Summary
Influensa A virus (iav) är smittsam respiratoriska patogener som orsakar årliga epidemier och enstaka pandemier. Här beskriver vi ett protokoll för att spåra virusinfektioner in vivo med hjälp av en roman rekombinant luciferas och Fluorescence-uttrycker bi-reporter iav (birflu). Detta tillvägagångssätt ger forskare ett utmärkt verktyg för att studera IAV in vivo.
Abstract
Influensavirus (iav) orsakar mänskliga luftvägssjukdomar som är förknippade med betydande hälso-och ekonomiska konsekvenser. Som med andra virus, studerar IAV kräver användning av mödosamma sekundära metoder för att upptäcka förekomsten av viruset i infekterade celler och/eller i djurmodeller av infektion. Denna begränsning har nyligen kringgås med generering av rekombinanta iAVS uttrycker lätt spåras fluorescerande eller bioluminescerande (luciferase) reporter proteiner. Emellertid, forskare har tvingats att välja fluorescerande eller luciferas reporter gener på grund av den begränsade kapaciteten hos iav genomet för att inkludera främmande sekvenser. För att övervinna denna begränsning, vi har genererat en rekombinant replikering kompetenta bi-reporter iav (birflu) stabilt uttrycker både en fluorescerande och en luciferas reporter gen för att enkelt spåra iav infektioner in vitro-och in vivo. I detta syfte ändrades de virala icke-strukturella (NS) och hemagglutinin (HA) virala segmenten av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) för att koda de fluorescerande Venus och de bioluminescerande Nanoluc luciferasproteinerna. Här beskriver vi användningen av BIRFLU i en musmodell av IAV-infektion och detektion av både rapportgener med hjälp av ett in vivo-bildbehandlings system. I synnerhet har vi observerat ett bra samband mellan uttrycken för både reportrar och viral replikering. Kombinationen av banbrytande tekniker inom molekylärbiologi, djur forskning och bildteknik, ger forskarna en unik möjlighet att använda detta verktyg för influensaforskning, inklusive studiet av virus-värdinteraktioner och dynamik av virusinfektioner. Det är viktigt att möjligheten att genetiskt förändra virusgenomet för att uttrycka två främmande gener från olika virala segment öppnar möjligheter att använda denna metod för: (i) utveckling av nya IAV-vacciner, (II) generering av rekombinanta IAVs- kan användas som vaccin vektorer för behandling av andra humana patogener infektioner.
Introduction
Influensavirus (IAV) är ett insvept, enkelsträngat, negativt segmenterat RNA-virus av Orthomyxoviridae -familjen1,2,3. Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattar 3-5 miljoner årliga influensafall och över 250 000 dödsfall från influensa i världen4,5,6. Grupper som är särskilt utsatta för influensa inkluderar äldre, immunokomprometterade individer, och barn7,8,9,10,11. Även vacciner finns tillgängliga och utgör den vanligaste och mest effektiva ingripande mot virusinfektion, iav kan snabbt utvecklas och undkomma redan existerande immunitet3,12,13, fjorton , 15. återkomsten av en pandemi H1N1 stam i 2009 och uppkomsten av patogena iav upprepar det ständiga hotet mot människors folkhälsa i hela världen4,16.
Under en epidemi eller pandemi är det viktigt att snabbt fastställa patogenicitet och överförbarhet av nyligen isolerade virus. För närvarande tillgängliga tekniker för att upptäcka viruset är tidskrävande och ibland kräver användning av mödosamma metoder, vilket kan fördröja slutförandet av dessa analyser17,18,19,20. Dessutom är det svårt att skala upp nuvarande virus analyser, vilket kan vara nödvändigt vid ett utbrott. Slutligen, användningen av validerade djurmodeller av infektion, såsom möss, marsvin och illrar används rutinmässigt och är avgörande för att studera influensainfektioner, immunsvar, och effekten av nya vacciner och/eller antivirala läkemedel. Dessa modeller är dock restriktiva på grund av oförmåga att observera viral dynamik i realtid; Detta begränsarstudierna till statisk avbildning av virusinfektioner21,22,23,24,25. Djur som används i dessa analyser är också euthanized för att fastställa virusbelastningen, vilket ökar antalet djur som krävs för att slutföra dessa studier26. För att kringgå alla dessa begränsningar, många forskare förlitar sig på användning av rekombinant replikering-kompetenta, reporter-uttrycker IAVs, som kan påskynda virologiska analyser och upptäcka virusbelastning och spridning in vivo i realtid26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Viktigare, dessa reporter-uttrycker iAVS är kompetent att replikera på motsvarande sätt till Wild-Type (WT) iAVS i cellkultur och in djur modellerar av infektion33,42.
Fluorescerande och bioluminescerande proteiner är två reporter system som vanligen används av forskare på grund av deras känslighet, stabilitet och användarvänlighet. Dessutom finns det ett enormt stöd och avancemang i fluorescerande och bioluminescerande protein detektionstekniker43,44,45,46,47,48 . Fluorescerande proteiner och luciferas har olika egenskaper som gör att de kan glöda, särskilt olika i hur upphetsad stater genereras och hur mittancen detekteras43,44,45, 46,47,48. Fluorescerande proteiner är först upphetsad av absorberar energi, som därefter släpps som ljus på en annan våglängd som molekylerna minskar till ett lägre energitillstånd43. Å andra sidan, Mareld härstammar från en kemisk exoterm reaktion som innebär ett substrat, syre, och ibland ATP för att producera ljus45. På grund av de varierande egenskaperna hos dessa två typer av reporter proteiner, en kanske mer fördelaktigt än den andra beroende på studiet av intresse. Medan fluorescerande proteiner används ofta för att observera cellulära lokalisering28,41, deras in vivo-signaler har otillräcklig intensitet och är ofta skyms av autofluorescence i levande vävnader49. Därför förlitar sig forskarna på luciferaser för att utvärdera viral dynamik i levande organismer, även om fluorescerande proteiner kan föredras för ex vivo-studier50,51,52,53. Till skillnad från fluorescerande proteiner är luciferaser bekvämare för in vivo-studier och mer tillämpbara vid icke-invasiva metoder26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. i slutändan, baserat på vilken typ av studie, forskare måste välja mellan användning av antingen en fluorescerande eller en luciferas reporter protein som sin avläsning, som försökspersoner deras studie till en trade-off av funktioner och känslighet, och allvarligt begränsar nyttan av de rekombinanta reportern-virusen. Dessutom finns det farhågor om sambandet mellan uttrycket av olika rapportörer med fluorescens eller luciferas system och viral replikering eller spridning, vilket kan äventyra tolkningen av de uppgifter som erhållits med reporter-uttrycker IAVs.
Vi har övervunnit denna begränsning genom att generera en rekombinant replikerkompetent bi-reporter IAV (BIRFLU) som kodar för både fluorescerande och ett luciferasprotein i samma virala genom55 (figur 1). Här infördes nanoluc luciferas (nluc), en liten och ljus bioluminescerande protein48, uppströms hemagglutinin (ha) sekvens i viral ha segment av influensa a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Dessutom, Venus, en ofta använd monomeriska fluorescerande protein, sattes in i icke-strukturella (NS) viral segment32,33,36,41,55. Eftersom birflu kodar för både fluorescerande och luciferas reporter-gener, kan antingen reporter protein signal användas som avläsning för att bestämma viral replikation och spridning in vitro eller in vivo55. Ytterligare information om generering och in vitro-eller in vivo-karakterisering av BIRFLU finns i vår senaste publikation55. Birflu kan användas för att testa effektiviteten av antivirala läkemedel eller neutraliserande antikroppar via en roman fluorescerande-och Bioluminescent-baserade mikroneutraliseringstest assay55. Dessutom kan BIRFLU också användas för att utvärdera viral dynamik i en musmodell av infektion55. I detta manuskript beskriver vi procedurerna för att karakterisera birflu55 in vitro och hur man studerar birflu-infektion hos möss med hjälp av in vivo luminiscens Imaging Systems för detektion av nluc in vivo eller Venus ex vivo.
Kombinationen av banbrytande tekniker inom molekylärbiologi, djur forskning och bildteknik, ger forskarna en unik möjlighet att använda BIRFLU för IAV-forskning, inklusive studiet av virus-värdinteraktioner, dynamik av virusinfektion; utveckling av nya vaccin metoder för terapeutisk behandling av IAV-infektioner eller potentiell användning av IAV som vaccin vektor för behandling av andra patogena infektioner.
Protocol
Alla protokoll som involverar möss har godkänts av den institutionella djur vårds-och användnings kommittén (IACUC) och den institutionella Biosäkerhetskommittén (IBC) vid University of Rochester, School of Medicine and Dentistry. Alla experiment som utförs på djur följer rekommendationerna i handledningen för vård och användning av försöksdjur i det nationella forskningsrådet58. Vivarium och avdelningen för laboratorie djurs medicin anläggningar vid School of Medicine and Dentistry vid University of Rochester är ackrediterade av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg (AALAC) International och överensstämmer med federala och statliga lagar och National Institutes of Health (NIH) politik. Lämplig personlig skyddsutrustning krävs vid arbete med möss. Liknande policyer och krav bör implementeras när man utför experiment som beskrivs i detta manuskript vid varje institution.
1. användning av små ryggradsdjur
- Köp fem till sju veckor gamla kvinnliga BALB/c möss och underhålla dem i djur vården anläggningen under särskilda patogen-fria villkor. Vid möss ankomst till de fastställda anläggningarna, tillåta viloperiod för 4 – 5 dagar att tillåta djur anpassa sig till sin nya miljö.
- Följande IACUC-protokoll, placera högst 5 möss per bur.
Anmärkning: Vid experiment slutsats, för att säkerställa att djuret är dött, var möss euthanized med hjälp av två godkända förfaranden, med hänsyn till att den andra måste vara en fysisk metod. I denna studie, efter möss infektion med BIRFLU och in vivo Imaging, djur är euthanized med en dödlig dos av 2, 2, 2-tribromoethanol (TBE), och genom att skära levern ven som fysisk sekundär metod som vi tidigare har visat23.
2. biosäkerhet
Anmärkning: I detta manuskript, birflu genererades i ryggraden i influensa a/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), som är en vanlig mus-anpassade laboratorium iav stam23,32,33,56. Viruset genererades med hjälp av tidigare beskrivna plasmid-baserade omvänd genetik metoder och en fullständig beskrivning av generationen, och in vitro-och in vivo karakterisering av BIRFLU kan hittas i vår senaste publikation55. Alla procedurer som involverar IAV-infektioner (in vitro eller in vivo) utfördes i ett biologiskt säkerhetsskåp under biosäkerhetsnivå (BSL)-2 villkor.
Försiktighet: En lämplig biosäkerhetsnivå bör fastställas i enlighet med en riskbedömning av biosäkerhet. Ytterligare information om hur man utför biosäkerhets riskbedömningar och upprättar en effektiv biosäkerhets reaktor bör konsulteras med den institution där experimenten kommer att utföras.
- Rengör biosäkerhets skåpen med 70% etanol eller klordioxiddesinfektions medel före och efter att ha utfört alla experimentella procedurer. För möss arbete, sterilisera alla dissektion material (sax, dissekera pincett, etc.) och Dounce Homogenisatorer före och efter deras användning.
- Kassera allt biologiskt material som producerats under förfarandena enligt lämpliga IBC-och IACUC-riktlinjer.
3. in vitro-karakterisering av BIRFLU (figur 2)
Anmärkning: Se tabell 1 för alla buffert-och medie kompositioner.
- Analysera proteinuttryck med fluorescens (figur 2A) och indirekt immunofluorescensering (figur 2b)
- En dag före infektion, utsäde 24-brunn tallrikar med Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) epitelceller (1 x 105 celler/brunn, triplicates) i vävnad kultur media och underhålla plattorna i en 37 ° c inkubator med 5% Co2. Förbered tillräckligt brunnar för att utvärdera alla valda antikroppar i både mock-infekterade och BIRFLU-infekterade celler.
Anmärkning: Vi rekommenderar att du visualiserar cellerna under ett ljusmikroskop för att bekräfta ett enskiktslager innan virusinfektionen påbörjas. En 90% confluency enskiktslager av MDCK celler vid tidpunkten för infektion rekommenderas. - Förbered utspädningar av WT eller BIRFLU IAVs i infektionsmedia och infektera de seedade MDCK-cellerna med en mångfald av infektioner (MOI) av 0,1 plackbildande enheter (PFU) per cell i en slutlig volym på 0,25 mL/brunn av infektionsmedia.
- Ta bort vävnads odlingsmediet från steg 3.1.1 och tvätta MDCK-cellerna två gånger med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt virus spädningar från 3.1.2 till MDCK-cellerna och placera plattorna på en gungande plattform för 1 h vid rumstemperatur för att möjliggöra viral adsorption.
Anmärkning: Mock-infekterade celler inkuberas endast med infektion media i avsaknad av virus. - Efter viral adsorption (steg 3.1.3), ta bort viral inokulum genom aspiration och tillsätt 1 ml efter infektion mediainnehåll ande 1 μg/ml av tpck-behandlade trypsin till varje brunn. Inkubera celler för 18 h i en 5% CO2 Befuktad inkubator vid 33 ° c.
- Efter 18 h av infektion, ta bort vävnads kulturen supernatanten från 24-brunnen plattor (3.1.4). Fix och permeabilize cellerna med 0,25 mL/brunn av fixering/permeabilization lösning för 20 min vid rumstemperatur.
Anmärkning: Förbered fixering/permeabiliseringslösningen i en draghuv för att förhindra exponering av formaldehyd. - Ta bort fixering/permeabilization lösning från steg 3.1.5, tvätta cellerna två gånger med 1x PBS, och inkubera cellerna med 0,25 mL/brunn av blockerande lösning för 1 h vid rumstemperatur.
Anmärkning: Fortsätt till nästa steg eller förvara celler i blockerande lösning vid 4 ° c över natten. - Ta bort den blockerande lösningen (steg 3.1.6) och tillsätt 0,25 mL/brunn (1 μg/mL) av en mus monoklonal antikropp (MAb) mot IAV-nukleoproteinet, NP (HB-65) eller en 1:1000-utspädning av en kanin-polyklonala antikropp (pAb) mot NLuc (se tabellen med material). båda späddes i lösning för antikropps utspädning (1x PBS, 2,5% BSA) och inkubera cellerna i 1 h vid 37 ° c.
- Ta bort den primära antikroppen från steg 3.1.7, tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS och inkubera dem med 0,25 mL/brunn av en Texas röd-konjugerad anti-mus eller anti-kanin sekundära antikroppar (se tabellen av material) utspädd 1:200 i antikropp spädningsvätska.
Anmärkning: Cell kärnor kan färgas på samma gång genom att tillsätta 0,5 μg/mL 4 ', 6 '-diamidino-2-phenylindole (DAPI) till samma sekundära antikropps lösning. Inkubera cellerna i 1 h vid 37 ° c i mörker. Andra sekundära antikroppar som konjugeras med andra fluoroforer kan användas. - Ta bort den sekundära antikroppen och DAPI från steg 3.1.8, tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS. Efter tvättning, lämna cellerna i 0,25 mL/brunn av 1x PBS.
- Placera plattan på scenen i ett fluorescensmikroskop för att detektera Venus och Nluc reporter uttryck, och NP från infekterade celler med rätt fluorescerande filter. Ta bilder med hjälp av ett fluorescensmikroskop (20x förstoring) och sammanfoga dem med hjälp av ett bildredigeringsprogram (figur 2A, B).
- En dag före infektion, utsäde 24-brunn tallrikar med Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) epitelceller (1 x 105 celler/brunn, triplicates) i vävnad kultur media och underhålla plattorna i en 37 ° c inkubator med 5% Co2. Förbered tillräckligt brunnar för att utvärdera alla valda antikroppar i både mock-infekterade och BIRFLU-infekterade celler.
- Analysera Nluc-aktiviteten (figur 2C) och virusreplikation (figur 2D).
- En dag före infektion, utsäde 12-brunn tallrikar med MDCK celler (2 x 105celler/brunn, triplicates) med hjälp av vävnad kultur media i en 37 ° c inkubator med 5% Co2 för att nå cirka 90% confluency vid tidpunkten för infektionen.
Anmärkning: Innan infektion, kontrollera cellerna under ett mikroskop för att kontrollera en enskiktslager av MDCK celler. - Infektions dagen förbereda spädningar av WT och BIRFLU virus i infektionsmedia att infektera MDCK cellerna (steg 3.2.1.) i tre exemplar med en MOI av 0,001 PFU i 0,5 mL/brunn. Ta bort vävnads odlingsmediet och tvätta MDCK-cellerna två gånger med 1x PBS.
- Tillsätt virus spädningar till MDCK enskiktslager och Tillåt viral adsorption vid rumstemperatur i 1 h på en gungande plattform. Efter viral adsorption, ta bort viruset inokulum och tillsätt 1,5 ml av efter infektion media som innehåller 1 μg/ml av tpck-behandlade trypsin, till varje brunn. Inkubera infekterade celler i en 5% Co2 Befuktad inkubator vid 33 ° c och samla samman supernatanterna vid de angivna tidpunkter som anges i steg 3.2.4.
- Vid 24, 48, 72, och 96 h post infektion (p.i.) samla 150 μL av vävnad kultur supernatanten från varje brunn och förvara proverna i ett microcentrifug rör vid-80 ° c för att utföra Nluc analyser och virala titreringar.
- För att utföra Nluc-aktivitetstest, följ tillverkarens indikationer. Först Tina vävnads kulturen supernatanten lagras vid-80 ° c (steg 3.2.4) på is.
Anmärkning: Se rekommendationerna från tillverkaren och optimera analysen om det behövs. - Bered lösningen på luciferas-analysen (se tabellen med material) genom att späda ut nluc-substratet 1:50 med utspädnings bufferten. I en vit platt-botten 96-väl mikroplatta för luciferas-analyser, blanda 25 μl av luciferas assay lösning med 10 till 25 μl av de insamlade vävnads kulturerna supernatanten prover. Inkubera blandningen i 2 – 3 minuter innan du mäter Luminescens med en luminometern (figur 2C).
Anmärkning: Förekomst av smittsamma viruspartiklar i vävnads kulturen samman supernatanterna bestäms av fluorescens immun-fokus analys (Venus) eller indirekta immunofluorescensen (viral antigen färgning) som tidigare beskrivits23,32, 33,56. - En dag före viral titreringar, utsäde MDCK celler i en 96-brunn tallrik (2 x 104 celler/brunn, triplicates) med vävnad kultur media och tillåta celler att nå 90% sammanflödet vid tidpunkten för infektionen i en inkubator inställd på 37 ° c med 5% Co2.
- Använd vävnads kulturen supernatanten prover som tinats på is (steg 3.2.4.). Tillsätt 90 μL av infektionsmedia till var och en av brunnarna i en ny 96-brunnsplattan, tillsätt sedan 10 μL av den upptinade vävnads kulturen supernatanten (steg 3.2.4) till den första brunnen (rad A). Använd ett flerkanaligt Pipettera för att blanda och överföra 10 μL från rad A till rad B. ändra tipsen mellan spädningar och blanda väl.
Anmärkning: Den här proceduren bör upprepas tills den sista raden (H). Vi rekommenderar att utföra viral titreringar i tre exemplar för noggrann mätning av virala titrar. - Ta bort vävnads odlingsmediet från MDCK-cellerna i 96-well-plattorna (steg 3.2.7) och tvätta två gånger med 1x PBS. Tillsätt 50 μL av supernatanten spädningar av replika 96-väl plattan som innehåller virus spädningar (steg 3.2.8) till varje brunn i den 96-brunnen plattan som innehåller MDCK celler.
- Inkubera 96-brunnen plattan på en gungande plattform för 1 h vid rumstemperatur för att möjliggöra viral adsorption. Efter viral adsorption, ta bort inokulum och tillsätt 100 μl/brunn av media efter infektion innehållande 1 μg/ml tpck-behandlad trypsin. Inkubera infekterade celler för 12 h i en 33 ° c inkubator med 5% CO2.
- Eftersom BIRFLU uttrycker Venus kan antalet infekterade celler direkt räknas med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Alternativt kan virala titrar bestämmas genom indirekt immunofluorescens som tidigare beskrivits med hjälp av en antikropp mot ett virus protein23,56,57,59. För den senare, gå vidare till Fix/permeabilize cellerna och fläcken med hjälp av anti-NP mAb HB-65 som beskrivs i avsnitt 4,4.
- Bestäm de virala titrar genom att räkna antalet Lysrörs-Forming enheter (FFU)/ml med formeln: ((antal FFU) x 20 x 1/spädning (figur 2D).
- En dag före infektion, utsäde 12-brunn tallrikar med MDCK celler (2 x 105celler/brunn, triplicates) med hjälp av vävnad kultur media i en 37 ° c inkubator med 5% Co2 för att nå cirka 90% confluency vid tidpunkten för infektionen.
4. in vivo karaktärisering av BIRFLU (figur 3 och figur 4)
- Mus infektion
Anmärkning: intranasal infektion av möss gjordes som tidigare beskrivits23. För ett mer detaljerat protokoll för IAV-infektion in vivo med hjälp av musmodell av infektion, rekommenderar vi att titta på videon i samband med den tidigare publikationen23. Det här avsnittet sammanfattar bara de steg som krävs för mus infektion med BIRFLU.- Inspektera möss för att utvärdera deras hälsa och övergripande fysiska utseende. Bered spädningen av BIRFLU i 1x PBS för att Inokulera möss med 1 x 106 PFU av birflu i en total volym av 30 μl/mus. Underhålla viruset på is tills musen inympning.
Anmärkning: Mock-infekterade (1x PBS) möss kommer att behövas som intern kontroll för avbildning. Placera mock-infekterade möss i en annan bur än BIRFLU-infekterade djur. - Anesthetize fem till sju veckor gamla kvinnliga BALB/c möss intraperitonealt med 240 – 250 mg/kg tribromoethanol (TBE) genom att sätta in nålen i caudal 2/3 på höger sida av buken. Sedan, tillbaka musen till buren och vänta ca 5 min. Kontrollera att musen är sövda innan viruset inympning av avsaknaden av tå-nypa reflex.
Anmärkning: Injicerbara lugnande medel rekommenderas över inhalerade lugnande medel för influensainfektioner in vivo, eftersom den senare kan ändra beteendet och upptaget av viruset genom luftvägsepitelet. Dessutom, de kan också påverka lokala immunsvar av lungan och störa in vivo avbildning av infekterade möss. Slutligen har inhalerade lugnande medel reducerad effektduration, vilket skulle vara ett problem för in vivo-avbildning av de infekterade djuren. - Inokulera möss intranasalt med 30 μL av den beredda BIRINFLUENSA-spädningen. Kontrollera att mössen andas ordentligt innan de återsänds till buren.
- Inspektera möss för att utvärdera deras hälsa och övergripande fysiska utseende. Bered spädningen av BIRFLU i 1x PBS för att Inokulera möss med 1 x 106 PFU av birflu i en total volym av 30 μl/mus. Underhålla viruset på is tills musen inympning.
- Bioluminescens övervakning av möss infekterade med BIRFLU (figur 4a)
Anmärkning: i detta manuskript reporter uttryck för Nluc eller Venus och viral replikering i lungorna av möss infekterade med BIRFLU bestäms vid 3 dagar efter infektion. Men arten av Mareld Imaging möjliggör upprepad övervakning av nluc uttryck i enskilda birflu-infekterade djur utan att behöva euthanize dem för varje experimentell tidspunkt. Ett in vivo avbildningssystem med en isofluran anestesi grenrör krävs för att utföra de beskrivna experimentella procedurer. Se tabellen av material för detaljer om Imaging instrument och bildprogram som används för bild förvärv och dataanalys.- Raka mus bröstet för att förbättra signalen från bioluminescens. Öppna avbildningsprogrammet och tryck på initiera. Därefter ställer du in parametrarna som ska användas, inklusive inställning av Imaging-läget till bioluminescence, autosparande, exponeringstid till Auto, öppna filter, etc.
- När maskinen är helt initierad, slå på isofluran anestesisystem. Placera djuren i anestesi kammaren. Möss är samtidigt och lätt sövda med en blandning av syre gas och avdunsterad 1 – 2% isofluran.
- När möss är sövda, administrera Nluc substrat (se tabellen av material) utspädd 1:10 i 1x PBS (slutlig volym 100 μl/mus) via retro-orbital rutt med en spruta med en 22 G nål.
- Omedelbart efter Nluc reagens administration, placera djuren i Imaging instrumentet med sina kistor vända upp och nos inuti grenröret för att hålla djur sövda under avbildning. Omedelbart efter stängning av kameran dörren, klicka förvärva i programvaran (figur 4a, överst).
- Efter avbildning, returnera möss till deras burar övervaka dem tills de har helt återhämtat sig och stänga av isofluran Vaporizer. Fortsätt sedan med ex vivo-avbildning av möss lungor att utvärdera Venus reporter genuttryck (avsnitt 4,3).
- Använd avbildningsprogram varu verktygen för att analysera de förvärvade Mareld-data. Utnyttja verktyget ROI (region av intresse) för att utse den specifika signalen och utföra Flux mätningar i regionen av intresse (vanligtvis runt bröstet) (figur 4a, botten). Även om ROI-formen är irrelevant, är större ROIs vanligtvis att föredra för att fånga hela signal spridningsområdet.
- Klicka på mått. Bedöma bioluminescens i fotoner eftersom det ger en absolut Photon emission mätning som är jämförbar med output mätningar som tillhandahålls av olika parametrar eller Imaging instrument.
- Fluorescensanalys hos möss infekterade med BIRFLU (figur 3 och figur 4b)
- Samla mus lungor efter in vivo Imaging, som tidigare beskrivits23.
- Kortfattat, euthanize möss med en dödlig dos av TBE (500 mg/kg). Desinficera snitt platsen med 70% etanol. Med en skalpell, göra ett snitt från bröstbenet till botten av buken och sedan skära från botten av snittet till sidorna med sax. Nästa, klippa levern ven (andra fysiska dödshjälp metod) att blöda djuret.
Anmärkning: För att undvika hög bakgrunds signal vid avbildning är det viktigt att minimera mängden blod i lungorna (se nedan).
- Kortfattat, euthanize möss med en dödlig dos av TBE (500 mg/kg). Desinficera snitt platsen med 70% etanol. Med en skalpell, göra ett snitt från bröstbenet till botten av buken och sedan skära från botten av snittet till sidorna med sax. Nästa, klippa levern ven (andra fysiska dödshjälp metod) att blöda djuret.
- Placera musen i dorsala recumbency, och använda saxen för att klippa lungsäcken och öppna bröstkorgen. Därefter, ta bort lungorna genom att snippa i slutet av luftstrupen med sax medan försiktigt hålla lungorna med tång.
- Placera lungorna i en sex-bra tallrik med 2 mL 1x PBS och tvätta lungorna tre gånger med 1x PBS.
Anmärkning: För att undvika kontaminering mellan proverna rengör och desinfekterar du dissekeringsverktygen mellan varje djur.
- Placera lungorna i en sex-bra tallrik med 2 mL 1x PBS och tvätta lungorna tre gånger med 1x PBS.
- Starta programmet för bild anskaffning genom att klicka på initiera och ställa in parametrarna för avbildning, inklusive inställning av bildläge till fluorescens, automatisk sparande, exponeringstid till Auto, excitation (500 Nm) och emission (540 nm) filter.
- När maskinen är initierad, placera lungorna i en svart bakgrund bricka, se till att vävnaderna är åtskilda från varandra, införa facket i kameran och klicka på förvärva på Imaging system programmet efter stängning av kameran dörren ( Figur 4B, överst).
- Efter avbildning, avlägsna vävnaderna omedelbart och förvara dem på is (4 ° c) om proverna bearbetas samma dag; eller på ett rör och torris för att frysa dem snabbt, innan du lagrar dem vid-80 ° c, om proverna kommer att bearbetas senare på en annan dag.
- För bildbehandling väljer du ROI -verktyget och ritar Rois runt var och en av de enskilda lungorna. Klicka på mått. Sedan, med hjälp av de resulterande genomsnittliga mätningar strålnings effektivitet, subtrahera värdena från mock-infekterade möss (figur 4b, botten).
Obs: med BIRFLU, det finns en god korrelation mellan nivåerna av Nluc och Venus uttryck, och signal distribution. Därför är det viktigt att analysera Nluc (hela musen) och Venus (excised lungor) uttryck från samma djur, och bibehålla samma orientering.
- Samla mus lungor efter in vivo Imaging, som tidigare beskrivits23.
- Utvärdering av BIRFLU-replikering hos möss i lungorna (figur 3 och figur 4c)
- Homogenisera möss lungor för viral titrering av plack assay som tidigare beskrivits23.
- Placera lungorna i en Dounce Homogenisatorer med 1 mL kyld infektion media. Homogenisera lungorna med mortelstöt i 1 min vid rumstemperatur tills den helt har söndersplittrats och förvara proverna i ett sterilt rör vid 4 ° c.
- Centrifugera proverna vid 300 x g i 10 min och samla upp supernatanten i ett sterilt rör. Förvara proverna på isen om de kommer att användas på samma dag eller frysa dem vid-80 ° c för att utvärdera virala titrar vid ett senare tillfälle.
Anmärkning: En ny Dounce Homogenisatorer bör användas för varje lung prov. - För att utföra plack analysen, dagen före utför viral titrering, utsäde sex-brunn plattor med MDCK celler (5 x 105 celler/brunn) i vävnad kultur media. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° c med 5% Co2 för att nå 90% sammanflödet nästa dag. Före infektion, bekräfta att cellerna bildar en enskiktslager under ett ljusmikroskop.
- Förbered 1:10 seriella utspädningar av supernatanten från de homogeniserade proverna (steg 4.4.1) i infektionsmedia. Förbered mikrocentrifugrör med 540 μL av infektionsmedia, tillsätt 60 μL från det homogeniserade lung provet till det första röret, blanda genom att Pipettera upp och ner, och sedan använda en ny spets, överför 60 μL till nästa tub. Upprepa denna seriella utspädnings process tills den sista spädningen.
Anmärkning: I vår erfarenhet 7 spädningar är tillräckliga för att bestämma viral titrar genom plack analys från lungorna av infekterade möss. - Tvätta MDCK-cellerna (steg 4.4.3) två gånger med 1x PBS och överför 500 μL av de seriellt utspädda proverna till varje brunn i sex-well-plattan. Placera plattorna på en gungande plattform och tillåta viral absorption att inträffa för 1 h vid rumstemperatur.
- Efter 1 h viral absorption, ta bort viral inoculum, tillsätt 2 mL/brunn av overlay medium som innehåller 1 μg/mL av TPCK-behandlade trypsin, och sedan Inkubera cellerna vid 33 ° c under 5% CO2 för 3 dagar.
- Fix infekterade celler (steg 4.4.6) med 1 mL/brunn av 4% formaldehyd utspädd i 1x PBS vid rumstemperatur i 2 h, sedan försiktigt bort overlay mediet och tillsätt 1 mL 1x PBS till varje brunn. För visualisering av Venus, bild de sex-well plattor med ett avbildningssystem för detektion av fluorescens.
Anmärkning: Virala plack kan färgas med hjälp av en bildredigeringsprogram (se tabellen av material). - För att utvärdera Nluc uttryck, visualisera virala plack genom immunofärgning med hjälp av en anti-Nluc pAb. För detta, ta bort 1x PBS, permeabilize celler med 0,5 ml/brunn av depolarisering lösning för 15 min vid rumstemperatur.
- Ta bort permeabiliseringslösningen, tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS och blockera med 0,5 mL/brunn av blockerande lösning för 1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort den blockerande lösningen från steg 4.4.9 och inkubera cellerna med 0,5 mL/brunn av pAb anti-Nluc utspädd 1:1000 i utspädnings lösning för 1 h vid 37 ° c.
- Använd ABC alkaliska Fosfatassats och DAB peroxidas substrat kit enligt tillverkarens rekommendation för visualisering av Nluc-uttrycksplack.
- Kort, tvätta celler från 4.4.10 tre gånger med 1x PBS och inkubera dem med 0,5 ml/brunn av en anti-kanin sekundär antikropp för 1 h vid 37 ° c.
- Ta bort den sekundära antikroppen, tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS och inkubera med ABC-lösningen i 1 h vid 37 ° c. Tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS och visualisera de virala plack med DAB HRP substrat kit. Skanna de immunfärgade plack med en konventionell skanner.
Anmärkning: Andra liknande satser för immunofärgning kan användas.
- Fläcka virala plack med kristall violett lösning för 1 h vid rumstemperatur. Kassera kristallviolett, tvätta plattorna tre gånger med vatten, låt plattorna torka och skanna plattorna igen.
- För att bestämma virala titrar, räkna plack avslöjade efter Crystal Violet färgning. Skanna plack med en konventionell skanner. Beräkna virutiter som plackbildande enheter (PFU) per mL (PFU/mL).
- För att bedöma BIRFLU stabilitet in vivo, beräkna andelen reporter-uttrycker virus genom att räkna antalet kristall violett-färgade plack (antal smittsamma virus, steg 4.4.12) och jämföra med antalet Venus-och Nluc-uttrycker plack ( steg 4.4.7 respektive steg 4.4.11).
- Centrifugera proverna vid 300 x g i 10 min och samla upp supernatanten i ett sterilt rör. Förvara proverna på isen om de kommer att användas på samma dag eller frysa dem vid-80 ° c för att utvärdera virala titrar vid ett senare tillfälle.
Representative Results
Generering och karakterisering av BIRFLU in vitro (figur 1 och figur 2)
En rekombinant replikation-kompetent IAV uttrycker två olika reporter gener (BIRFLU) konstruerades med hjälp av State of the art molekylär biologi och plasmid-baserade omvänd genetik tekniker (figur 1). Här valde vi att använda nluc på grund av flera fördelar jämfört med andra luciferases, inklusive dess ringa storlek, ATP-självständighet, större intensitet, och optimerad substrat48,60. Nluc klonas i ha-segmentet av iav PR8 följt av svin teschovirus (PTV) 2a klyvning plats (2a) framför den öppna läsbild (ORF) av ha (figur 1). ORF av HA inkluderade tysta mutationer för att ta bort de ursprungliga förpacknings signalerna och undvika eventuell rekombination. Den kompletta ha-förpackningssignalen lades framför nluc för att möjliggöra en korrekt inkorporering av det modifierade ha-segmentet i spjälkat virus-och nluc-och ha-uttrycket från samma virala RNA-segment (figur 1). Dessutom var det fluorescerande proteinet Venus klonade i en modifierad iav PR8 ns segment som kodar de två virala proteiner ns1 och NEP från en enda utskrift32,36,41,54, 57. För detta ändamål var Venus smält till C-terminalen av NS1 och hela NEP ORF var klonade nedströms av PTV 2A klyvning plats som placerades mellan NS1-Venus och NEP sekvenser (figur 1). Ytterst, dessa två modifierade HA och NS viral plasmid konstruktioner användes i kombination med resten av IAV PR8 omvänd genetik plasmider att generera BIRFLU (figur 1). In vitro-och in vivo-karakteriseringen av BIRFLU har beskrivits tidigare55.
I figur 2, vi kännetecknas in vitro-birflu genom att bestämma Venus, nluc, och NP uttrycks nivåer med fluorescens och indirekta immunofluorescensmetoder (figur 2A, B). Confluent enskiktslager av MDCK celler var antingen håna-infekterade eller infekterade (Moi 0,1) med WT eller birflu PR8 virus och, vid 18 h efter infektion, Venus uttryck utvärderades direkt med fluorescens mikroskopi (figur 2A, B). Nluc (figur 2A) och NP (figur 2b) uttryck visualiserades genom indirekt immunofluorescens med hjälp av antikroppar som är specifika för varje protein. Som väntat upptäcktes Venus och Nluc uttryck endast i celler infekterade av BIRFLU och inte i celler infekterade av WT PR8 virus. Dessutom avslöjade indirekt immunofluorescensmikroskopi NP-uttryck i både WT-och BIRFLU PR8-infekterade celler. Inget uttryck av Venus, Nluc eller NP upptäcktes, som förväntat, i mock-infekterade celler (figur A, B).
För att utvärdera nluc uttrycks nivåer in vitro, var MDCK celler infekterade (Moi 0,001) med WT eller birflu PR8 virus och nluc aktivitet i vävnad kultur samman supernatanterna utvärderades vid 24, 48, 72 och 96 h efter infektion (figur 2C). Endast nluc aktivitet upptäcktes i vävnad kultur samman supernatanterna av MDCK celler infekterade med birflu (figur 2C). Nluc aktivitet i vävnads kulturen samman supernatanterna upptäcktes så tidigt som 24 h post-infektion med högre uttrycks nivåer vid 96 h post-infektion, troligen på grund av cytopatisk effekt (CPE) inducerad under virusinfektion release nluc protein behålls i cellen. För att utvärdera lämplighet birflu i odlade celler, var tillväxtkinetik av WT och birflu PR8 virus också utvärderats (figur 2D) och förekomsten av smittsamma virus i vävnad kultur samman supernatanterna bestämdes genom immun-fokus assay (figur 2D ). Särskilt, birflu replikering kinetik var jämförbara med de av WT PR8 virus, även om birflu replikering var något försenad och nådde inte samma virala titrar som WT PR8. BIRFLU kunde dock nå titrar på 5 x 107 PFU/ml (figur 2D), vilket indikerar att uttrycket av två rapportörgener i viral genomet inte påtagligt stör birflu-replikation i MDCK-celler.
Spåra BIRFLU-infektion hos möss (figur 3 och figur 4)
Figur 3 är ett schematiskt flödesschema för bedömning av birflu Dynamics i en musmodell av iav-infektion. Fem till sju veckor gamla kvinnliga BALB/C möss var antingen håna-infekterade med 1x PBS eller infekterade med 1 x 106 PFU av birflu intranasalt. Vid 3 dagar efter infektion, möss bedövnings med isofluran och sedan injiceras med Nluc substrat retro-Orbitally. Alla möss placerades omedelbart i IVIS-instrumentet och Nluc-signalen utvärderades in vivo med hjälp av IVIS. Därefter var möss euthanized och lungor skördades. Exciderade lungor analyserades sedan ex vivo med in vivo-kameran för att bestämma fluorescensintensiteten via Venus-uttrycket. Slutligen, möss lungor var homogeniserade, och virala titrar och stabilitet bestämdes genom plack assay. Plack bedömdes genom den direkta fluorescensen av Venus, genom immunofärgning med antikroppar specifika för Nluc och Crystal Violet färgning.
Tidigare beskrivits replikerande-kompetenta reporter-uttrycker iAVS uttrycka en enda reporter gen, oftast antingen en fluorescerande eller ett bioluminescerande protein, som surrogat för virusinfektion och replikering. Men, BIRFLU, kan uttrycka båda typerna av rapportörer gener på virusinfektion. För att bedöma sambandet mellan bioluminescens (in vivo Imaging) och fluorescens (ex vivo Imaging) efter BIRFLU-infektion var fem till sju veckor gamla kvinnliga BALB/c-möss mock-infekterade med 1x PBS eller inokulerades med BIRFLU (106 PFU) intranasalt . Nluc-aktiviteten (figur 4a) utvärderades genom administrering av nluc-substrat injicerad retro-Orbitally vid 3 dagar efter infektion med ett in vivo Imaging-instrument. Vi valde att utvärdera bioluminescens dag 3 eftersom tidigare studier indikerade att iav-replikering, inklusive PR8, toppar mellan dag 2 och 4 efter infektion24,54. Bioluminescens övervakades (figur 4a, överst) och användes för att beräkna det genomsnittliga totala flödet (Flux (log10 p/s) (figur 4a, botten). Som förväntat, möss inokulerade med birflu visade hög Mareld aktivitet men ingen signal upptäcktes i mock-infekterade möss. Därefter skördades lungorna hos infekterade möss och Venus-uttrycket utvärderades med hjälp av ex vivo-avbildning (figur 4b, överst). Dessutom beräknades fluorescenens genomsnittliga strålnings effektivitet (figur 4b, botten). De censurerade möss lungorna var också homogeniseras för att bestämma de virala titrar och den genetiska stabiliteten av birflu in vivo (figur 4c, D). Genetisk stabilitet av BIRFLU analyserades genom plack analys med hjälp av virus isolerade från möss lungor och fluorescerande mikroskopi (Venus, Top), immunofärgning (Nluc, mitten) och Crystal Violet färgning (botten). BIRFLU återhämtade sig från möss lungorna kunde bilda plack och uttrycker stabilt båda reportern gener (figur 4c). I synnerhet observerade vi ett bra samband mellan bioluminescens och fluorescens signaler med viral replikering.
Figur 1: schematisk representation av iav PR8 WT och birflu spjälkat virus struktur och genomsegment. IAV är omgivna av ett lipidbilayer som innehåller de två stora virala glykoproteinerna hemagglutinin (HA; svart) och neuraminidas (NA; blå). IAV innehåller åtta enkelsträngade, negativa-Sense, RNA segment (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, och NS). Varje viral segment innehåller icke-kodning regioner (NCR) vid 3 ' och 5 ' ändar (svarta lådor). Dessutom, vid 3 ' och 5 ' slutet av viral (v) rnas är förpackningen signaler, ansvarig för effektiv encapsidation av vrnas till begynnande virioner (vita lådor). IAV PR8 HA och NS viral segment och produkter är indikerade i svart. Sekvenser av Nluc, Venus och PTV 2A anges i röda, gröna respektive randiga rutor. Den schematiska representationen av de modifierade HA-och NS-segmenten som uttrycker Nluc respektive Venus i BIRFLU anges också. Denna siffra har anpassats från Nogales et al.55. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: in vitro-karakterisering av BIRFLU. (a, B) Analys av proteinuttryck genom direkt fluorescens och immunofluorescensen. MDCK celler var mock-infekterade eller infekterade (MOI 0,1) med PR8 WT eller BIRFLU virus. Infekterade celler fastställdes till 18 h efter infektion för att direkt visualisera Venus uttryck genom direkt fluorescerande mikroskopi och för att visualisera Nluc (A) och viral NP (B) uttryck med hjälp av specifika antikroppar och indirekta immunofluorescens. Kärnor färgas med DAPI. Representativa bilder (20x förstoring) visas. Skalstreck = 100 μm. (C, D) Tillväxtkinetik av PR8 WT och BIRFLU. Nluc aktivitet (C) och viral titrar (D) i vävnad kultur samman supernatanterna från MDCK celler infekterade (Moi 0,001) med WT och birflu PR8 virus bedömdes vid de angivna tiderna efter infektion. Data representerar medel ± SD av tre exemplar. Viral titrar bestämdes genom immun-fokus assay (FFU/ml). Streckad linje betecknar detektionsgränsen (200 FFU/ml). Denna siffra har anpassats från Nogales et al.55. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: schematisk representation för studier av BIRFLU hos möss. Uttryck för Nluc-och Venus-rapportgener utvärderades hos möss infekterade med 1 x 106 PFU av birflu med in vivo-eller ex vivo-avbildning. Kort, på dag 1, 5 till 7 vecka gamla kvinnliga BALB/c möss var håna-infekterade (1x PBS) eller inokuleras med 1 x 106 PFU av birflu intranasalt. På dag 3 efter infektion, möss var milt bedövningsmedel med isofluran och Nluc substrat injicerades retro-Orbitally. Nluc signal bedömdes direkt med hjälp av in vivo Imaging. Omedelbart efter avbildning, möss var euthanized och uttryck av Venus i hela censurerade lungor analyserades med ex vivo Imaging. Återvunna möss lungor var homogeniserade för att utvärdera viral replikering och stabilitet genom plack assay. Pilar indikerar korrelation mellan fluorescens (Venus), immunofärgning (Nluc) och Crystal Violet färgning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: in vivo-uttryck för bioluminescens och fluorescens. Kvinnliga fem till sju veckor gamla BALB/c möss var mock-infekterade (1x PBS) eller inokulerades med 1 x 106 PFU av birflu intranasalt. Vid dag 3 efter infektion bestämdes Nluc Activity (a) i hela musen. Representativa bilder av en enda mus som visar radians skala (p/SEK/cm2/SR). Bioluminescens strålningsvärdena kvantifierades och det genomsnittliga totala flödet visas (Flux (log10 p/s). Efter Nluc-avbildning skördades lungor för ex vivo-avbildning (B). Representativa bilder från hela lungorna visas. För att kvantifiera Venus-uttrycket normaliserades medelvärdet av intresseområden (ROIs) till lung autofluorescens från mock-infekterade möss och veck förändringar beräknades. För att analysera den genetiska stabiliteten hos BIRFLU in vivo analyserades virus från möss i lungorna genom plackanalys med hjälp av fluorescerande mikroskopi (Venus, Top), immunofärgning (Nluc, Middle) och Crystal Violet-färgning (botten) (C). Representativa bilder från en mus visas. För att utvärdera virusreplikering, hela lungorna var homogeniseras efter avbildning och används för att infektera MDCK celler och bestämma virala titrar av plack assay (PFU/mL) (D). Pilar indikerar korrelation mellan fluorescens (Venus), immunofärgning (Nluc) och kristall violett färgning. Staplarna representerar medelvärdet ± SD av lung virus titrar. Denna siffra har anpassats från Logales et al.55. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vävnadskultur medier och lösningar | Sammansättning | Lagring | Använda |
| Vävnad kultur media: Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM), 10% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG). | 445 ml DMEM, 50 mL FBS och 5 mL 100x PSG. | 4 ° c | Underhåll av MDCK-celler |
| Media efter infektion: dmem 0,3% bovint albumin (ba), 1% PSG (DMEM 0,3% BA 1% PSG). | 491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA och 5 ml 100x PSG | 4 ° c | Underhåll av MDCK-celler efter virusinfektion |
| 10X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) | 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g na2HPO4. 7h2O, 2 g KH2Po4. Lägg till ddH2O upp till 1 L. Justera pH till 7,3 | Rumstemperatur | För att förbereda 1x PBS |
| 1x PBS | Späd 10X PBS med ddH2O | Rumstemperatur | Tvätta celler |
| Infektion media: 1x pbs, 0,3% BA, 1% penicillin-streptomycin (PS) (PBS/BA/PS). | 487 mL 1x PBS steril, 4,2 mL 35% BA och 5 ml 100x 1% PS (100 U/mL) | 4 ° c | Virusinfektioner |
| Fixering/permeabiliseringslösning: 4% formaldehyd, 0,5% Triton X-100 utspädd i 1x PBS. | 400 mL neutral buffrad formalin 10%, 5 ml Triton X-100 och 595 mL 1x PBS | Rumstemperatur | Fix och depolarisering av MDCK celler. |
| Blockerande lösning: 2,5% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS. | 2,5 g BSA i 97,5 mL 1x PBS | 4 ° c | Blockerande lösning för immunofluorescens och plackanalyser. |
| Lösning för antikropps utspädning (1% BSA i 1x PBS) | 1 g BSA i 99 mL 1x PBS | 4 ° c | Utspädning av primära och sekundära antikroppar. |
| 0,1% kristall violett lösning | 1 g kristallviolett i 400 mL metanol. Tillsätt 600 ml ddH2O | Rumstemperatur | Färgning av MDCK-celler i plack-analyser. |
| Tosylsulfonylfenylalanyl klormetyl keton (tpck)-behandlad trypsin | Bered en 1 000 x stamlösning på 1 mg/mL i ddH2O | -20 ° c | För virusinfektioner. |
Tabell 1: vävnads kulturs medier och lösningar.
Discussion
Forskare har förlitat sig på rekombinanta reporter-uttrycker virus som vitala molekylära verktyg för att förstå och expandera på den nuvarande förståelsen av viral replikering och patogenes26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. de mest gynnade reportern gener är luciferases och fluorescerande proteiner, främst på grund av de tekniska framstegen i identifieringen, utveckling av förbättrade varianter, och detektering av imaging Technologies43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. rekombinanta reporter virus används ofta för att påskynda virologiska analyser, studera dynamiken av virus in vitro och in vivo, och för att testa effekten av nuvarande godkända eller nya vaccin och terapeutiska metoder26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Tyvärr, i fallet med iav, tidigare studier begränsades till uttrycket av en enda reporter gen, som hindrar den typ av studie som skulle kunna genomföras 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. för att undvika denna begränsning har vi genererat en replikerad bi-reporter iav som uttrycker en nluc luciferas och ett Venus fluorescerande protein (birflu).
I denna rapport beskriver vi in vitro-karakterisering av BIRFLU och experimentella metoder för att använda BIRFLU för att spåra virusinfektion in vivo med hjälp av en musmodell av IAV-infektion. BIRFLU Nluc och Venus uttryck korrelerade med virala titrar. Dessutom förblev BIRFLU stabil och fortsatte att uttrycka båda reportern gener efter att ha återhämtat sig från lungorna av infekterade möss. Detta tillvägagångssätt ger forskarna ett utmärkt tillfälle att studera IAV i odlade celler och i djurmodeller, inklusive identifiering och utveckling av nya terapeutiska alternativ för behandling av IAV-infektioner.
Även om BIRFLU har genererats med ryggraden i PR8, kan andra rekombinanta IAV med olika typ, subtyp eller virusstam stamnät genereras med hjälp av samma experimentella tillvägagångssätt. Likaså beskrev vi i denna rapport de experimentella förfarandena för användning av BIRFLU i en musmodell av IAV. BIRFLU kan dock vara en värdefull teknik för att utvärdera IAV-infektion i andra djurmodeller.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning om influensavirus i LM-S laboratorium är delvis finansierat av New York influensa Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), en medlem av NIAID Centers of Excellence för influensaforskning och övervakning (CEIRS) kontrakt nr. HHSN272201400005C (NYICE) och av försvarsdepartementet (DoD) peer reviewed medicinsk forskning program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4 ° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| 5 to 7 week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
References
- Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th edition, Lippincott Williams and WIlkins. (2007).
- Martinez-Sobrido, L., Peersen, O., Nogales, A. Temperature Sensitive Mutations in Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complex Responsible for the Attenuation of the Live Attenuated Influenza Vaccine. Viruses. 10 (10), (2018).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), (2016).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Louie, J. K., et al. A review of adult mortality due to 2009 pandemic (H1N1) influenza A in California. PLoS One. 6 (4), e18221 (2011).
- Barr, I. G., et al. Epidemiological, antigenic and genetic characteristics of seasonal influenza A(H1N1), A(H3N2) and B influenza viruses: basis for the WHO recommendation on the composition of influenza vaccines for use in the 2009-2010 Northern Hemisphere season. Vaccine. 28 (5), 1156-1167 (2010).
- Simonsen, L., et al. Impact of influenza vaccination on seasonal mortality in the US elderly population. A.M.A. archives of internal medicine. 165 (3), 265-272 (2005).
- McLean, H. Q., Peterson, S. H., King, J. P., Meece, J. K., Belongia, E. A. School absenteeism among school-aged children with medically attended acute viral respiratory illness during three influenza seasons, 2012-2013 through 2014-2015. Influenza and Other Respiratory Viruses. 11 (3), 220-229 (2017).
- Principi, N., Esposito, S. Protection of children against influenza: Emerging problems. Human Vaccines and Immunotherapeutics. , 1-8 (2017).
- Falsey, A. R., Treanor, J. J., Tornieporth, N., Capellan, J., Randomized Gorse, G. J. double-blind controlled phase 3 trial comparing the immunogenicity of high-dose and standard-dose influenza vaccine in adults 65 years of age and older. Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 172-180 (2009).
- Fuller, J. D., et al. Influenza vaccination of human immunodeficiency virus (HIV)-infected adults: impact on plasma levels of HIV type 1 RNA and determinants of antibody response. Clinical Infectious Diseases. 28 (3), 541-547 (1999).
- Carrat, F., Flahault, A. Influenza vaccine: the challenge of antigenic drift. Vaccine. 25 (39-40), 6852-6862 (2007).
- Doherty, P. C., Kelso, A. Toward a broadly protective influenza vaccine. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3273-3275 (2008).
- Fiore, A. E., et al. Prevention and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 2010. MMWR Recommendations and Reports. 59 (RR-8), 1-62 (2010).
- Pica, N., Palese, P. Toward a universal influenza virus vaccine: prospects and challenges. Annual Review of Medicine. 64, 189-202 (2013).
- To, K. K., Chan, J. F., Chen, H., Li, L., Yuen, K. Y. The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities. Lancet Infectious Diseases. 13 (9), 809-821 (2013).
- Baker, S. F., Nogales, A., Santiago, F. W., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Competitive detection of influenza neutralizing antibodies using a novel bivalent fluorescence-based microneutralization assay (BiFMA). Vaccine. 33 (30), 3562-3570 (2015).
- He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
- Kayali, G., et al. Testing human sera for antibodies against avian influenza viruses: horse RBC hemagglutination inhibition vs. microneutralization assays. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 73-78 (2008).
- Stephenson, I., et al. Reproducibility of serologic assays for influenza virus A (H5N1). Emerging Infectious Diseases. 15 (8), 1252-1259 (2009).
- Maher, J. A., DeStefano, J. The ferret: an animal model to study influenza virus. Lab Animal (NY). 33 (9), 50-53 (2004).
- Webster, R. G., Cox, N., Stoehr, K. WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev. 1. , (2002).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. Journal of Virology. 89 (6), 3421-3426 (2015).
- Steel, J., Lowen, A. C., Mubareka, S., Palese, P. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathogens. 5 (1), e1000252 (2009).
- Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nature Communications. 6, 6600 (2015).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Perez, J. T., Garcia-Sastre, A., Manicassamy, B. Insertion of a GFP reporter gene in influenza virus. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15G 14 (2013).
- Reuther, P., et al. Generation of a variety of stable Influenza A reporter viruses by genetic engineering of the NS gene segment. Scientific Reports. 5, 11346 (2015).
- Tran, V., et al. Multi-Modal Imaging with a Toolbox of Influenza A Reporter Viruses. Viruses. 7 (10), 5319-5327 (2015).
- Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Perez, D. R., Martinez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A and B Viruses Expressing a Fluorescent Dynamic Timer Protein for In Vitro and In Vivo Studies. PLoS One. 11 (1), e0147723 (2016).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. , 206-216 (2014).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2015).
- Avilov, S. V., et al. Replication-competent influenza A virus that encodes a split-green fluorescent protein-tagged PB2 polymerase subunit allows live-cell imaging of the virus life cycle. Journal of Virology. 86 (3), 1433-1448 (2012).
- Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A Viruses Expressing Reporter Genes. Viruses. 8 (7), (2016).
- Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PLoS One. 9 (5), e97695 (2014).
- Karlsson, E. A., et al. Visualizing real-time influenza virus infection, transmission and protection in ferrets. Nature Communications. 6, 6378 (2015).
- Czako, R., et al. In Vivo Imaging of Influenza Virus Infection in Immunized Mice. MBio. 8 (3), (2017).
- Harding, A. T., Heaton, B. E., Dumm, R. E., Heaton, N. S. Rationally Designed Influenza Virus Vaccines That Are Antigenically Stable during Growth in Eggs. MBio. 8 (3), (2017).
- DiPiazza, A., et al. Pandemic 2009 H1N1 Influenza Venus reporter virus reveals broad diversity of MHC class II-positive antigen-bearing cells following infection in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 10857 (2017).
- Yan, D., et al. Replication-Competent Influenza Virus and Respiratory Syncytial Virus Luciferase Reporter Strains Engineered for Co-Infections Identify Antiviral Compounds in Combination Screens. Biochemistry. 54 (36), 5589-5604 (2015).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (Pt 24), 4247-4260 (2007).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 592-600 (2012).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Vintersten, K., et al. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Pan, W., et al. Visualizing influenza virus infection in living mice. Nat Commun. 4, 2369 (2013).
- Heaton, N. S., et al. In vivo bioluminescent imaging of influenza a virus infection and characterization of novel cross-protective monoclonal antibodies. J Virol. 87 (15), 8272-8281 (2013).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476, 206-216 (2015).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent Bi-Reporter influenza A virus (BIRFLU) to evaluate viral infections. Journal of Virology. , (2019).
- Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. Journal of Virology. 88 (18), 10525-10540 (2014).
- Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. Journal of Virology. 90 (14), 6291-6302 (2016).
- National Research Council (U.S.). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th edn, National Academies Press. (2011).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Chiem, K., Topham, D. J., DeDiego, M. L. Functional Evolution of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus NS1 and PA in Humans. Journal of Virology. 92 (19), (2018).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
