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Immunology and Infection

वायरल संक्रमण के लाइव इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन के लिए एक लुसिफेरेज़-फ्लोरेसेंट रिपोर्टर इन्फ्लुएंजा वायरस

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/59890
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Division of Allergy/Immunology and Rheumatology, Department of Medicine, University of Rochester, 3Center for Animal Health Research, INIA-CISA

Summary

इन्फ्लुएंजा एक वायरस (आईएवी) संक्रामक श्वसन रोगजनक हैं जो वार्षिक महामारियों और कभी-कभी महामारी का कारण बनते हैं। यहाँ, हम एक उपन्यास रिकॉमबिनेंट luciferase और फ्लोरोसेंट-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) का उपयोग कर विवो में वायरल संक्रमण को ट्रैक करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस दृष्टिकोण विवो में आईएवी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है.

Abstract

इन्फ्लुएंजा एक वायरस (IAVs) मानव श्वसन रोग है कि महत्वपूर्ण स्वास्थ्य और आर्थिक परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है कारण. अन्य वायरस के साथ के रूप में, IAV का अध्ययन संक्रमित कोशिकाओं में वायरस की उपस्थिति का पता लगाने के लिए कठिन माध्यमिक दृष्टिकोण के उपयोग की आवश्यकता है और / इस सीमा को हाल ही में पुनः संयोजक IAVs की पीढ़ी के साथ दरकिनार किया गया है आसानी से पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट या bioluminescent (luciferase) रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त. हालांकि, शोधकर्ताओं को विदेशी दृश्यों सहित के लिए आईएवी जीनोम की प्रतिबंधित क्षमता के कारण फ्लोरोसेंट या ल्यूसिफरेस रिपोर्टर जीन का चयन करने के लिए मजबूर किया गया है। इस सीमा को दूर करने के लिए, हम एक पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) stably दोनों एक फ्लोरोसेंट और एक luciferase रिपोर्टर जीन व्यक्त करने के लिए आसानी से इन विट्रो में और विवो में आईएवी संक्रमण को ट्रैक उत्पन्न किया है. इस उद्देश्य के लिए, इन्फ्लुएंजा ए/Puerto रिको/8/34 H1N1 (PR8) के वायरल गैर-संरचनात्मक (एनएस) और हेमग्लूटिनिन (एचए) वायरल खंडों को क्रमशः फ्लोरोसेंट वीनस और बायोल्युमिनेसेंट नैनोलुक लूसीफेरेप्रोटीन को सांकेतिक करने के लिए संशोधित किया गया था। यहाँ, हम आईएवी संक्रमण के एक माउस मॉडल में BIRFLU के उपयोग और दोनों रिपोर्टर जीन का पता लगाने के एक में विवो इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर वर्णन. विशेष रूप से, हम दोनों पत्रकारों और वायरल प्रतिकृति की अभिव्यक्ति के बीच एक अच्छा संबंध देखा है. आणविक जीव विज्ञान, पशु अनुसंधान और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में अत्याधुनिक तकनीकों का संयोजन, शोधकर्ताओं को इन्फ्लूएंजा अनुसंधान के लिए इस उपकरण का उपयोग करने का अनूठा अवसर प्रदान करता है, वायरस होस्ट बातचीत और गतिशीलता के अध्ययन सहित वायरल संक्रमण. महत्वपूर्ण बात, आनुवंशिक रूप से वायरल जीनोम को बदलने के लिए विभिन्न वायरल क्षेत्रों से दो विदेशी जीन व्यक्त करने की व्यवहार्यता के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के अवसरों को खोलता है: (i) उपन्यास IAV टीकों के विकास, (ii) पुनः संयोजक IAVs की पीढ़ी है कि अन्य मानव रोगजनक संक्रमण के उपचार के लिए टीका वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) ओर्थोमाइक्सोविरिडी परिवार 1,2,3के एक ढंके हुए नकारात्मक-सेंस खंडित आरएनए वायरस है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) का अनुमान है कि 3-5 मिलियन वार्षिक इन्फ्लूएंजा के मामलों और दुनिया भर में इन्फ्लूएंजा से 250,000 से अधिक मौतें4,5,6. विशेष रूप से इन्फ्लुएंजा की चपेट में आने वाले समूहों में बुजुर्ग , प्रतिरक्षा - व्यक्तियों और बच्चोंके 7,8,9,10,11शामिल हैं . हालांकि टीके उपलब्ध हैं और वायरल संक्रमण के खिलाफ सबसे आम और प्रभावी हस्तक्षेप का प्रतिनिधित्व करते हैं, आईएवी तेजी से विकसित करने और preexisting प्रतिरक्षा से बचने में सक्षम है3,12,13, 14 , 15. 2009 में एक महामारी H1N1 तनाव के फिर से उभरने और रोगजनक IAV के उद्भव दुनिया भर में मानव सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए लगातार खतरा दोहराताहै 4,16.

एक महामारी या महामारी के दौरान, यह तेजी से रोगजनकता और नए अलग वायरस की transmissibility निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. वर्तमान में वायरस का पता लगाने के लिए उपलब्ध तकनीकें समय लेने वाली हैं औरकभी-कभी उनके लिए कठिन दृष्टिकोणों के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिससे इन विश्लेषणों के पूरा होने में 17 ,18,19,20की देरी हो सकती है . इसके अलावा, वर्तमान वायरल परख को पैमाने पर मुश्किल है, जो एक प्रकोप की स्थिति के दौरान आवश्यक हो सकता है. अंत में, संक्रमण के मान्य पशु मॉडल का उपयोग, जैसे चूहों, गिनी सूअरों और फेरेट नियमित रूप से उपयोग किया जाता है और इन्फ्लूएंजा संक्रमण, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, और नए टीकों की प्रभावकारिता और / हालांकि, इन मॉडलों वास्तविक समय में वायरल गतिशीलता का निरीक्षण करने में असमर्थता के कारण प्रतिबंधात्मक हैं; इस अध्ययन में वायरल संक्रमण के स्थैतिक इमेजिंग 21 ,22,23,24,25को सीमित किया गया है . इन परखों में प्रयुक्त पशुओं को वायरल लोड का निर्धारण करने के लिए भी इच्छामृत्यु दी जाती है, जिससे इन अध्ययनों को पूरा करने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्यामेंवृद्धि होती है . इन सभी सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, कई शोधकर्ताओं पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम, रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग IAVs, जो virological assays को तेज करने और वास्तविक समय में विवो में वायरल लोड और प्रसार का पता लगाने में सक्षम हैं के उपयोग पर भरोसा करते हैं26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. महत्वपूर्ण बात यह है कि ये रिपोर्टर-अभिव्यक्ति IAVs सेल संस्कृति में जंगली प्रकार (WT) IAVs और संक्रमण के पशु मॉडल में इसी तरह दोहराने में सक्षम हैं33,42.

फ्लोरोसेंट और bioluminescent प्रोटीन दो रिपोर्टर सिस्टम आमतौर पर उनकी संवेदनशीलता, स्थिरता और उपयोग में आसानी के कारण शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल कर रहे हैं. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट और bioluminescent प्रोटीन का पता लगाने प्रौद्योगिकियों में जबरदस्त समर्थन और प्रगतिहै 43,44,45,46,47,48 . फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ल्यूसिफरेज़ के अलग-अलग गुण होते हैं जो उन्हें चमकने की अनुमति देते हैं, विशेष रूप से यह अलग होता है कि उत्तेजित अवस्थाएं कैसे उत्पन्न होती हैं और उत्सर्जन का पता कैसे लगाया जाता है43,44,45, 46,47,48. फ्लोरोसेंट प्रोटीन पहले ऊर्जा को अवशोषित करके उत्तेजित होते हैं, जो बाद में एक अलग तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश के रूप में जारी किया जाता है क्योंकि अणु कम ऊर्जा अवस्था43में कम हो जाते हैं। दूसरी ओर, जैव-दीप्ति एक रासायनिक ऊष्माक्षेपी अभिक्रिया से प्राप्त होती है जिसमें प्रकाश45का उत्पादन करने के लिए सब्सट्रेट, ऑक्सीजन तथा कभी-कभी एटीपी शामिल होता है। रिपोर्टर प्रोटीन के इन दो प्रकार के अलग-अलग गुणों के कारण, एक शायद ब्याज के अध्ययन के आधार पर अन्य की तुलना में अधिक फायदेमंद. जहां फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग कोशिकीय स्थानीयकरण28,41का अवलोकन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है , वहीं उनके विवो संकेतों की तीव्रता अपर्याप्त होती है और अक्सर जीवित ऊतकों में स्वप्रवाहता 49 से अस्पष्ट हो जाती है . इसलिए, शोधकर्ता जीवित जीवों में वायरल गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए ल्यूसिफरेस पर भरोसा करते हैं, हालांकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन को पूर्व विवो अध्ययन50,51,52,53के लिए प्राथमिकता दी जा सकती है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विपरीत, luciferases विवो अध्ययन में और अधिक के लिए सुविधाजनक हैं गैर इनवेसिव दृष्टिकोण मेंलागू 26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.अंत में, अध्ययन के प्रकार के आधार पर, शोधकर्ताओं को या तो एक फ्लोरोसेंट या एक luciferase रिपोर्टर प्रोटीन के उपयोग के बीच उनके readout के रूप में चुनना चाहिए, जो कार्यक्षमताओं और संवेदनशीलता के एक व्यापार बंद करने के लिए अपने अध्ययन विषयों, और गंभीर रूप से पुनः संयोजक रिपोर्टर वायरस की उपयोगिता को प्रतिबंधित करता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट या ल्यूसिफरेस सिस्टम और वायरल प्रतिकृति या प्रसार का उपयोग कर के विभिन्न रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के बीच संबंध के बारे में चिंता है, जो के साथ प्राप्त डेटा की व्याख्या ख़तरे में डालना हो सकता है रिपोर्टर-रिपोर्ट-रिपोर्ट आईएवी.

हम एक पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर आईएवी (BIRFLU) है कि दोनों एक फ्लोरोसेंट और एक एक ही वायरल जीनोम55 में एक luciferase प्रोटीन के लिए encodes पैदा करके इस सीमा को दूर किया है (चित्र 1) . यहाँ, NanoLuc luciferase (Nluc), एक छोटे और उज्ज्वल bioluminescent प्रोटीन48, इन्फ्लूएंजा A/Puerto रिको/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, के वायरल हा खंड में हेमग्लूटिनिन (एचए) अनुक्रम के ऊपर डाला गया था 40,55,56,57. इसके अलावा, शुक्र, एक बार इस्तेमाल किया monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन, गैर संरचनात्मक (एनएस) वायरल खंड32,33,36,41,55में डाला गया था. चूंकि BIRFLU दोनों फ्लोरोसेंट और luciferase रिपोर्टर जीन के लिए encodes, या तो रिपोर्टर प्रोटीन संकेत readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है वायरल प्रतिकृति और विट्रो में या विवो55में प्रसार निर्धारित करने के लिए . उत्पादन के बारे में अतिरिक्त जानकारी और इन इन इन इन इन या BIRFLU के vivo लक्षणीकरण में हमारे हाल के प्रकाशन55में पाया जा सकता है . BIRFLU एंटीवायरल दवाओं की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक उपन्यास फ्लोरोसेंट के माध्यम से एंटीबॉडी बेअसर- और bioluminescent आधारित microneutralization परख55. इसके अलावा, BIRFLU भी संक्रमण55के एक माउस मॉडल में वायरल गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पांडुलिपि में, हम इन विट्रो में BIRFLU55 की विशेषता के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन और कैसे विवो में Nluc का पता लगाने के लिए या वीनस पूर्व vivo के लिए vivo luminscence इमेजिंग सिस्टम में उपयोग कर चूहों में BIRFLU संक्रमण का अध्ययन करने के लिए.

आणविक जीव विज्ञान, पशु अनुसंधान और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में अत्याधुनिक तकनीकों का संयोजन, शोधकर्ताओं को आईएवी अनुसंधान के लिए BIRFLU का उपयोग करने का अनूठा अवसर लाता है, जिसमें वायरस-होस्ट इंटरैक्शन, वायरल संक्रमण की गतिशीलता का अध्ययन शामिल है; आईएवी संक्रमण के चिकित्सीय उपचार या अन्य रोगजनक संक्रमण के उपचार के लिए एक टीका वेक्टर के रूप में आईएवी के संभावित उपयोग के लिए उपन्यास टीका दृष्टिकोण का विकास।

Protocol

चूहों से जुड़े सभी प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और Rochester विश्वविद्यालय में संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (IBC) द्वारा अनुमोदित किया गया है, चिकित्सा और दंत चिकित्सा के स्कूल. पशुओं में किए गए सभी प्रयोग राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद58की प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में की गई सिफारिशों का पालन करते हैं . Rochester विश्वविद्यालय में चिकित्सा और दंत चिकित्सा के स्कूल में प्रयोगशाला पशु चिकित्सा सुविधाओं के Vivarium और प्रभाग प्रयोगशाला पशु देखभाल के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा मान्यता प्राप्त है (AALAC) इंटरनेशनल और संघीय और राज्य कानूनों और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (एनआईएच) नीति के अनुरूप. उचित व्यक्तिगत संरक्षण उपकरण (PPE) जब चूहों के साथ काम करने की आवश्यकता है. प्रत्येक संस्थान में इस पांडुलिपि के भीतर उल्लिखित प्रयोगों का निष्पादन करते समय इसी प्रकार की नीतियों और आवश्यकताओं को लागू किया जाना चाहिए।

1. छोटे Vertebrate जानवरों का उपयोग

  1. पांच से सात सप्ताह पुरानी मादा BALB/c चूहों की खरीद और उन्हें विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत पशु देखभाल सुविधा में बनाए रखने. निर्धारित सुविधाओं के लिए चूहों के आगमन पर, 4-5 दिनों के लिए आराम की अवधि की अनुमति के लिए जानवरों को अपने नए वातावरण के लिए acclimate अनुमति देते हैं.
  2. IACUC प्रोटोकॉल के बाद, पिंजरे प्रति 5 चूहों की एक अधिकतम जगह है.
    नोट: प्रयोग निष्कर्ष पर, आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि पशु मर चुका है, चूहों दो अनुमोदित प्रक्रियाओं का उपयोग कर ethanized थे, ध्यान में रखते हुए कि दूसरा एक भौतिक विधि होना चाहिए. इस अध्ययन में, BIRFLU के साथ और विवो इमेजिंग में चूहों के संक्रमण के बाद, जानवरों को 2,2,2-tribromoethanol (TBE) की घातक खुराक के साथ ethanized कर रहे हैं, और शारीरिक माध्यमिक विधि के रूप में यकृत नस काटने के रूप में हम पहले से पता चला है23.

2. जैव सुरक्षा

नोट: इस पांडुलिपि में, इन्फ्लुएंजा A/Puerto रिको/08/34 H1N1 (PR8) की रीढ़ की हड्डी में BIRFLU उत्पन्न किया गया था, जो एक आम माउस-अनुकूलित प्रयोगशाला IAV तनाव23,32,33,56है . वायरस पहले वर्णित प्लाज्मिड आधारित रिवर्स जेनेटिक्स दृष्टिकोण और पीढ़ी का एक पूरा विवरण का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था, और इन विट्रो में और BIRFLU के vivo लक्षणमें हमारे हाल के प्रकाशन55में पाया जा सकता है। सभी प्रक्रियाओं है कि आईएवी संक्रमण शामिल (विट्रो में या विवो में) जैव सुरक्षा स्तर (BSL)-2 शर्तों के तहत एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया गया.

चेतावनी: एक उपयुक्त जैव सुरक्षा स्तर एक जैव सुरक्षा जोखिम मूल्यांकन के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए. जैव सुरक्षा जोखिम मूल्यांकन करने और प्रभावी जैव सुरक्षा रोकथाम की स्थापना के बारे में अतिरिक्त जानकारी उस संस्थान के साथ परामर्श किया जाना चाहिए जहां प्रयोग किए जाएंगे।

  1. सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के प्रदर्शन से पहले और बाद में 70% इथेनॉल या क्लोरीन डाइऑक्साइड कीटाणुनाशक के साथ जैव सुरक्षा अलमारियाँ साफ करें। चूहों के काम के लिए, सभी विच्छेदन सामग्री (sciss, विच्छेदन संदंश, आदि) और उनके उपयोग से पहले और बाद में dounce homogenizer बाँझ.
  2. उचित आईबीसी और IACUC दिशा निर्देशों के तहत प्रक्रियाओं के दौरान उत्पादित सभी जैविक सामग्री को छोड़ दें।

3. BIRFLU की विट्रो विशेषता में (चित्र 2)

नोट: सभी बफ़र और मीडिया रचनाओं के लिए तालिका 1 देखें.

  1. फ्लोरोसेंट द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें (चित्र 2क) और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्र 2ख)
    1. संक्रमण से एक दिन पहले, ऊतक संस्कृति मीडिया में Madin-Darby कैनी किडनी (MDCK) उपकला कोशिकाओं (1 x 105 कोशिकाओं / नकली संक्रमित और BIRFLU-संक्रमित कोशिकाओं दोनों में सभी चुने गए एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त कुओं को तैयार करें।
      नोट: हम वायरल संक्रमण शुरू करने से पहले एक मोनोलेयर की पुष्टि करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं visualizing सलाह देते हैं। संक्रमण के समय तक एमडीसीके कोशिकाओं के 90% संगम मोनोलेयर की सिफारिश की जाती है।
    2. संक्रमण मीडिया में डब्ल्यूटी या BIRFLU IAVs के कमजोर पड़ने की तैयारी करें और संक्रमण मीडिया के अंतिम खंड में 0.25 एमएल/वेल के अंतिम खंड में 0.1 प्लेक-फॉर्मिंग यूनिट (पीएफयू) प्रति सेल के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता के साथ बीजप्राप्त एमडीसीके कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    3. चरण 3.1.1 से ऊतक संस्कृति माध्यम निकालें और 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ दो बार MDCK कोशिकाओं को धो लें। MDCK कोशिकाओं के लिए 3.1.2 से वायरस कमजोर पड़ने जोड़ें और वायरल अधिशोषण की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए एक कमाल मंच पर प्लेटें जगह.
      नोट: मॉक-संक्रमित कोशिकाओं को केवल वायरस के अभाव में संक्रमण मीडिया के साथ इनक्यूबेट किया जाता है।
    4. वायरल अधिशोषण (चरण 3.1.3) के बाद, आकांक्षा द्वारा वायरल इनोकुलम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में टीपीसीके-उपचारित ट्रिप्सिन के 1 ग्राम/एमएल वाले पोस्ट-इंफेक्शन मीडिया के 1 एमएल को जोड़ें। 33 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ2 humidified इनक्यूबेटर में 18 एच के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    5. संक्रमण के 18 एच के बाद, 24-वेल प्लेट (3.1.4) से ऊतक संस्कृति supernatant हटा दें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए निर्धारण/permeabilization समाधान के 0.25 एमएल/वेल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और permeabilize।
      नोट: फार्मेल्डिहाइड जोखिम को रोकने के लिए एक धूआं हुड में निर्धारण/permebilization समाधान तैयार करें।
    6. चरण 3.1.5 से निर्धारण/permebilization समाधान निकालें, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ दो बार धो लें, और कक्ष के तापमान पर 1 h के लिए समाधान को अवरुद्ध करने के 0.25 एमएल/वेल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को अवरुद्ध करने में अगले चरण या स्टोर कोशिकाओं के लिए आगे बढ़ें।
    7. अवरुद्ध समाधान निकालें (चरण 3.1.6) और जोड़ें 0.25 एमएल/वेल (1 डिग्री ग्राम/एमएल) एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MAb) IAV न्यूक्लिओप्रोटीन के खिलाफ, एनपी (एचबी-65) या एक खरगोश polyclonal एंटीबॉडी (pAb) के खिलाफ एक खरगोश polyclonal एंटीबॉडी (pAb) की सामग्रीदेखें ( की सामग्री देखें), एंटीबॉडी तनुता समाधान (1x पीबीएस, 2.5% बीएसए) में पतला दोनों, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    8. चरण 3.1.7 से प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें, कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और उन्हें टेक्सास रेड-कंजुटेड एंटी-माउस या एंटी-रैबिट सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ 0.25 एमएल/वेल के साथ इनक्यूबेट करें (सामग्री की तालिकादेखें ) एंटीबॉडी में पतला 1:200 तनुता समाधान.
      नोट: सेल नाभिक एक ही माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान करने के लिए 4',6'-diamidino-2-फेनिलिनोल (DAPI) के 0.5 डिग्री/ अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। अन्य माध्यमिक एंटीबॉडी अन्य फ्लोरोफोर्स के साथ संयुग्मी का उपयोग किया जा सकता है।
    9. चरण 3.1.8 से द्वितीयक एंटीबॉडी और DAPI निकालें, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ तीन बार धो लें। धोने के बाद, कोशिकाओं को 0.25 एमएल/वेल में 1x पीबीएस में छोड़ दें।
    10. शुक्र और Nluc रिपोर्टर अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के मंच पर थाली प्लेस, और उचित फ्लोरोसेंट फिल्टर का उपयोग कर संक्रमित कोशिकाओं से एनपी. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (20x आवर्धन) का उपयोग कर छवियों पर कब्जा और उन्हें एक छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विलय (चित्र 2A, बी) .
  2. Nluc गतिविधि का विश्लेषण करें (चित्र 2C) और वायरल प्रतिकृति (चित्र 2D) .
    1. संक्रमण से एक दिन पहले, एमडीकेके कोशिकाओं (2 x 105कोशिकाओं/अच्छी तरह से, ट्रिप्लिकेट्स) के साथ 12-वेल प्लेट्स 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ऊतक संस्कृति मीडिया का उपयोग करके संक्रमण के समय तक लगभग 90% संगम तक पहुंच सकते हैं।
      नोट: संक्रमण से पहले, MDCK कोशिकाओं के मोनोलेयर को सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें।
    2. संक्रमण के दिन 0.5 एमएल/वेल में 0.001 PFU के MOI के साथ ट्रिपलिकेट में MDCK कोशिकाओं (चरण 3.2.1.) को संक्रमित करने के लिए संक्रमण मीडिया में WT और BIRFLU वायरस के कमजोर पड़ने तैयार करते हैं। ऊतक संस्कृति माध्यम निकालें और 1x पीबीएस के साथ दो बार MDCK कोशिकाओं को धो लें।
    3. MDCK monolayers करने के लिए वायरस कमजोर पड़ने जोड़ें और एक कमाल मंच पर 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर वायरल अधिशोषण की अनुमति देते हैं। वायरल अधिशोषण के बाद, वायरस इनोकुलम को हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से टीपीसीके-उपचार ित ट्रिप्सिन के 1 डिग्री ग्राम/एमएल वाले पोस्ट-इंफेक्शन मीडिया के 1.5 एमएल जोड़ें। 33 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ2 humidified इनक्यूबेटर में संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और चरण 3.2.4 में इंगित संकेत समय बिंदुओं पर supernatants इकट्ठा।
    4. 24, 48, 72, और 96 एच पोस्ट संक्रमण (p.i.) प्रत्येक अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति supernatant के 150 डिग्री सेल्सियस इकट्ठा करने और -80 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge ट्यूब में नमूने की दुकान Nluc assays और वायरल titrations प्रदर्शन करने के लिए.
    5. Nluc गतिविधि परख करने के लिए, निर्माता के संकेतकापालन करें। सबसे पहले, बर्फ पर -80 डिग्री सेल्सियस (चरण 3.2.4) पर संग्रहीत ऊतक संस्कृति supernatant thaw.
      नोट: निर्माता से सिफारिशों को देखें और यदि आवश्यक हो तो परख का अनुकूलन करें।
    6. कमजोर पड़ने बफर के साथ Nluc सब्सट्रेट 1:50 को कम करके luciferase परख समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें। ल्यूसिफेस परख के लिए एक सफेद फ्लैट-नीचे 96-वेल माइक्रोप्लेट में, एकत्र किए गए ऊतक संस्कृति supernatant नमूनों के 10 से 25 डिग्री के साथ luciferase परख समाधान के 25 डिग्री एल मिश्रण। luminometer का उपयोग करके संदीप्ति को मापने से पहले 2-3 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें (चित्र 2ब्)।
      नोट: ऊतक संस्कृति supernatants में संक्रामक वायरल कणों की उपस्थिति फ्लोरोसेंट प्रतिरक्षा फोकस परख (वीनस) या अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस (वायरल एंटीजन धुंधला) द्वारा निर्धारित किया जाता है जैसा कि पहले वर्णित23,32, 33,56.
    7. वायरल titrations से पहले एक दिन, एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में बीज MDCK कोशिकाओं (2 x 104 कोशिकाओं / ठीक है, triplicates) ऊतक संस्कृति मीडिया के साथ और कोशिकाओं को एक इनक्यूबेटर में संक्रमण के समय तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं 37 डिग्री सेल्सियस के साथ सेट 5% सीओ2के साथ .
    8. ऊतक संस्कृति supernatant नमूने है कि बर्फ पर thawed थे का प्रयोग करें (कदम 3.2.4.). एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में कुओं में से प्रत्येक के लिए संक्रमण मीडिया के 90 डिग्री एल जोड़ें, तो पहले अच्छी तरह से (पंक्ति ए) के लिए thawed ऊतक संस्कृति supernatant (कदम 3.2.4) के 10 $L जोड़ें। मिश्रण और पंक्ति A से पंक्ति B. कमजोर पड़ने के बीच युक्तियों को बदलने और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टीचैनल पाइप का उपयोग करें।
      नोट: अंतिम पंक्ति (H) तक यह कार्यविधि दोहराया जाना चाहिए। हम वायरल titers का सही उपाय के लिए triplicates में वायरल titrations प्रदर्शन की सलाह देते हैं.
    9. 96-वेल प्लेट्स (चरण 3.2.7) में MDCK कोशिकाओं से ऊतक संस्कृति माध्यम निकालें और 1x PBS के साथ दो बार धो लें। एमडीसीके कोशिकाओं वाले 96-वेल प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए प्रतिकृति 96-वेल प्लेट के 50 डिग्री एल जोड़ें।
    10. वायरल अधिशोषण की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए एक कमाल मंच पर 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें। वायरल अधिशोषण के बाद, इनोकुलम को हटा दें और टीपीसीके-उपचारित ट्रिप्सिन के 1 डिग्री ग्राम/एमएल वाले संक्रमण के बाद मीडिया के 100 $L/वेल जोड़ें। 5% सीओ2के साथ 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 एच के लिए संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    11. BIRFLU शुक्र व्यक्त करता है के बाद से, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या सीधे एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर गिना जा सकता है. वैकल्पिक रूप से , वायरल titers अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा निर्धारित किया जा सकता है के रूप में पहले एक वायरल प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर वर्णित23,56,57,59. बाद के लिए, धारा 4.4 में वर्णित के रूप में विरोधी एनपी mAb एचबी-65 का उपयोग कर कोशिकाओं और दाग को ठीक करने के लिए आगे बढ़ें।
    12. सूत्र का उपयोग करके फ्लोरोसेंट बनाने वाली इकाइयों (FFU)/mL की संख्या की गणना करके वायरल titersनिर्धारित करें: ((FFU की संख्या) x 20 x 1/

4. BIRFLU के Vivo विशेषता में (चित्र 3 और चित्र 4)

  1. माउस संक्रमण
    नोट:     चूहों के Intranasal संक्रमण पहले के रूप में वर्णित किया गया था23. संक्रमण के माउस मॉडल का उपयोग कर के विवो में IAV संक्रमण के एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, हम पिछले प्रकाशन23के साथ जुड़े वीडियो को देखने की सलाह देते हैं। यह अनुभाग केवल BIRFLU के साथ माउस संक्रमण के लिए आवश्यक चरणों को सारांशित करता है।
    1. चूहों का निरीक्षण करने के लिए उनके स्वास्थ्य और समग्र शारीरिक उपस्थिति का मूल्यांकन. 1x पीबीएस में BIRFLU के कमजोर पड़ने के लिए चूहों को टीका करने के लिए तैयार 1 x 106 PFU BIRFLU के साथ एक कुल मात्रा में 30 $L/ माउस टीका तक बर्फ पर वायरस बनाए रखें.
      नोट: नकली संक्रमित (1x पीबीएस) चूहों इमेजिंग के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में की जरूरत होगी. BIRFLU संक्रमित जानवरों की तुलना में एक अलग पिंजरे में नकली संक्रमित चूहों प्लेस.
    2. पेट के दाईं ओर के कैडल 2/3 में सुई डालने से पांच से सात सप्ताह पुरानी मादा बीएएलबी/सी चूहों को 240-250 मिलीग्राम/किग्रा ट्राइब्रोमोथेनोल (टीबीई) के साथ एन्सथेटाइज़ करें। फिर, माउस को पिंजरे में वापस करें और लगभग 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें, जांच करें कि माउस को टो-पिंच प्रतिवर्त की अनुपस्थिति से वायरस टीका लगाने से पहले एनेस्थेटाइज़ किया गया है.
      नोट: इंजेक्शन शामक vivo में इन्फ्लूएंजा संक्रमण के लिए साँस शामक पर सिफारिश कर रहे हैं, बाद के व्यवहार को संशोधित कर सकते हैं और airway उपकला द्वारा वायरस के तेज के रूप में. इसके अलावा, वे फेफड़ों की स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी प्रभावित कर सकते हैं और संक्रमित चूहों के विवो इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं। अंत में, साँस शामक प्रभाव की अवधि कम है, जो संक्रमित जानवरों के vivo इमेजिंग में के लिए एक समस्या होगी.
    3. तैयार BIRFLU कमजोर पड़ने के 30 डिग्री एल के साथ चूहों intranasally टीका. जाँच करें कि चूहों उन्हें पिंजरे में लौटने से पहले ठीक से साँस ले रहे हैं.
  2. BIRFLU से संक्रमित चूहों की जैव-संदीप् ति निगरानी (चित्र 4A)
    नोट:     Nluc या शुक्र की इस पांडुलिपि रिपोर्टर अभिव्यक्ति और BIRFLU से संक्रमित चूहों के फेफड़ों में वायरल प्रतिकृति 3 दिनों के बाद संक्रमण पर निर्धारित कर रहे हैं. हालांकि, bioluminescence इमेजिंग की प्रकृति प्रत्येक प्रयोगात्मक समय बिंदु के लिए उन्हें इच्छामृत्यु की आवश्यकता के बिना व्यक्तिगत BIRFLU संक्रमित जानवरों में Nluc अभिव्यक्ति की बार-बार निगरानी की अनुमति देता है. वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को करने के लिए आइसोलुरेन संज्ञाहरण कई गुना के साथ विवो इमेजिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है। छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया इमेजिंग साधन और छवि सॉफ्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    1. जैव-दीप्ति संकेत में सुधार करने के लिए चूहों छाती दाढ़ी. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और प्रारंभ करेंदबाएँ. अगले, इस्तेमाल किया जाएगा कि मानकों सेट, bioluminescence के लिए इमेजिंग मोड की स्थापना सहित, ऑटो की बचत, ऑटो के लिए जोखिम समय, खुले फिल्टर, आदि.
    2. एक बार मशीन पूरी तरह से शुरू हो जाने पर, आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण प्रणाली को चालू करें। संज्ञाहरण कक्ष में जानवरों रखें। चूहे एक साथ और हल्के से ऑक्सीजन गैस के मिश्रण के साथ anesthetized कर रहे हैं और वाष्पीकृत 1-2% isoflurane.
    3. एक बार चूहों anesthetized कर रहे हैं, Nluc सब्सट्रेट प्रशासन (सामग्री की तालिकादेखें) पतला 1:10 में 1x पीबीएस (अंतिम मात्रा 100 $L/माउस) एक 22 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर के माध्यम से कक्षीय मार्ग.
    4. Nluc अभिकर्मक प्रशासन के तुरंत बाद, इमेजिंग के दौरान पशु एनेस्थेटाइज़्ड रखने के लिए जानवरों को कई गुना शंकु के अंदर सामना करना पड़ रहा है और उनके चेस्ट के साथ इमेजिंग उपकरण में जानवरों को रखें। छविकार दरवाजा बंद करने के तुरंत बाद, सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में प्राप्त करें क्लिक करें (चित्र 4A, शीर्ष).
    5. इमेजिंग के बाद, चूहों उन्हें निगरानी उन्हें वापस जब तक वे पूरी तरह से बरामद किया है और isoflurane vaporizer बंद कर देते हैं. फिर, वीनस रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति (अनुभाग 4.3) का मूल्यांकन करने के लिए चूहों फेफड़ों के पूर्व विवो इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें।
    6. अधिग्रहीत bioluminscence डेटा का विश्लेषण करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग करें. विशिष्ट संकेत निर्दिष्ट करने और ब्याज के क्षेत्र में प्रवाह माप प्रदर्शन करने के लिए उपकरण रॉय (ब्याज के क्षेत्र) का उपयोग करें (आमतौर पर छाती के आसपास) (चित्र 4A, नीचे). हालांकि ROI आकार अप्रासंगिक है, बड़े ROIs आम तौर पर पूरे संकेत प्रसार क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए पसंद कर रहे हैं.
    7. मापेंक्लिक करें. फोटॉनों में bioluminescence का आकलन के बाद से यह एक पूर्ण फोटॉन उत्सर्जन माप है कि विभिन्न मापदंडों या इमेजिंग उपकरणों द्वारा प्रदान की उत्पादन माप के लिए तुलनीय है प्रदान करता है.
  3. BIRFLU से संक्रमित चूहों में फ्लोरोसेंट विश्लेषण (चित्र 3 और चित्र 4B)
    1. विवो इमेजिंग में माउस फेफड़ों को इकट्ठा करें, जैसा कि पहले23में वर्णित किया गया था।
      1. संक्षेप में, TBE की घातक खुराक के साथ चूहों की इच्छा (500 मिलीग्राम/ 70% इथेनॉल के साथ चीरा साइट को संक्रमित. एक स्केलपेल के साथ, पेट के आधार पर स्टर्नम से चीरा लगाएं और फिर कैंची से किनारों को चीरा के नीचे से काट दें। इसके बाद, पशु को खून करने के लिए यकृत शिरा (दूसरी शारीरिक इच्छामृत्यु विधि) को काट दिया।
        नोट: इमेजिंग के दौरान उच्च पृष्ठभूमि संकेत से बचने के लिए, फेफड़ों में रक्त की मात्रा को कम करना महत्वपूर्ण है (नीचे देखें)।
    2. पृष्ठीय recumbency में माउस प्लेस, और pleura में कटौती और रिब पिंजरे को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें। बाद में, धीरे forceps के साथ फेफड़ों पकड़े हुए कैंची से श्वासनली के अंत snipping द्वारा फेफड़ों को हटा दें।
      1. फेफड़ों को एक छह-वेल प्लेट में 2 एमएल 1x पीबीएस के साथ रखें और 1x पीबीएस के साथ तीन बार फेफड़ों को धोएं।
        नोट: नमूनों के बीच संदूषण से बचने के लिए, प्रत्येक जानवर के बीच विच्छेदन उपकरणको साफ और कीटाणुरहित करना।
    3. क्लिक प्रारंभ करके छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें और इमेजिंग के लिए पैरामीटर सेट, फ्लोरोसेंट के लिए इमेजिंग मोड की स्थापना सहित, ऑटो की बचत, ऑटो के लिए जोखिम समय, उत्तेजना (500 एनएम) और उत्सर्जन (540 एनएम) फिल्टर.
    4. जब मशीन प्रारंभ हो जाती है, तो फेफड़ों को एक काली पृष्ठभूमि ट्रे में रखें, यह सुनिश्चित करना कि ऊतकों को एक-दूसरे से अलग किया जाए, इमेजर में ट्रे का परिचय दें, और इमेजर दरवाजा बंद करने के बाद इमेजिंग सिस्टम प्रोग्राम पर प्राप्त करें क्लिक करें ( चित्र 4B, शीर्ष).
    5. इमेजिंग के बाद, ऊतकों को तुरंत हटा दें और उन्हें बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर स्टोर करें यदि नमूने उसी दिन संसाधित किए जाते हैं; या एक ट्यूब और सूखी बर्फ पर उन्हें जल्दी फ्रीज करने के लिए, उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले, अगर नमूने एक अलग दिन पर बाद में संसाधित किया जाएगा.
    6. छवि संसाधन के लिए, ROI टूल का चयन करें और प्रत्येक अलग-अलग फेफड़ों के आस-पास ROI आरेखित करें. मापेंक्लिक करें. फिर, परिणामी औसत विकिरण दक्षता माप का उपयोग करके, नकली संक्रमित चूहों से मान घटाएँ (चित्र 4B, नीचे).
      नोट: BIRFLU के साथ, वहाँ Nluc और शुक्र अभिव्यक्ति के स्तर का एक अच्छा संबंध है, और संकेत वितरण. इसलिए, यह एक ही जानवर से Nluc (पूरे माउस) और वीनस (एक्साइज्ड फेफड़ों) अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है, और एक ही अभिविन्यास बनाए रखने के.
  4. चूहों के फेफड़ों में BIRFLU प्रतिकृति का मूल्यांकन (चित्र 3 और चित्र 4C)
    1. प्लेक परख द्वारा वायरल अनुमापन के लिए चूहों के फेफड़ों को होमोजेनाइज करें जैसा कि पहले23का वर्णन किया गया था .
  5. ठंडा संक्रमण मीडिया के 1 एमएल के साथ एक Dounce homogenizer में फेफड़ों प्लेस. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए मूसल के साथ फेफड़ों homogenize जब तक यह पूरी तरह से विघटित है और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ ट्यूब में नमूने की दुकान.
    1. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर नमूने centrifuge और एक बाँझ ट्यूब में supernatant इकट्ठा. बर्फ पर नमूने स्टोर अगर वे एक ही दिन में इस्तेमाल किया जाएगा या उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करने के लिए एक बाद में वायरल titers का मूल्यांकन.
      नोट: प्रत्येक फेफड़ों के नमूने के लिए एक नया डंजर homogenizer इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    2. पट्टिका परख प्रदर्शन करने के लिए, वायरल अनुमापन करने से पहले दिन, ऊतक संस्कृति मीडिया में एमडीसीके कोशिकाओं (5 x 105 कोशिकाओं/वेल) के साथ छह-वेल प्लेट्स बीज। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 5% सीओ2 के साथ इनक्यूबेट करें ताकि अगले दिन 90% संगम तक पहुंच सके। संक्रमण से पहले, पुष्टि करें कि कोशिकाओं को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एक मोनोलेयर फार्म.
    3. संक्रमण मीडिया में homogenized नमूनों (चरण 4.4.1) से supernatant के 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें. संक्रमण मीडिया के 540 डिग्री सेल्सियस के साथ microcentrifuge ट्यूब तैयार, homogenized फेफड़ों के नमूने से पहले ट्यूब के लिए 60 डिग्री सेल्सियस जोड़ने, ऊपर और नीचे pipeting द्वारा मिश्रण, और फिर एक नया टिप का उपयोग कर, हस्तांतरण 60 $L अगले ट्यूब के लिए. पिछले कमजोर पड़ने तक इस धारावाहिक कमजोर पड़ने की प्रक्रिया को दोहराएँ.
      नोट: हमारे अनुभव में 7 कमजोर पड़ने संक्रमित चूहों के फेफड़ों से पट्टिका परख द्वारा वायरल titers निर्धारित करने के लिए पर्याप्त हैं.
    4. MDCK कोशिकाओं को धो लें (चरण 4.4.3) 1x पीबीएस के साथ दो बार और छह अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से पतला नमूनों के 500 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण. एक कमाल मंच पर प्लेटें प्लेस और वायरल अवशोषण कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए होने के लिए अनुमति देते हैं।
    5. वायरल अवशोषण के 1 एच के बाद, वायरल इनोकुलम को हटा दें, टीपीसीके-उपचारित ट्रिप्सिन के 1 डिग्री ग्राम/एमएल वाले ओवरले माध्यम के 2 एमएल/वेल को जोड़ें, और फिर 3 दिनों के लिए 5% सीओ2 के तहत 33 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    6. संक्रमित कोशिकाओं को ठीक करें (चरण 4.4.6) के साथ 1 एमएल/वेल 4% फॉर्मेल्डिहाइड के साथ 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस में पतला, फिर ध्यान से ओवरले माध्यम को हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से 1x पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें। शुक्र के दृश्य के लिए, फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए एक इमेजिंग प्रणाली के साथ छह अच्छी प्लेटें छवि.
      नोट: वायरल प्लेक एक छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रंग का हो सकता है (सामग्री की तालिकादेखें).
    7. Nluc अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, एक विरोधी Nluc pAb का उपयोग कर immunostaining द्वारा वायरल प्लेक कल्पना. इसके लिए, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.5 एमएल/वेल का उपयोग करके 1x पीबीएस, permebilize कोशिकाओं को हटा दें।
    8. permebilization समाधान निकालें, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ तीन बार धोएं और कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए समाधान को अवरुद्ध करने के 0.5 एमएल/वेल के साथ ब्लॉक करें।
    9. चरण 4.4.9 से अवरुद्ध समाधान निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए कमजोर पड़ने के समाधान में पीएबी एंटी-Nluc पतला 1:1,000 के 0.5 एमएल/वेल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    10. Nluc-expressing प्लेक के दृश्य के लिए निर्माता की सिफारिश के बाद एबीसी क्षारीय फॉस्फेटस किट और DAB Peroxidase Substrate किट का प्रयोग करें।
      1. संक्षेप में, 1x पीबीएस के साथ 4.4.10 तीन बार से कोशिकाओं को धोने और उन्हें 0.5 एमएल /
      2. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें, कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए एबीसी समाधान के साथ इनक्यूबेट करें। 1x पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोएं और DAB एचआरपी सब्सट्रेट किट के साथ वायरल प्लेक कल्पना करें। एक पारंपरिक स्कैनर का उपयोग कर प्रतिरक्षा से सना हुआ प्लेक स्कैन करें।
        नोट: इम्यूनोस्टेनिंग के लिए अन्य इसी तरह की किट का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    11. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए क्रिस्टल बैंगनी समाधान के साथ वायरल प्लेक दाग। क्रिस्टल बैंगनी छोड़ें, प्लेटों को पानी से तीन बार धोएं, प्लेटों को सूखने दें, और प्लेटों को फिर से स्कैन करें।
    12. वायरल titers निर्धारित करने के लिए, क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के बाद पता चला प्लेक गिनती. एक पारंपरिक स्कैनर का उपयोग कर प्लेक स्कैन करें। प्रति एमएल (PFU/mL) के रूप में वायरस टिटर की गणना करें।
    13. विवो में BIRFLU स्थिरता का आकलन करने के लिए, क्रिस्टल बैंगनी सना हुआ प्लेक (संक्रामक वायरस की संख्या, चरण 4.4.12) की संख्या की गणना करके रिपोर्टर-एक्सप्रिंग वायरस के प्रतिशत की गणना करें और वीनस-और Nluc-expressing प्लेक की संख्या के साथ तुलना करें () चरण 4.4.7 और चरण 4.4.11, क्रमशः).

Representative Results

इन विट्रो में BIRFLU का उत्पादन और लक्षण (चित्र 1 और चित्र 2)

एक पुनः संयोजक प्रतिकृति-सक्षम आईएवी दो अलग-अलग रिपोर्टर जीन ों को व्यक्त (BIRFLU) कला आणविक जीव विज्ञान और प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक के राज्य का उपयोग कर का निर्माण किया गया था (चित्र 1)। यहाँ, हम अपने छोटे आकार, एटीपी स्वतंत्रता, अधिक तीव्रता, और अनुकूलित सब्सट्रेट48,60सहित अन्य luciferases पर कई फायदे के कारण Nluc का उपयोग करने के लिए चुना है। Nluc IAV PR8 के HA खंड में क्लोन किया गया था porcine teschovirus (PTV) 2A दरार साइट (2A) के सामने खुला पढ़ने फ्रेम (ORF) के सामने (चित्र 1). एचए के ORF मूल पैकिंग संकेतों को हटाने और किसी भी संभव पुनर्संयोजन से बचने के लिए मूक उत्परिवर्तनों शामिल थे। पूरा हा पैकेजिंग संकेत Nluc के सामने जोड़ा गया था एक ही वायरल आरएनए खंड से virion और Nluc और Nluc और हा अभिव्यक्ति में संशोधित हा खंड के उचित समावेश की अनुमति देने के लिए (चित्र 1) . इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस एक संशोधित IAV PR8 एन एस खंड है जो दो वायरल प्रोटीन NS1 और एक ही प्रतिलिपि से एनईपी encodes में क्लोन किया गया था32,36,41,54, 57| उस अंत तक, शुक्र को NS1 के सी-टर्मिनल से मिला दिया गया था और पूरे एनईपी ओआरएफ को पीटीवी 2ए क्लीवेज साइट के डाउनस्ट्रीम से क्लोन किया गया था जो एनएस1-वीनस और एनईपी अनुक्रमों के बीच रखा गया था (चित्र 1)। अंत में, इन दो संशोधित हा और एन एस वायरल प्लाज्मिड constructs IAV PR8 रिवर्स आनुवंशिकी प्लाज्मिड के बाकी के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया BIRFLU उत्पन्न करने के लिए (चित्र 1). इन विट्रो और विवो चरित्र में BIRFLU के पहले55वर्णित किया गया है .

चित्र 2में, हम प्रतिदीप्ति तथा अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोणों (चित्र 2क, बी) का उपयोग करके शुक्र, Nluc और NP व्यंजक स्तरों का निर्धारण करके विट्रो BIRFLU में विशेषता करते हैं. MDCK कोशिकाओं के confluent monolayers या तो नकली संक्रमित या संक्रमित थे (MOI 0.1) WT या BIRFLU PR8 वायरस के साथ और, 18 एच के बाद संक्रमण पर, वीनस अभिव्यक्ति सीधे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था (चित्र2A,B). Nluc (चित्र 2A) और एनपी (चित्र 2B) अभिव्यक्ति अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्रत्येक प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके कल्पना की गई थी। प्रत्याशित के रूप में, वीनस और Nluc अभिव्यक्ति केवल BIRFLU से संक्रमित कोशिकाओं में पाया गया और WT PR8 वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में नहीं. इसके अलावा, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ने डब्ल्यूटी और BIRFLU PR8-संक्रमित कोशिकाओं दोनों में एनपी अभिव्यक्ति का पता चला। शुक्र, Nluc या एनपी की कोई अभिव्यक्ति का पता नहीं लगाया गया, के रूप में की उम्मीद, नकली संक्रमित कोशिकाओं में (चित्र ए,बी).

इन विट्रो में Nluc अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए, MDCK कोशिकाओं को संक्रमित थे (MOI 0.001) WT या BIRFLU PR8 वायरस और ऊतक संस्कृति supernatants में Nluc गतिविधि के साथ 24, 48, 72 और 96 एच पोस्ट संक्रमण (चित्र 2C) पर मूल्यांकन किया गया था. BIRFLU से संक्रमित MDCK कोशिकाओं के ऊतक संस्कृति supernatants में केवल Nluc गतिविधि का पता लगाया गया था (चित्र 2C) ऊतक संस्कृति supernatants में Nluc गतिविधि के रूप में जल्दी के रूप में पता चला था 24 एच के बाद 96 एच के बाद संक्रमण पर उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के साथ संक्रमण, सबसे शायद क्योंकि वायरल संक्रमण के दौरान प्रेरित cytopathic प्रभाव (सीपीई) जारी Nluc प्रोटीन बनाए रखा सेल में. सुसंस्कृत कोशिकाओं में BIRFLU की फिटनेस का मूल्यांकन करने के लिए, WT और BIRFLU PR8 वायरस की वृद्धि गतिजका का भी मूल्यांकन किया गया (चित्र 2D) और ऊतक संस्कृति supernatants में संक्रामक वायरस की उपस्थिति प्रतिरक्षा फोकस परख द्वारा निर्धारित किया गया था (चित्र 2 डी ). विशेष रूप से, BIRFLU प्रतिकृति गतिज WT PR8 वायरस के उन लोगों के लिए तुलनीय थे, हालांकि BIRFLU प्रतिकृति थोड़ा देरी हो गई थी और WT PR8 के रूप में एक ही वायरल titers तक नहीं पहुँच. तथापि, BIRFLU 5 x 107 PFU/mL (चित्र2D)के titers तक पहुँचने में सक्षम था, यह दर्शाता है कि वायरल जीनोम में दो रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति एमडीसीके कोशिकाओं में BIRFLU प्रतिकृति के साथ काफी हस्तक्षेप नहीं करता है।

चूहों में BIRFLU संक्रमण ट्रैकिंग (चित्र 3 और चित्र 4)

चित्र 3 आईएवी संक्रमण के माउस मॉडल में BIRFLU गतिशीलता के मूल्यांकन के लिए एक योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट है। पांच से सात सप्ताह पुरानी महिला BALB/C चूहों या तो नकली 1x पीबीएस के साथ संक्रमित थे या 1 x 106 PFU के साथ संक्रमित BIRFLU intranasally. संक्रमण के बाद 3 दिनों में, चूहों को isoflurane के साथ एनेस्थेटाइज़ किया गया और फिर Nluc सब्सट्रेट रेट्रो-ऑर्बिटलकेके के साथ इंजेक्ट किया गया। सभी चूहों को तुरंत IVIS उपकरण में रखा गया था और Nluc संकेत IVIS का उपयोग कर विवो में मूल्यांकन किया गया था। इसके बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और फेफड़ों को काटा गया। इसके बाद वीनस एक्सप्रेशन के माध्यम से फ्लोरो की तीव्रता निर्धारित करने के लिए इन विवो इमेजर का उपयोग करके एक्स विवो का विश्लेषण किया गया। अंत में, चूहों फेफड़ों homogenized थे, और वायरल titers और स्थिरता पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किए गए थे. प्लेक वीनस के प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट द्वारा मूल्यांकन किया गया था, Nluc के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर और क्रिस्टल बैंगनी धुंधला द्वारा इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा।

पहले प्रतिकृति-सक्षम रिपोर्टर-एक्सप्रेसIng IAVs एक एकल रिपोर्टर जीन व्यक्त, सबसे अधिक बार या तो एक फ्लोरोसेंट या एक bioluminescent प्रोटीन, वायरल संक्रमण और प्रतिकृति के लिए किराए के रूप में. हालांकि, BIRFLU, वायरल संक्रमण पर रिपोर्टर जीन के दोनों प्रकार व्यक्त करने में सक्षम है. BIRFLU संक्रमण के बाद bioluminscence (विवो इमेजिंग में) और फ्लोरो इमेजिंग (एक्स विवो इमेजिंग) के बीच संबंध का आकलन करने के लिए, पांच से सात सप्ताह की महिला BALB/c चूहों नकली 1x पीबीएस के साथ संक्रमित थे या BIRFLU के साथ inoculated (106 PFU) intranasally . Nluc गतिविधि (चित्र 4A) Nluc सब्सट्रेट के प्रशासन द्वारा मूल्यांकन किया गया था इंजेक्शन रेट्रो-ऑर्बिटलली पर 3 दिनों के बाद संक्रमण एक में विवो इमेजिंग उपकरण का उपयोग कर. हम दिन 3 में bioluminescence का मूल्यांकन करने के लिए चुना है क्योंकि पिछले अध्ययनों से संकेत दिया है कि IAV प्रतिकृति, PR8 सहित, दिन 2 और 4 के बीच चोटियों के बाद संक्रमण24,54. जैव-दीप्ति की निगरानी की गई (चित्र4क, शीर्ष) तथा इसका उपयोग औसत कुल फ्लक्स (लॉग10 चध) (चित्र4क, तल) की गणना करने के लिए किया जाता है। के रूप में भविष्यवाणी की, चूहों BIRFLU के साथ inoculated उच्च bioluminescence गतिविधि प्रदर्शित लेकिन नकली संक्रमित चूहों में कोई संकेत नहीं पाया गया था. इसके बाद, संक्रमित चूहों के फेफड़ों को काटा गया और शुक्र अभिव्यक्ति का मूल्यांकन पूर्व विवो इमेजिंग (चित्र4 बी, शीर्ष) का उपयोग करके किया गया था। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट औसत विकिरण दक्षता की गणना की गई (चित्र4B, नीचे)। एक्साइज किए गए चूहे फेफड़े भी वायरल टिटर और विवो में BIRFLU की आनुवंशिक स्थिरता का निर्धारण करने के लिए homogenized थे (चित्र 4C, डी) . BIRFLU की आनुवंशिक स्थिरता चूहों फेफड़ों और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (वीनस, ऊपर), इम्यूनोस्टेनिंग (Nluc, मध्य) और क्रिस्टल बैंगनी धुंधला (नीचे) से अलग वायरस का उपयोग कर पट्टिका परख के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। चूहों के फेफड़ों से बरामद BIRFLU प्लेक बनाने में सक्षम थे और दोनों रिपोर्टर जीनों को स्पष्ट रूप से व्यक्त करते हैं (चित्र 4C) . विशेष रूप से, हम वायरल प्रतिकृति के साथ bioluminescence और फ्लोरोसेंट संकेतों के बीच एक अच्छा संबंध मनाया.

Figure 1
चित्र 1: IAV PR8 WT और BIRFLU virion संरचना और जीनोम क्षेत्रों के Schematic प्रतिनिधित्व. आईएवी एक लिपिड बाइलेयर से घिरा हुआ है जिसमें दो प्रमुख वायरल ग्लाइकोप्रोटीन हेमाग्लूटिनिन (एचए; ब्लैक) और न्यूरेमिनिडेज (ना; ब्लू) हैं। IAV आठ एकल फैला हुआ, नकारात्मक भावना, आरएनए क्षेत्रों (PB2, PB1, पीए, हा, एनपी, एनए, एम, और एन एस) होते हैं। प्रत्येक वायरल खंड में 3 'और 5' सिरों (ब्लैक बॉक्स) पर गैर-कोडिंग क्षेत्र (एनसीआर) होते हैं। इसके अलावा, वायरल (v) RNAs के 3' और 5' अंत में पैकेजिंग संकेत हैं, नवजात virions (सफेद बक्से) में vRNAs के कुशल encapsidation के लिए जिम्मेदार हैं। IAV PR8 HA और एन एस वायरल क्षेत्रों और उत्पादों काले रंग में संकेत दिया जाता है. Nluc, शुक्र, और पीटीवी 2A के अनुक्रम क्रमशः लाल, हरे और धारीदार बक्से में संकेत दिया जाता है। BIRFLU में क्रमशः Nluc और शुक्र व्यक्त संशोधित हा और एन एस खंडों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व भी संकेत दिया है. यह आंकड़ा नोगल्स एट अल55से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: BIRFLU के इन विट्रो अभिलक्षण। (ए, बी) प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट और इम्यूनोफ्लोरेसेंट द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण। MDCK कोशिकाओं नकली संक्रमित या संक्रमित थे (MOI 0.1) PR8 WT या BIRFLU वायरस के साथ. संक्रमित कोशिकाओं को 18 एच पोस्ट-इंफेक्शन पर स्थिर किया गया था ताकि सीधे वीनस अभिव्यक्ति को प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सके और विशिष्ट एंटीबॉडी और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसिस का उपयोग करके Nluc (A) और वायरल एनपी (बी) अभिव्यक्ति की कल्पना की जा सके। न्यूक्लिय डीएपीआई के साथ दागा गया था। प्रतिनिधि छवियों (20x आवर्धन) दिखाए जाते हैं. स्केल बार्स $ 100 डिग्री मी. (सी, डी) पीआर 8 डब्ल्यूटी और BIRFLU की विकास गतिज। MdCK कोशिकाओं से संक्रमित (एमओआई 0.001) से संक्रमित ऊतक संस्कृति supernatants में Nluc गतिविधि (सी) और वायरल titers (डी) WT और BIRFLU PR8 वायरस के साथ संक्रमित संकेत समय पर मूल्यांकन किया गया संक्रमण के बाद. डेटा ट्राइक्लिकेस के साधन एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। वायरल titers प्रतिरक्षा फोकस परख (FFU/ डॉटेड रेखा संसूचन की सीमा (200 एफएफयू/एमएल) को निर्दिष्ट करती है। यह आंकड़ा नोगल्स एट अल55से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: चूहों में BIRFLU के अध्ययन के लिए Schematic प्रतिनिधित्व. Nluc और वीनस रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति चूहों में मूल्यांकन किया गया था 1 x 106 BIRFLU के PFU से संक्रमित विवो या पूर्व विवो इमेजिंग में उपयोग कर. संक्षेप में, दिन 1, 5 से 7 सप्ताह पुरानी महिला BALB/c चूहों नकली संक्रमित थे (1x पीबीएस) या 1 x 106 PFU के साथ intranasally. दिन में 3 के बाद संक्रमण, चूहों हल्के isoflurane का उपयोग कर एनेस्थेटाइज किया गया और Nluc सब्सट्रेट रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन था. Nluc संकेत सीधे विवो इमेजिंग में उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. इमेजिंग के तुरंत बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और पूरे उत्पादित फेफड़ों में वीनस की अभिव्यक्ति का पूर्व विवो इमेजिंग का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। बरामद चूहों फेफड़ों पट्टिका परख द्वारा वायरल प्रतिकृति और स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए homogenized थे. तीर फ्लोरोसेंट (वीनस), इम्यूनोस्टेनिंग (Nluc) और क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के बीच सहसंबंध का संकेत देते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विवो बायोल्युमिनेशन और फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति में। महिला पांच से सात सप्ताह पुराने BALB/c चूहों नकली संक्रमित थे (1x पीबीएस) या के साथ inoculated 1 x 106 PFU BIRFLU intranasally. दिन 3 के बाद संक्रमण, Nluc गतिविधि (एक) पूरे माउस में निर्धारित किया गया था. एक एकल माउस के प्रतिनिधि छवियों चमक पैमाने दिखा (p/sec/cm2/sr). जैव-दीप्ति विकिरण मानों का परिमाण निर्धारित किया गया था और औसत कुल फ्रलक्स दर्शाया गया है (फ्लक्स (लॉग10 च/ Nluc इमेजिंग के बाद, फेफड़ों ex vivo इमेजिंग (बी) के लिए काटा गया. पूरे फेफड़ों से प्रतिनिधि तस्वीरें दिखाए जाते हैं. शुक्र अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए, ब्याज के क्षेत्रों के मतलब मूल्यों (आरओआई) नकली संक्रमित चूहों से फेफड़ों ऑटो-प्रवाह के लिए सामान्यीकृत किया गया और गुना परिवर्तन की गणना की गई. विवो में BIRFLU की आनुवंशिक स्थिरता का विश्लेषण करने के लिए, चूहों फेफड़ों से बरामद वायरस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (वीनस, ऊपर), इम्यूनोस्टेनिंग(Nluc, मध्य) और क्रिस्टल बैंगनी धुंधला (नीचे) (सी) का उपयोग कर पट्टिका परख द्वारा विश्लेषण किया गया। एक माउस से प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है. वायरस प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए, पूरे फेफड़ों इमेजिंग के बाद homogenized थे और MDCK कोशिकाओंको संक्रमित करने और पट्टिका परख (PFU/mL) (डी) द्वारा वायरल titers निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया. तीर फ्लोरोसेंट (वीनस), इम्यूनोस्टेनिंग (Nluc) और क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के बीच सहसंबंध का संकेत देते हैं। बार फेफड़ों के वायरस titers के मतलब - एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा Logales एट अल55से अनुकूलित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ऊतक संस्कृति मीडिया और समाधान संरचना भंडारण उपयोग
ऊतक संस्कृति मीडिया: Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM), 10 % भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एल-ग्लूटामाइन (पीएसजी)(DMEM 10 % FBS 1% पीएसजी)। 445 मिलीलीटर DMEM, FBS के 50 एमएल और 100x पीएसजी के 5 एमएल. 4 डिग्री सेल्सियस एमडीके कोशिकाओं का रखरखाव
पोस्ट संक्रमणमीडिया: DMEM 0.3% बोवाइन एल्बुमिन (बीए), 1% पीएसजी (DMEM0.3 % बीए 1% पीएसजी)। 491 मिलीलीटर DMEM, 35 % बीए के 4.2 मिलीलीटर और 100x पीएसजी के 5 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस वायरल संक्रमण के बाद एमडीके कोशिकाओं का रखरखाव
10x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) 80 ह नक, 2 ह kCl, 11.5 ग्राम ना2एचपीओ4.7ह2ओ, 2 ग्राम KH2PO4. डीडीएच2ओ अप करने के लिए जोड़ें 1 एल समायोजित पीएच 7.3 करने के लिए कमरे का तापमान 1x पीबीएस तैयार करने के लिए
1x पीबीएस डीडीएच2ओ के साथ पतला 10x पीबीएस कमरे का तापमान कोशिकाओं को धोएं
संक्रमण मीडिया: 1x पीबीएस, 0.3% बीए, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीएस)(पीबीएस/ 487 एमएल 1x पीबीएस बाँझ, 35% बीए के 4.2 एमएल और 100x 1% पीएस (100 यू / 4 डिग्री सेल्सियस वायरल संक्रमण
Fixation/permebilization solution: 4% फॉर्मेल्डिहाइड, 0.5% ट्राइटन एक्स-100 1x पीबीएस में पतला। 400 एमएल तटस्थ बफर फॉर्मलिन 10%, ट्राइटन एक्स-100 के 5 मिलीलीटर और 1x पीबीएस के 595 एमएल कमरे का तापमान एमडीकेके कोशिकाओं को ठीक करें और परिमंडलीकरण करें।
समाधान अवरुद्ध: 1x पीबीएस में 2.5% बोवाइन सीरम Albumin (BSA). 1x पीबीएस के 97.5 एमएल में बीएसए के 2.5 ग्राम 4 डिग्री सेल्सियस इम्यूनोफ्लोरेसेंस और प्लेक परख के लिए समाधान को अवरुद्ध करना।
एंटीबॉडी तनुता समाधान (1% 1x पीबीएस में बीएसए) 1x पीबीएस के 99 एमएल में बीएसए के 1 ग्राम 4 डिग्री सेल्सियस प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का फैलाव।
0.1% क्रिस्टल बैंगनी समाधान 400 एमएल मेथनॉल में 1 ग्राम क्रिस्टल बैंगनी। डीडीएच2हे की 600 मिलीलीटर जोड़ें कमरे का तापमान प्लेक परख में एमडीसीके कोशिकाओं का दाग लगाना।
टॉसिलसल्फोनिल फेनिललैनेल क्लोरोमेथिल कीटोन (टीपीसीके)-उपचारित ट्रिप्सिन डीडीएच2हे में 1 मिलीग्राम/एमएल पर 1,000x स्टॉक समाधान तैयार करें -20 डिग्री सेल्सियस वायरल संक्रमण के लिए.

तालिका 1: ऊतक संस्कृति मीडिया और समाधान.

Discussion

शोधकर्ताओं ने वायरल प्रतिकृति और रोगजनन की वर्तमान समझ को समझने और विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण आणविक उपकरण के रूप में वायरस पुनः संयोजक रिपोर्टर पर भरोसा किया है26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.सबसे अधिक इष्ट रिपोर्टर जीन luciferases और फ्लोरोसेंट प्रोटीन हैं, मुख्य रूप से उनकी पहचान में तकनीकी प्रगति के कारण, बेहतर वेरिएंट के विकास, और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों द्वारा पता लगाने43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48.रिकॉमबिनेंट रिपोर्टर वायरस का उपयोग अक्सर virological परख में तेजी लाने, विट्रो में और विवो में वायरस की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, और वर्तमान में अनुमोदित या नए टीके और चिकित्सीय दृष्टिकोण26की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए किया जाता है, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. दुर्भाग्य से, आईएवी के मामले में, पिछले अध्ययन एक ही रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति तक ही सीमित थे, जो 26,27,28,29 आयोजित किए जा सकने वाले अध्ययन के प्रकार में बाधा डालता है , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.इस सीमा से बचने के लिए, हम एक प्रतिकृति-सक्षम द्वि-रिपोर्टर IAV है कि एक Nluc luciferase और एक वीनस फ्लोरोसेंट प्रोटीन (BIRFLU) व्यक्त उत्पन्न किया है.

इस रिपोर्ट में, हम BIRFLU के इन विट्रो विशेषता और IAV संक्रमण के एक माउस मॉडल का उपयोग कर विवो में वायरल संक्रमण को ट्रैक करने के लिए BIRFLU का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन. BIRFLU Nluc और शुक्र अभिव्यक्ति वायरल titers के साथ सहसंबद्ध. इसके अलावा, BIRFLU स्थिर बने रहे और संक्रमित चूहों के फेफड़ों से बरामद होने के बाद दोनों रिपोर्टर जीन व्यक्त करने के लिए जारी रखा. इस दृष्टिकोण की पहचान और IAV संक्रमण के उपचार के लिए नए चिकित्सीय विकल्प के विकास सहित सुसंस्कृत कोशिकाओं में और पशु मॉडल में IAV का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है.

हालांकि BIRFLU PR8 की रीढ़ का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है, अन्य रिकॉमबिनेंट IAV विभिन्न प्रकार का उपयोग कर, उपप्रकार या वायरल तनाव रीढ़ एक ही प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. इसी तरह, इस रिपोर्ट में हम IAV के एक माउस मॉडल में BIRFLU के उपयोग के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन किया. हालांकि, BIRFLU अन्य पशु मॉडल में आईएवी संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान तकनीक हो सकती है।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एलएम-एस प्रयोगशाला में इन्फ्लूएंजा वायरस पर अनुसंधान आंशिक रूप से न्यूयॉर्क इन्फ्लुएंजा सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (NYICE) (NIH 272201400005C), इन्फ्लुएंजा अनुसंधान और निगरानी (सीईआईआरएस) अनुबंध के लिए उत्कृष्टता के NIAID केंद्र ोंको के एक सदस्य द्वारा आंशिक रूप से वित्त पोषित है। HHSN2722201400005C (NYICE) और रक्षा विभाग (DoD) सहकर्मी की समीक्षा की चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (PRMRP) अनुदान W81XWH-18-1-0460 द्वारा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 665102
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Adobe Photoshop CS4 Adobe This software is used in 3.1.10 and 4.4.7
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 ° C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell Culture dishes 100mm Greiner Bio-one 664-160
ChemiDoc MP Imaging System BioRad This instrument is used in 4.4.7
Crystal Violet Thermo Fisher Scientific C581-100 Store at Room temperature
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
5 to 7 week-old female BALB/c mice National Cancer Institute (NCI) 555
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at Room temperature
IVIS Spectrum PerkinElmer 124262 This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)
IX81 Motorized Inverted Microscope Olympus Olympus IX81
Living Image 4.7.2 software PerkinElmer This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)
Lumicount Packard This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATCC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Retiga 20000R Fast1394 Camera Qimaging Retiga 2000R
Scanner HP
Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies Jackson 715-075-150 Store at -20 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices

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References

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Chiem, K., Rangel-Moreno, J., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection. J. Vis. Exp. (150), e59890, doi:10.3791/59890 (2019).

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