,并首先捕获整个绿通道 z 堆栈(在切换到蓝色通道之前),以防止伪影模糊。此外,还要考虑相机的线性范围,以避免饱和像素。 - 要图像细胞边界,在蓝色通道中设置光强度和曝光时间(级联蓝色dextran的激发和发射最大值分别为400和420nm)。
注:图像分割需要蓝色通道的信号强度,但它本身不用于LD量化。因此,此通道中的最佳设置对于分析并不重要。 - 如果可能,在显微镜控制软件中创建自动化的实验工作流程,以方便在标准化条件下对多个样品进行成像。
- 使用相位对比度或差分干扰对比度 (DIC) 聚焦细胞。
- 一旦成像条件得到优化,图像样本将用于定量。如步骤 4.1 所述,聚焦单元格并在绿色和蓝色通道中成像它们。
注:必须使用相同的设置获取所有图像,以便对样本进行比较。每个样本对多个视场进行映像,以获得可靠、有代表性的数据。 - 将蓝色和绿色通道 z 堆栈图像另存为 16 位多层 TIFF 文件(即每个视场两个文件)。在相应的文件名中包括单词"绿色"或"蓝色"。继续图像分析(第 5 节)。
5. 图像分析
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目视检查获取图像的质量。
- 在ImageJ29、30或其他合适的图像分析软件中打开微观图像。
- 删除包含大量在采集过程中移动的单元格的图像堆栈(从而创建模糊伪影)。
- 清除蓝色通道中含有高荧光非细胞颗粒的任何图像堆栈(例如,显微镜滑轨或盖玻片上的污垢、培养培养基中的杂质)。
注:蓝色通道中非常明亮的非细胞对象可能会产生细胞检测伪影,或者干扰其附近细胞的检测。 - 移除包含大量死细胞的图像堆栈(即,与活细胞相比,蓝色荧光增加的细胞)。
注:虽然样本中存在一小部分死细胞通常不是问题,并且这些细胞在分析过程中会自动丢弃,但一些死细胞或垂死细胞可能偶尔被分割算法识别为活细胞,因此扭曲报告的结果。
-
分析 MATLAB 软件中的图像。
- 创建主文件夹并将所有 MATLAB 脚本复制到此位置。
- 创建一个子文件夹("pombe"、"cerevisae"或"japonicus"),并将输入的TIFF图像文件复制到此位置。
- 启动 MATLAB,打开脚本 MAIN.m 并运行它。在菜单中选择要分析的酵母品种并开始图像处理。
注:细胞和LD检测所需的一些参数是为特定物种预先设置的,其他参数在图像处理过程中自动确定。预设值是经验确定的,取决于几个因素,如目标放大倍率、摄像机类型和灵敏度以及成像设置。如果需要,用户可以编辑脚本文件以更改生物体特定的预设,以便更好地反映其实验设置。也就是说,在单元识别期间,可接受的对象大小由"最小区域"和"最大区域"参数给出,对象边界内填充体积的最小分数由"Solidity"参数给出。对于 LD 识别,亮度阈值由"th"参数给出(其值主要受图像位深度和荧光信号强度的影响),而可接受的 LD 大小由"MaxArea"参数给出。 - 使用电子表格编辑器或统计包根据需要检查和处理输出文件;工作流生成分号分隔的 CSV 文件,以及带有检测到的单元格对象和 LD 的分段 TIFF 文件。
注:工作流将图像分割为背景对象和单元格对象,其中每个单元格对象可能由多个相邻单元格组成。因此,"xxxx_cells.csv"文件中的输出不表示单单元数据,应仅用于计算每个单元体积指标。
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Representative Results
图1对裂变酵母(萌芽酵母工作流程类似)总结了整个过程,下面我们提供了如何在已知各种条件下使用该工作流研究三个不同酵母物种的LD含量的示例影响蜂窝 LD 内容。每个示例代表一个生物实验。
图1:实验和分析工作流程的原理图。裂变酵母的工作流程以示例显示。请点击此处查看此图的较大版本。
首先,我们分析了S.pombe细胞(图2)。野生型(WT;h\s)细胞在复杂的YES介质或定义的EMM介质中增长到指数相。与YES相比,在EMM中检测到的单位细胞体积的LD和LD染色强度较低(图2A-C)。此外,在EMM介质中形成的单个LD较大,显示总染色强度增加(图2D,E)。这与先前在EMM24中生长的细胞中增加储存脂质含量的发现一致。ppc1基因编码辅酶A合成所需的磷酸二酯-半胱氨酸连带酶。温度敏感ppc1-88突变体在限制性温度31下生长时LD含量明显下降,为低BODIPY 493/503信号的细胞提供了一个示例(图2A)。因此,与野生类型(在32°C下生长)相比,在转向36°C(图2D,E)后,在YES生长的ppc1-88细胞中检测到具有较低总染色强度的较小LD,而每片LD数没有明显变化。细胞体积单位(图2B)。
图2:生长培养和脂质代谢突变对LD含量的影响S. 庞贝.如所示,野生型 (WT) 和ppc1-88细胞在复杂 YES 或定义的 EMM 介质中增长到指数相。WT细胞在32°C生长。对温度敏感的ppc1-88细胞在25°C下生长,在分析前2小时转移到36°C。(A) 代表未处理的 D 的显微图像,这些图像上沾染了 BODIPY 493/503。为每个条件显示单个光学切片;添加了 10% 的倒置蓝色通道叠加,以更好地可视化细胞边界。刻度条 = 10 μm . (B) 每单位细胞体积的标识 ID 数。(C) 每单位细胞体积的已识别的LD的荧光强度。(D) 所有已识别的 LD 的总荧光强度分布。(E) 所有已识别的 LD 的体积分布。B-E面板中的数据分别来自WT YES、WT EMM和ppc1-88样本的242个、124个和191个单元对象。请点击此处查看此图的较大版本。
接下来,我们从在 YES 中生长的指数和早期固定培养基 (图 3A) 中量化了S. japonicus细胞中的 LD 含量 (h=matsj-2017)32。进入固定相的细胞与指数增长的细胞相比,每单位细胞体积的LD数量明显减少(图3B),而体积标准化LD荧光强度在两个条件之间略有下降(图 3C.早期固定相LD通常比指数增长细胞的LD稍大,总荧光强度也略高(图3D,E)。
图 3:中的 LD 内容S. 黄斑细胞随生长阶段而变化。分析了指数生长(LOG)和早期固定相(STAT)细胞。(A) 代表未处理的 D 的显微图像,这些图像上沾染了 BODIPY 493/503。为每个条件显示单个光学切片;添加了 10% 的倒置蓝色通道叠加,以更好地可视化细胞边界。刻度条表示每单位细胞体积的标识的 LD 数。(C) 每单位细胞体积的已识别的LD的荧光强度。(D) 所有已识别的 LD 的总荧光强度分布。 * 未配对的威尔科森测试p = 1.3 x 10-114。(E) 所有已识别的 LD 的体积分布。 * 未配对的威尔科森测试 p = 2.4 x 10-85。B-E面板中的数据分别来自LOG和STAT样本的274个和187个单元对象。请点击此处查看此图的较大版本。
最后,我们分析了广泛使用的BY4741实验室菌株(MATa his3_1 leu2_0满足15_0 ura3]0)在复杂的YPAD介质中分别增长到指数和固定相的S.cerevisiae细胞。 萌芽酵母细胞在进入静止阶段1时通常会积累储存脂质,我们能够重述这些发现(图4)。与指数增长的细胞相比,固定细胞每单位体积的LD略少(图4B),但其体积标准化LD荧光强度几乎翻了一番(图4C)。整体LD含量的急剧上升是由于静止相中单个LD的荧光强度和体积要高得多(图4D,E)。
图 4:中的 LD 内容S. s. cerevisae 细胞随生长阶段而变化。分析了指数生长(LOG)和固定相(STAT)细胞。(A) 代表未处理的 D 的显微图像,这些图像上沾染了 BODIPY 493/503。为每个条件显示单个光学切片;添加了 10% 的倒置蓝色通道叠加,以更好地可视化细胞边界。刻度条表示每单位细胞体积的标识的 LD 数。(C) 每单位细胞体积的已识别的LD的荧光强度。(D) 所有已识别的 LD 的总荧光强度分布。 * 未配对的威尔科森测试p = 4.6 x 10-78 。(E) 所有已识别的 LD 的体积分布。 * 未配对的威尔科森测试 p = 3.7 x 10-63 。B-E面板中的数据分别来自LOG和STAT样本的430个和441个单元对象。请点击此处查看此图的较大版本。
因此,我们的分析工作流程可以检测三个不同和形态上截然不同的酵母菌种的LD数、大小和脂质含量的变化,这些酵母在对细胞LD含量有正面或负面的条件下。
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Discussion
对脂质代谢及其调控的理解对于基础生物学以及临床和生物技术应用都很重要。LD含量代表细胞脂质代谢状态的方便读出,荧光显微镜是LD含量测定的主要方法之一。提出的协议允许自动检测和定量描述三个不同和形态上不同的酵母物种的单个LD。据我们所知,裂变酵母没有类似的工具。图像处理所需的 MATLAB 脚本作为补充文件包含在内,也可从 Figshare 存储库 (DOI 10.6084/m9.figshare.7745738) 以及本手稿中的所有原始和已处理图像和表格数据获得,CSV 输出文件和用于下游数据分析和可视化的 R 脚本的详细描述。此外,GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis) 提供了最新版本的 MATLAB 脚本。
成功的 LD 分析很大程度上取决于获得的原始荧光图像的质量。为了优化分割算法的性能,清洁玻璃玻片中没有灰尘颗粒的清洁玻璃片应用于显微镜,细胞应形成单层(每个视场的实际细胞数不是关键参数),并且不应包含大量死细胞。此外,z 堆栈成像应稍微低于单元格并略高于单元格结束。根据特定的微观设置,用户可能需要调整图像处理脚本中的某些参数(例如图像背景强度阈值的"th")。虽然当前方法能够检测和描述分段的单元对象中的单个 LD,但由于难以自动分离所有单个单元,工作流无法生成真正的单细胞数据。相反,报告每个单元单元的LD含量,这些细胞体积适用于整个样本。这种限制可能妨碍对异质细胞群的分析数据解释。此外,当使用改变的小分子(例如,排泄泵突变体)的细胞时,应小心谨慎,因为这可能影响细胞内BODIPY 493/503浓度和LD染色,如尼罗河红亲脂染料33所观察到的,34.
用细胞防渗透级联蓝色荧光dextran染色介质是区分细胞与背景35的便捷方法,可以应用于许多(如果不是全部)酵母品种。它还有助于自动从分析中去除死细胞,因为这些细胞在染色后会变蓝。在基于检测到的细胞对象的"强度MedianBlue"值的数据分析步骤中,可以移除任何死亡或生病(因此部分可渗透为dextran)的细胞。原则上,整个工作流程可用于检测各种其他细胞结构,如DNA修复中心,前提是这些结构可以贴上合适的荧光草标签。工作流程也应适用于其他(酵母)物种的细胞,进一步拓宽其效用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了查尔斯大学资助PRIMUS/MED/26、GAUK 1308217和SVV 260310的支持。我们感谢翁代伊·塞贝塔在显微镜和图像分析管道开发方面的帮助。我们感谢ReGenEx实验室的S.cerevisae菌株,以及JapoNet和HironoriNiki的S.japonicus菌株实验室。ppc1-88菌株由日本酵母遗传资源中心提供。显微镜在由欧洲区域发展基金和捷克共和国国家预算共同资助的共和荧光显微镜实验室进行(项目No.CZ.1.05/4.1.00/16.0347 和 CZ.2.16/3.1.00/21515)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) - Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| Pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| Standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
References
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