Summary
인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 연간 전염병과 간헐적 인 전염병을 일으키는 전염성 호흡기 병원체입니다. 여기서, 우리는 새로운 재조합 루시퍼라제 및 형광 발현 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 사용하여 생체 내에서 바이러스 감염을 추적하는 프로토콜을 기술한다. 이 접근법은 연구원에게 생체 내에서 IAV를 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 제공합니다.
Abstract
인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 중요한 건강 및 경제적 결과와 관련된 인간의 호흡기 질환을 일으킵니다. 다른 바이러스와 마찬가지로, IAV를 공부하는 것은 감염된 세포 및 / 또는 감염의 동물 모델에서 바이러스의 존재를 감지하기 위해 힘든 보조 접근법의 사용을 필요로한다. 이러한 제한은 최근 쉽게 추적 가능한 형광 또는 생체 발광(luciferase) 리포터 단백질을 발현하는 재조합 IAV의 생성과 함께 우회되고 있다. 그러나, 연구자들은 외래 서열을 포함하는 IAV 게놈의 제한된 용량으로 인해 형광 또는 루시퍼라아제 리포터 유전자를 선택하도록 강요받았다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 생체외 및 생체 내에서 IAV 감염을 용이하게 추적하기 위해 형광및 루시퍼라제 리포터 유전자를 안정적으로 발현하는 재조합 복제 유능한 바이-리포터 IAV(BIRFLU)를 생성하였다. 이를 위해, 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/34 H1N1(PR8)의 바이러스 성 비구조적(NS) 및 헤마글루티닌(HA) 바이러스 성 세그먼트는 각각 형광 성 금성 및 생물 발광 나노 루시퍼라아제 단백질을 인코딩하도록 변형되었다. 여기서, 우리는 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 IAV 감염의 마우스 모델에서 BIRFLU의 사용 및 두 리포터 유전자의 검출에 대해 설명한다. 특히, 우리는 기자와 바이러스 복제 의 식 사이의 좋은 상관 관계를 관찰했다. 분자 생물학, 동물 연구 및 이미징 기술의 최첨단 기술의 조합은 연구원에게 바이러스 호스트 상호 작용 및 역학의 연구를 포함하여 인플루엔자 연구를 위해이 도구를 사용할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 바이러스 감염. 중요한 것은, 다른 바이러스 세그먼트에서 2개의 외국 유전자를 발현하기 위하여 바이러스 게놈을 유전으로 변경하는 타당성은 이 접근을 사용하는 기회를 열어줍니다: (i) 새로운 IAV 백신의 발달, (ii) 재조합 IAV의 생성 다른 인간 병원체 감염의 치료를 위한 백신 벡터로 사용될 수 있다.
Introduction
인플루엔자 A 바이러스(IAV)는 정형재증소비리대 패밀리 1,2,3의단일 가닥 네거티브 센스 분할 RNA 바이러스이다. 세계보건기구(WHO)는 연간 3~500만 건의 인플루엔자 발생과 전 세계적으로 250,000명 이상의 사망자를 추정하고 있으며, 4,5,6. 특히 인플루엔자에 취약한 그룹은 노인, 면역손상개인, 어린이7,8,9,10,11을포함한다. 백신을 사용할 수 있고 바이러스 감염에 대한 가장 일반적이고 효과적인 개입을 나타내지만, IAV는 급속하게 진화하고 기존의 면역을탈출 할 수 3,12,13, 14세 , 15. 2009 년 전염병 H1N1 균주의 재출현과 병원성 IAV의 출현은 전 세계적으로 인간의 공중보건에 대한 지속적인 위협을 반복4,16.
전염병이나 전염병 동안 새로 고립 된 바이러스의 병원성과 투과성을 신속하게 결정하는 것이 중요합니다. 현재 바이러스를 검출하기 위해 이용 가능한 기술은 시간이 많이 걸리고 때로는 이러한 분석17,18,19,20의완료를 지연시킬 수 있는 힘든 접근법의 사용을 필요로 한다. 더욱이, 현재 바이러스성 희소한 안산은 발발의 사건 도중 필요할 수 있던 확장하기 어렵습니다. 마지막으로, 마우스, 기니 피그 및 페렛과 같은 감염의 검증된 동물 모델의 사용은 일상적으로 사용되며 인플루엔자 감염, 면역 반응 및 새로운 백신 및/또는 항바이러스제의 효능을 연구하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 이 모형은 실시간으로 바이러스성 역학을 관찰하는 무능력 때문에 제한적입니다; 이것은 바이러스 성 감염의 정적 화상 진찰에 연구 한계21,22,23,24,25. 이러한 공소사에 사용되는 동물은 또한 바이러스 하중을 결정하기 위해 안락사되고, 따라서 이러한 연구를 완료하는 데 필요한 동물의 수를 증가시킨다26. 이러한 모든 한계를 우회하기 위해 많은 연구자들은 바이러스 학적 검사를 가속화하고 생체 내 바이러스 부하 및 보급을 실시간으로 감지 할 수있는 재조합 복제 유능한 리포터 표현 IAV의 사용에 의존합니다26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. 중요한 것은, 이러한 리포터 발현 IAV는 감염33,42의세포 배양 및 동물 모델에서 야생형(WT) IAV와 유사하게 복제할 수 있다.
형광 및 생물 발광 단백질은 감도, 안정성 및 사용 용이성으로 인해 연구원이 일반적으로 사용하는 두 가지 리포터 시스템입니다. 또한 형광 및 생물 발광 단백질 검출 기술 43,44,45,46,47,48에 대한 엄청난 지원과 발전이 있습니다. . 형광 단백질과 루시퍼라제는 빛을 발할 수 있는 다른 성질을 가지며, 특히 흥분된 상태가생성되는 방식과 방출이 검출되는 방식이 43,44,45, 46,47,48. 형광 단백질은 먼저 에너지를 흡수함으로써 흥분되며, 이는 분자가 더 낮은 에너지 상태(43)로감소함에 따라 상이한 파장에서 빛으로 방출된다. 한편, 생물발광은 빛을 생성하기 위해 기질, 산소 및 때로는 ATP를 수반하는 화학적 열성반응으로부터 유래된다(45). 리포터 단백질의 이 2가지 모형의 변화하는 속성 때문에, 관심의 연구 결과에 따라 다른 것보다 어쩌면 더 유리한 것. 형광 단백질은 세포 국소화를 관찰하기 위해 널리 사용되는 반면,41,생체 내 신호는 부적절한 강도를 가지며 종종 살아있는 조직49에서자가형광에 의해 가려집니다. 따라서 연구자들은 살아있는 유기체에서 바이러스 역학을 평가하기 위해 luciferases에 의존하지만, 형광 단백질은 생체 내 연구50,51,52,53에선호될 수 있다. 형광성 단백질과 는 달리, 루시퍼라제는 생체 내 연구에 더 편리하며 비침습적 접근법26,27,28,29,30에 더 적합합니다. , 31세 , 32세 , 33세 , 34세 , 35세 , 36세 , 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 54. 궁극적으로, 연구의 유형에 따라, 연구원은 기능과 감도의 절충에 자신의 연구를 과목, 심각하게 자신의 판독으로 형광 또는 루시 퍼라제 기자 단백질중 하나를 선택해야합니다 재조합 리포터 바이러스의 유용성을 제한합니다. 더욱이, 형광 또는 루시퍼라제 시스템 및 바이러스성 복제 또는 보급을 이용한 다른 리포터 유전자의 발현 간의 상관관계에 관한 우려가 있으며, 이는 획득한 데이터의 해석을 위태롭게 할 수 있다. 리포터 표현 IAV.
우리는 동일한 바이러스 게놈55에서 형광 및 루시퍼라제 단백질 둘 다에 대해 인코딩하는 재조합 복제 유능한 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 생성함으로써 이러한 한계를 극복하였다(도 1). 여기서, 나노루크 루시퍼라제(Nluc)는 작고 밝은 생물발광 단백질(48)으로, 인플루엔자 A/푸에르토리코/08/1934 H1N1(PR8)24,33, 40,55,56,57. 또한, 자주 사용되는 단색 형광 단백질인 비너스는 비구조적(NS) 바이러스 분절32,33, 36,41,55에삽입하였다. BIRFLU는 형광 및 루시퍼라제 리포터 유전자 모두에 대해 인코딩하기 때문에, 리포터 단백질 신호는 시험관 내 또는 생체 내 바이러스 복제 및 보급을 결정하기 위해 판독으로 사용될 수 있다55. BIRFLU의 생성 및 생체외 또는 생체내 특성화에 관한 추가 정보는 최근 간행물55에서확인할 수 있다. BIRFLU는 새로운 형광-및 생물발광 계 미세중화 분석법55를통해 항바이러스 약물의 효과를 테스트하거나 항체를 중화시키는 데 사용될 수 있다. 더욱이, BIRFLU는 또한 감염(55)의 마우스모델에서 바이러스 역학을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 원고에서, 우리는 생체외에서 BIRFLU55를 특성화하는 절차와 생체 내 발광 이미징 시스템을 사용하여 마우스에서 BIRFLU 감염을 연구하는 방법을 설명합니다.
분자 생물학, 동물 연구 및 이미징 기술에 있는 최첨단 기술의 조합은, 바이러스 호스트 상호 작용의 연구 결과, 바이러스 감염의 역학을 포함하여 IAV 연구를 위해 BIRFLU를 사용하는 유일한 기회를 연구원을 제공합니다; IAV 감염의 치료 적 치료 또는 다른 병원체 감염의 치료를위한 백신 벡터로서의 IAV의 잠재적 사용에 대한 새로운 백신 접근법의 개발.
Protocol
마우스를 관련시키는 모든 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 로체스터 대학, 의학 및 치과 의과 대학에 기관 생물 안전위원회 (IBC)에 의해 승인되었습니다. 동물에서 수행 된 모든 실험은 국가 연구위원회58의실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 따릅니다. 로체스터 대학의 의학 및 치과 대학의 실험실 동물 의학 시설 의학과는 실험실 동물 관리 (AALAC) 국제 및 연방 및 주 법과 국립 보건원(NIH) 정책을 준수해야 합니다. 마우스와 함께 작업할 때 적절한 개인 보호 장비(PPE)가 필요합니다. 각 기관에서 이 원고에 설명된 실험을 수행할 때 유사한 정책 및 요구 사항을 구현해야 합니다.
1. 작은 척추 동물의 사용
- 5~7주 된 암컷 BALB/c 마우스를 구입하고 특정 병원균이 없는 조건하에서 동물 보호 시설에서 유지하십시오. 결정된 시설에 도착한 마우스는 동물이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 4-5일 동안 휴식을 취하십시오.
- IACUC 프로토콜에 따라 케이지당 최대 5개의 마우스를 배치합니다.
참고: 실험 결론에서, 동물이 죽임을 확인하기 위해, 마우스는 두 번째 물리적 인 방법이어야한다는 점을 고려하여 두 개의 승인 된 절차를 사용하여 안락사되었다. 본 연구에서, BIRFLU 및 생체 내 이미징을 이용한 마우스 감염 후, 동물은 2,2,2-트리브로모에탄올(TBE)의 치명적인 용량으로 안락사되고, 우리가 이전에 나타낸 바와 같이 물리적 이차 적인 방법으로 간 정맥을 절단하여23.
2. 생물 안전성
참고: 이 원고에서, BIRFLU는 일반적인 마우스 적응 실험실 IAV 균주23,32,33,56인인플루엔자 A/푸에르토리코/08/34 H1N1(PR8)의 중추에서 생성되었다. 바이러스는 앞서 설명한 플라스미드 기반 역유전학 접근법 및 생성에 대한 완전한 설명을 사용하여 생성되었으며, BIRFLU의 생체외 및 생체내 특성화는 당사의 최근 간행물55에서확인할 수 있다. IAV 감염 (시험관 내 또는 생체 내)을 관련시키는 모든 절차는 생물 안전 성 수준 (BSL)-2 조건 하에서 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되었다.
주의 사항: 적절한 생물 안전 성 수준은 생물 안전 성 위험 평가에 따라 결정되어야합니다. 생물 안전 위험 평가 수행 및 효과적인 생물 안전 억제 확립에 대한 추가 정보는 실험이 수행될 기관과 상의해야 합니다.
- 모든 실험 절차를 수행하기 전과 후에 70% 에탄올 또는 이산화염소 소독제로 생물 안전 성 캐비닛을 청소하십시오. 마우스 작업의 경우 모든 해부 물질 (가위, 해부 집게 등)과 Dounce 균질화제를 사용 전후에 살균하십시오.
- 적절한 IBC 및 IACUC 지침에 따라 절차 중에 생산된 모든 생물학적 물질을 폐기하십시오.
3. 비르플루의 체외 특성화 (그림 2)
참고: 모든 버퍼 및 미디어 컴포지션은 표 1을 참조하십시오.
- 형광에 의한 단백질 발현 분석 (그림2A)및 간접 면역 형광 (그림2B)
- 감염 1일 전, 매딘-다비 개 신장(MDCK)을 함유한 종자 24-웰 플레이트를 조직 배양 배지에서 상피 세포(1 x 105 세포/well, 삼중)로 하고 5% CO2로 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 유지한다. 모의 감염 및 BIRFLU 감염 세포 모두에서 선택된 모든 항체를 평가하기에 충분한 우물을 준비합니다.
참고: 우리는 바이러스 성 감염을 시작하기 전에 단층을 확인하기 위해 가벼운 현미경으로 세포를 시각화하는 것이 좋습니다. 감염 시점까지 MDCK 세포의 90% 동체층이 권장됩니다. - 감염 매체에서 WT 또는 BIRFLU IAV의 희석을 준비하고 감염 매체의 최종 부피에서 세포 당 0.1 플라크 형성 단위 (PFU)의 감염 (MOI)의 복합성으로 시드 된 MDCK 세포를 감염시.
- 3.1.1단계에서 조직 배양배지를 제거하고 1x 인산완충식염수(PBS)로 MDCK 세포를 2회 세척한다. 3.1.2에서 바이러스 희석을 MDCK 세포에 추가하고 바이러스 흡착을 허용하기 위해 실온에서 1 시간 동안 흔들리는 플랫폼에 플레이트를 놓습니다.
참고: 모의 감염 세포는 바이러스가 없는 경우에만 감염 매체로 배양됩니다. - 바이러스 흡착 후(단계 3.1.3), 흡인에 의해 바이러스 성 접종을 제거하고 TPCK 처리 트립신의 1 μg/mL을 포함하는 감염 후 매체의 1 mL을 각각 잘 추가한다. 33°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 18시간 동안 세포를 배양한다.
- 감염 의 18 시간 후, 24 웰 플레이트 (3.1.4)에서 조직 배양 상판을 제거하십시오. 실온에서 20 분 동안 0.25 mL / 고정 / 투과 용액으로 세포를 수정하고 투과하십시오.
참고: 포름알데히드 노출을 방지하기 위해 연기 후드에 고정/투과 솔루션을 준비합니다. - 3.1.5 단계에서 고정 / 투과 용액을 제거하고 1 x PBS로 세포를 두 번 씻고 실온에서 1 시간 동안 차단 용액을 0.25 mL / 웰로 세포를 배양하십시오.
참고: 다음 단계로 진행하거나 밤새 4°C에서 차단 용액에 세포를 저장한다. - 차단 용액(단계 3.1.6)을 제거하고 IAV 핵단백질, NP(HB-65) 또는 NLuc에 대한 토끼 폴리클로날 항체(pAb)의 1:1,000 희석에 대해 마우스 단일클론 항체(MAb)의 0.25 mL/well(1 μg/mL)을 추가합니다(재료 표참조), 둘 다 항체 희석 액 (1x PBS, 2.5 % BSA)에서 희석하고 37 °C에서 1 시간 동안 세포를 배양합니다.
- 3.1.7 단계에서 1 차 항체를 제거하고 세포를 1 x PBS로 세 번 세척하고 텍사스 적색 공액 항 마우스 또는 항 토끼 이차 항체의 0.25 mL / 웰로 배양하십시오 (재료 표참조) 항체에서 1 :200 희석 희석 용액.
참고: 세포 핵은 동일한 이차 항체 용액에 0.5 μg/mL의 4',6'-디아미디노-2-페니린들레(DAPI)를 첨가하여 동시에 염색될 수 있다. 암흑에서 37°C에서 1시간 동안 세포를 배양한다. 다른 형광단과 공액된 다른 이차 항체가 사용될 수 있다. - 이차 항체 및 DAPI를 3.1.8단계에서 제거하고, 세포를 1x PBS로 3회 세척한다. 세척 후, 0.25 mL/well 의 1x PBS에 세포를 둡니다.
- 적절한 형광 필터를 사용하여 감염된 세포로부터 금성 및 Nluc 리포터 발현 및 NP를 검출하기 위해 형광 현미경의 단계에 플레이트를 놓습니다. 형광 현미경 (20 배배)를 사용하여 이미지를 캡처하고 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 병합 (그림2A,B).
- 감염 1일 전, 매딘-다비 개 신장(MDCK)을 함유한 종자 24-웰 플레이트를 조직 배양 배지에서 상피 세포(1 x 105 세포/well, 삼중)로 하고 5% CO2로 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 유지한다. 모의 감염 및 BIRFLU 감염 세포 모두에서 선택된 모든 항체를 평가하기에 충분한 우물을 준비합니다.
- Nluc 활성(도2C)및 바이러스 복제(도2D)를분석한다.
- 감염 1일 전, MDCK 세포(2 x 105세포/well, 삼중항)를 함유한 시드 12-웰 플레이트는 5% CO2를 가진 37°C 인큐베이터에서 조직 배양 배지를 사용하여 감염 시까지 약 90% 수렴에 도달한다.
참고: 감염 전에 현미경으로 세포를 확인하여 MDCK 세포의 단층을 확인하십시오. - 감염의 날은 0.5 mL/well에서 0.001 PFU의 MOI로 삼중질로 MDCK 세포(단계 3.2.1.)를 감염시키기 위해 감염 매체에서 WT 및 BIRFLU 바이러스의 희석을 준비한다. 조직 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 MDCK 세포를 두 번 세척합니다.
- MDCK 단층체에 바이러스 희석을 추가하고 흔들 플랫폼에서 1 시간 동안 실온에서 바이러스 흡착을 허용합니다. 바이러스 흡착 후, 바이러스 접종을 제거하고 TPCK 처리 트립신의 1 μg/mL을 포함하는 감염 후 매체의 1.5 mL를 각각 잘 추가합니다. 감염된 세포를 33°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에 인큐베이션하고 3.2.4단계에서 지시된 시점에서 상피제를 수집한다.
- 24, 48, 72, 및 96h 포스트 감염(p.i.)에서 각 웰로부터 조직 배양 상급제의 150 μL을 수집하고 샘플을 -80°C에서 미세원심분리튜브에 저장하여 Nluc 검역및 바이러스 적정을 수행하였다.
- Nluc 활동 분석 을 수행 하려면 제조업체의 표시를 따르십시오. 먼저, -80°C(단계 3.2.4)에 저장된 조직 배양 상상을 얼음 위에 해동한다.
참고: 제조업체의 권장 사항을 참조하고 필요한 경우 분석방법을 최적화하십시오. - 희석 완충액으로 Nluc 기판을 1:50 희석하여 루시퍼라아제 분석 용액(재료 표참조)을 준비한다. 루시퍼라아제 분석법을 위한 백색 평바닥 96-well 마이크로플레이트에서, 25 μL의 루시퍼라아제 분석액을 수집된 조직 배양 상수 샘플의 10~25 μL과 혼합한다. 발광계(도2C)를사용하여 발광을 측정하기 전에 2-3분 동안 혼합물을 배양하였다.
참고: 조직 배양 에 있는 감염성 바이러스 입자의 존재는 앞서 설명한 바와 같이 형광 면역 초점 분석 (금성) 또는 간접 면역 형광 (바이러스 성 항원 염색)에 의해 결정된다23,32, 33,56. - 바이러스 적정 을 하루 전에, 96 웰 플레이트에 종자 MDCK 세포 (2 x 104 세포 / 잘, 삼중)조직 배양 배지와 세포가 5 % CO2와 함께 37°C에서 설정 인큐베이터에서 감염의 시간에 의해 90 % 합류에 도달 할 수 있도록.
- 얼음 상에서 해동시킨 조직 배양 상급 샘플을 사용하였다(단계 3.2.4.). 새로운 96 웰 플레이트의 각 웰에 감염 배지 90 μL을 추가한 다음 해동된 조직 배양 상판(단계 3.2.4)의 10 μL을 제1 웰(행 A)에 추가합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 10 μL을 A행에서 행 B로 혼합하고 전송합니다.
참고: 이 절차는 마지막 행(H)까지 반복되어야 합니다. 우리는 바이러스 적당의 정확한 측정을 위해 삼중 항적에 바이러스 적정을 수행하는 것이 좋습니다. - 96웰 플레이트(단계 3.2.7)에서 MDCK 세포로부터 조직 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 2회 세척한다. MDCK 세포를 함유하는 96웰 플레이트에서 각각의 웰에 바이러스 희석(단계 3.2.8)을 함유하는 복제본 96웰 플레이트의 상피 희석액의 50 μL을 첨가한다.
- 바이러스 흡착을 허용하기 위해 실온에서 1 시간 동안 흔들 플랫폼상에서 96 웰 플레이트를 배양합니다. 바이러스 흡착 후, 접종을 제거하고 TPCK 처리 트립신의 1 μg / mL을 포함하는 감염 후 매체의 100 μL / 웰을 추가하십시오. 5% CO2를 가진 33°C 인큐베이터에서 12시간동안 감염된 세포를 배양한다.
- BIRFLU는 금성을 표현하기 때문에, 감염된 세포의 수는 형광 현미경을 사용하여 직접 계산될 수 있습니다. 대안적으로, 바이러스 역가는 바이러스 성 단백질23,56,57,59에대하여 항체를 사용하여 상술한 바와 같이 간접 면역형광에 의해 결정될 수 있다. 후자의 경우, 섹션 4.4에 기재된 바와 같이 안티 NP mAb HB-65를 사용하여 세포 및 얼룩을 고치고 퍼메아빌화하는 것을 진행한다.
- 수식을 사용하여 형광 형성 단위(FFU)/mL의 수를 계수하여 바이러스 역가를 결정합니다: ((FFU 수 x20 x 1/희석(도 2D).
- 감염 1일 전, MDCK 세포(2 x 105세포/well, 삼중항)를 함유한 시드 12-웰 플레이트는 5% CO2를 가진 37°C 인큐베이터에서 조직 배양 배지를 사용하여 감염 시까지 약 90% 수렴에 도달한다.
4. 비르플루의 생체 내 특성화(그림3 및 그림4)
- 마우스 감염
참고: 마우스의 비강 내 감염은 앞서 설명한대로 23을수행하였다. 감염의 마우스 모델을 사용하여 생체 내 IAV 감염의 보다 상세한 프로토콜을 위해, 우리는 이전 간행물23과관련된 비디오를 보는 것이 좋습니다. 이 섹션에서는 BIRFLU를 가진 마우스 감염에 필요한 단계만 요약합니다.- 마우스의 건강과 전반적인 외모를 평가하기 위해 마우스를 검사합니다. BIRFLU의 희석을 1x PBS로 준비하여 총 부피 30 μL/마우스에서 BIRFLU의 1 x 106 PFU로 마우스를 접종합니다. 마우스 가 접종 될 때까지 얼음에 바이러스를 유지합니다.
참고: 모의 감염 (1x PBS) 마우스는 화상 진찰을 위한 내부 통제로 필요합니다. BIRFLU에 감염된 동물과 는 다른 케이지에 모의 감염된 마우스를 놓습니다. - 5-7주 된 암컷 BALB/c 마우스를 복부 오른쪽의 2/3에 바늘을 삽입하여 트리브로모에탄올(TBE)의 240-250 mg/kg으로 신상으로 마취시. 그런 다음 마우스를 케이지로 되돌리고 약 5분 동안 기다립니다.
참고: 주 사용 진정 제는 생체 내에서 인플루엔자 감염에 대 한 흡입 된 진정 제를 통해 권장 됩니다., 후자는 기도 상피에 의해 바이러스의 행동 및 통풍 구 를 수정할 수 있습니다. 더욱이, 그(것)들은 또한 폐의 현지 면역 반응에 영향을 미치고 감염된 마우스의 생체 내 화상 진찰을 방해할 수 있습니다. 마지막으로, 흡입된 진정제는 감염한 동물의 생체 내 화상 진찰을 위한 문제가 될 효력의 기간을 감소시켰습니다. - 제조된 BIRFLU 희석의 30 μL로 마우스를 내로 접종하였다. 마우스가 케이지로 되돌리기 전에 제대로 호흡하고 있는지 확인합니다.
- 마우스의 건강과 전반적인 외모를 평가하기 위해 마우스를 검사합니다. BIRFLU의 희석을 1x PBS로 준비하여 총 부피 30 μL/마우스에서 BIRFLU의 1 x 106 PFU로 마우스를 접종합니다. 마우스 가 접종 될 때까지 얼음에 바이러스를 유지합니다.
- BIRFLU에 감염된 마우스의 생물 발광 모니터링 (그림4A)
참고: 이 원고 기자발현에서 은루크 또는 비너스의 발현과 BIRFLU에 감염된 마우스의 폐에서의 바이러스 복제는 감염 후 3일에 결정된다. 그러나, 생물 발광 화상 진찰의 본질은 각 실험 적인 시간 점 동안 그(것)들을 안락사할 필요 없이 개별 BIRFLU 감염한 동물에 있는 Nluc 표현의 반복한 감시를 허용합니다. 이소플루란 마취 매니폴드가 있는 생체 내 이미징 시스템은 기재된 실험 절차를 수행하는 데 필요합니다. 이미지 수집 및 데이터 분석에 사용되는 이미징 기기 및 이미지 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.- 생물 발광 신호를 개선하기 위해 마우스 가슴을 면도. 이미징 소프트웨어를 열고 초기화를누릅니다. 그런 다음 이미징 모드를 생물 발광으로 설정, 자동 저장, 자동 노출 시간, 필터 열기 등을 포함하여 사용할 매개 변수를 설정합니다.
- 기계가 완전히 초기화되면 이소플루란 마취 시스템을 켭니다. 마취 실에 동물을 놓습니다. 마우스는 산소 가스와 기화 된 1-2 % 이소플루란의 혼합물로 동시에 가볍게 마취됩니다.
- 일단 마우스가 마취되면, 22 G 바늘을 가진 주사기를 사용하여 레트로 궤도 경로를 통해 1x PBS (최종 부피 100 μL/마우스)에서 1:10 희석된 Nluc 기질(재료 표참조)을 투여한다.
- Nluc 시약 투여 직후, 이미징 기구에 동물을 가슴이 위로 향하고 매니폴드 콘 내부에 주전자를 두어 이미징 중에 동물을 마취상태로 유지합니다. 이미저 문을 닫은 직후 소프트웨어 프로그램(그림4A,상단)에서 획득을 클릭합니다.
- 이미징 후, 마우스를 케이지로 돌려 완전히 회복하고 이소플루란 기화기를 끌 때까지 모니터링합니다. 이어서, 마우스 폐의 생체내 영상을 진행하여 비너스 리포터 유전자 발현을 평가하였다(섹션 4.3).
- 이미징 소프트웨어 도구를 사용하여 획득한 생물 발광 데이터를 분석합니다. 도구 ROI (관심 영역)를 활용하여 특정 신호를 지정하고 관심 영역 (일반적으로 가슴 주위)에서 플럭스 측정을 수행합니다 (그림4A, 아래). ROI 모양은 관련이 없지만 일반적으로 전체 신호 확산 영역을 캡처하는 것이 좋습니다.
- 측정을클릭합니다. 광자에서 생물 발광을 평가하는 것은 다른 파라미터 또는 이미징 기기에서 제공하는 출력 측정과 비교할 수 있는 절대 적인 광자 방출 측정을 제공하기 때문에.
- BIRFLU에 감염된 마우스의 형광 분석(그림 3 및 그림 4B)
- 앞서 설명한바와같이 생체내 이미징 후 마우스 폐를 수집한다 23.
- 간단히, TBE의 치명적인 복용량으로 마우스를 안락사 (500 mg/kg). 절개 부위를 70 % 에탄올로 소독하십시오. 메스로 흉골에서 복부 기저부로 절개 한 다음 절개 아래에서 가위로 옆으로 자른다. 다음으로, 동물을 출혈시키기 위해 간 정맥(제2 물리적 안락사 방법)을 잘라낸다.
참고: 화상 진찰 도중 높은 배경 신호를 피하기 위하여는, 폐에 있는 혈액의 양을 극소화하는 것이 중요합니다 (아래 참조).
- 간단히, TBE의 치명적인 복용량으로 마우스를 안락사 (500 mg/kg). 절개 부위를 70 % 에탄올로 소독하십시오. 메스로 흉골에서 복부 기저부로 절개 한 다음 절개 아래에서 가위로 옆으로 자른다. 다음으로, 동물을 출혈시키기 위해 간 정맥(제2 물리적 안락사 방법)을 잘라낸다.
- 등도 의 자세로 마우스를 놓고, 흉막을 잘라 늑골 케이지를 열고 가위를 사용합니다. 그 후, 집게로 폐를 부드럽게 잡고 있는 동안 기관의 끝을 가위로 잘라서 폐를 제거하십시오.
- 1x PBS의 2 mL로 6 웰 플레이트에 폐를 놓고 1 x PBS로 폐를 세 번 씻습니다.
참고: 시료 간의 오염을 방지하려면 각 동물 간에 해부 도구를 청소하고 소독하십시오.
- 1x PBS의 2 mL로 6 웰 플레이트에 폐를 놓고 1 x PBS로 폐를 세 번 씻습니다.
- 이미지 수집 소프트웨어를 클릭하여 초기화를 시작하고 이미징 모드를 형광으로 설정, 자동 저장, 자동 노출 시간, 여기(500nm) 및 방출(540nm) 필터를 포함한 이미징 매개변수를 설정합니다.
- 기계가 초기화되면 폐를 검은 색 배경 트레이에 놓고 조직이 서로 분리되도록하고 트레이를 이미저에 소개한 다음 이미저 문을 닫은 후 이미징 시스템 프로그램에서 획득을 클릭합니다. 그림 4B,상단).
- 이미징 후, 조직을 즉시 제거하고 시료가 같은 날 처리되는 경우 얼음 (4 °C)에 저장; 또는 시료가 나중에 다른 날에 처리될 경우 - 80 °C에 저장하기 전에, 신속하게 동결 튜브와 드라이 아이스에.
- 이미지 처리를 위해 ROI 도구를 선택하고 각 개별 폐 주위에 ROI를 그립니다. 측정을클릭합니다. 이어서, 생성된 평균 복사 효율 측정을 사용하여, 모의 감염된 마우스로부터 값을 뺍니다(도4B,하단).
참고: BIRFLU의 경우 Nluc 및 금성 발현 수준과 신호 분포의 양호한 상관 관계가 있습니다. 따라서, 동일한 동물로부터 Nluc(전체 마우스) 및 금성(폐) 발현을 분석하고, 동일한 배향을 유지하는 것이 중요하다.
- 앞서 설명한바와같이 생체내 이미징 후 마우스 폐를 수집한다 23.
- 마우스 폐에서 BIRFLU 복제의 평가 (그림3 및 그림 4C)
- 앞서 설명한 바와 같이 플라크 분석에 의한 바이러스 적정을 위한 마우스 폐를 균질화하는23.
- 폐를 차가운 감염 매체 1 mL로 Dounce 균질화제에 넣습니다. 완전히 분해 될 때까지 실온에서 1 분 동안 유봉으로 폐를 균질화하고 4 °C의 멸균 튜브에 샘플을 저장합니다.
- 샘플을 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 멸균 튜브에서 상류를 수집합니다. 같은 날에 사용하거나 -80 °C에서 동결하여 나중에 바이러스 성기를 평가하기 위해 샘플을 얼음에 보관하십시오.
참고: 새로운 Dounce 균질화는 각 폐 샘플에 사용되어야합니다. - 플라크 분석, 바이러스 적정을 수행하기 전날, 조직 배양 배지에서 MDCK 세포(5 x 105 세포/웰)를 가진 종자 6웰 플레이트를 수행하였다. 세포를 37°C에서 5% CO2로 밤새 배양하여 다음날 90% 합류에 도달합니다. 감염 전에 세포가 가벼운 현미경으로 단층을 형성하는지 확인하십시오.
- 감염 매체에서 균질화된 샘플(단계 4.4.1)으로부터 상급자의 1:10 직렬 희석을 준비한다. 감염 매체의 540 μL로 microcentfuge 튜브를 준비하고, 균질화된 폐 샘플에서 60 μL을 첫 번째 튜브에 추가하고, 위아래로 파이펫팅하여 혼합한 다음 새로운 팁을 사용하여 다음 튜브로 60 μL을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다. 이 직렬 희석 프로세스를 마지막 희석까지 반복합니다.
참고: 우리의 경험에서 7 희석은 감염된 마우스의 폐에서 플라크 분석에 의해 바이러스 성 역가를 결정하기에 충분하다. - MDCK 세포(단계 4.4.3)를 1x PBS로 2회 세척하고 연속적으로 희석된 시료의 500 μL을 6웰 플레이트에서 각각 잘 이송한다. 플레이트를 흔들 플랫폼에 놓고 실온에서 1 시간 동안 바이러스 흡수가 발생할 수 있습니다.
- 1 시간 의 바이러스 흡수 후, 바이러스 접종을 제거하고, TPCK 처리 트립신1 μg / mL을 포함하는 오버레이 배지의 2 mL / well을 추가한 다음 3 일 동안 5 %CO2 미만의 33 °C에서 세포를 배양하십시오.
- 감염된 세포(4.4.6단계)를 실온에서 1x PBS에서 2시간 동안 1mL/웰에 희석한 후, 중첩 매체를 조심스럽게 제거하고 각 우물에 1mL의 1mL를 추가합니다. 금성의 시각화를 위해 형광 검출을 위한 이미징 시스템으로 6웰 플레이트를 이미지화합니다.
참고: 바이러스 성 플라크는 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 색칠 할 수 있습니다 (재료 표참조). - Nluc 발현을 평가하기 위해, 항-Nluc pAb를 사용하여 면역 염색을 하여 바이러스 성 플라크를 시각화한다. 이를 위해 1x PBS를 제거하고 실온에서 15 분 동안 0.5 mL / 웰의 투과 솔루션을 사용하여 세포를 투과합니다.
- 투과 용액을 제거하고 1 x PBS로 세포를 세 번 씻고 실온에서 1 시간 동안 차단 용액0.5 mL / 웰로 차단하십시오.
- 4.4.9 단계에서 차단 용액을 제거하고 37 °C에서 1 시간 동안 희석 용액에서 1:1,000을 희석 한 pAb 항 Nluc의 0.5 mL / well로 세포를 배양합니다.
- Nluc 표현 플라크의 시각화에 대한 제조업체의 권고에 따라 ABC 알칼리성 포스파타제 키트 및 DAB 퍼옥시다아제 기판 키트를 사용합니다.
- 간단히, 1x PBS로 4.4.10에서 세포를 세 번 세척하고 37 °C에서 1 시간 동안 생체 용 항 토끼 이차 항체의 0.5 mL / 웰로 배양하십시오.
- 이차 항체를 제거하고, 세포를 1x PBS로 3회 세척하고, 37°C에서 1시간 동안 ABC 용액으로 배양한다. 1x PBS로 세포를 세 번 세척하고 DAB HRP 기판 키트로 바이러스 성 플라크를 시각화합니다. 종래의 스캐너를 사용하여 면역 염색된 플라크를 스캔합니다.
참고: 면역 염색을 위한 그밖 유사한 키트는 이용될 수 있었습니다.
- 실온에서 1 시간 동안 크리스탈 바이올렛 용액으로 바이러스 플라크를 염색하십시오. 크리스탈 바이올렛을 버리고, 접시를 물로 세 번 씻고, 접시를 건조시키고, 접시를 다시 스캔하십시오.
- 바이러스 성기를 결정하려면 크리스탈 바이올렛 염색 후 드러난 플라크를 계산하십시오. 기존의 스캐너를 사용하여 플라크를 스캔합니다. mL당 플라크 형성 단위(PFU)(PFU/mL)로 바이러스 적규기를 계산합니다.
- 생체 내에서 BIRFLU 안정성을 평가하기 위해, 크리스탈 바이올렛 염색 플라크(감염성 바이러스 수, 4.4.12단계)의 수를 계산하여 리포터 발현 바이러스의 백분율을 계산하고 금성 및 Nluc 발현 플라크의 수와 비교합니다. 각각 4.4.7 단계와 4.4.11 단계)를 참조하십시오.
- 샘플을 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 멸균 튜브에서 상류를 수집합니다. 같은 날에 사용하거나 -80 °C에서 동결하여 나중에 바이러스 성기를 평가하기 위해 샘플을 얼음에 보관하십시오.
Representative Results
시험관 내 BIRFLU의 생성 및 특성화(그림 1 및 그림 2)
두 개의 상이한 리포터 유전자(BIRFLU)를 발현하는 재조합 복제-유능한 IAV는 최첨단 분자 생물학 및플라스미드 계 역유전학 기술을 사용하여 시공되었다(도 1). 여기서, 우리는 그것의 작은 크기, ATP 독립성, 더 큰 강렬 및 최적화된 기판48,60을포함하여 그밖 luciferases에 비해 몇몇 이점 때문에 Nluc를 사용하기로 결정했습니다. Nluc는 Ha의 개방 판독 프레임(ORF) 앞에서 돼지 테초바이러스(PTV) 2A 절단 부위(2A)를 이어서 IAV PR8의 HA세그먼트로 복제하였다(도 1). HA의 ORF는 원래의 포장 신호를 제거하고 가능한 재조합을 피하기 위해 자동 돌연변이를 포함했다. 완전한 HA 패키징 신호는 동일한 바이러스 RNA 세그먼트로부터의 비리온 및 Nluc 및 HA 발현에 변형된HA 세그먼트의 적절한 혼입이 허용되도록 Nluc 의 앞에 추가되었다(도 1). 또한, 형광 단백질 비너스는 단일 전사체32, 36,41,54에서두 개의 바이러스 성 단백질 NS1 및 NEP를 인코딩하는 변형된 IAV PR8 NS 세그먼트로 복제되었다. 57. 이를 위해, 비너스는 NS1의 C 단말에 융합되었고 전체 신천ORF는 NS1-비너스와 신천시 서열 사이에 배치된 PTV 2A분열 부위의 하류를 복제하였다(도 1). 궁극적으로, 이들 2개의 변형된 HA 및 NS 바이러스 성 플라스미드 컨스트럭트들은 BIRFLU를 생성하기 위해IAV PR8 역유전학 플라스미드의 나머지 부분과 조합하여 사용되었다(도 1). BIRFLU의 생체외 및 생체내 특성화는 이전에55에기재되어 있다.
도2에서, 우리는 형광 및 간접 면역형광 접근법을 사용하여 금성, Nluc 및 NP 발현 수준을 결정함으로써 시험관 내 BIRFLU을 특징으로 한다(도2A,B). MDCK 세포의 동시 단층은 WT 또는 BIRFLU PR8 바이러스로 모의 감염 또는 감염(MOI 0.1)을 하였고, 감염 후 18시간에서, 금성 발현은 형광 현미경 검사법을 사용하여 직접 평가하였다(도2A,B). Nluc(도 2A)및 NP (도2B)발현은 각 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 간접 면역 형광에 의해 가시화되었다. 예상대로, 비너스 및 Nluc 발현은 WT PR8 바이러스에 의해 감염된 세포가 아닌 BIRFLU에 감염된 세포에서만 검출되었다. 또한, 간접 면역형광 현미경 검사법은 WT 및 BIRFLU PR8 감염 세포 모두에서 NP 발현을 밝혀냈습니다. 모의 감염 세포에서 예상대로 금성, Nluc 또는 NP의 발현이 검출되지 않았다(도A,B).
시험관내에서 Nluc 발현 수준을 평가하기 위해, MDCK 세포는 WT 또는 BIRFLU PR8 바이러스와 Nluc 활성을 감염시키고 조직 배양 서식탄에서 24, 48,72 및 96h 감염 후(도 2C)로 평가하였다. BIRFLU에 감염된 MDCK 세포의 조직 배양 과장제에서 Nluc활성만 검출되었다(도 2C). 조직 배양 에서의 Nluc 활성은 96 h 후 감염에서 더 높은 발현 수준으로 감염 후 24 시간 초기에 검출되었으며, 아마도 바이러스 감염 방출 중에 유도된 세포병증 효과(CPE)가 Nluc 단백질을 유지했기 때문일 것입니다. 셀안으로 들어갑니다. 배양된 세포에서 BIRFLU의 적합성을 평가하기 위해, WT 및 BIRFLU PR8 바이러스의 성장 역학도 평가하였다(도2D)조직 배양 에 감염성 바이러스의 존재는 면역 초점 분석(도2D)에 의해 결정되었다. ). 특히, BIRFLU 복제 역학은 WT PR8 바이러스의 그것과 비교되었다, BIRFLU 복제는 약간 지연되고 WT PR8와 같은 바이러스 성 역가에 도달하지 않았지만. 그러나, BIRFLU는 5 x 107 PFU/mL(도2D)의역가에 도달할 수 있었고, 이는 바이러스 게놈에서 두 개의 리포터 유전자의 발현이 MDCK 세포에서 BIRFLU 복제를 현저하게 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
마우스에서 BIRFLU 감염 추적(그림3 및 그림 4)
도 3은 IAV 감염의 마우스 모델에서 BIRFLU 역학의 평가를 위한 개략적 흐름 도표이다. 5-7주령 암컷 BALB/C 마우스는 1x PBS로 모의 감염되었거나 비르플루의 1 x 106 PFU에 감염되었다. 감염 후 3일에서, 마우스는 이소플루란으로 마취한 다음, Nluc 기판을 레트로 궤도로 주입하였다. 모든 마우스를 IVIS 계측기에 즉시 배치하고 Nluc 신호를 IVIS를 사용하여 생체 내에서 평가하였다. 다음으로, 마우스를 안락사시키고 폐를 수확하였다. 절제된 폐는 생체 내 이미저를 사용하여 생체 내 발현을 통해 형광 강도를 결정하기 위해 생체 내 생체 내를 분석한 후 분석되었다. 마지막으로, 마우스 폐를 균질화하고, 바이러스 성역자 및 안정성은 플라크 분석에 의해 결정되었다. 플라크는 금성의 직접적인 형광에 의해, Nluc에 특이적인 항체를 사용하여 면역 염색및 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 평가되었다.
이전에 설명된 복제 유능한 리포터-발현 IAv는 바이러스 감염 및 복제를 위한 대리로서 형광 또는 생물 발광 단백질 중 가장 빈번하게 단일 리포터 유전자를 발현한다. 그러나, BIRFLU는, 바이러스 감염 시 두 가지 유형의 리포터 유전자를 발현할 수 있다. BIRFLU 감염 후 생물 발광 (생체 내 이미징)과 형광 (생체 내 이미징) 사이의 상관 관계를 평가하기 위해, 5-7 주 된 여성 BALB / c 마우스는 1x PBS로 모의 감염되거나 BIRFLU (106 PFU)로 접종했습니다. . Nluc 활성(도4A)은생체내 이미징 기기를 사용하여 감염 후 3일째에 레트로 궤도에서 주사된 Nluc 기판을 투여하여 평가하였다. 우리는 이전 연구 결과에 의하여 IAV 복제가 PR8를 포함하는, 일 2와 4 감염 후24,54사이에서 피크를 표시했기 때문에 3 일째에 생물 발광을 평가하기로 결정했습니다. 생물 발광을 모니터링하고 (도4A,상단) 평균 총 플럭스 (플럭스 (로그10 p/s)(도4A,하단)를 계산하는 데 사용하였다. 예측된 바와 같이, BIRFLU로 접종된 마우스는 높은 생물 발광 활성을 보였지만 모의 감염된 마우스에서는 신호가 검출되지 않았다. 그 후, 감염된 마우스의 폐를 수확하고 금성 발현을 생체내 영상(도4B,상단)을 사용하여 평가하였다. 더욱이, 형광 평균 복사 효율을 계산하였다(도4B,하단). 절제된 마우스 폐는 또한 생체 내에서 BIRFLU의 바이러스 적시 및 유전적 안정성을 결정하기 위해 균질화되었다(도4C,D). BIRFLU의 유전적 안정성은 마우스 폐 및 형광 현미경 검사법(비너스, 상부), 면역 염색(Nluc, middle) 및 크리스탈 바이올렛 염색(아래)으로부터 분리된 바이러스를 이용하여 플라크 분석법을 통해 분석하였다. 비르플루는 마우스 폐로부터 회수하여 플라크를 형성할 수 있었고두 리포터 유전자를 안정적으로 발현하였다(도 4C). 특히, 우리는 바이러스 복제와 생물 발광과 형광 신호 사이의 좋은 상관 관계를 관찰.
도 1: IAV PR8 WT 및 BIRFLU 비리온 구조 및 게놈 세그먼트의 개략적 표현. IAV는 헤마글루티닌(HA; 검정) 및 뉴라미니다아제(NA; 블루)를 함유하는 지질 이중층으로 둘러싸여 있다. IAV는 8개의 단일 가닥, 음의 감각, RNA 세그먼트(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS)를 포함합니다. 각 바이러스 성 세그먼트는 3'및 5'끝 (블랙 박스)에서 비 코딩 영역 (NCR)을 포함합니다. 또한 바이러스(v)RNA의 3' 및 5' 말단에는 포장 신호가 있으며, vRNA를 초기 비리온(흰색 상자)으로 효율적으로 캡슐화합니다. IAV PR8 HA 및 NS 바이러스 성 세그먼트 및 제품은 검은색으로 표시됩니다. Nluc, 금성 및 PTV 2A의 시퀀스는 각각 빨간색, 녹색 및 줄무늬 상자로 표시됩니다. 비르플루에서 각각 Nluc 및 금성으로 표현되는 변형된 HA 및 NS 세그먼트의 개략적 표현도 표시된다. 이 수치는 노갈레스 외55에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 비르플루의 체외 특성화. (A, B) 직접 형광 및 면역 형광에 의한 단백질 발현 분석. MDCK 세포는 PR8 WT 또는 BIRFLU 바이러스로 모의 감염 또는 감염(MOI 0.1)하였다. 감염된 세포는 직접 형광 현미경검사법에 의해 금성 발현을 직접 시각화하고 Nluc(A)및 바이러스 성 NP(B) 특이적 항체 및 간접 면역형광을 사용하여 발현을 시각화하기 위해 감염 후 18시간에서 고정하였다. 핵을 DAPI로 염색시켰다. 대표 이미지(20배 배율)가 표시됩니다. 배율 막대 = 100 μm. (C, D) PR8 WT 및 BIRFLU의 성장 역학. Nluc 활성(C) 및 바이러스 적시 (D) WT 및 BIRFLU PR8 바이러스를 감염된 MDCK 세포로부터의 조직 배양 장신구 (MOI 0.001)에서 감염 후 표시된 시간에 평가하였다. 데이터는 삼중분의 평균 ± SD를 나타낸다. 바이러스 성 적규자는 면역 초점 분석 (FFU / mL)에 의해 결정되었다. 점선은 검출 한계(200 FFU/ml)를 나타냅니다. 이 수치는 노갈레스 외55에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 마우스에서 BIRFLU의 연구를 위한 개략적 표현. Nluc 및 금성 리포터 유전자의 발현은 VIVFLU의 1 x 106 PFU에 감염된 마우스에서 생체 내 또는 생체내 영상을 사용하여 평가하였다. 간단히, 1일째, 5~7주령암컷 BALB/c 마우스를 모의 감염(1x PBS) 또는 비르플루의 1 x 106 PFU로 접종하였다. 감염 후 3일째에, 마우스는 이소플루란을 사용하여 경미하게 마취되었고, Nluc 기질은 레트로 궤도로 주입하였다. Nluc 신호는 생체 내 이미징을 사용하여 직접 평가되었다. 이미징 직후, 마우스를 안락사시키고 전체 절제된 폐에서 금성의 발현을 생체 내 이미징을 사용하여 분석하였다. 회수된 마우스 폐는 플라크 분석에 의한 바이러스 복제 및 안정성을 평가하기 위해 균질화되었다. 화살표는 형광 (금성), 면역 염색 (Nluc) 및 크리스탈 바이올렛 염색 사이의 상관 관계를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 생체 내 생물 발광 및 형광 발현. 암컷 5-7주 된 BALB/c 마우스는 모의 감염(1x PBS) 또는 비르플루의 1 x 106 PFU를 접종하였다. 감염 후 3일째에, 전체마우스에서 Nluc 활성(A)을 결정하였다. 광도 척도(p/sec/cm2/sr)를 보여주는 단일 마우스의 대표 이미지입니다. 생물 발광 광채 값은 정량화되었고 평균 총 플럭스가 도시됩니다(Flux(Log10 p/s). Nluc 화상 진찰 후에, 폐는 생체내 화상 진찰을 위해 수확되었습니다 (B). 전체 폐의 대표 사진이 표시됩니다. 금성 발현을 정량화하기 위해, 관심 영역(ROI)의 평균 값을 모의 감염된 마우스로부터 폐 자동 형광으로 정규화하고 배 변화변화를 계산하였다. VIVFLU의 생체 내 유전적 안정성을 분석하기 위해, 마우스 폐에서 회수된 바이러스는 형광 현미경 검사법(금성, 상부), 면역 염색(Nluc, middle) 및크리스탈 바이올렛 염색(아래)을 사용하여 플라크 분석법으로 분석하였다. 한 마우스의 대표 이미지가 표시됩니다. 바이러스 복제를 평가하기 위하여는, 전체 폐는 화상 진찰 후에 균질화되고 MDCK 세포를 감염시키고 플라크 분석(PFU/mL)에 의해 바이러스성 적규를 결정하기 위하여 이용되었습니다 (D). 화살표는 형광 (금성), 면역 염색 (Nluc) 및 크리스탈 바이올렛 염색 사이의 상관 관계를 나타냅니다. 바는 폐 바이러스 적수의 평균 ± SD를 나타낸다. 이 수치는 Logales 외55에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 조직 배양 배지 및 솔루션 | 구성 | 보관소 | 사용 |
| 조직 배양 배지: 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM), 10% 태아 소 세럼(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민(PSG)(DMEM 10% FBS 1%PSG). | 445 ml DMEM, FBS 50 mL 및 100x PSG의 5 mL. | 4 °C | MDCK 세포의 유지 보수 |
| 감염 후 미디어: DMEM 0.3% 소 알부민 (BA), 1 % PSG (DMEM0.3 % BA 1 %PSG). | 491 ml DMEM, 4.2 ml의 35 % BA 및 100x PSG의 5 ml | 4 °C | 바이러스 감염 후 MDCK 세포의 유지 보수 |
| 10x 인산염 완충식염수(PBS) | NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2HPO4.7H2O, KH2PO4의 11.5 g. ddH2O최대 1L. pH를 7.3으로 조정 추가 | 실온 | 1x PBS를 준비하려면 |
| 1x PBS | ddH2O로 10x PBS 희석 | 실온 | 세척 셀 |
| 감염 매체: 1x PBS, 0.3% BA, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (PS)(PBS/BA/PS). | 487 mL 1x PBS 멸균, 35% BA의 4.2 mL 및 100x 1% PS(100 U/mL) 5ml | 4 °C | 바이러스 성 감염 |
| 고정 /투과 용액 : 4 % 포름알데히드, 0.5 % 트리톤 X-100은 1 x PBS에서 희석됩니다. | 400 mL 중립 완충 포르말린 10%, 트리톤 X-100 5 ml 및 1x PBS 595 mL | 실온 | MDCK 세포의 수정 및 투과. |
| 차단 솔루션 : 1 x PBS에서 2.5 % 소 혈청 알부민 (BSA). | 1x PBS의 97.5 mL에서 BSA 2.5 g | 4 °C | 면역 형광 및 플라크 분석법에 대한 차단 솔루션. |
| 항체 희석 액 (1 x PBS에서 1 % BSA) | 1x PBS의 99 mL에서 BSA 1 g | 4 °C | 1 차 및 이차 항체의 희석. |
| 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액 | 메탄올 400 mL에 크리스탈 바이올렛 1 g. ddH2O 600 ml 추가 | 실온 | 플라크 어세이에서 MDCK 세포의 염색. |
| 토실설포닐 페닐라닐 클로로메틸 케톤(TPCK) 처리 트립신 | ddH 2O에서 1 mg/mL에서 1,000x 스톡 솔루션 준비 | -20 °C | 바이러스 감염. |
표 1: 조직 배양 배지 및 솔루션.
Discussion
연구원은 바이러스 복제 및 병인의 현재 이해를 이해하고 확장하는 중요한 분자 도구로 재조합 기자 발현 바이러스에 의존했다26,27,28, 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33세 , 34세 , 35세 , 36세 , 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 54. 가장 일반적으로 선호되는 리포터 유전자는 루시퍼라제와 형광 단백질이며, 주로 식별의 기술 발전, 개선 된 변이체 개발 및 이미징 기술에 의한 검출으로 인한 것입니다43 , 44세 , 45세 , 46세 , 47세 , 48. 재조합 기자 바이러스는 종종 바이러스 학적 검사를 가속화하고, 시험관 내 및 생체 내 바이러스의 역학을 연구하고, 현재 승인 또는 새로운 백신 및 치료 접근법의 효과를 테스트하기 위해26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. 불행하게도, IAV의 경우, 과거 연구는 26,27,28,29를 수행 할 수있는 연구의 유형을 방해 단일 기자 유전자의 발현에 국한되었다 , 30개 , 31세 , 32세 , 33세 , 34세 , 35세 , 36세 , 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 54. 이러한 제한을 피하기 위해, 우리는 Nluc 루시퍼라제 및 비너스 형광 단백질 (BIRFLU)을 발현하는 복제 유능한 이중 리포터 IAV를 생성했습니다.
이 보고서에서, 우리는 비르플루의 시험관 내 특성화 및 비르플루를 사용하여 IAV 감염의 마우스 모델을 사용하여 생체 내 바이러스 감염을 추적하는 실험적 접근법을 기술한다. BIRFLU Nluc 및 금성 발현은 바이러스 성 역가와 상관관계가 있습니다. 또한, BIRFLU는 안정적으로 유지되었고 감염된 마우스의 폐로부터 회수된 후에도 두 리포터 유전자를 계속 발현하였다. 이 접근법은 연구원에게 IAV 감염의 처리를 위한 새로운 치료 대안의 확인 그리고 개발을 포함하여 배양된 세포 및 동물 모형에 있는 IAV를 공부하는 좋은 기회를 제공합니다.
BIRFLU는 PR8의 백본을 사용하여 생성되었지만, 다른 유형, 아류형 또는 바이러스 성 변형 백본을 사용하여 다른 재조합 IAV는 동일한 실험 접근법을 사용하여 생성 될 수있다. 마찬가지로, 이 보고서에서는 IAV의 마우스 모델에서 BIRFLU를 사용하기 위한 실험 절차를 설명했습니다. 그러나 BIRFLU는 다른 동물 모델에서 IAV 감염을 평가하는 귀중한 기술이 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
LM-S 실험실에 있는 인플루엔자 바이러스에 대한 연구는 부분적으로 뉴욕 인플루엔자 우수 센터 (NYICE)에 의해 투자됩니다 (NIH 272201400005C), 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수성의 NIAID 센터의 회원 (CEIRS) 계약 번호. HHSN272201400005C (NYICE) 및 국방부 (DoD) 동료 검토 의학 연구 프로그램 (PRMRP) 교부금 W81XWH-18-1-0460.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4 ° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| 5 to 7 week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
References
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