Summary
甲型流感病毒(IAv)是传染性呼吸道病原体,每年流行和偶尔大流行。在这里,我们描述了一种使用新型重组荧光素酶和荧光表达双报告IAV(BIRFLU)跟踪体内病毒感染的协议。这种方法为研究人员提供了一个极好的工具来研究IAV在体内。
Abstract
甲型流感病毒(IAV)引起人类呼吸道疾病,对健康和经济造成重大影响。与其他病毒一样,研究IAV需要使用费力的辅助方法来检测感染细胞和/或动物感染模型中是否存在病毒。最近,随着重组IAV的产生,这种限制被规避了,这种反应素表达的易于追踪的荧光或生物发光(荧光酶)报告蛋白。然而,由于IAV基因组在包括外来序列方面的能力有限,研究人员被迫选择荧光或荧光酶报告基因。为了克服这一限制,我们产生了一个重组复制能力双报告器IAV(BIRFLU),可稳稳地表达荧光和荧光酶报告基因,以轻松跟踪体外和体内的IAV感染。为此,分别对甲型流感/PuertoRico/8/34 H1N1(PR8)的病毒非结构(NS)和血凝素(HA)病毒片段进行了改造,以分别编码荧光金星和生物发光纳米荧光素荧光酶蛋白。在这里,我们描述了BIRFLU在IAV感染小鼠模型中的使用,以及使用体内成像系统检测两个报告基因。值得注意的是,我们观察到记者的表达和病毒复制之间的良好相关性。分子生物学、动物研究和成像技术中的尖端技术相结合,为研究人员提供了利用这一工具进行流感研究的独特机会,包括研究病毒-宿主相互作用和动力学。病毒感染。重要的是,基因改变病毒基因组以表达来自不同病毒片段的两个外来基因的可行性为使用这种方法提供了机会:(i) 开发新型IAV疫苗,(二) 生成重组IAV,可用作治疗其他人类病原体感染的疫苗载体。
Introduction
甲型流感病毒(IAV)是一种包络的单链阴性感分段RNA病毒的正交菌病毒家族1,2,3。世界卫生组织(WHO)估计,全球每年有300万至500万人死于流感,超过25万人死于流感。特别易感染流感的群体包括老年人、免疫功能低下者以及7、8、9、10、11岁儿童。虽然疫苗是可用的,代表了对病毒感染最普遍和有效的干预,IAV能够迅速进化和逃脱预先存在的免疫3,12,1314,15.2009年甲型H1N1流感疫情再度出现,病原性IAV的出现,再次对全世界人类健康构成持续威胁。
在流行病或大流行期间,必须迅速确定新分离的病毒的致病性和传染性。目前可用的检测病毒的技术非常耗时,有时需要使用费力的方法,这可能会延迟完成这些分析17,18,19,20。此外,目前的病毒检测很难扩大,这在爆发时可能是必要的。最后,使用经验证的动物感染模型,如小鼠、豚鼠和雪铁龙,在研究流感感染、免疫反应以及新疫苗和/或抗病毒药物的有效性方面至关重要。然而,由于无法实时观察病毒动力学,这些模型是限制性的;这限制了对病毒感染的静态成像研究21,22,23,24,25。这些检测中使用的动物也被安乐死,以确定病毒载量,从而增加完成这些研究所需的动物数量26。为了规避所有这些限制,许多研究人员依靠使用重组复制能力,记者表达IAV,能够加速病毒学检测和检测病毒载量和实时传播在体内26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41。重要的是,这些记者表达的IAV能够复制类似野生型(WT)IAV在细胞培养和动物模型感染33,42 。
荧光和生物发光蛋白是研究人员常用的两种报告系统,由于其灵敏度、稳定性和易用性。此外,荧光和生物发光蛋白检测技术43、44、45、46、47、48也有着巨大的支持和进步。.荧光蛋白和荧光素酶具有不同的特性,允许它们发光,具体不同于兴奋状态的产生方式和检测出容率的方式43,44,45, 46,47,48.荧光蛋白首先通过吸收能量激发,当分子降低至低能量状态43时,能量以不同波长以光释放。另一方面,生物发光来自化学放热反应,涉及基质、氧气,有时也涉及ATP,以产生光45。由于这两种类型的报告蛋白的不同性质,一种可能比其他更有利,这取决于兴趣的研究。虽然荧光蛋白被广泛用于观察细胞定位28,41,其体内信号强度不足,并经常被活组织49的自荧光遮蔽。因此,研究人员依靠荧光素酶来评估活生物体的病毒动力学,尽管荧光蛋白可以优先用于体外研究50、51、52、53。与荧光蛋白不同,荧光素酶在体内研究更方便,更适用于非侵入性方法26、27、28、29、30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54.最终,根据研究的类型,研究人员必须在使用荧光或荧光素酶报告蛋白作为读出两种蛋白质之间做出选择,这使他们的研究取决于功能和敏感性的权衡,并严格限制重组报告器病毒的实用性。此外,还有人担心使用荧光或荧光酶系统的不同报告基因表达与病毒复制或传播之间的相关性,这可能危及对通过荧光或荧光酶酶系统获得的数据的解释。记者表达的IAV。
我们已经克服了这一限制,通过生成重组复制能力双报告IAV(BIRFLU),编码荧光蛋白和荧光酶蛋白在同一病毒基因组55(图1)。在这里 , NanoLuc Luciferase ( Nluc ) , 一种小而明亮的生物发光蛋白 48 ,入甲型流感 H / PuertoRico / 08 / 1934 H1N1 ( PR8 ) 24 、 33 的病毒 HA 片段中血凝素 ( HA ) 序列的上游。 40,55,56,57.此外 , 金星 , 一种经常使用的单体荧光蛋白 , 入非结构 ( NS ) 病毒段 32 , 33 , 36 , 41 , 55 。由于BIRFLU编码荧光和荧光酶报告者基因,无论是报告蛋白信号都可用作读出,以确定病毒复制和传播在体外或体内55。有关BIRFLU的产生和体外或体内特征的其他信息,见我们最近的出版物55。BIRFLU可用于测试抗病毒药物的有效性或中和抗体通过新型荧光和生物发光为基础的微中和测定55。此外,BIRFLU还可用于评估小鼠感染模型中的病毒动力学55。在本手稿中,我们描述了在体外描述 BIRFLU55的程序,以及如何使用体内发光成像系统来检测体内的 Nluc 或金星体外,研究小鼠的 BIRFLU 感染。
分子生物学、动物研究和成像技术领域的尖端技术相结合,为研究人员提供了利用BIRFLU进行IAV研究的独特机会,包括病毒-宿主相互作用的研究、病毒感染动力学研究;开发治疗IAV感染的新型疫苗方法,或可能将IAV用作治疗其他病原体感染的疫苗载体。
Protocol
涉及小鼠的所有协议都已获得罗切斯特大学医学和牙科学院的机构动物护理和使用委员会(IACUC)和机构生物安全委员会(IBC)的批准。所有在动物身上进行的实验都遵循国家研究委员会《实验室动物护理和使用指南》第58章的建议。罗切斯特大学医学和牙科学院的实验室动物医学设施和实验室动物医学设施分会获得国际实验室动物护理评估与认证协会(AALAC)的认可,遵守联邦和州法律和国家卫生研究院 (NIH) 政策。使用小鼠时,需要适当的个人防护设备 (PPE)。在每个机构进行本手稿中概述的实验时,应执行类似的政策和要求。
1. 使用小型脊椎动物
- 购买5至7周大雌性BALB/c小鼠,并在特定的无病原体条件下在动物护理机构中饲养。老鼠到达确定的设施后,允许休息4~5天,让动物适应新的环境。
- 遵循IACUC协议,每个笼子最多放置5只小鼠。
注:在实验结束时,为了确保动物死亡,老鼠使用两个经批准的程序被安乐死,同时考虑到第二个必须是物理方法。在这项研究中,在小鼠感染BIRFLU和体内成像后,动物被安乐死与2,2,2-三溴二苯乙醇(TBE)的致命剂量,并通过切割肝静脉作为物理辅助方法,正如我们先前显示的23。
2. 生物安全
注:在这份手稿中,BIRFLU产生于甲型流感/波多黎各甲型H1N1流感(PR8)的骨干,这是一个常见的小鼠适应实验室IAV菌株23,32,33,56。该病毒是使用先前描述的基于质粒的反向遗传学方法和生成的完整描述产生的,并且BIRFLU的体外和体内特征可以在我们最近的出版物55中找到。所有涉及IAV感染(体外或体内)的程序在生物安全级别(BSL)-2条件下在生物安全柜中进行。
警告:应根据生物安全风险评估确定适当的生物安全级别。应与进行试验的机构协商关于进行生物安全风险评估和建立有效的生物安全遏制的其他信息。
- 在执行所有实验程序之前和之后,使用 70% 乙醇或二氧化氯消毒剂清洁生物安全柜。对于小鼠工作,消毒所有解剖材料(剪刀,解剖钳子等)和去均匀器之前和之后使用。
- 根据适当的IBC和IACUC准则,丢弃在程序过程中生产的所有生物材料。
3. BIRFLU的体外特征(图2)
注:有关所有缓冲区和媒体组合,请参阅表1。
- 通过荧光(图2A)和间接免疫荧光分析蛋白质表达(图2B)
- 感染前一天,种子24孔板与马丁-达比白细胞(MDCK)上皮细胞(1 x 105细胞/孔,三胞胎)在组织培养基,并保持板在37°C培养箱与5%CO2。准备足够的井来评估所有选择的抗体在模拟感染和BIRFLU感染细胞。
注:我们建议在光显微镜下可视化细胞,在开始病毒感染之前确认单层。建议在感染时将MDCK细胞的单层汇合90%。 - 在感染培养基中制备WT或BIRFLU IAV的稀释剂,以0.25 mL/孔感染介质的最终体积,以0.1个斑块形成单位(PFU)的多重感染(MOI)感染种子MDCK细胞。
- 从步骤 3.1.1 中取出组织培养基,用 1 倍磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗 MDCK 细胞两次。将3.1.2的病毒稀释剂添加到MDCK细胞中,在室温下将板放在摇动平台上1小时,以便病毒吸附。
注:模拟感染的细胞只有在没有病毒的情况下才用感染培养。 - 病毒吸附后(步骤3.1.3),通过吸入消除病毒接种,并在每个井中加入1 mL感染后培养基,其中含有1μg/mLTPCK处理的胰蛋白酶。在33°C的5%CO2加湿培养箱中孵育细胞18小时。
- 感染18小时后,从24孔板(3.1.4)中取出组织培养上清液。在室温下,使用0.25 mL/井的固定/渗透溶液修复和渗透细胞20分钟。
注:在烟机罩中准备固定/渗透溶液,以防止甲醛暴露。 - 从步骤 3.1.5 中取出固定/渗透溶液,用 1x PBS 洗涤细胞两次,并在室温下用 0.25 mL/井的阻滞溶液孵育细胞 1 小时。
注:继续下一步,或在4°C的阻隔溶液中储存细胞。 - 去除阻滞溶液(步骤3.1.6),并添加0.25 mL/well (1 μg/mL)的小鼠单克隆抗体(MAb)对IAV核蛋白,NP(HB-65)或1:1,000稀释兔子多克隆抗体(pAb)对NLuc(见材料表),在抗体稀释溶液中稀释(1x PBS,2.5%BSA),并在37°C下孵育细胞1小时。
- 从步骤3.1.7中取出原抗体,用1x PBS清洗细胞三次,用0.25 mL/孔孵育德州红胶抗小鼠或抗兔子二级抗体(见材料表)稀释抗体1:200稀释溶液。
注:在同一次抗体溶液中加入0.5 μg/mL的4',6'-二酰胺-2-苯胺醇(DAPI),可以同时染色细胞核。在黑暗中在37°C下孵育细胞1小时。其他与其他荧光荧光道结合的二级抗体可以使用。 - 从步骤 3.1.8 中取出二级抗体和 DAPI,用 1x PBS 清洗细胞三次。洗涤后,将细胞留在0.25 mL/井1x PBS中。
- 将板放在荧光显微镜的舞台上,以检测金星和Nluc报告器的表达,以及使用适当的荧光过滤器从受感染细胞的NP。使用荧光显微镜(20倍放大倍数)捕捉图像,并使用图像编辑软件合并图像(图2A,B)。
- 感染前一天,种子24孔板与马丁-达比白细胞(MDCK)上皮细胞(1 x 105细胞/孔,三胞胎)在组织培养基,并保持板在37°C培养箱与5%CO2。准备足够的井来评估所有选择的抗体在模拟感染和BIRFLU感染细胞。
- 分析 Nluc 活性 (图 2C) 和病毒复制 (图 2D.
- 感染前一天,在37°C培养箱中使用组织培养基(含5%CO2)的12孔板,在感染时达到约90%的汇合。
注:感染前,在显微镜下检查细胞,以验证MDCK细胞的单层。 - 感染当天准备在感染介质中稀释WT和BIRFLU病毒,以感染MDCK细胞(步骤3.2.1.),在0.5 mL/well中用0.001 PFU的MOI进行三联处理。取出组织培养基,用1xPBS洗涤MDCK细胞两次。
- 将病毒稀释添加到MDCK单层,允许在室温下在摇动平台上吸附1小时。病毒吸附后,去除病毒接种,并在每个井中加入含有1微克/mLTPCK处理胰蛋白酶的感染后培养基。在33°C的5%CO2加湿培养箱中孵育受感染的细胞,并在步骤3.2.4中指示的时间点收集上生子。
- 在感染后24、48、72和96小时(p.i.)收集每个井150μL的组织培养上清液,并将样品储存在-80°C的微离心管中,以执行Nluc测定和病毒性定子。
- 要执行 Nluc 活动测定,请遵循制造商的指示。首先,解冻储存在-80°C(步骤3.2.4)的冰上组织培养上清液。
注:请参阅制造商的建议,并根据需要优化测定。 - 使用稀释缓冲液稀释 Nluc 基板 1:50,制备荧光素酶测定溶液(参见材料表)。在用于荧光酶测定的白色平底96孔微孔板中,将25μL的荧光素酶测定溶液与10至25 μL收集的组织培养上清液样品混合。在使用发光计测量发光之前,孵育混合物 2⁄3 分钟(图 2C)。
注:组织培养物中传染性病毒颗粒的存在是由荧光免疫焦点测定(Venus)或间接免疫荧光(病毒抗原染色)决定的,如前所述23、32, 33,56. - 在病毒滴定前一天,用组织培养基培养基在96孔板(2 x 104细胞/孔,三联体)中播种MDCK细胞,在37°C的培养箱中,以5%CO2为培养物,使细胞在感染时达到90%的汇合。
- 使用在冰上解冻的组织培养上清液样品(步骤 3.2.4.)。在新的 96 孔板中向每个孔中添加 90 μL 的感染介质,然后将 10 μL 的解冻组织培养液(步骤 3.2.4)添加到第一口井(A行)。使用多通道移液器将 10 μL 从行 A 混合和传输到行 B。
注:此过程应重复,直到最后一行 (H)。我们建议在三胞胎中执行病毒性定子,以便准确测量病毒定子。 - 从 96 孔板中的 MDCK 细胞中取出组织培养基(步骤 3.2.7),用 1x PBS 洗涤两次。在含有MDCK细胞的96孔板中,将含有病毒稀释剂的96孔板的上清稀释剂50μL(步骤3.2.8)添加到每个孔中。
- 在室温下在摇动平台上孵育96孔板1小时,以便进行病毒吸附。病毒吸附后,取出接种液,并添加100μL/井感染后培养基含有1μg/mLTPCK处理的胰蛋白酶。在33°C的培养箱中孵育受感染的细胞12小时,CO2为5%。
- 由于BIRFLU表示金星,感染细胞的数量可以直接计数使用荧光显微镜。或者,病毒性定子可以通过间接免疫荧光来确定,如前所述使用抗体对抗病毒蛋白23,56,57,59。对于后者,继续使用第 4.4 节所述的抗NP mAb HB-65修复/渗透细胞和污渍。
- 使用公式计算荧光形成单位 (FFU)/mL 的数量确定病毒牙名:(FFU 数量) x 20 x 1/稀释(图 2D)。
- 感染前一天,在37°C培养箱中使用组织培养基(含5%CO2)的12孔板,在感染时达到约90%的汇合。
4. 在 BIRFLU 的 Vivo 特征化中 (图 3和图 4)
- 老鼠感染
注:小鼠的鼻内感染如前所述23。有关使用小鼠感染模型在体内感染的更详细的协议,我们建议观看与上一出版物23关联的视频。本节仅概述鼠标感染 BIRFLU 所需的步骤。- 检查小鼠以评估其健康和整体外观。在 1x PBS 中制备 BIRFLU 的稀释剂,用 1 x 106 PFU 的 BIRFLU 给小鼠接种,总体积为 30 μL/小鼠。在冰上保持病毒,直到小鼠接种。
注:需要模拟感染 (1x PBS) 小鼠作为成像内部控制。将模拟感染的小鼠放在与BIRFLU感染动物不同的笼子里。 - 将针头插入腹部右侧的2/3,用240~250mg/kg三溴二苯乙醇(TBE)对5至7周大雌性BALB/c小鼠进行麻醉。然后,将鼠标送回笼子,等待约5分钟。
注:在体内流感感染中,推荐注射镇静剂超过吸入镇静剂,因为后者可以通过气道上皮改变病毒的行为和吸收。此外,它们也会影响肺部的局部免疫反应,并干扰受感染小鼠的体内成像。最后,吸入镇静剂减少了效果持续时间,这将是受感染动物体内成像的问题。 - 用制备的BIRFLU稀释剂的30μL对小鼠进行内吸。在将小鼠送回笼子之前,检查它们是否呼吸正常。
- 检查小鼠以评估其健康和整体外观。在 1x PBS 中制备 BIRFLU 的稀释剂,用 1 x 106 PFU 的 BIRFLU 给小鼠接种,总体积为 30 μL/小鼠。在冰上保持病毒,直到小鼠接种。
- 感染BIRFLU的小鼠的生物发光监测 (图4A)
注:本稿件记者在感染BIRFLU的小鼠肺部表达Nluc或Venus和病毒复制,确定在感染后3天。然而,生物发光成像的性质允许重复监测单个BIRFLU感染动物的Nluc表达,而无需在每个实验时间点对它们实施安乐死。执行所述实验程序需要带有异法麻醉歧管的体内成像系统。有关用于图像采集和数据分析的成像仪器和图像软件的详细信息,请参阅材料表。- 切地小鼠胸部以改善生物发光信号。打开成像软件,然后按"初始化"。接下来,设置将使用的参数,包括将成像模式设置为生物发光、自动保存、自动曝光时间、打开滤波器等。
- 机器完全初始化后,打开机外麻醉系统。将动物放在麻醉室。小鼠同时和轻洗与氧气的混合物和蒸发1⁄2%的异常。
- 一旦小鼠被麻醉,使用带有22G针头的注射器,在1xPBS(最终体积100μL/鼠标)中稀释1:10的Nluc基质(见材料表)。
- Nluc试剂给给后立即放入成像仪器中,将动物的胸部朝上,鼻塞在歧管锥内,在成像过程中保持动物麻醉。关闭成像器门后,立即单击软件程序中的获取(图4A,顶部)。
- 成像后,将小鼠送回笼子,监测它们,直到它们完全恢复并关闭离脱蒸发器。然后,继续对小鼠肺进行活体成像,以评估金星报告者的基因表达(第4.3节)。
- 使用成像软件工具分析获取的生物发光数据。利用工具ROI(感兴趣的区域)指定特定信号,并在感兴趣的区域(通常围绕胸部)执行磁通量测量(图 4A,底部)。尽管 ROI 形状不相关,但通常倾向于捕获整个信号扩散区域。
- 单击"测量"。评估光子中的生物发光,因为它提供绝对光子发射测量,可与不同参数或成像仪器提供的输出测量相媲美。
- 感染BIRFLU的小鼠的荧光分析(图3和图4B)
- 收集小鼠肺后,在体内成像,如前所述23。
- 简单地说,用致命剂量的TBE(500毫克/千克)对小鼠实施安乐死。用70%乙醇消毒切口部位。用手术刀,从胸骨切开腹部底部,然后用剪刀从切口底部切到两侧。接下来,切肝静脉(第二物理安乐死方法)出血动物。
注:为了避免在成像过程中出现高背景信号,尽量减少肺部的血液量非常重要(见下文)。
- 简单地说,用致命剂量的TBE(500毫克/千克)对小鼠实施安乐死。用70%乙醇消毒切口部位。用手术刀,从胸骨切开腹部底部,然后用剪刀从切口底部切到两侧。接下来,切肝静脉(第二物理安乐死方法)出血动物。
- 将鼠标置于背功能中,用剪刀切开胸膜并打开肋骨笼。随后,用剪刀剪断气管末端,同时用钳子轻轻握住肺部,切除肺部。
- 将肺部放入6孔板,2 mL为1x PBS,用1x PBS清洗肺部三次。
注:为了避免样品之间的污染,清洁和消毒每个动物之间的解剖工具。
- 将肺部放入6孔板,2 mL为1x PBS,用1x PBS清洗肺部三次。
- 单击初始化启动图像采集软件并设置成像参数,包括将成像模式设置为荧光、自动保存、自动曝光时间、激发(500 nm)和发射(540 nm)滤波器。
- 初始化机器时,将肺部放在黑色背景托盘中,确保组织彼此分离,将托盘引入成像器,并在关闭成像器门后单击"获取成像系统程序"(图 4B,顶部)。
- 成像后,如果样品在同一天处理,立即取出组织并将其储存在冰上(4°C);或放在管子和干冰上,以迅速冷冻,然后储存在-80°C,如果样品将在以后处理在不同的一天。
- 对于图像处理,选择ROI工具并绘制每个肺周围的 ROI。单击"测量"。然后,使用生成的平均辐射效率测量值,从模拟感染的小鼠中减去值(图4B,底部)。
注:使用BIRFLU,Nluc和金星表达的水平和信号分布具有良好的相关性。因此,分析来自同一动物的Nluc(全小鼠)和金星(被切除的肺)表达,并保持相同的方向是很重要的。
- 收集小鼠肺后,在体内成像,如前所述23。
- 小鼠肺BIRFLU复制的评价(图3和图4C)
- 如前述23所述,通过斑块测定使小鼠肺部进行病毒滴定。
- 将肺放入带有1 mL冷冻感染介质的Dounce均质器中。在室温下,用刺虫与肺同质化1分钟,直到完全分解,并将样品储存在4°C的无菌管中。
- 将样品在300 x g下离心10分钟,并在无菌管中收集上清液。如果样品将在同一天使用,则将其储存在冰上,或将其冷冻在-80°C,以在以后评估病毒性定子。
注:每个肺样本都应使用新的大数均化剂。 - 为了执行斑块测定,在进行病毒滴定前一天,在组织培养基培养基中用MDCK细胞(5 x 105细胞/孔)播种六孔板。在37°C下用5%的CO2孵育细胞过夜,第二天达到90%的汇合。感染前,确认细胞在光学显微镜下形成单层。
- 从感染介质中的均质样品(步骤 4.4.1)制备上清液的1:10序列稀释。用540μL感染培养基制备微离心管,从均质肺样品中加入60μL到第一管,通过上下移液混合,然后使用新的尖端,将60μL转移到下一个管。重复此串行稀释过程,直到最后稀释。
注:根据我们的经验,7稀释液足以通过从受感染小鼠的肺部进行斑块测定来确定病毒性牙点。 - 用1x PBS清洗MDCK细胞(步骤4.4.3)两次,并将500μL的序列稀释样品转移到六孔板中的每口。将板放在摇动平台上,在室温下进行 1 小时病毒吸收。
- 在1小时病毒吸收后,去除病毒接种,加入含有1μg/mLTPCK处理胰蛋白酶的覆盖介质2mL/井,然后在33°C下5%CO2孵育细胞3天。
- 修复受感染的细胞(步骤4.4.6),在室温下在1x PBS中稀释1mL/4%甲醛,然后小心地取出覆盖介质,并在每口井中加入1 mL的1x PBS。为了对金星进行可视化,使用用于检测荧光的成像系统对六孔板进行成像。
注:可以使用图像编辑软件对病毒斑块进行着色(参见材料表)。 - 要评估 Nluc 表达,使用抗 Nluc pAb 进行免疫染色,使病毒斑块可视化。为此,在室温下,使用0.5 mL/井渗透溶液去除1xPBS渗透细胞15分钟。
- 去除渗透溶液,用1x PBS清洗细胞三次,在室温下用0.5 mL/井的阻隔溶液封堵1小时。
- 从步骤4.4.9中去除阻滞溶液,在37°C下用0.5 mL/well的pAb抗Nluc稀释1:1,000在稀释溶液中孵育细胞。
- 根据制造商关于氮表达斑块可视化的建议,使用 ABC 碱性磷酸酶套件和 DAB 过氧化物酶基底套件。
- 简单地说,用1x PBS三次清洗4.4.10的细胞,并在37°C下用0.5 mL/井的生物素化抗兔子二次抗体孵育1小时。
- 去除二级抗体,用1x PBS洗涤细胞三次,并在37°C下用ABC溶液孵育1小时。用1x PBS清洗细胞三次,使用DAB HRP基板套件可视化病毒斑块。使用传统扫描仪扫描免疫染色斑块。
注:可以使用其他类似的免疫染色试剂盒。
- 在室温下用水晶紫罗兰溶液染色病毒斑块1小时。丢弃水晶紫罗兰,用水清洗板三次,让盘子干燥,然后再次扫描盘子。
- 要确定病毒性牙点,请计算水晶紫罗兰染色后显示的斑块。使用传统扫描仪扫描斑块。将病毒牙斑计算为每 mL (PFU/mL) 的斑块形成单位 (PFU)。
- 要评估BIRFLU在体内的稳定性,请计算被传播的水晶紫色斑块的数量(传染性病毒的数量,步骤4.4.12),并与金星和Nluc表达斑块的数量进行比较(步骤 4.4.7 和步骤 4.4.11)。
- 将样品在300 x g下离心10分钟,并在无菌管中收集上清液。如果样品将在同一天使用,则将其储存在冰上,或将其冷冻在-80°C,以在以后评估病毒性定子。
Representative Results
BIRFLU体外的生成和表征(图1和图2)
使用最先进的分子生物学和基于质粒的反向遗传学技术构建了一个具有重组复制能力的IAV,表达两个不同的报告基因(BIRFLU)。在这里,我们选择使用Nluc,因为与其他荧光素酶有几个优势,包括其体积小,ATP独立,更大的强度,和优化的基材48,60。Nluc被克隆到IAV PR8的HA部分,然后是HA开放阅读框架(ORF)前面的猪孢子病毒(PTV)2A裂解位点(2A)(图1)。HA 的 ORF 包括无声突变,以去除原始包装信号并避免任何可能的重组。完整的HA包装信号被添加到Nluc前面,以便将经过修饰的HA段从同一病毒RNA片段中适当纳入病毒和Nluc和HA表达中(图1)。此外,荧光蛋白金星被克隆成一个经过修饰的IAV PR8 NS片段,从一个单一的转录本32,36,41,54编码两种病毒蛋白NS1和NEP。 57.为此,金星被融合到NS1的C端,整个NEP ORF被克隆到位于NS1-Venus和NEP序列之间的PTV2A裂解位点下游(图1)。最终,这两个经过修饰的HA和NS病毒质粒结构与IAV PR8反向遗传学质粒的其余部分结合使用,以生成BIRFLU(图1)。BIRFLU的体外和体内特征已经描述之前55。
在图2中,我们使用荧光和间接免疫荧光方法确定金星、Nluc和NP表达水平,从而对体外BIRFLU进行特征化(图2A,B)。MDCK细胞的分离单层被模拟感染或感染(MOI 0.1)与WT或BIRFLU PR8病毒,并在感染后18小时,金星表达直接评估使用荧光显微镜(图2A,B)。Nluc (图 2A) 和 NP (图 2B) 表达通过间接免疫荧光使用每种蛋白质的抗体进行可视化。正如预期的那样,金星和Nluc表达只在受BIRFLU感染的细胞中检测,而不是在WT PR8病毒感染的细胞中检测到。此外,间接免疫荧光显微镜显示WT和BIRFLU PR8感染细胞中的NP表达。在模拟感染的细胞中未按预期检测金星、Nluc或NP的表达(图A,B)。
为了在体外评估Nluc表达水平,MDCK细胞被WT或BIRFLU PR8病毒感染(MOI 0.001),在感染后24、48、72和96小时评估组织培养上生子中的Nluc活性(图2C)。在感染了BIRFLU的MDCK细胞的组织培养上生细胞中只检测到Nluc活性(图2C)。在组织培养上生子中的Nluc活性早在感染后24小时就检测到感染后96h的表达水平较高,很可能是因为病毒感染释放期间诱发的细胞病变效应(CPE)使Nluc蛋白保留进入细胞。为了评价BIRFLU在培养细胞中的适应性,还评估了WT和BIRFLU PR8病毒的生长动力学(图2D),并通过免疫焦点测定确定了感染病毒在组织培养上生动物中的存在(图2D)).值得注意的是,BIRFLU复制动力学与WT PR8病毒的复制动力学相当,尽管BIRFLU复制略有延迟,没有达到与WT PR8相同的病毒分子。然而,BIRFLU能够达到5 x 107 PFU/mL(图2D),表明病毒基因组中两个报告基因的表达不会显著干扰MDCK细胞中的BIRFLU复制。
追踪小鼠的BIRFLU感染(图3和图4)
图 3是用于评估 IAV 感染小鼠模型中 BIRFLU 动力学的原理图流程图。五至七周雌性BALB/C小鼠要么被模拟感染1xPBS,要么感染了BIRFLU的1 x 106 PFU。在感染后3天,对小鼠进行非曲菌麻醉,然后以反光轨道注射Nluc基质。所有小鼠立即被放置在IVIS仪器中,Nluc信号在体内使用IVIS进行评估。接下来,对小鼠进行安乐死,并收获肺部。然后,使用体内成像器对被切除的肺进行外体分析,通过金星表达确定荧光强度。最后,小鼠肺均质化,病毒性定子和稳定性由斑块测定确定。斑块通过金星的直接荧光、使用Nluc特有的抗体进行免疫染色和晶体紫罗兰染色来评估。
以前描述的复制能力报告表达IAV表达一个单一的报告基因,最常见的是荧光或生物发光蛋白,作为病毒感染和复制的代理。然而,BIRFLU,能够表达两种类型的报告基因在病毒感染。为了评估生物发光(体内成像)和BIRFLU感染后荧光(活体成像)之间的相关性,5至7周大雌性BALB/c小鼠被模拟感染1xPBS或接种BIRFLU(106 PFU)的内伤.Nluc活性(图4A)在感染后3天使用体内成像仪器对Nluc基板注射回溯轨道进行评价。我们选择在第3天评估生物发光,因为以前的研究表明IAV复制,包括PR8,感染后第2天和第4天之间的峰值24,54。生物发光被监测(图4A,上图),用于计算平均总通量(Flux(日志10 p/s)(图4A,底部)。正如预测的那样,接种BIRFLU的小鼠表现出高生物发光活性,但在模拟感染的小鼠中未检测到任何信号。之后,采集了受感染小鼠的肺部,并用活体成像评估金星的表达(图4B,上图)。此外,还计算了荧光平均辐射效率(图4B,下图)。切除的小鼠肺也同质化,以确定病毒性定位和BIRFLU在体内的遗传稳定性(图4C,D)。利用从小鼠肺部和荧光显微镜(维纳斯,上)、免疫染色(Nluc、中)和水晶紫罗兰染色(底部)分离的病毒,通过斑块测定对BIRFLU的遗传稳定性进行了分析。从小鼠肺中恢复的BIRFLU能够形成斑块并稳稳地表达两个报告基因(图4C)。值得注意的是,我们观察到生物发光和荧光信号与病毒复制之间的良好相关性。
图1:IAV PR8 WT和BIRFLU病毒结构和基因组段的原理表示。IAV被含有两种主要病毒性糖蛋白血凝素(HA;黑色)和神经氨酸酶(NA;蓝色)的脂质双层包围。IAV 包含八个单链、负感 RNA 段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和 NS)。每个病毒段包含 3' 和 5' 端处的非编码区域 (NCR) (黑盒)。此外,在病毒 (v) RNA 的 3' 和 5' 端是包装信号,负责将 vRNA 有效地封装到新生病毒(白色盒)。IAV PR8 HA 和 NS 病毒片段和产品以黑色表示。Nluc、Venus 和 PTV 2A 的序列分别以红色、绿色和条纹框表示。在BIRFLU中分别表示Nluc和Venus的修改HA和NS段的示意图表示。这个数字是从诺加莱斯等人55。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:BIRFLU的体外表征。(A, B)通过直接荧光和免疫荧光分析蛋白质表达。MDCK细胞被模拟感染或感染(MOI 0.1)与PR8 WT或BIRFLU病毒。受感染的细胞在感染后18小时被固定,通过直接荧光显微镜直接可视化金星表达,并使用特定的抗体和间接免疫荧光可视化Nluc (A) 和病毒NP (B) 表达。核被DAPI弄脏了。显示代表性图像(20 倍放大倍数)。刻度条 = 100 μm。(C, D)PR8 WT 和 BIRFLU 的生长动力学。在感染WT和BIRFLU PR8病毒的MDCK细胞(MOI 0.001)的组织培养上生子中的Nluc活性(C)和病毒滴度(D)在感染后指示时间进行评估。数据表示三元数的自定值和 SD。病毒性牙点由免疫聚焦测定(FFU/mL)决定。虚线表示检测限制 (200 FFU/ml)。这个数字是从诺加莱斯等人55。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:小鼠BIRFLU研究的原理表。Nluc和Venus报告基因的表达在感染BIRFLU的1 x 106 PFU的小鼠中进行了评估,使用体内或前体成像。简单地说,在第1天,5至7周大的雌性BALB/c小鼠被模拟感染(1x PBS)或接种1 x 106 PFU的BIRFLU内。在感染后的第3天,使用胶质对小鼠进行轻度麻醉,并采用逆向注射Nluc基质。使用体内成像直接评估Nluc信号。成像后,立即对小鼠实施安乐死,并使用外生成像技术分析整个切除肺部的金星表情。恢复的小鼠肺被同质化,以评估病毒复制和稳定性通过斑块测定。箭头表示荧光(金星)、免疫染色(Nluc)和水晶紫罗兰染色之间的相关性。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:体内生物发光和荧光表达。雌性五至七周大的BALB/c小鼠被模拟感染(1x PBS)或接种1 x 106 PFU的BIRFLU内。在感染后的第3天, 整个小鼠的Nluc活动 (A) 被确定.显示辐射刻度(p/sec/cm2/sr)的单只鼠标的代表性图像。定量了生物发光辐射值,并显示了平均总通量(Flux(日志10 p/s)。Nluc成像后,肺被采集用于活体成像(B)。显示来自整个肺部的代表性图片。为了量化金星表达,将感兴趣区域(ROIs)的平均值归一化为模拟受感染小鼠的肺自荧光,并计算了折叠变化。为了分析BIRFLU在体内的遗传稳定性,使用荧光显微镜(维纳斯,上),免疫染色(Nluc,中)和水晶紫罗兰染色(下)(C),通过斑块测定分析从小鼠肺中恢复的病毒。将显示来自一个鼠标的代表性图像。为了评估病毒复制,整个肺在成像后被同质化,用于感染MDCK细胞,并通过斑块测定(PFU/mL) (D) 确定病毒滴定。箭头表示荧光(金星)、免疫染色(Nluc)和水晶紫罗兰染色之间的相关性。条代表肺病毒垂子的平均值 = SD。这个数字是从洛加莱斯等人55。请点击此处查看此图的较大版本。
| 组织培养介质和解决方案 | 组成 | 存储 | 使用 |
| 组织培养培养:Dulbeco 的改良鹰介质 (DMEM), 10% 胎儿牛血清 (FBS), 1% 青霉素 - 链霉素 - L -谷氨酰胺 (PSG)(DMEM 10 % FBS 1% PSG)。 | 445 ml DMEM,50 mL FBS 和 5 mL 100x PSG。 | 4 °C | MDCK 细胞的维护 |
| 感染后介质: DMEM 0.3% 牛白蛋白 (BA), 1% PSG(DMEM 0.3 % BA 1% PSG. | 491 毫升 DMEM,4.2 ml 35% BA 和 5 毫升 100x PSG | 4 °C | 病毒感染后MDCK细胞的维护 |
| 10x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) | 80 克 NaCl,2 g KCl,11.5 g Na2HPO4.7H2O,2 g KH2PO4。将 ddH2O 添加到 1 L. 将 pH 调整到 7.3 | 室温 | 准备 1x PBS |
| 1x PBS | 稀释 10x PBS 与 ddH2O | 室温 | 洗涤细胞 |
| 感染介质:1x PBS,0.3%BA,1%青霉素-链霉素(PS)(PBS/BA/PS )。 | 487 mL 1x PBS 无菌,4.2 mL 35% BA 和 5 ml 100x 1% PS (100 U/mL) | 4 °C | 病毒性感染 |
| 固定/渗透溶液:4%甲醛,0.5%三吨X-100稀释在1xPBS中。 | 400 mL 中性缓冲形式 10%, 5 ml Triton X-100 和 595 mL 1x PBS | 室温 | MDCK细胞的修复和渗透。 |
| 阻断溶液:1x PBS中的2.5%牛血清白蛋白(BSA)。 | 2.5 克 BSA,97.5 mL 的 1x PBS | 4 °C | 免疫荧光和斑块测定的阻断溶液。 |
| 抗体稀释溶液(1x PBS中的1%BSA) | 1 g BSA 在 99 mL 的 1x PBS | 4 °C | 稀释原抗体和次级抗体。 |
| 0.1% 水晶紫色溶液 | 1克400mL甲醇中的水晶紫罗兰。添加 600 毫升 ddH2O | 室温 | MDCK细胞在斑块测定中的染色。 |
| 苯甲基苯基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶 | 以 1 mg/mL 的 ddH2O 为 1,000x 库存溶液准备 | -20 °C | 对于病毒感染。 |
表1:组织培养介质和溶液。
Discussion
研究人员一直依靠重组报告人表达的病毒作为重要的分子工具,了解和扩大目前对病毒复制和发病机制的理解26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54.最受青睐的记者基因是荧光素酶和荧光蛋白,这主要是由于在识别、改进的变异和成像技术检测方面技术进步43,44,45,46,47,48.重组报告病毒通常用于加速病毒学检测,研究病毒在体外和体内的动态,以及测试目前批准或新疫苗的有效性和治疗方法26 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54。不幸的是,在IAV的情况下,过去的研究仅限于单一报告基因的表达,这阻碍了可以进行的研究类型,可以进行26,27,28,29 ,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,54.为了避免这种限制,我们产生了一个具有复制能力的双报告IAV,它表示一种Nluc荧光素酶和一种金星荧光蛋白(BIRFLU)。
在本报告中,我们描述了BIRFLU的体外表征,以及使用BIRFLU使用IAV感染小鼠模型跟踪体内病毒感染的实验方法。BIRFLU Nluc和金星表达与病毒性地名子相关。此外,BIRFLU保持稳定,并在从受感染小鼠的肺部恢复后继续表达两个报告者的基因。这种方法为研究人员提供了一个极好的机会来研究培养细胞和动物模型中的IAV,包括识别和开发新的治疗IAV感染的替代方法。
虽然BIRFLU是使用PR8的主干生成的,但使用不同类型、亚型或病毒株主干的其他重组IAV也可以使用相同的实验方法生成。同样,在本报告中,我们描述了在IAV小鼠模型中使用BIRFLU的实验程序。然而,BIRFLU可能是评估其他动物模型中IAV感染的宝贵技术。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
LM-S 实验室对流感病毒的研究部分资金来自纽约流感卓越中心 (NYICE) (NIH 272201400005C),该中心是 NIAID 流感研究与监测卓越中心 (CEIRS) 合同号的成员。HHSN272201400005C (NYICE) 和由国防部 (DoD) 同行评审医学研究计划 (PRMRP) 授予 W81XWH-18-1-0460。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4 ° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| 5 to 7 week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
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