Summary
Influenza A-vira (IAVs) er smitsomme luftvejs patogener, der forårsager årlige epidemier og lejlighedsvis pandemier. Her beskriver vi en protokol til at spore virale infektioner in vivo ved hjælp af en roman rekombinant der og fluorescens-udtrykker bi-reporter iav (birflu). Denne fremgangsmåde giver forskerne et glimrende værktøj til at studere IAV in vivo.
Abstract
Influenza A-vira (IAVs) forårsager luftvejssygdomme, der er forbundet med betydelige sundhedsmæssige og økonomiske konsekvenser. Som med andre vira, studere IAV kræver brug af omstændelig sekundære tilgange til at påvise tilstedeværelsen af virus i inficerede celler og/eller i dyremodeller af infektion. Denne begrænsning er for nylig blevet omgået med generering af rekombinante iAVS udtrykke let sporbare fluorescerende eller bioluminescerende (luciferase) reporter proteiner. Men, forskere har været tvunget til at vælge fluorescerende eller der reporter gener på grund af den begrænsede kapacitet iav genomet for herunder udenlandske sekvenser. For at overvinde denne begrænsning har vi genereret en rekombinant replikation-kompetent bi-reporter iav (birflu), der stabilt udtrykker både et fluorescerende og et der reporter-gen til nemt at spore iav-infektioner in vitro og in vivo. Med henblik herpå blev de virale ikke-strukturelle (NS) og hemagglutinin (ha) virale segmenter af influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) modificeret til at indkode fluorescerende Venus og de bioluminescerende nanoluc luciferaseproteiner. Her beskriver vi brugen af BIRFLU i en musemodel af IAV-infektion og påvisning af begge reporter-gener ved hjælp af et in vivo-billedbehandlingssystem. Vi har især observeret en god sammenhæng mellem udtryk for både journalister og viral replikation. Kombinationen af avancerede teknikker inden for molekylær biologi, dyreforskning og billeddannelsesteknologier giver forskerne en enestående mulighed for at bruge dette værktøj til influenza forskning, herunder studiet af interaktioner mellem virus og vært og dynamikken i virusinfektioner. Det er vigtigt, at muligheden for genetisk ændring af det virale genom for at udtrykke to fremmede gener fra forskellige virale segmenter åbner mulighed for at anvende denne tilgang til: i) udvikling af nye IAV-vacciner, II) generering af rekombinante IAVs, der kan anvendes som vaccine vektorer til behandling af andre humane patogen infektioner.
Introduction
Influenza A-virus (IAV) er et indhyllet enkeltstrenget negativt-Sense-segmenteret RNA-virus fra Orthomyxoviridae -familien1,2,3. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anslår 3-5 millioner årlige influenza tilfælde og over 250.000 dødsfald fra influenza Worldwide4,5,6. Grupper, der er særligt sårbare over for influenza omfatter ældre, immunkompromitterede individer, og børn7,8,9,10,11. Selv om vacciner er tilgængelige og repræsenterer den mest almindelige og effektive intervention mod virus infektion, iav er i stand til hurtigt at udvikle sig og undslippe allerede eksisterende immunitet3,12,13, 14 , 15. genfremkomsten af en pandemisk H1N1-stamme i 2009 og fremkomsten af sygdomsfremkaldende iav gentager den konstante trussel mod menneskers folkesundhed på verdensplan4,16.
Under en epidemi eller pandemi er det afgørende hurtigt at bestemme patogeniciteten og Trans lovligheden af nyligt isolerede vira. I øjeblikket tilgængelige teknikker til påvisning af virus er tidskrævende og undertiden kræver brug af omstændelig tilgange, som kan forsinke færdiggørelsen af disse analyser17,18,19,20. Desuden er det vanskeligt at opskalere de nuværende virale undersøgelser, hvilket kan være nødvendigt i tilfælde af et udbrud. Endelig anvendes validerede dyremodeller for infektion, såsom mus, marsvin og fritter, rutinemæssigt og er afgørende for at studere influenza infektioner, immunrespons og effekten af nye vacciner og/eller antivirale lægemidler. Men disse modeller er restriktive på grund af den manglende evne til at observere viral dynamik i realtid; Dette begrænser undersøgelserne til statisk billeddannelse af virale infektioner21,22,23,24,25. Dyr, der anvendes i disse analyser, er også aflives med henblik på at bestemme viral belastning, hvilket øger antallet af dyr, der kræves for at gennemføre disse undersøgelser26. For at omgå alle disse begrænsninger, er mange forskere afhængige af brugen af rekombinant replikation-kompetente, reporter-udtrykker IAVs, som er i stand til at accelerere virologiske analyser og påvisning af viral belastning og udbredelse in vivo i realtid26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Vigtigere, disse reporter-udtrykker iAVS er i stand til at replikere på samme måde som vild-type (WT) iAVS i cellekultur og i dyremodeller af infektion33,42.
Fluorescerende og bioluminescerende proteiner er to reporter-systemer, der almindeligvis anvendes af forskere på grund af deres følsomhed, stabilitet og brugervenlighed. Desuden er der enorm støtte og avancement i fluorescerende og bioluminescerende protein afsløring teknologier43,44,45,46,47,48 . Fluorescerende proteiner og der har forskellige egenskaber, der giver dem mulighed for at gløde, specifikt adskiller sig i, hvordan ophidset stater genereres, og hvordan emittering detekteres43,44,45, 46,47,48. Fluorescerende proteiner er først ophidset ved at absorbere energi, som efterfølgende frigives som lys på en anden bølgelængde, da molekylerne falder til en lavere energi tilstand43. På den anden side, bioluminescens er afledt af en kemisk eksoterm reaktion, der involverer et substrat, ilt, og nogle gange ATP for at producere lys45. På grund af de varierende egenskaber af disse to typer af reporter proteiner, en måske mere fordelagtig end den anden afhængigt af undersøgelsen af interesse. Mens fluorescerende proteiner er almindeligt anvendt til at observere cellulær lokalisering28,41, deres in vivo-signaler har utilstrækkelig intensitet og er ofte tilsløret af autofluorescens i levende væv49. Derfor er forskerne afhængige af luciferaser til at evaluere viral dynamik i levende organismer, selv om fluorescerende proteiner kan foretrækkes for ex vivo undersøgelser50,51,52,53. I modsætning til fluorescerende proteiner er luciferaser mere bekvemt for in vivo-undersøgelser og mere anvendelig i ikke-invasive tilgange26, 27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. i sidste ende, baseret på typen af undersøgelse, skal forskerne vælge mellem brugen af enten et fluorescerende eller en der reporter protein som deres udlæser, som undersøger deres undersøgelse til en trade-off af funktionaliteter og følsomheder, og alvorligt begrænser nytten af de rekombinante reporter vira. Desuden er der betænkeligheder med hensyn til sammenhængen mellem de forskellige reporter geners ekspression ved anvendelse af fluorescens-eller luciferasesystemer og viral replikation eller udbredelse, hvilket kan bringe fortolkningen af de data, der er indhentet med reporter-udtrykker IAVs.
Vi har overvundet denne begrænsning ved at generere en rekombinant replikation-kompetent bi-reporter IAV (BIRFLU), der koder for både et fluorescerende og et luciferaseprotein i samme virale genom55 (figur 1). Her blev nanoluc der (nluc), et lille og lyst bioluminescerende protein48, indsat opstrøms for hemagglutinin (ha)-sekvensen i det virale ha-segment af influenza a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Desuden blev Venus, et hyppigt anvendt Monofilament fluorescerende protein, indsat i det ikke-strukturelle (NS) virale segment32,33,36,41,55. Da birflu koder for både fluorescerende og der reporter gener, enten reporter protein signal kan anvendes som udlæser til bestemmelse af viral replikation og udbredelse in vitro eller in vivo55. Yderligere oplysninger om generering og in vitro eller in vivo karakterisering af BIRFLU kan findes i vores seneste publikation55. BIRFLU kan bruges til at teste effektiviteten af antivirale lægemidler eller neutraliserende antistoffer via en ny fluorescerende-og bioluminescerende mikroneutraliseringassay55. Desuden kan BIRFLU også bruges til at evaluere viral dynamik i en musemodel af infektion55. I dette manuskript beskriver vi de procedurer, som karakteriserer BIRFLU55 in vitro, og hvordan man STUDERER birflu-infektion i mus ved hjælp af in vivo luminescens billedbehandlingssystemer til påvisning af nluc in vivo eller af Venus ex vivo.
Kombinationen af Cutting-Edge teknikker i molekylær biologi, dyreforskning og billeddannelse teknologier, bringer forskerne den enestående mulighed for at bruge BIRFLU til IAV forskning, herunder studiet af virus-vært interaktioner, dynamik viral infektion; udvikling af nye vaccine tilgange til terapeutisk behandling af IAV-infektioner eller potentiel anvendelse af IAV som vaccine vektor til behandling af andre patogeninfektioner.
Protocol
Alle protokoller, der involverer mus, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) og den institutionelle Komité for Biosikkerhed (IBC) ved universitetet i Rochester, School of Medicine and Dentistry. Alle de eksperimenter, der udføres på dyr, følger anbefalingerne i vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr i det nationale Forskningsråd58. Vivarium og division af laboratorie dyre medicin faciliteter på skolen for medicin og tandpleje på University of Rochester er akkrediteret af foreningen for vurdering og akkreditering af laboratoriet Animal Care (AALAC) International og overholde føderale og stats love og National Institutes of Health (NIH) politik. Korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) er påkrævet, når der arbejdes med mus. Lignende politikker og krav bør gennemføres ved udførelse af eksperimenter, der er skitseret i dette manuskript på hver institution.
1. brug af små hvirveldyr
- Køb fem til syv uger gamle kvindelige BALB/c-mus og vedligehold dem i dyrepleje faciliteten under specifikke patogenfrie forhold. Ved mus ankomst til de fastsatte faciliteter, tillade hvileperiode i 4 – 5 dage for at tillade dyrene akklime til deres nye miljø.
- Efter IACUC protokoller, sted højst 5 mus per bur.
Bemærk: På eksperimentet konklusion, for at sikre, at dyret er død, mus blev aflives ved hjælp af to godkendte procedurer, idet der tages hensyn til, at den anden skal være en fysisk metode. I denne undersøgelse, efter mus infektion med birflu og in vivo Imaging, dyr er aflives med en dødelig dosis af 2, 2, 2-tribromoethanol (TBE), og ved at skære den hepatiske vene som den fysiske sekundære metode, som vi tidligere har vist23.
2. biosikkerhed
Bemærk: I dette manuskript blev birflu genereret i rygraden af influenza A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), som er et fælles mus-tilpasset laboratorium iav stamme23,32,33,56. Virussen blev genereret ved hjælp af tidligere beskrevne plasmid-baserede reverse genetik tilgange og en komplet beskrivelse af generation, og in vitro og in vivo karakterisering af BIRFLU kan findes i vores seneste publikation55. Alle procedurer, der involverer IAV-infektioner (in vitro eller in vivo), blev udført i et biologisk sikkerhedskabinet under biosikkerhedsniveau (BSL)-2 betingelser.
Forsigtig: Der bør fastsættes et passende biosikkerhedsniveau i overensstemmelse med en risikovurdering for Biosikkerhed. Yderligere oplysninger om udførelse af risikovurderinger af biosikkerhed og etablering af effektiv biosikkerheds indeslutning bør konsulteres med den institution, hvor forsøgene vil blive udført.
- Rengør biosikkerheds fryserne med 70% ethanol eller klordioxid desinfektionsmiddel før og efter udførelse af alle forsøgsprocedurer. For mus arbejde, sterilisere alle dissektion materiale (saks, dissekere pincet, etc.) og dounce homogenisator før og efter deres anvendelse.
- Alt biologisk materiale, der produceres under procedurerne i henhold til de korrekte IBC-og IACUC-retningslinjer, kasseres.
3. in vitro karakterisering af BIRFLU (figur 2)
Bemærk: Se tabel 1 for alle buffer-og medie sammensætninger.
- Analysér protein ekspression ved fluorescens (figur 2a) og indirekte immunofluorescens (figur 2b)
- En dag før infektion, Seed 24-brønd plader med Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitelceller (1 x 105 celler/godt, triplicater) i vævskultur medier og vedligeholde pladerne i en 37 °c inkubator med 5% Co2. Forbered nok brønde til at evaluere alle de valgte antistoffer i både mock-inficerede og BIRFLU-inficerede celler.
Bemærk: Vi anbefaler, at du visualiserer cellerne under et let mikroskop for at bekræfte en enkeltlags, før du starter virusinfektionen. En 90% confluency-enkeltlags af mdck-celler ved infektionstidspunktet anbefales. - Forbered fortyndinger af WT eller BIRFLU IAVs i infektions medier og inficere de seedede MDCK-celler med en mangfoldighed af infektion (MOI) af 0,1 plaque-dannende enheder (PFU) pr. celle i et endeligt volumen på 0,25 mL/brønd af infektions medier.
- Fjern vævskultur mediet fra trin 3.1.1 og vask MDCK-cellerne to gange med 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS). Der tilsættes virus fortyndinger fra 3.1.2 til MDCK-cellerne, og pladerne placeres på en gynge platform i 1 time ved stuetemperatur for at muliggøre viral adsorption.
Bemærk: Mock-inficerede celler inkuberet kun med infektion medier i fravær af virus. - Efter viral adsorptions (trin 3.1.3) fjernes den virale inokulum ved aspiration og tilsættes 1 ml post-infektion, der indeholder 1 μg/ml tpck-behandlet trypsin til hver brønd. Inkubér cellerne i 18 timer i en 5% CO2 -befuret rugemaskine ved 33 °c.
- Efter 18 timers infektion fjernes vævs kulturens supernatanten fra 24-brøndens plader (3.1.4). Fix og permeabilize cellerne med 0,25 mL/brønd af fiksering/permeabilization løsning til 20 min ved stuetemperatur.
Bemærk: Klargør fikserings-/permeabiliserings opløsningen i en stinkhætte for at forhindre eksponering af formaldehyd. - Fjern fikserings-/permeabiliserings opløsningen fra trin 3.1.5, vask cellerne to gange med 1x PBS, og Inkuber cellerne med 0,25 mL/brønd blokerende opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Fortsæt til næste trin eller Opbevar cellerne i blokerende opløsning ved 4 °C natten over. - Fjern blokerings opløsningen (trin 3.1.6) og tilsæt 0,25 mL/brønd (1 μg/mL) af et muse monoklonalt antistof (MAb) mod IAV nucleoprotein, NP (HB-65) eller en 1:1000 fortynding af et kanin polyklonal antistof (pAb) mod NLuc (Se tabellen over materialer), begge fortyndet i antistof fortyndingsopløsning (1x PBS, 2,5% BSA), og Inkuber cellerne i 1 time ved 37 °C.
- Fjern det primære antistof fra trin 3.1.7, vask cellerne tre gange med 1x PBS og Inkuber dem med 0,25 mL/brønd af en Texas rød-konjugeret anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer (Se tabellen over materialer) fortyndet 1:200 i antistof fortyndede opløsning.
Bemærk: Cellekerner kan farves på samme tid ved at tilføje 0,5 μg/mL 4 ', 6 '-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til den samme sekundære antistof opløsning. Cellerne inkubates i 1 time ved 37 °C i mørke. Andre sekundære antistoffer konjugeret med andre fluorophorer kan anvendes. - Fjern det sekundære antistof og DAPI fra trin 3.1.8, vask cellerne tre gange med 1x PBS. Efter vask, lad cellerne i 0,25 mL/godt 1x PBS.
- Placer pladen på scenen af et fluorescens mikroskop for at detektere Venus og Nluc reporter Expression, og NP fra inficerede celler ved hjælp af de korrekte fluorescerende filtre. Capture billeder ved hjælp af en fluorescens mikroskop (20x forstørrelse) og flette dem ved hjælp af en billedredigeringssoftware (figur 2a, B).
- En dag før infektion, Seed 24-brønd plader med Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitelceller (1 x 105 celler/godt, triplicater) i vævskultur medier og vedligeholde pladerne i en 37 °c inkubator med 5% Co2. Forbered nok brønde til at evaluere alle de valgte antistoffer i både mock-inficerede og BIRFLU-inficerede celler.
- Analysér Nluc-aktiviteten (figur 2c) og viral replikation (figur 2D).
- En dag før infektion, frø 12-brønd plader med MDCK celler (2 x 105celler/godt, triplicates) ved hjælp af vævskultur medier i en 37 °c inkubator med 5% Co2 at nå ca 90% konfluency på tidspunktet for infektion.
Bemærk: Før infektion skal du kontrollere cellerne under et mikroskop for at verificere en enkeltlags af mdck-celler. - Infektions dagen forbereder fortyndinger af WT og BIRFLU virus i infektions medier til at inficere MDCK-cellerne (trin 3.2.1.) i tre eksemplarer med en MOI på 0,001 PFU i 0,5 mL/brønd. Fjern vævskultur mediet og vask MDCK-cellerne to gange med 1x PBS.
- Tilsæt virus fortyndinger til MDCK-monolayerne og Tillad viral adsorptions ved stuetemperatur i 1 time på en gynge platform. Efter viral adsorption fjernes virussen inokulum og tilsættes 1,5 ml post-infektion, der indeholder 1 μg/ml tpck-behandlet trypsin, til hver brønd. Der inkuberes inficerede celler i en 5% CO2 -befuret inkubator ved 33 °c og opsamles supernatanter på de angivne tidspunkter, der er angivet i trin 3.2.4.
- Ved 24, 48, 72, og 96 h post infektion (p.i.) indsamle 150 μL vævskultur supernatanten fra hver brønd og opbevare prøverne i et mikrocentrifuge glas ved-80 °C til at udføre Nluc assays og virale titreringer.
- For at udføre Nluc-aktivitets analysen skal du følge producentens anvisninger. Først tø vævs kulturen supernatanten opbevaret ved-80 °C (trin 3.2.4) på is.
Bemærk: Se anbefalingerne fra producenten og Optimer analysen, hvis det er nødvendigt. - Klargøre der-analyseopløsningen (Se tabellen over materialer) ved at fortynde nluc substrat 1:50 med fortyndings bufferen. I en hvid flad bund 96-brønd mikroplade til der assays blandes 25 μl der-analyse opløsning med 10 til 25 μl af de indsamlede supernatanten prøver af vævs kulturen. Blandingen inkubates i 2 – 3 minutter, før luminescens måles ved hjælp af et luminometer (figur 2c).
Bemærk: Tilstedeværelsen af infektiøse viruspartikler i vævs kulturen supernatanter bestemmes af fluorescens immun fokus analyse (Venus) eller indirekte immunofluorescens (viral antigen farvning) som tidligere beskrevet23,32, 33af56. - En dag før viral titreringer, frø MDCK celler i en 96-brønd plade (2 x 104 celler/godt, triplicates) med væv kultur medier og tillade celler at nå 90% sammenløbet på tidspunktet for infektion i en inkubator sat til 37 °c med 5% Co2.
- Brug de vævskultur supernatanten prøver, der blev optøet på is (trin 3.2.4.). Tilsæt 90 μL smitte medier til hver af brøndene i en ny 96-brønd plade, og tilsæt derefter 10 μL af den optøede vævskultur supernatanten (trin 3.2.4) til det første brønd (række A). Brug et multikanals pipet til at blande og overføre 10 μL fra række A til række B. Skift spidserne mellem fortyndinger og bland godt.
Bemærk: Denne procedure skal gentages indtil den sidste række (H). Vi anbefaler at udføre virale titreringer i triplicater for nøjagtig måling af virale titre. - Fjern vævskultur mediet fra MDCK-cellerne i 96-brønd pladerne (trin 3.2.7), og vask to gange med 1x PBS. Der tilsættes 50 μL af supernatanten fortyndinger af replikaen 96-brønd pladen indeholdende virus fortyndinger (trin 3.2.8) til hver brønd i 96-brønd pladen, der indeholder MDCK-celler.
- 96-brønd pladen inkubates på en Rocking-platform i 1 time ved stuetemperatur for at tillade viral adsorption. Efter viral adsorption fjernes inokulum og tilsættes 100 μL/brønd af post-infektion medier indeholdende 1 μg/mL TPCK-behandlet trypsin. Incubate inficerede celler i 12 timer i en 33 °C inkubator med 5% CO2.
- Da BIRFLU udtrykker Venus, kan antallet af inficerede celler tælles direkte ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Alternativt kan virale titre bestemmes ved indirekte immunofluorescens som tidligere beskrevet ved hjælp af et antistof mod et viral protein23,56,57,59. For sidstnævnte, Fortsæt med at fastsætte/permeabilize cellerne og pletten ved hjælp af anti-NP mAb HB-65 som beskrevet i afsnit 4,4.
- Bestem viral titre ved at tælle antallet af fluorescerende dannende enheder (FFU)/mL ved hjælp af formlen: ((antal FFU) x 20 x 1/fortynding (figur 2D).
- En dag før infektion, frø 12-brønd plader med MDCK celler (2 x 105celler/godt, triplicates) ved hjælp af vævskultur medier i en 37 °c inkubator med 5% Co2 at nå ca 90% konfluency på tidspunktet for infektion.
4. in vivo karakterisering af BIRFLU (figur 3 og figur 4)
- Mus infektion
Bemærk: intranasal infektion af mus blev udført som tidligere beskrevet23. For en mere detaljeret protokol af IAV infektion in vivo ved hjælp af musemodel af infektion, anbefaler vi at se videoen i forbindelse med den foregående publikation23. Dette afsnit opsummerer kun de skridt, der kræves for mus infektion med BIRFLU.- Undersøg musene for at evaluere deres helbred og generelle fysiske udseende. Fortynding af BIRFLU i 1x PBS forberedes til inokulerede mus med 1 x 106 PFU af birflu i et samlet volumen på 30 μl/mus. Opretholde virus på is indtil mus inokulation.
Bemærk: Mock-inficerede (1x PBS) mus vil være nødvendig som intern kontrol til billeddannelse. Placer mock-inficerede mus i et andet bur end BIRFLU-inficerede dyr. - Anesthetize fem til syv uger gamle kvindelige Balb/c-mus intraperitonealt med 240 – 250 mg/kg tribromoethanol (TBE) ved at indsætte nålen i hale 2/3 i højre side af maven. Derefter returnere musen til buret og vente i omkring 5 min. Kontroller, at musen er bedøvet før virus inokulation ved fravær af tå-knivspids refleks.
Bemærk: Injicerbare sedativer anbefales over inhalerede sedativer til influenza infektioner in vivo, da sidstnævnte kan ændre adfærd og optagelse af virus ved luftvejene epitel. Desuden kan de også påvirke lokale immunrespons af lungerne og interferere med in vivo billeddannelse af inficerede mus. Endelig har inhalerede sedativer reduceret varigheden af virkningen, hvilket ville være et problem for in vivo billeddannelse af de inficerede dyr. - Inokulere musene intranasalt med de 30 μL af den forberedte BIRFLU fortynding. Kontroller, at musene indånder korrekt, før de returneres til buret.
- Undersøg musene for at evaluere deres helbred og generelle fysiske udseende. Fortynding af BIRFLU i 1x PBS forberedes til inokulerede mus med 1 x 106 PFU af birflu i et samlet volumen på 30 μl/mus. Opretholde virus på is indtil mus inokulation.
- Bioluminescens monitorering af mus inficeret med BIRFLU (figur 4a)
Bemærk: i dette manuskript er reporter ekspression af Nluc eller Venus og viral replikation i lungerne af mus inficeret med BIRFLU bestemmes ved 3 dage efter infektion. Karakteren af bioluminescens Imaging giver dog mulighed for gentagen monitorering af nluc-ekspression i individuelle birflu-inficerede dyr, uden at det er nødvendigt at aflive dem for hvert eksperimentelt tidspunkt. Der kræves et in vivo-billedbehandlingssystem med en isofluran anæstesi manifold for at udføre de beskrevne forsøgsprocedurer. Se tabellen over materiale for detaljer om billedbehandlings instrumentet og billedsoftware, der anvendes til billed erhvervelse og dataanalyse.- Barberer musene brystet for at forbedre bioluminescens signalet. Åbn billedbehandlings softwaren, og tryk på Initialiser. Dernæst indstille de parametre, der vil blive brugt, herunder indstilling af Imaging mode til bioluminescens, automatisk besparelse, eksponeringstid til Auto, åbne filter, etc.
- Når maskinen er fuldt initialiseret, skal du tænde isofluran anæstesi systemet. Anbring dyr i anæstesi kammeret. Mus er samtidig og let bedøvet med en blanding af oxygen gas og fordamper 1 – 2% isoflurane.
- Når mus er bedøvet, administrere Nluc substrat (Se tabellen over materialer) fortyndet 1:10 i 1x PBS (endelige volumen 100 μl/mus) via retro-orbital rute ved hjælp af en sprøjte med en 22 G nål.
- Umiddelbart efter Nluc reagens administration, placere dyrene i billedbehandlings instrumentet med deres kister vender opad og snude inde i manifold kegle at holde dyret bedøvet under billeddannelse. Umiddelbart efter lukning af Imager døren, Klik erhverve i softwareprogrammet (figur 4a, top).
- Efter billeddannelse, returnere musene til deres bure overvåge dem, indtil de er fuldt genoprettet og slukke isofluran vaporizer. Fortsæt derefter med ex vivo-billeddannelse af mus lunger for at evaluere Venus reporter-genekspression (afsnit 4,3).
- Brug billedsoftware værktøjerne til at analysere de erhvervede bioluminescens data. Udnyt værktøjet ROI (region af interesse) til at betegne det specifikke signal og udføre flux målinger i regionen af interesse (normalt omkring brystet) (figur 4a, bund). Selvom ROI Shape er irrelevant, foretrækkes større ROIs generelt for at indfange hele signal diffusions området.
- Klik på mål. Vurdere bioluminescens i fotoner , da den giver en absolut måling af foton emission, der kan sammenlignes med output målinger fra forskellige parametre eller billedbehandlings instrumenter.
- Fluorescens analyse hos mus inficeret med BIRFLU (figur 3 og figur 4b)
- Saml muse lungerne efter in vivo-billeddannelse, som tidligere beskrevet23.
- Kortvarigt, aflive mus med en dødelig dosis TBE (500 mg/kg). Desinficer incisionstedet med 70% ethanol. Med en skalpel, lave et snit fra brystbenet til bunden af maven og derefter skæres fra bunden af snittet til siderne med saks. Dernæst skæres den hepatiske vene (anden fysisk eutanasi metode) til at bløde dyret.
Bemærk: For at undgå et højt baggrunds signal under billeddannelse er det vigtigt at minimere mængden af blod i lungerne (se nedenfor).
- Kortvarigt, aflive mus med en dødelig dosis TBE (500 mg/kg). Desinficer incisionstedet med 70% ethanol. Med en skalpel, lave et snit fra brystbenet til bunden af maven og derefter skæres fra bunden af snittet til siderne med saks. Dernæst skæres den hepatiske vene (anden fysisk eutanasi metode) til at bløde dyret.
- Placer musen i dorsale recumbency, og brug saksen til at klippe brysthinden og åbne rib bur. Derefter fjernes lungerne ved at Snippe enden af luftrøret med en saks, mens du forsigtigt holder lungerne med pincet.
- Lungerne placeres i en seks-brønd plade med 2 mL 1x PBS og vaskes lungerne tre gange med 1x PBS.
Bemærk: For at undgå kontaminering mellem prøverne skal du rengøre og desinficere dissekere-værktøjerne mellem hvert dyr.
- Lungerne placeres i en seks-brønd plade med 2 mL 1x PBS og vaskes lungerne tre gange med 1x PBS.
- Start billed anskaffelsesoftwaren ved at klikke på Initialiser og Indstil parametrene for Imaging, herunder indstilling af billedbehandlings tilstand til fluorescens, automatisk lagring, eksponeringstid for auto, excitation (500 nm) og emission (540 nm) filtre.
- Når maskinen er initialiseret, placere lungerne i en sort baggrund bakke, sikre, at vævene er adskilt fra hinanden, introducere bakken i Imager, og klik erhverve på Imaging systemprogram efter lukning af Imager døren ( Figur 4B, top).
- Efter billeddannelse fjernes vævet straks og opbevares på is (4 °C), hvis prøverne behandles samme dag. eller på et rør og tøris for at fryse dem hurtigt, før de opbevares ved-80 °C, hvis prøverne vil blive behandlet senere på en anden dag.
- Til billedbehandling skal du vælge værktøjet ROI og tegne Rois omkring hver af de enkelte lunger. Klik på mål. Derefter trække værdierne fra de mock-inficerede mus (figur 4b, bund) ved hjælp af de resulterende gennemsnitlige strålings effektivitetsmålinger.
Bemærk: med BIRFLU, der er en god korrelation mellem niveauerne af Nluc og Venus udtryk, og signal fordeling. Derfor er det vigtigt at analysere Nluc (hele mus) og Venus (excised lunger) udtryk fra det samme dyr, og opretholde den samme orientering.
- Saml muse lungerne efter in vivo-billeddannelse, som tidligere beskrevet23.
- Evaluering af BIRFLU-replikation i mus lunger (figur 3 og figur 4c)
- Der homogeniseres mus lunger for viral titrering ved plaque assay som tidligere beskrevet23.
- Lungerne placeres i en Dounce-homogenisator med 1 mL afkølede infektions medier. Lungerne skal homogeniseres med Pestle i 1 min ved stuetemperatur, indtil den er helt opløst, og prøverne opbevares i et sterilt rør ved 4 °C.
- Prøverne centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter, og supernatanten opsamles i et sterilt rør. Prøverne opbevares på is, hvis de vil blive brugt samme dag eller fryse dem ved-80 °C for at evaluere virale titre på et senere tidspunkt.
Bemærk: Der bør anvendes en ny Dounce-homogenisator til hver enkelt lunge prøve. - For at udføre plaque assay, dagen før udførelse viral titrering, frø seks-brønd plader med MDCK celler (5 x 105 celler/brønd) i væv kultur medier. Inkuber cellerne natten over ved 37 °C med 5% CO2 for at nå 90% sammenløbet næste dag. Før infektion, Bekræft, at cellerne danner en enkeltlags under et let mikroskop.
- Forbered 1:10 serielle fortyndinger af supernatanten fra de homogeniserede prøver (trin 4.4.1) i infektions medier. Forbered mikrocentrifuge glas med 540 μL infektions medier, tilsæt 60 μL fra den homogeniserede lunger prøve til det første rør, bland ved pipettering op og ned, og brug derefter et nyt tip, Overfør 60 μL til næste rør. Gentag denne serielle fortyndings proces indtil den sidste fortynding.
Bemærk: I vores erfaring 7 fortyndinger er tilstrækkelige til at bestemme viral titre ved plaque assay fra lungerne af inficerede mus. - MDCK-cellerne (trin 4.4.3) vaskes to gange med 1x PBS og overføres 500 μL af de serielt fortyndede prøver til hver brønd i 6-brønd pladen. Placer pladerne på en gynge platform og lad viral absorption forekomme i 1 h ved stuetemperatur.
- Efter 1 time viral absorption fjernes viral inoculum, tilsættes 2 mL/brønd af overlay medium indeholdende 1 μg/mL TPCK-behandlet trypsin, og Inkuber derefter cellerne ved 33 °C under 5% CO2 i 3 dage.
- Fix inficerede celler (trin 4.4.6) med 1 mL/brønd af 4% formaldehyd fortyndet i 1x PBS ved stuetemperatur i 2 h, derefter forsigtigt fjerne overlay medium og tilsæt 1 mL 1x PBS til hver brønd. For visualisering af Venus, billede de seks-brønden plader med et billedsystem til påvisning af fluorescens.
Bemærk: Viral plaques kan være farvet ved hjælp af en billedredigeringssoftware (Se tabellen over materialer). - For at evaluere Nluc-ekspression, visualisere virale plaques ved immun farvning ved hjælp af en anti-Nluc pAb. Til dette, fjerne 1x PBS, permeabilize celler ved hjælp af 0,5 mL/brønd af permeabilization løsning til 15 min ved stuetemperatur.
- Fjern permeabiliserings opløsningen, vask cellerne tre gange med 1x PBS og Bloker med 0,5 mL/brønd blokerende opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern blokerings opløsningen fra trin 4.4.9 og Inkuber cellerne med 0,5 mL/brønd af pAb anti-Nluc fortyndet 1:1000 i fortyndings opløsning i 1 time ved 37 °C.
- Brug ABC alkaline phosphatase kit og DAB peroxidase substrat kit efter producentens anbefaling til visualisering af Nluc-udtrykker plaques.
- Kortvarigt, vask cellerne fra 4.4.10 tre gange med 1x PBS og Inkuber dem med 0,5 mL/brønd af biotinyleret anti-kanin sekundært antistof i 1 time ved 37 °C.
- Fjern det sekundære antistof, vask cellerne tre gange med 1x PBS, og Inkuber med ABC-opløsningen i 1 time ved 37 °C. Vask cellerne tre gange med 1x PBS og Visualiser de virale plaques med DAB HRP substrat kit. Scan de immunofarvede plaques ved hjælp af en konventionel scanner.
Bemærk: Andre lignende sæt til immun farvning kan anvendes.
- Pletter de virale plaques med krystalviolet opløsning i 1 h ved stuetemperatur. Kassér krystalviolet, vask pladerne tre gange med vand, lad pladerne tørre, og Scan pladerne igen.
- At bestemme viral titers, tælle plaques afsløret efter krystalviolet farvning. Scan plaques ved hjælp af en konventionel scanner. Beregn virus titer som plaque dannende enheder (PFU) pr. mL (PFU/mL).
- At vurdere BIRFLU stabilitet in vivo, beregne procentdelen af reporter-udtrykker virus ved at tælle antallet af krystalviolet-farvede plaques (antal infektiøse vira, trin 4.4.12) og sammenligne med antallet af Venus-og Nluc-udtrykker plaques ( henholdsvis trin 4.4.7 og Step 4.4.11).
- Prøverne centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter, og supernatanten opsamles i et sterilt rør. Prøverne opbevares på is, hvis de vil blive brugt samme dag eller fryse dem ved-80 °C for at evaluere virale titre på et senere tidspunkt.
Representative Results
Generering og karakterisering af BIRFLU in vitro (figur 1 og figur 2)
En rekombinant replikation-kompetent IAV udtrykker to forskellige reporter gener (BIRFLU) blev konstrueret ved hjælp af state of the art molekylær biologi og plasmid-baserede reverse genetik teknikker (figur 1). Her valgte vi at bruge nluc på grund af flere fordele i forhold til andre luciferaser, herunder dens lille størrelse, ATP-uafhængighed, større intensitet og optimeret substrat48,60. Nluc blev klonet ind i ha-segmentet for iav PR8 efterfulgt af svine-svine (PTV) 2a-kavaler pladsen (2a) foran den åbne læse ramme (ORF) af ha (figur 1). ORF af HA inkluderede tavse mutationer for at fjerne de originale emballerings signaler og undgå enhver mulig rekombination. Det komplette HA-emballerings signal blev tilføjet foran Nluc for at muliggøre korrekt inkorporering af det modificerede HA-segment i virion-og Nluc-og HA-ekspression fra det samme virale RNA-segment (figur 1). Desuden blev det fluorescerende protein Venus klonet ind i en modificeret iav PR8 NS segment, som koder de to virale proteiner NS1 og NEP fra en enkelt afskrift32,36,41,54, 57. Med henblik herpå blev Venus smeltet til C-terminalen i NS1, og hele NEP ORF blev klonet nedstrøms for PTV 2A-spaltningen, der blev placeret mellem NS1-Venus-og NEP-sekvenserne (figur 1). I sidste ende, disse to modificerede HA og NS viral plasmid konstruktioner blev anvendt i kombination med resten af IAV PR8 reverse genetik plasmider at generere BIRFLU (figur 1). In vitro og in vivo karakterisering af BIRFLU er blevet beskrevet tidligere55.
I figur 2, vi karakteriseret in vitro birflu ved at bestemme Venus, nluc, og NP ekspressionsniveauer ved hjælp af fluorescens og indirekte immunofluorescens tilgange (figur 2a, B). Confluent-monolag af mdck-celler var enten mock-inficerede eller inficerede (Moi 0,1) med WT eller birflu PR8 vira, og ved 18 timer efter infektion blev Venus Expression direkte evalueret ved hjælp af Fluorescens mikroskopi (figur 2a, B). Nluc (figur 2a) og NP (figur 2b) udtryk blev visualiseret ved indirekte immunofluorescens ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for hvert protein. Som forventet blev Venus og Nluc ekspression kun detekteret i celler inficeret af BIRFLU og ikke i celler inficeret med WT PR8 virus. Desuden afslørede indirekte immunofluorescens mikroskopi NP-ekspression i både WT og BIRFLU PR8-inficerede celler. Ingen udtryk for Venus, Nluc eller NP blev detekteret, som forventet, i mock-inficerede celler (figur A, B).
For at evaluere nluc-ekspressions niveauerne in vitro blev mdck-celler inficeret (Moi 0,001) med WT eller birflu PR8 vira og nluc-aktivitet i vævskultur supernatanter blev vurderet ved 24, 48, 72 og 96 h efter infektion (figur 2c). Kun nluc-aktivitet blev påvist i vævskultur supernatanter af mdck-celler inficeret med birflu (figur 2c). Nluc aktivitet i vævs kulturen supernatanter blev detekteret så tidligt som 24 h efter infektion med højere ekspressionsniveauer ved 96 h efter infektion, sandsynligvis fordi den cytopatiske effekt (CPE) induceret under viral infektion frigive nluc protein bevaret ind i cellen. For at evaluere egnetheden af birflu i dyrkede celler blev vækst kinetikken for WT og birflu PR8 vira også evalueret (figur 2D), og tilstedeværelsen af infektiøs virus i vævskultur supernatanter blev bestemt af immun fokus analyse (figur 2D ). Især var BIRFLU-replikeringkinetikken sammenlignelig med WT PR8-virusset, selv om BIRFLU-replikation var en anelse forsinket og ikke nåede de samme virale titre som WT PR8. Men, birflu var i stand til at nå titre af 5 x 107 PFU/ml (figur 2D), hvilket indikerer, at ekspression af to reporter gener i det virale genom ikke signifikant interfererer med birflu replikation i mdck celler.
Sporing af BIRFLU-infektion i mus (figur 3 og figur 4)
Figur 3 er et skematisk flowdiagram til vurdering af birflu dynamik i en musemodel af iav infektion. Fem-til-syv-ugers gamle kvindelige BALB/C-mus var enten mock-inficerede med 1x PBS eller inficeret med 1 x 106 PFU af birflu intranasally. På 3 dage efter infektion, blev mus bedøvet med isofluran og derefter injiceres med Nluc substrat retro-orbitally. Alle mus blev straks anbragt i IVIS-instrumentet, og Nluc-signalet blev vurderet in vivo ved hjælp af IVIS. Dernæst blev mus aflives og lunger blev høstet. De fjernede lunger blev derefter analyseret ex vivo ved hjælp af in vivo Imager til bestemmelse af fluorescens intensitet via Venus ekspression. Endelig blev mus lunger homogeniseret, og viral titre og stabilitet blev bestemt af plaque assay. Plaques blev vurderet af Venus ' direkte fluorescens, ved immun farvning ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for Nluc og ved krystalviolet farvning.
Tidligere beskrevne replikation-kompetente reporter-udtrykker IAVs udtrykker et enkelt reporter gen, oftest enten et fluorescerende eller et bioluminescerende protein, som surrogat for viral infektion og replikation. Men, BIRFLU, er i stand til at udtrykke begge typer af reporter gener på viral infektion. For at vurdere korrelationen mellem bioluminescens (in vivo-billeddannelse) og fluorescens (ex vivo-billeddannelse) efter BIRFLU-infektion var fem-til-syv uger gamle kvindelige BALB/c-mus mock-inficerede med 1x PBS eller inokuleret med BIRFLU (106 PFU) intranasalt . Nluc-aktiviteten (figur 4a) blev evalueret ved administration af nluc-substrat injiceret retroorbitalt ved 3 dage efter infektion med et in vivo-billedbehandlings instrument. Vi valgte at evaluere bioluminescens på dag 3, fordi tidligere undersøgelser indikerede, at iav-replikation, herunder PR8, toppe mellem dag 2 og 4 efter infektion24,54. Bioluminescens blev overvåget (figur 4a, top) og anvendt til at beregne den gennemsnitlige totale flux (flux (log10 p/s) (figur 4a, bund). Som forudset, mus inokuleret med BIRFLU viste høj bioluminescens aktivitet, men ingen signal blev påvist i mock-inficerede mus. Derefter blev lungerne af inficerede mus høstet og Venus ekspression blev vurderet ved hjælp af ex vivo Imaging (figur 4b, top). Desuden blev fluorescens gennemsnitlige stråle effektivitet beregnet (figur 4b, bund). De fjernede mus lunger blev også homogeniseret for at bestemme viral titre og den genetiske stabilitet af birflu in vivo (figur 4c, D). Genetisk stabilitet af BIRFLU blev analyseret gennem plaque assay ved hjælp af vira isoleret fra mus lunger og fluorescerende mikroskopi (Venus, top), immun farvning (Nluc, midten) og krystalviolet farvning (bund). BIRFLU genvundet fra mus lunger var i stand til at danne plaques og stabilt udtrykker både reporter gener (figur 4c). Vi observerede især en god korrelation mellem bioluminescens-og fluorescens signaler med viral replikation.
Figur 1: skematisk gengivelse af iav PR8 WT og birflu virion struktur og genom segmenter. Iav er omgivet af en lipid-tolags, der indeholder de to store virale glycoproteiner hemagglutinin (ha; sort) og neuraminidasetypen (na; blå). IAV indeholder otte enkelt-strandede, negative-Sense, RNA segmenter (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, og NS). Hver viral segment indeholder ikke-kodning regioner (NCR) på 3 ' og 5 ' ender (sorte bokse). Også, på 3 ' og 5 ' ende af viral (v) RNAs er emballagen signaler, ansvarlig for den effektive encapsidation af vrnas i spirende virions (hvide kasser). IAV PR8 HA og NS virale segmenter og produkter er indikeret med sort. Sekvenser af Nluc, Venus og PTV 2A er angivet i henholdsvis rød, grøn og stribet boks. Den skematiske gengivelse af de modificerede HA-og NS-segmenter, der udtrykker henholdsvis Nluc og Venus i BIRFLU, er også indiceret. Dette tal er blevet tilpasset fra Nogales et al.55. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: in vitro karakterisering af BIRFLU. (A, B) Analyse af protein ekspression ved direkte fluorescens og immunofluorescens. MDCK-celler var mock-inficerede eller inficerede (MOI 0,1) med PR8 WT eller BIRFLU vira. Inficerede celler blev fastsat til 18 h efter infektion for direkte at visualisere Venus udtryk ved direkte fluorescerende mikroskopi og at visualisere Nluc (A) og viral NP (B) udtryk ved hjælp af specifikke antistoffer og indirekte immunofluorescens. Kerner blev plettet med DAPI. Repræsentative billeder (20x forstørrelse) vises. Skala stænger = 100 μm. (C, D) Vækst kinetik af PR8 WT og BIRFLU. Nluc aktivitet (C) og viral titre (D) i vævskultur supernatanter fra mdck celler inficeret (Moi 0,001) med WT og birflu PR8 vira blev vurderet på de angivne tidspunkter efter infektion. Data repræsenterer midlerne ± SD af triplicater. Viral titre blev bestemt af immun-Focus assay (FFU/ml). Punkteret linje angiver detektionsgrænsen (200 FFU/ml). Dette tal er blevet tilpasset fra Nogales et al.55. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk repræsentation for studiet af BIRFLU i mus. Ekspression af Nluc og Venus reporter gener blev evalueret hos mus inficeret med 1 x 106 PFU af birflu med in vivo eller ex vivo Imaging. Kort, på dag 1, 5 til 7 uger gamle kvindelige BALB/c mus var mock-inficerede (1x PBS) eller inokuleret med 1 x 106 PFU af birflu intranasally. På dag 3 efter infektion, mus blev mildt bedøvet ved hjælp af isofluran og Nluc substrat blev injiceret retro-orbitally. Nluc-signalet blev direkte vurderet ved hjælp af in vivo-billeddannelse. Umiddelbart efter billeddannelse blev mus aflives og ekspression af Venus i hele exciserede lunger blev analyseret ved hjælp af ex vivo-billeddannelse. Gendannede mus lunger blev homogeniseret for at evaluere viral replikation og stabilitet ved plaque assay. Pilene indikerer korrelation mellem fluorescens (Venus), immun farvning (Nluc) og krystalviolet farvning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: in vivo bioluminescens og fluorescens udtryk. Kvindelige fem til syv uger gamle BALB/c-mus var mock-inficerede (1x PBS) eller inokuleret med 1 x 106 PFU af birflu intranasally. På dag 3 efter infektion blev Nluc aktivitet (A) i hele musen fastlagt. Repræsentative billeder af en enkelt mus, der viser Radiance Scale (p/sek/cm2/SR). Bioluminescens Radiance værdier blev kvantiteret, og den gennemsnitlige totale flux vises (flux (log10 p/s). Efter Nluc-billeddannelse blev der høstet lunger til ex vivo-billeddannelse (B). Repræsentative billeder fra hele lunger vises. For at kvantificere Venus ekspression blev middelværdien af regioner af interesse (ROIs) normaliseret til lunge Auto-fluorescens fra mock-inficerede mus og fold ændringer blev beregnet. For at analysere den genetiske stabilitet af BIRFLU in vivo, vira genvundet fra mus lunger blev analyseret af plaque assay ved hjælp af fluorescerende mikroskopi (Venus, top), immun farvning (Nluc, midten) og krystalviolet farvning (bund) (C). Repræsentative billeder fra én mus vises. For at evaluere virusreplikation blev hele lunger homogeniseret efter billeddannelse og anvendt til at inficere MDCK-celler og bestemme virale titre ved plaque assay (PFU/mL) (D). Pilene indikerer korrelation mellem fluorescens (Venus), immun farvning (Nluc) og krystalviolet farvning. Søjler repræsenterer den gennemsnitlige ± SD af lunge virus titre. Dette tal er blevet tilpasset fra Logales et al.55. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Væv kultur medier og løsninger | Sammensætning | Opbevaring | Bruge |
| Væv kultur medier: Dulbecco's modificerede ørne medium (DMEM), 10% føtal bovin serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG). | 445 ml DMEM, 50 mL FBS og 5 mL 100x PSG. | 4 °C | Vedligeholdelse af MDCK-celler |
| Post-infektion medier: dmem 0,3% kvæg ALBUMIN (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% BA 1% PSG). | 491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA og 5 ml 100x PSG | 4 °C | Vedligeholdelse af MDCK-celler efter virus infektion |
| 10x fosfat bufferet saltvand (PBS) | 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g af na2HPO4. 7h2O, 2 g af KH2po4. Tilføj ddH2O op til 1 L. Juster pH til 7,3 | Stuetemperatur | Sådan forberedes 1x PBS |
| 1x PBS | Fortyndet 10x PBS med ddH2O | Stuetemperatur | Vaske celler |
| Infektion medier: 1x PBS, 0,3% BA, 1% penicillin-streptomycin (PS) (PBS/BA/PS). | 487 mL 1x PBS steril, 4,2 mL 35% BA og 5 ml 100x 1% PS (100 U/mL) | 4 °C | Virale infektioner |
| Fiksering/permeabiliseringsvæske: 4% formaldehyd, 0,5% Triton X-100 fortyndet i 1x PBS. | 400 mL neutral Buffered formalin 10%, 5 ml Triton X-100 og 595 mL 1x PBS | Stuetemperatur | Fix og permeabilization af MDCK celler. |
| Blokerende opløsning: 2,5% bovin serum ALBUMIN (BSA) i 1x PBS. | 2,5 g BSA i 97,5 mL 1x PBS | 4 °C | Blokerende opløsning til immunofluorescens og plaque assays. |
| Antistoffortyndingsopløsning (1% BSA i 1x PBS) | 1 g BSA i 99 mL 1x PBS | 4 °C | Fortynding af primære og sekundære antistoffer. |
| 0,1% krystalviolet opløsning | 1 g krystalviolet i 400 mL methanol. Tilsæt 600 ml ddH2O | Stuetemperatur | Farvning af MDCK celler i plaque assays. |
| Tosylsulfonylphenylalanyl klormethyl keton (tpck)-behandlet trypsin | Forbered en 1.000 x stamopløsning ved 1 mg/mL i Hedeselskabet2O | -20 °C | For virusinfektioner. |
Tabel 1: vævskultur medier og opløsninger.
Discussion
Forskere har påberåbt sig rekombinant reporter-udtrykker vira som vitale molekylære værktøjer til at forstå og udvide på den nuværende forståelse af viral replikation og patogenese26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. de mest almindeligt begunstigede reporter gener er luciferaser og fluorescerende proteiner, primært på grund af de teknologiske fremskridt i deres identifikation, udvikling af forbedrede varianter, og detektion af imaging Technologies43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. rekombinant reporter virus bruges ofte til at fremskynde virologiske analyser, studere dynamikken i vira in vitro og in vivo, og til at teste effektiviteten af aktuelt godkendte eller nye vaccine og terapeutiske tilgange26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Desværre, i tilfælde af iav, tidligere undersøgelser var begrænset til udtryk for en enkelt reporter gen, som hindrer den type undersøgelse, der kunne udføres 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. for at undgå denne begrænsning har vi genereret en replikeringskompetent bi-reporter iav, der udtrykker en nluc der og en Venus fluorescerende protein (birflu).
I denne rapport beskriver vi in vitro-karakteriseringen af BIRFLU og de eksperimentelle tilgange til at bruge BIRFLU til at spore virus infektion in vivo ved hjælp af en musemodel af IAV-infektion. BIRFLU Nluc og Venus udtryk korrelerede med virale titers. Desuden forblev BIRFLU stabil og fortsatte med at udtrykke begge reporter gener efter at være blevet genvundet fra lungerne af inficerede mus. Denne tilgang giver forskerne en glimrende mulighed for at studere IAV i dyrkede celler og i dyremodeller, herunder identifikation og udvikling af nye terapeutiske alternativer til behandling af IAV-infektioner.
Selv om BIRFLU er blevet genereret ved hjælp af rygraden i PR8, andre rekombinant IAV ved hjælp af forskellige type, subtype eller viral stamme backbones kunne genereres ved hjælp af samme eksperimentelle tilgang. Ligeledes beskrev vi i denne rapport de eksperimentelle procedurer for brugen af BIRFLU i en musemodel af IAV. Men, BIRFLU kunne være en værdifuld teknologi til at evaluere IAV infektion i andre dyremodeller.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning på influenzavirus i LM-S laboratorium er delvist finansieret af New York influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), et medlem af NIAID Centre of Excellence for influenza forskning og overvågning (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) og af Department of Defense (DoD) peer reviewed medicinsk forskning program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4 ° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| 5 to 7 week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
References
- Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th edition, Lippincott Williams and WIlkins. (2007).
- Martinez-Sobrido, L., Peersen, O., Nogales, A. Temperature Sensitive Mutations in Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complex Responsible for the Attenuation of the Live Attenuated Influenza Vaccine. Viruses. 10 (10), (2018).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), (2016).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Louie, J. K., et al. A review of adult mortality due to 2009 pandemic (H1N1) influenza A in California. PLoS One. 6 (4), e18221 (2011).
- Barr, I. G., et al. Epidemiological, antigenic and genetic characteristics of seasonal influenza A(H1N1), A(H3N2) and B influenza viruses: basis for the WHO recommendation on the composition of influenza vaccines for use in the 2009-2010 Northern Hemisphere season. Vaccine. 28 (5), 1156-1167 (2010).
- Simonsen, L., et al. Impact of influenza vaccination on seasonal mortality in the US elderly population. A.M.A. archives of internal medicine. 165 (3), 265-272 (2005).
- McLean, H. Q., Peterson, S. H., King, J. P., Meece, J. K., Belongia, E. A. School absenteeism among school-aged children with medically attended acute viral respiratory illness during three influenza seasons, 2012-2013 through 2014-2015. Influenza and Other Respiratory Viruses. 11 (3), 220-229 (2017).
- Principi, N., Esposito, S. Protection of children against influenza: Emerging problems. Human Vaccines and Immunotherapeutics. , 1-8 (2017).
- Falsey, A. R., Treanor, J. J., Tornieporth, N., Capellan, J., Randomized Gorse, G. J. double-blind controlled phase 3 trial comparing the immunogenicity of high-dose and standard-dose influenza vaccine in adults 65 years of age and older. Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 172-180 (2009).
- Fuller, J. D., et al. Influenza vaccination of human immunodeficiency virus (HIV)-infected adults: impact on plasma levels of HIV type 1 RNA and determinants of antibody response. Clinical Infectious Diseases. 28 (3), 541-547 (1999).
- Carrat, F., Flahault, A. Influenza vaccine: the challenge of antigenic drift. Vaccine. 25 (39-40), 6852-6862 (2007).
- Doherty, P. C., Kelso, A. Toward a broadly protective influenza vaccine. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3273-3275 (2008).
- Fiore, A. E., et al. Prevention and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 2010. MMWR Recommendations and Reports. 59 (RR-8), 1-62 (2010).
- Pica, N., Palese, P. Toward a universal influenza virus vaccine: prospects and challenges. Annual Review of Medicine. 64, 189-202 (2013).
- To, K. K., Chan, J. F., Chen, H., Li, L., Yuen, K. Y. The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities. Lancet Infectious Diseases. 13 (9), 809-821 (2013).
- Baker, S. F., Nogales, A., Santiago, F. W., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Competitive detection of influenza neutralizing antibodies using a novel bivalent fluorescence-based microneutralization assay (BiFMA). Vaccine. 33 (30), 3562-3570 (2015).
- He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
- Kayali, G., et al. Testing human sera for antibodies against avian influenza viruses: horse RBC hemagglutination inhibition vs. microneutralization assays. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 73-78 (2008).
- Stephenson, I., et al. Reproducibility of serologic assays for influenza virus A (H5N1). Emerging Infectious Diseases. 15 (8), 1252-1259 (2009).
- Maher, J. A., DeStefano, J. The ferret: an animal model to study influenza virus. Lab Animal (NY). 33 (9), 50-53 (2004).
- Webster, R. G., Cox, N., Stoehr, K. WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev. 1. , (2002).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. Journal of Virology. 89 (6), 3421-3426 (2015).
- Steel, J., Lowen, A. C., Mubareka, S., Palese, P. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathogens. 5 (1), e1000252 (2009).
- Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nature Communications. 6, 6600 (2015).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Perez, J. T., Garcia-Sastre, A., Manicassamy, B. Insertion of a GFP reporter gene in influenza virus. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15G 14 (2013).
- Reuther, P., et al. Generation of a variety of stable Influenza A reporter viruses by genetic engineering of the NS gene segment. Scientific Reports. 5, 11346 (2015).
- Tran, V., et al. Multi-Modal Imaging with a Toolbox of Influenza A Reporter Viruses. Viruses. 7 (10), 5319-5327 (2015).
- Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Perez, D. R., Martinez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A and B Viruses Expressing a Fluorescent Dynamic Timer Protein for In Vitro and In Vivo Studies. PLoS One. 11 (1), e0147723 (2016).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. , 206-216 (2014).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2015).
- Avilov, S. V., et al. Replication-competent influenza A virus that encodes a split-green fluorescent protein-tagged PB2 polymerase subunit allows live-cell imaging of the virus life cycle. Journal of Virology. 86 (3), 1433-1448 (2012).
- Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A Viruses Expressing Reporter Genes. Viruses. 8 (7), (2016).
- Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PLoS One. 9 (5), e97695 (2014).
- Karlsson, E. A., et al. Visualizing real-time influenza virus infection, transmission and protection in ferrets. Nature Communications. 6, 6378 (2015).
- Czako, R., et al. In Vivo Imaging of Influenza Virus Infection in Immunized Mice. MBio. 8 (3), (2017).
- Harding, A. T., Heaton, B. E., Dumm, R. E., Heaton, N. S. Rationally Designed Influenza Virus Vaccines That Are Antigenically Stable during Growth in Eggs. MBio. 8 (3), (2017).
- DiPiazza, A., et al. Pandemic 2009 H1N1 Influenza Venus reporter virus reveals broad diversity of MHC class II-positive antigen-bearing cells following infection in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 10857 (2017).
- Yan, D., et al. Replication-Competent Influenza Virus and Respiratory Syncytial Virus Luciferase Reporter Strains Engineered for Co-Infections Identify Antiviral Compounds in Combination Screens. Biochemistry. 54 (36), 5589-5604 (2015).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (Pt 24), 4247-4260 (2007).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 592-600 (2012).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Vintersten, K., et al. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Pan, W., et al. Visualizing influenza virus infection in living mice. Nat Commun. 4, 2369 (2013).
- Heaton, N. S., et al. In vivo bioluminescent imaging of influenza a virus infection and characterization of novel cross-protective monoclonal antibodies. J Virol. 87 (15), 8272-8281 (2013).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476, 206-216 (2015).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent Bi-Reporter influenza A virus (BIRFLU) to evaluate viral infections. Journal of Virology. , (2019).
- Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. Journal of Virology. 88 (18), 10525-10540 (2014).
- Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. Journal of Virology. 90 (14), 6291-6302 (2016).
- National Research Council (U.S.). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th edn, National Academies Press. (2011).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Chiem, K., Topham, D. J., DeDiego, M. L. Functional Evolution of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus NS1 and PA in Humans. Journal of Virology. 92 (19), (2018).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
