Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Science, Charles University

Summary

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Abstract

Lipide metabolisme en de regulering ervan zijn van belang voor zowel elementaire als toegepaste biowetenschappen en biotechnologie. In dit verband, verschillende gist soorten worden gebruikt als modellen in lipide metabolische onderzoek of voor industriële lipide productie. Lipide druppeltjes zijn zeer dynamische opslag lichamen en hun cellulaire inhoud vertegenwoordigt een handige uitlezen van de lipide metabolische toestand. Fluorescentiemicroscopie is een methode van keuze voor kwantitatieve analyse van cellulaire lipide druppeltjes, als het steunt op algemeen beschikbare apparatuur en maakt analyse van individuele lipide druppeltjes. Bovendien, microscopische beeldanalyse kan worden geautomatiseerd, sterk verhogen van de algehele analyse doorvoer. Hier beschrijven we een experimentele en analytische workflow voor geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van individuele lipidedrup pels in drie verschillende model gist soorten: de splijting gisten schizosaccharomyces pombe en Schizosaccharomyces japonicus, en de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Lipide druppeltjes worden gevisualiseerd met BODIPY 493/503, en cel-ondoorlatend fluorescerende dextran wordt toegevoegd aan de cultuur media om celgrenzen te identificeren. Cellen worden onderworpen aan 3D epifluorescentie microscopie in groene en blauwe kanalen en de resulterende z-stack beelden worden automatisch verwerkt door een MATLAB pipeline. De procedure levert uitgebreide kwantitatieve gegevens op cellulaire lipide druppel inhoud en individuele lipide druppel kenmerken in een tabelvorm formaat geschikt voor downstream analyses in grote spreadsheet of statistische pakketten. Wij bieden voorbeeld analyses van lipide druppel inhoud onder verschillende omstandigheden die invloed hebben op cellulaire lipide metabolisme.

Introduction

Lipiden spelen cruciale rollen in cellulaire energie en koolstof metabolisme, synthese van membraan componenten, en productie van bioactieve stoffen. Lipide metabolisme is fijnafgesteld volgens omgevingscondities, beschikbaarheid van nutriënten en fase1van de celcyclus. Bij de mens, lipide metabolisme is verbonden met ziekten, zoals obesitas, diabetes type II en kanker2. In de industrie vormen lipiden die door micro-organismen worden geproduceerd, zoals gisten, een veelbelovende bron van hernieuwbare dieselbrandstoffen3. Cellen slaan neutrale lipiden op in zogenaamde lipide druppeltjes (LDs). Deze evolutionair behouden lichamen zijn samengesteld uit triacylglycerolen, steryl esters, een buitenste fosfolipide monolaag en geassocieerde eiwitten1. LDs zijn afkomstig uit het endoplasmisch reticulum, oefenen celcyclus of groeifase dynamiek, en zijn belangrijk voor cellulaire lipide homeostase1. LD-nummer en morfologie kan worden gebruikt als een handige proxy wanneer het lipide metabolisme onder verschillende groeiomstandigheden of bij het screenen van een panel van mutanten. Gezien hun dynamische karakter zijn technieken die de eigenschappen van individuele LDs kunnen analyseren van bijzonder belang in onderzoeken naar lipide-metabolisme.

Verschillende gist soorten zijn gebruikt om lipide-gerelateerde metabole trajecten en hun regulering te beschrijven, of gebruikt in de biotechnologie om interessante verbindingen of brandstoffen te produceren1. Bovendien zijn voor model gisten, zoals de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae of de ver verwante Splijtings gist schizosaccharomyces pombe, genoom-Wide deletie stam bibliotheken beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor hoge doorvoer schermen4,5. Onlangs is LD samenstelling en dynamiek beschreven in S. pombe6,7,8,9, en mutanten gerelateerd aan lipide metabolisme zijn geïsoleerd in de opkomende model gist Schizosaccharomyces japonicus10.

Er zijn tal van technieken beschikbaar om LD-inhoud en-dynamiek te bestuderen. De meesten gebruiken een soort kleuring van LDs met lipofiele kleurstoffen zoals Nile Red of BODIPY 493/503. De laatste toont meer nauwe excitatie en emissiespectra, en verhoogde specificiteit naar neutrale lipiden (LDs) in tegenstelling tot fosfolipiden (membranen)11. Fluorimetrische en flow-cytometrie methoden zijn met succes gebruikt in verschillende schimmelsoorten om genen en groeiomstandigheden te achterhalen die invloed hebben op opslag lipide-inhoud12,13,14,15. Hoewel deze methoden geschikt zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer, kunnen ze de aantallen en morfologie van afzonderlijke LDs in cellen niet meten, wat dramatisch kan verschillen tussen groeiomstandigheden en genotypes. Coherente Raman verstrooiing of digitale holografische microscopie zijn label vrije methoden die LD-niveau gegevens opleveren, maar vereisen gespecialiseerde dure apparatuur16,17,18. Fluorescentiemicroscopie, aan de andere kant, kan gedetailleerde gegevens verstrekken over LD-inhoud, terwijl gebruik wordt makend van algemeen beschikbare instrumenten en software tools voorbeeld analyse. Er bestaan verschillende analyse werkstromen met verschillende gradaties van verfijning en automatisering in cel/LD-detectie van afbeeldingsgegevens, en zijn geoptimaliseerd voor verschillende celtypen, zoals metazoan-cellen met grote LDS19,20 , 21, of ontluikende gisten17,22,23. Sommige van deze benaderingen werken alleen in 2D (bijvoorbeeld bij maximale projectie beelden), die de cellulaire LD-inhoud mogelijk niet betrouwbaar beschrijven. Voor onze kennis bestaan er geen hulpmiddelen voor de bepaling van LD-gehalte en morfologie van de analyse van microscopische gegevens van splijting. De ontwikkeling van geautomatiseerde en robuuste analyses op LD-niveau zou leiden tot meer gevoeligheid en meer statistisch vermogen, en biedt rijke informatie over neutraal lipide-inhoud, idealiter in meerdere gist soorten.

We hebben een workflow ontwikkeld voor LD content analyse van 3D fluorescentiemicroscopie beelden van gistcellen. Levende cellen zijn gekleurd met BODIPY 493/503 en Cascade blauwe dextran om LDs te visualiseren en celgrenzen te bepalen, respectievelijk. Cellen worden geïmmobiliseerd op glazen glijbanen en onderworpen aan z-stack beeldvorming met behulp van een standaard epifluorescentie Microscoop. Afbeeldingen worden vervolgens verwerkt door een geautomatiseerde pijplijn geïmplementeerd in MATLAB, een veelgebruikte (commerciële) pakket voor statistische analyses. De pijplijn voert de voor verwerking van afbeeldingen, segmentatie (cellen versus achtergrond, verwijdering van dode cellen) en LD-identificatie uit. Uitgebreide gegevens op LD-niveau, zoals LD-grootte en fluorescentie-intensiteit, worden vervolgens geleverd in tabelvorm die compatibel is met belangrijke spreadsheet softwaretools. De werkstroom werd met succes gebruikt om te bepalen van de impact van de beschikbaarheid van stikstofbron op lipide metabolisme in S. pombe24. We demonstreren nu de functionaliteit van de workflow in s. pombe, s. japonicus en s. cerevisiae, waarbij gebruik wordt gemaakt van groeicondities of mutanten die het cellulaire LD-gehalte beïnvloeden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding van oplossingen en media

  1. Bereid lipide-kleurings oplossing.
    1. Voor het bereiden van de lipide-kleurenoplossing Los 10 mg BODIPY 493/503 op in 10 mL watervrije DMSO (uiteindelijke concentratie 1 mg/mL). Los de volledige inhoud van een 10 mg BODIPY 493/503 injectieflacon op om verlies van materiaal tijdens het wegen te voorkomen.
      Let op: DMSO kan passeren de huid. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    2. Bereid werk lipiden kleurings oplossing voor door het mengen van 100 μL van de 1 mg/mL BODIPY 493/503 stockoplossing en 900 μL watervrij DMSO (eindconcentratie 0,1 mg/mL).
    3. Aliquot de voorraad en werkoplossingen, en bewaren bij-20 °C.
      Opmerking: Opgeloste BODIPY 493/503 is stabiel gedurende meerdere jaren bij-20 °C. De oplossing moet echter worden beschermd tegen vocht en licht.
  2. Om de voorraadoplossing voor de celgrens visualisatie te bereiden, lost u 25 mg Cascade Blue dextran (hele injectieflacon) op in 2,5 mL gedeïoniseerd water (eindconcentratie 10 mg/mL). Aliquot de stockoplossing en bewaren bij-20 °C beschermd tegen licht.
  3. Voor het bereiden van Microscoop dia coating oplossing, los 5 mg van soja lectine in 5 mL gedeïoniseerd water (uiteindelijke concentratie 1 mg/mL). Aliquot de lectine oplossing en bewaren bij-80 °C.
    Opmerking: De lectine oplossing is gedurende enkele jaren stabiel bij-80 °C. Aliquots die momenteel in gebruik zijn, kunnen bij-20 °C worden bewaard.
  4. Bereid de teelt media voor.
    1. Om 400 mL complex YES teeltmedium voor s. pombe en s. japonicus te bereiden, los 2 g gistextract en 0,1 g van SP supplementen (indien nodig voor auxotrofische mutanten) op in 340 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml fles en autoclaaf. Voeg in aseptische omstandigheden 60 mL van 20% (w/v) van afzonderlijk geautoclaveerd of met filter gesteriliseerde glucose toe.
    2. Om 400 mL van het gedefinieerde EMM-kweekmedium voor s. pombe en s. japonicus te bereiden, lost u 4,9 g EMM-Bouillon zonder dextrose op in 360 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml fles en autoclaaf. Voeg in aseptische omstandigheden 40 mL van 20% (w/v) van afzonderlijk geautoclaveerd of met filter gesteriliseerde glucose toe.
      Opmerking: Zie voor de algemene richtlijnen voor de teelt van s. pombe en s. japonicus respectievelijk25 en26.
    3. Om 300 ml complex ypad teeltmedium voor Saccharomyces cerevisiaete bereiden, Los 3 g gistextract, 6 g pepton en 30 mg adenine sulfaat op in 270 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml fles en autoclaaf. Voeg in aseptische omstandigheden 30 mL 20% (w/v) van afzonderlijk geautoclaveerd of met filter gesteriliseerde glucose toe.
    4. Om 300 mL gedefinieerd minimaal medium voor S. cerevisiae te bereiden, los 2 g gist stikstof base (zonder aminozuren) op in 270 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml fles en autoclaaf. Voeg in aseptische omstandigheden 30 mL 20% (w/v) van afzonderlijk geautoclaveerd of met filter gesteriliseerde glucose toe.
      Opmerking: Zie voor de algemene richtlijnen voor de teelt van S. cerevisiae 27.

2. celteelt

  1. De groei van s. pombe of s. japonicus naar een exponentiële of vroegtijdige stationaire fase.
    1. In de ochtend, inoculeren 5 mL ja medium met verse splijting gist biomassa. Incuberen bij 32 °C met schudden (180 rpm) gedurende enkele uren.
      Opmerking: Gebruik voor alle cultivaties erlenmeyerkolven met 10 maal het volume van de kweek om een goede beluchting te garanderen. Sommige laboratoria geven de voorkeur aan het kweken van fissie gisten bij 30 ° c, maar de kweek temperatuur van 32 °c resulteert in kortere Verdubbelings tijden zonder nadelige effecten voor de cellen, waardoor de totale tijd die nodig is om een experiment uit te voeren, wordt verkort25,28 .
    2. In de late namiddag van dezelfde dag (na ten minste 6 uur teelt), Verdun de cultuur met vers ja medium tot een 10 mL eind kweek volume, zodat het de volgende ochtend de gewenste extinctie (OD) (of aantal cellen/mL) bereikt en inbroed bij 32 °C met s Hacking (180 rpm). Het is van voordeel om de verdubbelingstijd van elke gebruikte stam te kennen om de verdunningsfactor nauwkeurig te bepalen (gebruik vergelijking 1).
      Equation 1
      Waar v-cultuur het precultuur volume is dat nodig is voor verdunning, is v-finale het totale volume van de nieuwe cultuur (10 ml voor standaard cultivaties), odFinal is de gewenste od om de volgende ochtend, odstroom is de momenteel gemeten od van de precultuur, t is de tijd van celgroei tot het oogsten, tlag is de duur van de lag-fase (afhankelijk van de laboratoriumomstandigheden, moet empirisch gedefinieerd) en tDT is de verdubbelingstijd van de stam.
      Opmerking: Wanneer exponentiële-fase cellen moeten worden geanalyseerd, laat dan geen preculturen de stationaire fase bereiken, omdat dit de celfysiologie (inclusief LD-gehalte) voor verschillende volgende generaties drastisch verandert.
    3. In de ochtend van de beeldvormings dag, als de cultuur iets hoger is dan vereist (in het geval van exponentiële fase cellen), Verdun deze dan met verse Ja en ga verder met incubatie gedurende ten minste twee verdubbelde tijden vóór het vlekken van LDs. Ga anders rechtstreeks naar vlekken (punt 3).
  2. Groei van S. cerevisiae naar exponentiële en stationaire fase.
    1. Inoculeren in de namiddag 10 mL YPAD medium met een kleine hoeveelheid verse ontluikende gist biomassa en incuberen 's nachts bij 30 °C met schudden (180 rpm).
    2. De ochtend van Imaging Day, Verdun de cultuur tot OD 0,1 in 10 mL YPAD medium en groei naar de vereiste OD (bijv., OD 1 voor exponentiële fase). Voer alle kweek verdunningen uit zoals beschreven in stap 2.1.2. Ga verder met vlekken (punt 3).

3. lipide druppel kleuring

  1. Bereid een Microscoop strook voor elk monster dat moet worden afgebeeld. Verdeel 1 μL dia-coating oplossing op een schone Afdekstrook met behulp van de lange zijde van een horizontaal geplaatste pipetpunt. Laat de coating oplossing volledig drogen en bewaar de afdek stroken in een stofvrije omgeving.
    Opmerking: Glazen glijbanen en dekstroken kunnen voor gebruik worden gereinigd, indien nodig. De reinigingsprocedure bestaat uit het wassen met afwasmiddel, spoelen met water, overnachten in 3% zoutzuur en wassen met gedistilleerd water. Gereinigde glijbanen en dekstroken worden tot gebruik in zuivere ethanol opgeslagen.
  2. Meet de OD van de celcultuur of het aantal cellen/mL, indien nodig. Probeer vergelijkbare waarden te bereiken tussen alle geteste stammen om vergelijkbare experimentele omstandigheden te garanderen.
  3. Pipetteer 1 mL van elke celkweek in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Alleen voor S. cerevisiae , voeg 5 μL van de coating oplossing van de dia, Vortex kort, en inbroed bij 30 ° c met schudden gedurende 5 minuten.
  4. Voeg 1 μL van de lipidenkleuringoplossing toe aan elke kweek aliquot en Vortex kort. Voeg vervolgens 10 μL van de cel grens visualisatie oplossing toe en Vortex kort.
    Opmerking: Bereid vooraf gemengde oplossingen van beide vlekken niet als dit leidt tot fluorescentie bluchen van BODIPY 493/503.
  5. Verzamel de cellen door centrifugeren (1.000 x g, 3 min, RT) en verwijder bijna alle supernatant (~ 950 μL). De cellen in de resterende supernatant hervatten.
  6. Pipetteer 2 μL van de dichte celsuspensie op een Afdekstrook met lectine coating en plaats deze op een schone Microscoop-dia. De cellen moeten een monolayer vormen. Ga zo snel mogelijk naar microscopie (sectie 4) om artefacten in beeldvorming te minimaliseren; maximaal twee monsters tegelijk verwerken.

4. de Microscoop en de beeldvorming instellen

  1. Optimaliseer imaging voorwaarden.
    Opmerking:     het instellen van de Microscoop vereist langdurige blootstelling aan sterke lichtbronnen die schade aan het monster kunnen veroorzaken en de resultaten scheeftrekken. Stel daarom de beeldvormings condities in met behulp van een speciale sample Slide die niet verder wordt gebruikt voor LD-kwantificering.
    1. Focus op de cellen met behulp van fase contrast of differentiële interferentie contrast (DIC).
      Opmerking: Fase contrast of DIC beelden kunnen worden genomen ter referentie, maar ze worden niet gebruikt tijdens de geautomatiseerde afbeelding analyse stap.
    2. Stel z-stack-instellingen in om het hele celvolume te overbruggen. De totale verticale afstand is afhankelijk van de celgrootte; het aantal optische segmenten is afhankelijk van het numerieke diafragma van de doelstelling (puntspreidingsfunctie in z-as). Stel de focus in ten opzichte van het centrale brandvlak.
      Opmerking: Het optimale aantal segmenten wordt vaak ingesteld door de Microscoop-besturingssoftware en hoeft niet handmatig te worden berekend. De typische celbreedtes zijn 3-5 μm voor s. pombe, 4-7 μm voor s . japonicusen 3-7 μm voor s. cerevisiae.
    3. Voorbeeld LDs stelt u de lichtintensiteit en de belichtingstijd in op het groene kanaal (excitatie en emissiemaxima van BODIPY zijn respectievelijk 493 en 503 nm).
      Opmerking: BODIPY 493/503 is een zeer helder fluorochrome; echter, het kan krijgen gebleekt snel met overdreven sterke lichtintensiteit. Bovendien zijn LDs mobiel in levende cellen, waardoor de belichtingstijd wordt beperkt en de volledige Green-Channel z-stack eerst wordt vastgelegd (voordat wordt overgeschakeld naar het blauwe kanaal) om vervaging-artefacten te voorkomen. Neem ook rekening met het lineaire bereik van de camera voor de signaalintensiteit om verzadigde pixels te voorkomen.
    4. Om celgrenzen te verleggen, stelt u de lichtintensiteit en de belichtingstijd in het blauwe kanaal in (excitatie en emissiemaxima van Cascade Blue dextran zijn respectievelijk 400 en 420 nm).
      Opmerking: De signaalintensiteit in het blauwe kanaal is vereist voorbeeld segmentatie, maar wordt niet gebruikt voor LD-kwantificering zelf. Daarom zijn optimale instellingen in dit kanaal niet cruciaal voor analyse.
    5. Maak indien mogelijk een geautomatiseerde experimentele workflow in de Microscoop besturingssoftware om beeldvorming van meerdere monsters onder gestandaardiseerde omstandigheden te vergemakkelijken.
  2. Zodra imaging voorwaarden zijn geoptimaliseerd, beeld monsters worden gebruikt voor kwantificering. Concentreer u op de cellen en beeld ze in groene en blauwe kanalen zoals beschreven in stap 4,1.
    Opmerking: Alle afbeeldingen moeten worden verkregen met dezelfde instellingen om vergelijking tussen samples mogelijk te maken. Afbeelding meerdere weergavevelden per sample om robuuste, representatieve gegevens te verkrijgen.
  3. Sla de Blue en Green Channel z-stack-afbeeldingen op als 16-bits TIFF-bestanden met meerdere lagen (d.w.z. twee bestanden per gezichtsveld). Woorden "groen" of "blauw" in de corresponderende bestandsnamen opnemen. Ga verder met beeldanalyse (paragraaf 5).

5. beeldanalyse

  1. Controleer visueel de kwaliteit van de verworven beelden.
    1. Open microscopische afbeeldingen in imagej29,30 of andere geschikte beeldanalyse software.
    2. Verwijder alle afbeeldingsstapels die een aanzienlijk aantal cellen bevatten die tijdens de overname zijn verplaatst (en zo gemaakte vervaging-artefacten).
    3. Verwijder alle afbeeldingsstapels met sterk fluorescerende niet-celdeeltjes in het blauwe kanaal (bijvoorbeeld vuil op de Microscoop-dia of Afdekstrook, verontreinigingen in het kweekmedium).
      Opmerking: Zeer heldere niet-cellige objecten in het blauwe kanaal kunnen celdetectieartefacten maken of kunnen interfereren met de detectie van cellen in hun omgeving.
    4. Verwijder alle afbeeldingsstapels met een groot deel van de dode cellen (d.w.z. cellen met een verhoogde blauwe fluorescentie in vergelijking met levende cellen).
      Opmerking: Hoewel de aanwezigheid van een klein deel van de dode cellen in het monster meestal geen probleem is en deze cellen automatisch worden verwijderd tijdens de analyse, kunnen sommige dode of stervende cellen af en toe worden herkend als levende cellen door het segmentatie algoritme en dus de gerapporteerde resultaten scheeftrekken.
  2. Analyseer afbeeldingen in de MATLAB-software.
    1. Maak een hoofdmap en kopieer alle MATLAB-scripts naar deze locatie.
    2. Maak een sub-map ("pombe", "cerevisiae" of "japonicus") en kopieer de invoer TIFF-afbeeldingsbestanden naar deze locatie.
    3. Start MATLAB, openscript MAIN. m en voer het uit. Selecteer in het menu de gist soorten die moeten worden geanalyseerd en start de beeldverwerking.
      Opmerking: Sommige parameters die nodig zijn voor de detectie van cellen en LD zijn vooraf ingesteld voor de specifieke soort, andere worden automatisch bepaald tijdens de beeldverwerking. De vooraf ingestelde waarden werden empirisch bepaald en zijn afhankelijk van verschillende factoren, zoals objectieve vergroting, cameratype en gevoeligheid, en imaging-instellingen. Indien nodig kunnen gebruikers de scriptbestanden bewerken om de specifieke voorinstellingen van het organisme te wijzigen om hun experimentele instellingen beter weer te geven. Namelijk, tijdens de celherkenning acceptabele object groottes worden gegeven door de parameters "minArea" en "maxArea", en de minimale Fractie van gevuld volume binnen de object grenzen wordt gegeven door de "solidity" parameter. Voor LD-herkenning wordt de helderheidsdrempel gegeven door de "th"-parameter (de waarde wordt meestal beïnvloed door de bitdiepte van de afbeelding en de intensiteit van het fluorescentie signaal) en de maximale acceptabele LD-grootte wordt gegeven door de parameter "MaxArea".
    4. Inspecteer en verwerk de uitvoerbestanden naar wens met een spreadsheet editor of statistisch pakket; de werkstroom produceert CSV-bestanden met puntkomma's gescheiden en gesegmenteerde TIFF-bestanden met gedetecteerde celobjecten en LDs.
      Opmerking: De werkstroom segmenteert afbeeldingen in achtergrond-en celobjecten, waarbij elk celobject kan bestaan uit meerdere aangrenzende cellen. Daarom de uitvoer in ' xxxx_cells. csv ' bestanden vertegenwoordigt geen eencellige gegevens en moet alleen worden gebruikt voor het berekenen van per eenheid-cel-volume metrische gegevens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hele procedure wordt samengevat in Figuur 1 voor de fissie gisten (de ontluikende gist werkstroom is analoog), en hieronder geven we voorbeelden van hoe de workflow kan worden gebruikt om ld-gehalte te bestuderen in drie verschillende gist soorten onder verschillende omstandigheden die bekend zijn om de cellulaire LD-inhoud te beïnvloeden. Elk voorbeeld vertegenwoordigt één biologisch experiment.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch diagram van de experimentele en analytische workflow. De werkstroom voor splijtings gisten wordt als voorbeeld getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Eerst analyseerden we de cellen van S. pombe (Figuur 2). Wild type (WT; h + s) cellen werden in een exponentiële fase in het complexe ja medium of gedefinieerd EMM-medium geteeld. In vergelijking met Ja werden er minder LDs-en hogere LD-kleurings intensiteit per eenheid celvolume gedetecteerd in EMM (Figuur 2a-C). Bovendien was de individuele LDs die in EMM-medium werd gevormd groter en werd een verhoogde totale kleurings intensiteit weergegeven (figuur 2D, E). Dit is in overeenstemming met eerdere bevindingen van toegenomen opslag lipide-inhoud in cellen gegroeid in EMM24. Het ppc1 gen codeert een foshopantothenaat-cysteïne ligase vereist voor co-enzym een synthese. De temperatuurgevoelige ppc1-88 Mutant toont een duidelijke afname in LD-gehalte wanneer het wordt geteeld op de beperkende temperatuur31, met een voorbeeld van cellen met een laag bodipy 493/503-signaal (Figuur 2a). In vergelijking met wild type (geteeld op 32 °C) werden kleinere LDs met een lagere totale kleurings intensiteit vastgesteld in ppc1-88 cellen die in Yes werden geteeld na een verschuiving naar 36 °C (figuur 2D, E), zonder enige duidelijke verandering in LD-nummer per eenheid van het celvolume (Figuur 2b).

Figure 2
Figuur 2: impact van de groeimedia en de lipide metabolisme mutatie op LD-gehalte in S. pombe. Wild type (WT) en ppc1-88 cellen werden in het complexe ja of gedefinieerd EMM-medium in exponentiële fase gekweekt, zoals aangegeven. WT-cellen werden geteeld bij 32 °C. De temperatuurgevoelige ppc1-88 cellen werden bij 25 °c geteeld en gedurende 2 uur voorafgaand aan de analyse naar 36 °c verschoven. (A) representatieve onbewerkte microscopische beelden van de LDS, gekleurd met bodipy 493/503. Voor elke toestand wordt een enkel optisch segment getoond; 10% overlay met omgekeerd blauw kanaal is toegevoegd om celgrenzen beter te visualiseren. Schaalbalk = 10 μm. (B) aantal vastgestelde LDS per eenheid celvolume. C) intensiteit van de fluorescentie van geïdentificeerde LDS per eenheid celvolume. D) uitkeringen van totale fluorescentie intensiteiten van alle geïdentificeerde LDS. * * *, # # # ongepaarde Wilcoxon test p = 1,7 x 10-107, p = 3,7 x 10-132, respectievelijk. (E) verdelingen van volumes van alle geïdentificeerde LDS. * * *, # # # ongepaarde Wilcoxon test p = 6,8 x 10-71, p = 1 x 10-64, respectievelijk. Gegevens in deelvensters B-E zijn afgeleid van respectievelijk 242, 124 en 191 celobjecten voor de WT YES, WT EMM en ppc1-88 samples. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Vervolgens hebben we LD-gehalte gekwantificeerd in S. japonicus -cellen (h+matsj-2017)32 van exponentiële en vroegstationaire culturen die in Yes zijn geteeld (Figuur 3a). Cellen die de stationaire fase binnengaan vertoonden een duidelijk afgenomen aantal LDs per eenheid celvolume vergeleken met exponentieel groeiende cellen (Figuur 3b), terwijl volumegenormaliseerde LD fluorescentie-intensiteit lichtjes daalde tussen de twee voorwaarden ( Figuur 3c). De vroege stationaire fase LDs was meestal matig groter en had een matig hogere totale fluorescentie intensiteit in vergelijking met LDs uit exponentieel groeiende cellen (figuur 3D, E).

Figure 3
Figuur 3: ld-gehalte in S. japonicus cellen verandert met groeifase. Exponentieel groeiende (LOG) en Early stationaire fase (STAT) cellen werden geanalyseerd. (A) representatieve onbewerkte microscopische beelden van de LDS, gekleurd met bodipy 493/503. Voor elke toestand wordt een enkel optisch segment getoond; 10% overlay met omgekeerd blauw kanaal is toegevoegd om celgrenzen beter te visualiseren. Schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm. (B) aantal vastgestelde LDS per eenheid celvolume. C) intensiteit van de fluorescentie van geïdentificeerde LDS per eenheid celvolume. D) uitkeringen van totale fluorescentie intensiteiten van alle geïdentificeerde LDS. * * * ongepaarde Wilcoxon test p = 1,3 x 10-114. E) verdelingen van de volumes van alle geïdentificeerde LDS. * * * ongepaarde Wilcoxon-test p = 2,4 x 10-85. Gegevens in deelvensters B-E zijn respectievelijk afgeleid van 274 en 187 celobjecten voor de LOG-en STAT-samples. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Tot slot, we analyseerden S. cerevisiae cellen van de veelgebruikte BY4741 laboratorium stam (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) gegroeid tot exponentiële en stationaire fase, respectievelijk, in het complexe ypad medium. Ontluikende gistcellen accumuleren meestal opslag lipiden bij binnenkomst in stationaire fase1, en we waren in staat om deze bevindingen te recapituleren (Figuur 4). Stationaire cellen bevatten iets minder LDs per volume-eenheid vergeleken met exponentieel groeiende cellen (figuur 4b), maar de volumegenormaliseerde LD fluorescentie intensiteit werd bijna verdubbeld (figuur 4c). Deze scherpe stijging van het totale LD-gehalte was te wijten aan de veel hogere fluorescentie intensiteit en het volume van de afzonderlijke LDs in stationaire fase (figuur 4D, E).

Figure 4
Figuur 4: ld-gehalte in S. cerevisiae cellen verandert met groeifase. Exponentieel groeiende (LOG) en stationaire fase (STAT) cellen werden geanalyseerd. (A) representatieve onbewerkte microscopische beelden van de LDS, gekleurd met bodipy 493/503. Voor elke toestand wordt een enkel optisch segment getoond; 10% overlay met omgekeerd blauw kanaal is toegevoegd om celgrenzen beter te visualiseren. Schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm. (B) aantal vastgestelde LDS per eenheid celvolume. C) intensiteit van de fluorescentie van geïdentificeerde LDS per eenheid celvolume. D) uitkeringen van totale fluorescentie intensiteiten van alle geïdentificeerde LDS. * * * ongepaarde Wilcoxon test p = 4,6 x 10-78. E) verdelingen van de volumes van alle geïdentificeerde LDS. * * * ongepaarde Wilcoxon-test p = 3,7 x 10-63. Gegevens in deelvensters B-E zijn respectievelijk afgeleid van 430 en 441 celobjecten voor de LOG-en STAT-samples. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Zo kan onze analyse-workflow veranderingen in LD-nummer, grootte en lipide-inhoud detecteren in drie verschillende en morfologisch verschillende gist soorten onder verschillende omstandigheden die een positieve of negatieve invloed hebben op het cellulaire LD-gehalte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het begrip van lipide metabolisme en de regulering ervan is belangrijk voor zowel de basis biologie, en klinische en biotechnologische toepassingen. LD-gehalte staat voor een handige uitlezen van de vetmetabolisme toestand van de cel, met fluorescentiemicroscopie als een van de belangrijkste methoden die worden gebruikt voor de bepaling van LD-inhoud. Het gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van individuele LDs in drie verschillende en morfologisch verschillende gist soorten mogelijk. Voor onze kennis bestaan er geen vergelijkbare instrumenten voor de splijting gisten. De MATLAB-scripts die vereist zijn voorbeeld verwerking zijn opgenomen als aanvullende bestanden en zijn ook beschikbaar in de Figshare-repository (DOI 10.6084/M9. figshare. 7745738), samen met alle onbewerkte en verwerkte beeld-en tabelgegevens uit dit manuscript, gedetailleerde beschrijvingen van de CSV-uitvoerbestanden en R-scripts voor downstream data-analyse en visualisatie. De meest recente versie van de MATLAB-scripts is ook beschikbaar via GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis).

Succesvolle LD-analyse is grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de verkregen ruwe fluorescentie beelden. Voor optimale prestaties van de segmentatie algoritmen moeten schone glaasjes zonder stofdeeltjes worden gebruikt voor microscopie, de cellen moeten een monolaag vormen (het werkelijke aantal cellen per gezichtsveld is geen kritische parameter) en mogen geen groot deel van de dode cellen. Ook moet de z-stack Imaging licht onder en eindigen iets boven de cellen. Afhankelijk van de specifieke microscopische instellingen moeten gebruikers mogelijk enkele parameters aanpassen in de beeldverwerkings scripts (zoals "th" voor de drempelwaarde voor de achtergrond intensiteit van afbeeldingen). Hoewel de huidige methode afzonderlijke LDs in de gesegmenteerde celobjecten kan detecteren en beschrijven, produceert de werkstroom geen echte eencellige gegevens vanwege problemen met de geautomatiseerde scheiding van alle afzonderlijke cellen. In plaats daarvan wordt LD-inhoud per eenheid van celvolume gegeneraliseerd voor het hele voorbeeld gerapporteerd. Deze beperking kan de interpretatie van gegevens in analyses van heterogene celpopulaties belemmeren. Ook moet worden gezorgd bij het werken met cellen met gewijzigd transport van kleine moleculen (bijv. Efflux-pomp mutanten), omdat dit de intracellulaire BODIPY 493/503-concentratie en LD-kleuring kan beïnvloeden, zoals waargenomen voor de Nijl rode lipofiele kleurstof33 , 34.

Kleuring van het medium met de cel-ondoorstroombare Cascade blauwe fluorescerende dextran is een handige manier om cellen te onderscheiden van de achtergrond35, die kan worden toegepast op veel (zo niet alle) gist soorten. Het helpt ook bij het geautomatiseerd verwijderen van dode cellen uit de analyse, omdat deze blauw zullen worden bij vlekken. Elke stervende of zieke (en dus gedeeltelijk permeabel voor dextran) cellen gedetecteerd als levend kan worden verwijderd tijdens data analysestappen op basis van de "IntensityMedianBlue" waarde van de gedetecteerde celobjecten. In principe kan de hele workflow worden gebruikt om verschillende andere cellulaire structuren, zoals DNA Repair Foci, op te sporen, op voorwaarde dat de structuren kunnen worden geëtiketteerd met geschikte fluor Foren. De werkstroom moet ook van toepassing zijn op cellen van andere (gist) soorten, die het nut ervan verder verruimen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Karelsuniversiteit subsidies PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 en SVV 260310. We danken Ondřej Šebesta voor hulp met microscopie en ontwikkeling van de pijplijn voorbeeld analyse. We danken het ReGenEx Lab voor s. cerevisiae stammen, en Japonet en Hironori niki's Lab voor s. japonicus stammen. De ppc1-88 stam werd geleverd door het gist genetische hulpmiddel centrum Japan. Microscopie werd uitgevoerd in het laboratorium voor confocale en fluorescentiemicroscopie, gecofinancierd door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling en de staatsbegroting van de Tsjechische Republiek (Projectnr. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 en CZ. 2.16/3.1.00/21515).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) - Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
Pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
Standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
  2. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  3. Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
  4. Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
  5. Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).
  6. Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
  7. Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
  8. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
  9. Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
  10. Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
  11. Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
  12. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
  13. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
  14. Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
  15. Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
  16. Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
  17. Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
  18. Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
  19. Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
  20. Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
  21. Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
  22. Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
  23. Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
  24. Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
  25. Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
  26. Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
  27. Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
  28. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
  29. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
  32. Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
  33. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  34. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
  35. Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).

Tags

Immunologie en infectie probleem 149 neutrale lipide opslag fluorescentiemicroscopie kwantitatieve microscopie BODIPY 493/503 schizosaccharomyces pombe schizosaccharomyces japonicus Saccharomyces cerevisiae
Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Princová, J., Schätz, M.,… More

Princová, J., Schätz, M., Ťupa, O., Převorovský, M. Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing. J. Vis. Exp. (149), e59889, doi:10.3791/59889 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter