Summary
Influenza-A-Viren (IAVs) sind ansteckende Atemwegserreger, die jährliche Epidemien und gelegentliche Pandemien verursachen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Verfolgung viraler Infektionen in vivo mit einer neuartigen rekombinanten Luziferase und fluoreszenz-exzierenden Bi-Reporter IAV (BIRFLU). Dieser Ansatz bietet Forschern ein ausgezeichnetes Werkzeug, um IAV in vivo zu studieren.
Abstract
Influenza-A-Viren (IAVs) verursachen Erkrankungen der menschlichen Atemwege, die mit erheblichen gesundheitlichen und wirtschaftlichen Folgen verbunden sind. Wie bei anderen Viren erfordert das Studium von IAV die Verwendung mühsamer sekundärer Ansätze, um das Vorhandensein des Virus in infizierten Zellen und/oder in Tiermodellen der Infektion zu erkennen. Diese Einschränkung wurde vor kurzem mit der Erzeugung von rekombinanten IAVs umgangen, die leicht rückverfolgbare fluoreszierende oder biolumineszierende (Luciferase) Reporterproteine exdrücken. Jedoch, Forscher wurden gezwungen, fluoreszierende oder luziferase Reporter Gene aufgrund der begrenzten Kapazität des IAV-Genoms für die Einbeziehung fremder Sequenzen zu wählen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir einen rekombinanten Replikations-kompetenten Bi-Reporter IAV (BIRFLU) generiert, der sowohl ein fluoreszierendes als auch ein luziferase Reporter-Gen stabil ausdrückt, um IAV-Infektionen in vitro und in vivo leicht zu verfolgen. Zu diesem Zweck wurden die viralen nichtstrukturellen (NS) und Hemagglutinin (HA) viralen Segmente der Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) modifiziert, um die fluoreszierende Venus bzw. die biolumineszierenden Nanoluzluc-Luziferase-Proteine zu kodieren. Hier beschreiben wir die Verwendung von BIRFLU in einem Mausmodell der IAV-Infektion und den Nachweis beider Reportergene mittels eines In-vivo-Bildgebungssystems. Insbesondere haben wir eine gute Korrelation zwischen den Ausdrücken von Reportern und der Virusreplikation beobachtet. Die Kombination modernster Techniken in der Molekularbiologie, Tierforschung und Bildgebungstechnologien bietet Forschern die einzigartige Möglichkeit, dieses Tool für die Grippeforschung zu nutzen, einschließlich der Untersuchung von Virus-Host-Wechselwirkungen und Virusinfektionen. Wichtig ist, dass die Möglichkeit, das virale Genom genetisch zu verändern, um zwei fremde Gene aus verschiedenen virusischen Segmenten auszudrücken, Möglichkeiten eröffnet, diesen Ansatz für folgende Möglichkeiten zu nutzen: (i) die Entwicklung neuartiger IAV-Impfstoffe, (ii) die Erzeugung rekombinanter IAVs, die kann als Impfstoffvektor für die Behandlung anderer infektionen menschlicher Erreger verwendet werden.
Introduction
Das Influenza-A-Virus (IAV) ist ein einsträngiges, negativ-seimstiges RNA-Virus der Familie Orthomyxoviridae aus der Familie der Orthomyxoviridae1,2,3. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt die Zahl der Grippetoten auf 3-5 Millionen jährlich und mehr als 250.000 Todesfälle durch Grippe weltweit4,5,6. Zu den Gruppen, die besonders anfällig für Influenza sind, gehören ältere Menschen, immungeschwächte Personen und Kinder7,8,9,10,11. Obwohl Impfstoffe verfügbar sind und die häufigste und wirksamste Intervention gegen Virusinfektionen darstellen, ist IAV in der Lage, sich schnell zu entwickeln und vorbestehende Immunität zu entgehen3,12,13, 14 , 15. Das Wiederauftauchen eines Pandemie-H1N1-Stamms im Jahr 2009 und das Aufkommen pathogener IAV wiederholt die ständige Bedrohung der menschlichen Gesundheit weltweit4,16.
Während einer Epidemie oder Pandemie ist es entscheidend, die Pathogenität und Übertragbarkeit neu isolierter Viren schnell zu bestimmen. Derzeit verfügbare Techniken zum Erkennen des Virus sind zeitaufwändig und erfordern manchmal die Verwendung von mühsamen Ansätzen, die den Abschluss dieser Analysen verzögern können17,18,19,20. Darüber hinaus sind die derzeitigen viralen Assays schwer zu skalieren, was im Falle eines Ausbruchs erforderlich sein könnte. Schließlich wird die Verwendung validierter Tiermodelle von Infektionen, wie Mäuse, Meerschweinchen und Frettchen, routinemäßig verwendet und ist für die Untersuchung von Influenza-Infektionen, Immunreaktionen und der Wirksamkeit neuer Impfstoffe und/oder antiviraler Medikamente von entscheidender Bedeutung. Diese Modelle sind jedoch aufgrund der Unfähigkeit, die virale Dynamik in Echtzeit zu beobachten, restriktiv; Dies beschränkt die Studien auf die statische Bildgebung von Virusinfektionen21,22,23,24,25. Tiere, die in diesen Assays verwendet werden, werden auch eingeschläfert, um die Viruslast zu bestimmen, wodurch die Anzahl der Tiere, die für die Vervollständigung dieser Studien erforderlich sind, erhöht wird26. Um all diese Einschränkungen zu umgehen, verlassen sich viele Forscher auf den Einsatz rekombinanter Replikations-kompetenter, reporter-ausdrückender IAVs, die in der Lage sind, virologische Tests zu beschleunigen und die Viruslast und -verbreitung in vivo in Echtzeit zu erkennen26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Wichtig ist, dass diese Reporter-exezierenden IAVs in der Lage sind, ähnlich wie Wildtyp (WT) IAVs in der Zellkultur und in Tiermodellen der Infektion33,42zu replizieren.
Fluoreszierende und biolumineszierende Proteine sind zwei Reportersysteme, die von Forschern aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Stabilität und Benutzerfreundlichkeit häufig verwendet werden. Darüber hinaus gibt es enorme Unterstützung und Weiterentwicklung in fluoreszierenden und biolumineszenten Proteindetektionstechnologien43,44,45,46,47,48 . Fluoreszierende Proteine und Luziferase haben unterschiedliche Eigenschaften, die sie leuchten lassen, insbesondere unterschiedlich in der Art und Weise, wie aufgeregte Zustände erzeugt werden und wie Emittance erkannt wird43,44,45, 46,47,48. Fluoreszierende Proteine werden zuerst durch absorbierende Energie angeregt, die anschließend als Licht bei einer anderen Wellenlänge freigesetzt wird, wenn die Moleküle auf einen niedrigeren Energiezustand abnehmen43. Auf der anderen Seite wird die Biolumineszenz aus einer chemischen exothermen Reaktion abgeleitet, die ein Substrat, Sauerstoff und manchmal ATP beinhaltet, um Licht zu erzeugen45. Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften dieser beiden Arten von Reporterproteinen ist eines je nach Studie vielleicht vorteilhafter als das andere. Während fluoreszierende Proteine weit verbreitet sind, um die zelluläre Lokalisation zu beobachten28,41, haben ihre In-vivo-Signale eine unzureichende Intensität und werden oft durch Autofluoreszenz in lebenden Geweben verdeckt49. Daher verlassen sich die Forscher auf Luziferasen, um die virale Dynamik in lebenden Organismen zu bewerten, obwohl fluoreszierende Proteine für ex vivo-Studien50,51,52,53bevorzugt werden können. Im Gegensatz zu fluoreszierenden Proteinen sind Luziferasen für In-vivo-Studien bequemer und in nicht-invasiven Ansätzen eher anwendbar26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. Letztendlich müssen die Forscher auf der Grundlage der Art der Studie zwischen der Verwendung eines fluoreszierenden oder eines luziferase-Reporterproteins als Auslese wählen, das ihre Studie einem Kompromiss von Funktionalitäten und Empfindlichkeiten unterwirft, und schränkt die Nützlichkeit der rekombinanten Reporterviren ein. Darüber hinaus bestehen Bedenken hinsichtlich der Korrelation zwischen der Expression verschiedener Reportergene unter Verwendung von Fluoreszenz- oder Luziferasesystemen und der Virusreplikation oder -verbreitung, die die Interpretation der mit Reporter-ausdrückende IAVs.
Wir haben diese Einschränkung überwunden, indem wir einen rekombinanten Replikations-kompetenten Bi-Reporter IAV (BIRFLU) erzeugt haben, der sowohl für ein fluoreszierendes als auch für ein Luziferase-Protein im selben viralen Genom kodiert55 (Abbildung 1). Hier wurde NanoLuc luciferase (Nluc), ein kleines und helles biolumineszierendes Protein48, vor der Hemagglutinin (HA)-Sequenz in das virale HA-Segment der Influenza A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Darüber hinaus wurde Venus, ein häufig verwendetes monomeres fluoreszierendes Protein, in das nicht-strukturelle (NS) virale Segment32,33,36,41,55eingeführt. Da BIRFLU sowohl für fluoreszierende als auch für luziferase Reportergene kodiert, kann entweder das Reporterproteinsignal als Auslese verwendet werden, um die Virusreplikation und -verbreitung in vitro oder in vivo55zu bestimmen. Weitere Informationen zur Erzeugung und In-vitro- oder In-vivo-Charakterisierung von BIRFLU finden Sie in unserer aktuellen Publikation55. BIRFLU kann verwendet werden, um die Wirksamkeit antiviraler Medikamente oder neutralisierender Antikörper über einen neuartigen fluoreszierenden und biolumineszenten Mikroneutralisationstest zu testen55. Darüber hinaus kann BIRFLU auch verwendet werden, um die virale Dynamik in einem Mausmodell der Infektion55zu bewerten. In diesem Manuskript beschreiben wir die Verfahren zur Charakterisierung von BIRFLU55 in vitro und wie die BIRFLU-Infektion bei Mäusen mit In-vivo-Lumineszenz-Bildgebungssystemen zum Nachweis von Nluc in vivo oder von Venus ex vivo untersucht wird.
Die Kombination modernster Techniken in der Molekularbiologie, Tierforschung und bildgebenden Technologien bietet Forschern die einzigartige Möglichkeit, BIRFLU für die IAV-Forschung zu nutzen, einschließlich der Untersuchung von Virus-Host-Wechselwirkungen, der Dynamik von Virusinfektionen; Entwicklung neuartiger Impfstoffansätze zur therapeutischen Behandlung von IAV-Infektionen oder die mögliche Verwendung von IAV als Impfstoffvektor für die Behandlung anderer Krankheitserregerinfektionen.
Protocol
Alle Protokolle, an denen Mäuse beteiligt sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und dem Institutional Biosafety Committee (IBC) der University of Rochester, School of Medicine and Dentistry genehmigt. Alle Tierversuche folgen den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Research Council58. Das Vivarium und die Abteilung für Labortiermedizin an der School of Medicine and Dentistry der University of Rochester ist von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International akkreditiert und den Bundes- und Landesgesetzen und der Politik der National Institutes of Health (NIH) entsprechen. Bei der Arbeit mit Mäusen ist eine ordnungsgemäße persönliche Schutzausrüstung (PSA) erforderlich. Ähnliche Richtlinien und Anforderungen sollten bei der Durchführung von Experimenten umgesetzt werden, die in diesem Manuskript an jeder Institution beschrieben werden.
1. Verwendung von kleinen Wirbeltieren
- Kaufen Sie fünf bis sieben Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse und halten Sie sie in der Tierpflegeeinrichtung unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen. Wenn Mäuse in die festgelegten Einrichtungen gelangen, lassen Sie 4–5 Tage Ruhezeit ein, damit sich die Tiere an ihre neue Umgebung akklimatisieren können.
- Legen Sie nach IACUC-Protokollen maximal 5 Mäuse pro Käfig auf.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das Tier tot ist, wurden Mäuse nach Abschluss des Versuchs mit zwei zugelassenen Verfahren eingeschläfert, wobei zu berücksichtigen war, dass das zweite eine physikalische Methode sein muss. In dieser Studie werden Die Tiere nach einer Infektion von Mäusen mit BIRFLU und in vivo-Bildgebung mit einer tödlichen Dosis von 2,2,2-Tribromethanol (TBE) eingeschläfert und die Lebervene als physikalische sekundäre Methode geschnitten, wie wir bisher23gezeigt haben.
2. Biosicherheit
HINWEIS: In diesem Manuskript wurde BIRFLU im Rückgrat der Influenza A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8) erzeugt, einem gemeinsamen mausangepassten Labor-IAV-Stamm23,32,33,56. Das Virus wurde mit zuvor beschriebenen Plasmid-basierten Reverse-Genetik-Ansätzen und einer vollständigen Beschreibung der Erzeugung erzeugt, und in vitro und in vivo Charakterisierung von BIRFLU finden Sie in unserer aktuellen Publikation55. Alle Verfahren, bei denen Eshandelten (in vitro oder in vivo) sind, wurden in einem biologischen Sicherheitsschrank unter Biosicherheitsniveau (BSL)-2 durchgeführt.
ACHTUNG: Ein angemessenes Biosicherheitsniveau sollte im Einklang mit einer Risikobewertung für die biologische Sicherheit festgelegt werden. Zusätzliche Informationen über die Durchführung von Risikobewertungen für die biologische Sicherheit und die Einrichtung einer wirksamen Eindämmung der biologischen Sicherheit sollten mit dem Organ konsultiert werden, in dem die Versuche durchgeführt werden.
- Reinigen Sie die Biosicherheitsschränke vor und nach durchführung aller experimentellen Verfahren mit 70 % Ethanol- oder Chlordioxid-Desinfektionsmittel. Für Mäuse arbeiten, sterilisieren Sie alle Seziermaterial (Schere, Sezieren Zangen, etc.) und die Dounce Homogenisator vor und nach ihrer Verwendung.
- Entsorgen Sie das gesamte biologische Material, das während der Verfahren gemäß den entsprechenden IBC- und IACUC-Richtlinien hergestellt wird.
3. In-Vitro-Charakterisierung von BIRFLU (Abbildung 2)
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für alle Puffer- und Medienkompositionen.
- Analyse der Proteinexpression durch Fluoreszenz (Abbildung 2A) und indirekte Immunfluoreszenz (Abbildung 2B)
- Einen Tag vor der Infektion Samen 24-Well-Platten mit Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Epithelzellen (1 x 105 Zellen/ well, Triplicate) in Gewebekultur Medien und pflegen die Platten in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2 . Bereiten Sie genügend Brunnen vor, um alle ausgewählten Antikörper in mock-infizierten und BIRFLU-infizierten Zellen zu bewerten.
HINWEIS: Wir empfehlen, die Zellen unter einem Lichtmikroskop zu visualisieren, um eine Monoschicht zu bestätigen, bevor die Virusinfektion beginnt. Es wird eine 90%ige Konfluenzmonoschicht von MDCK-Zellen zum Zeitpunkt der Infektion empfohlen. - Bereiten Sie Verdünnungen von WT- oder BIRFLU-IAVs in Infektionsmedien vor und infizieren Sie die ausgesäten MDCK-Zellen mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 0,1 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle in einem Endvolumen von 0,25 ml/Well von Infektionsmedien.
- Entfernen Sie das Gewebekulturmedium aus Schritt 3.1.1 und waschen Sie die MDCK-Zellen zweimal mit 1x phosphatgepufferter Saline (PBS). Fügen Sie die Virusverdünnungen von 3.1.2 zu den MDCK-Zellen hinzu und legen Sie die Platten auf einer Schaukelplattform für 1 h bei Raumtemperatur, um eine virale Adsorption zu ermöglichen.
HINWEIS: Mock-infizierte Zellen werden nur mit Infektionsmedien in Abwesenheit von Virus inkubiert. - Nach viraler Adsorption (Schritt 3.1.3) entfernen Sie das virale Inokulum durch Aspiration und fügen Sie jedem Brunnen 1 ml Nachinfektionsmedium mit 1 g/ml TPCK-behandeltem Trypsin hinzu. Inkubieren Sie Zellen für 18 h in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 33 °C.
- Nach 18 h Infektion, entfernen Sie die Gewebekultur Überstand von den 24-Well-Platten (3.1.4). Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,25 ml/Well der Fixations-/Permeabilisationslösung für 20 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Bereiten Sie die Fixierungs-/Permeabilisationslösung in einer Dunstabzugshaube vor, um eine Formaldehyd-Exposition zu verhindern. - Entfernen Sie die Fixierungs-/Permeabilisierungslösung aus Schritt 3.1.5, waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 0,25 ml/Gut der Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie Zellen in einer blockierenden Lösung bei 4 °C über Nacht. - Entfernen Sie die Blockierende Lösung (Schritt 3.1.6) und fügen Sie 0,25 ml/Well (1 g/ml) eines monoklonalen Mausantikörpers (MAb) gegen das IAV-Nukleoprotein, NP (HB-65) oder eine 1:1.000 Verdünnung eines polyklonalen Antikörpers (pAb) eines Kaninchens gegen NLuc hinzu (siehe Tabelle der Materialien), in einer Verdünnungslösung (1x PBS, 2,5% BSA) verdünnt und die Zellen für 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie den primären Antikörper aus Schritt 3.1.7, waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS und inkubieren Sie sie mit 0,25 ml/Well eines Texas Red-conjugated Anti-Mouse oder Anti-Rabbit Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) verdünnt 1:200 in Antikörpern Verdünnungslösung.
HINWEIS: Zellkerne können gleichzeitig gebeizt werden, indem der gleichen sekundären Antikörperlösung 0,5 g/ml 4',6'-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) hinzugefügt werden. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 37 °C im Dunkeln. Andere sekundäre Antikörper, die mit anderen Fluorophoren konjugiert sind, können verwendet werden. - Entfernen Sie den sekundären Antikörper und DAPI aus Schritt 3.1.8, waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS. Nach dem Waschen die Zellen in 0,25 ml/Gut von 1x PBS lassen.
- Platzieren Sie die Platte auf der Bühne eines Fluoreszenzmikroskops, um die Expression von Venus- und Nluc-Reportern und NP von infizierten Zellen mit den richtigen Fluoreszenzfiltern zu erkennen. Erfassen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop (20-fache Vergrößerung) und verschmelzen Sie sie mit einer Bildbearbeitungssoftware (Abbildung 2A,B).
- Einen Tag vor der Infektion Samen 24-Well-Platten mit Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Epithelzellen (1 x 105 Zellen/ well, Triplicate) in Gewebekultur Medien und pflegen die Platten in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2 . Bereiten Sie genügend Brunnen vor, um alle ausgewählten Antikörper in mock-infizierten und BIRFLU-infizierten Zellen zu bewerten.
- Analysieren Sie die Nluc-Aktivität (Abbildung 2C) und die Virusreplikation (Abbildung 2D).
- Einen Tag vor der Infektion säen 12-Well-Platten mit MDCK-Zellen (2 x 105Zellen/well, Triplicate) mit Gewebekulturmedien in einem 37 °C-Inkubator mit 5% CO2, um bis zur Infektion etwa 90% Konfluenz zu erreichen.
HINWEIS: Überprüfen Sie vor der Infektion die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht von MDCK-Zellen zu überprüfen. - Der Infektionstag bereitet Verdünnungen der WT- und BIRFLU-Viren in Infektionsmedien vor, um die MDCK-Zellen (Schritt 3.2.1.) in Dreifache mit einem MOI von 0,001 PFU in 0,5 ml/Well zu infizieren. Entfernen Sie das Gewebekulturmedium und waschen Sie die MDCK-Zellen zweimal mit 1x PBS.
- Fügen Sie die Virusverdünnungen zu den MDCK-Monolayern hinzu und ermöglichen Sie eine virale Adsorption bei Raumtemperatur für 1 h auf einer Schaukelplattform. Nach der viralen Adsorption entfernen Sie das Virus Inokulum und fügen Sie jedem Brunnen 1,5 ml Nachinfektionsmedien hinzu, die 1 g/ml TPCK-behandeltes Trypsin enthalten. Inkubieren Sie infizierte Zellen in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 33 °C und sammeln Überstand zu den in Schritt 3.2.4 angegebenen Zeitpunkten.
- Bei 24, 48, 72 und 96 h nach der Infektion (p.i.) sammeln 150 L Gewebekultur-Überstand aus jedem Brunnen und speichern die Proben in einem Mikrozentrifugenrohr bei -80 °C, um die Nluc-Assays und viralen Titrationen durchzuführen.
- Um den Nluc-Aktivitätstest durchzuführen, folgen Sie den Angaben des Herstellers. Zuerst tauen Sie den bei -80 °C (Schritt 3.2.4) gelagerten Gewebekulturüberstand auf Eis auf.
HINWEIS: Beziehen Sie sich auf die Empfehlungen des Herstellers und optimieren Sie den Test bei Bedarf. - Bereiten Sie die Luziferase-Assay-Lösung (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie das Nluc-Substrat 1:50 mit dem Verdünnungspuffer verdünnen. Mischen Sie in einer weißen 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden für Luziferase-Assays 25 L Luziferase-Assay-Lösung mit 10 bis 25 l der gesammelten Gewebekultur-Überstandproben. Inkubieren Sie die Mischung für 2-3 min, bevor Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer messen (Abbildung 2C).
HINWEIS: Das Vorhandensein infektiöser Viruspartikel in der Gewebekultur wird durch Fluoreszenz-Immunfokus-Assay (Venus) oder indirekte Immunfluoreszenz (virale Antigenfärbung) wie zuvor beschrieben23,32, 33,56. - Einen Tag vor viralen Titrationen samen MDCK-Zellen in einer 96-Well-Platte (2 x 104 Zellen/well, Triplicate) mit Gewebekulturmedien und ermöglichen es Zellen, bis zur Infektion in einem Inkubator, der bei 37 °C bei 5% CO2 liegt, 90% Zusammenfluss zu erreichen.
- Verwenden Sie die Gewebekultur-Überstandproben, die auf Eis aufgetaut wurden (Schritt 3.2.4.). Fügen Sie in jeder der Brunnen in einer neuen 96-Well-Platte 90 L Infektionsmedien hinzu, und fügen Sie dann 10 L des aufgetauten Gewebekulturüberstandes (Schritt 3.2.4) zum ersten Brunnen (Zeile A) hinzu. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten, um 10 l von Zeile A in Zeile B zu mischen und zu übertragen. Ändern Sie die Spitzen zwischen Verdünnungen und mischen Sie sie gut.
HINWEIS: Dieser Vorgang sollte bis zur letzten Zeile (H) wiederholt werden. Wir empfehlen die Durchführung viraler Titrationen in Triplicaten zur genauen Messung von viralen Tittern. - Entfernen Sie das Gewebekulturmedium aus den MDCK-Zellen in den 96-Well-Platten (Schritt 3.2.7) und waschen Sie es zweimal mit 1x PBS. Fügen Sie 50 l der überstandenen Verdünnungen der Replik96-Well-Platte, die die Virusverdünnungen (Schritt 3.2.8) enthält, zu jedem Brunnen in der 96-Well-Platte, die MDCK-Zellen enthält.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Platte auf einer Schaukelplattform für 1 h bei Raumtemperatur, um eine virale Adsorption zu ermöglichen. Nach der viralen Adsorption entfernen Sie das Inokulum und fügen Sie 100 L/Well von Nachinfektionsmedien hinzu, die 1 g/ml TPCK-behandeltes Trypsin enthalten. Inkubieren Sie infizierte Zellen für 12 h in einem33 °C Inkubator mit 5% CO2 .
- Da BIRFLU Venus ausdrückt, kann die Anzahl der infizierten Zellen direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop gezählt werden. Alternativ können virale Titter durch indirekte Immunfluoreszenz bestimmt werden, wie zuvor mit einem Antikörper gegen ein virales Protein23,56,57,59beschrieben. Für letztere, fahren Sie fort, die Zellen zu fixieren/permeabilisieren und mit dem Anti-NP mAb HB-65, wie in Abschnitt 4.4 beschrieben, zu befestigen/permeabilisieren.
- Bestimmen Sie die viralen Titer, indem Sie die Anzahl der fluoreszierenden Einheiten (FFU)/ml nach der Formel zählen: ((Anzahl der FFU) x 20 x 1/Verdünnung (Abbildung 2D).
- Einen Tag vor der Infektion säen 12-Well-Platten mit MDCK-Zellen (2 x 105Zellen/well, Triplicate) mit Gewebekulturmedien in einem 37 °C-Inkubator mit 5% CO2, um bis zur Infektion etwa 90% Konfluenz zu erreichen.
4. In-Vivo-Charakterisierung von BIRFLU (Abbildung 3 und Abbildung 4)
- Mausinfektion
HINWEIS: Intranasale Infektion von Mäusen wurde wie zuvor beschrieben23durchgeführt. Für ein detaillierteres Protokoll der IAV-Infektion in vivo mit dem Mausmodell der Infektion, empfehlen wir das Video mit der vorherigen Publikation23zugeordnet anzeigen. In diesem Abschnitt werden nur die Schritte zusammengefasst, die für eine Mausinfektion mit BIRFLU erforderlich sind.- Überprüfen Sie die Mäuse, um ihre Gesundheit und ihr allgemeines körperliches Erscheinungsbild zu bewerten. Bereiten Sie die Verdünnung von BIRFLU in 1x PBS vor, um Mäuse mit 1 x 106 PFU BIRFLU in einem Gesamtvolumen von 30 l/Maus zu impfen. Halten Sie das Virus auf Eis bis zur Mausimpfung.
HINWEIS: Mock-infizierte (1x PBS) Mäuse werden als interne Kontrolle für die Bildgebung benötigt. Platzieren Sie mockinfizierte Mäuse in einem anderen Käfig als BIRFLU-infizierte Tiere. - Anästhetisieren Sie fünf- bis sieben Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse intraperitoneal mit 240–250 mg/kg Tribromethanol (TBE), indem Sie die Nadel in die kaudale 2/3 der rechten Seite des Bauches einsetzen. Dann kehren Sie die Maus in den Käfig zurück und warten Sie etwa 5 min. Überprüfen Sie, ob die Maus vor der Virusimpfung durch das Fehlen des Zehen-Pinch-Reflexes beäszisiert ist.
HINWEIS: Injizierbare Beruhigungsmittel werden bei inhalierten Beruhigungsmitteln für Influenza-Infektionen in vivo empfohlen, da letztere das Verhalten und die Aufnahme des Virus durch das Atemwegsepithel verändern können. Darüber hinaus können sie auch lokale Immunreaktionen der Lunge beeinflussen und die In-vivo-Bildgebung infizierter Mäuse stören. Schließlich haben inhalierte Beruhigungsmittel die Wirkungsdauer verringert, was ein Problem für die In-vivo-Bildgebung der infizierten Tiere wäre. - Impfen Sie die Mäuse intranasal mit den 30 l der vorbereiteten BIRFLU-Verdünnung. Überprüfen Sie, ob die Mäuse richtig atmen, bevor Sie sie in den Käfig zurückbringen.
- Überprüfen Sie die Mäuse, um ihre Gesundheit und ihr allgemeines körperliches Erscheinungsbild zu bewerten. Bereiten Sie die Verdünnung von BIRFLU in 1x PBS vor, um Mäuse mit 1 x 106 PFU BIRFLU in einem Gesamtvolumen von 30 l/Maus zu impfen. Halten Sie das Virus auf Eis bis zur Mausimpfung.
- Biolumineszenzüberwachung von mit BIRFLU infizierten Mäusen (Abbildung 4A)
HINWEIS: In diesem Manuskript werden der Ausdruck von Nluc oder Venus und die Virusreplikation in der Lunge von mit BIRFLU infizierten Mäusen nach 3 Tagen nach der Infektion bestimmt. Die Art der Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht jedoch eine wiederholte Überwachung der Nluc-Expression bei einzelnen BIRFLU-infizierten Tieren, ohne sie für jeden versuchsweise Zeitpunkt einschläfern zu müssen. Für die Durchführung der beschriebenen experimentellen Verfahren ist ein In-vivo-Bildgebungssystem mit einer Isofluran-Anästhesie-Mannifasie erforderlich. Weitere Informationen zum Bildverarbeitungsinstrument und zur Bildsoftware, die für die Bildaufnahme und Datenanalyse verwendet werden, finden Sie in der Tabelle des Materials.- Rasieren Sie die Brust der Mäuse, um das Biolumineszenzsignal zu verbessern. Öffnen Sie die Imaging-Software, und drücken Sie Initialize. Legen Sie als Nächstes die parameter fest, die verwendet werden, einschließlich der Einstellung des Bildgebungsmodus auf Biolumineszenz, automatisches Speichern, Belichtungszeit gegenüber Auto, offenem Filter usw.
- Sobald die Maschine vollständig initialisiert ist, schalten Sie das Isofluran-Anästhesiesystem ein. Tiere in die Anästhesiekammer geben. Mäuse werden gleichzeitig und leicht mit einem Gemisch aus Sauerstoffgas und verdampftem 1-2% Isofluran besäuztiert.
- Sobald Mäuse anästhesiert sind, verabreichen Sie das Nluc-Substrat (siehe Materialtabelle) verdünnt 1:10 in 1x PBS (Endvolumen 100 l/Maus) über retro-orbitale Route mit einer Spritze mit einer 22 G Nadel.
- Unmittelbar nach der Verabreichung des Nluc-Reagenzes legen Sie die Tiere in das Bildgebungsinstrument mit nach oben gerichteter Brust und Schnauch in den Mannigfaltigkeitskegel, um die Tieranästhesie während der Bildgebung zu beäugen. Unmittelbar nach dem Schließen der Imagertür klicken Sie im Softwareprogramm auf Acquire (Abbildung 4A, oben).
- Nach der Bildgebung kehren Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück, um sie zu überwachen, bis sie sich vollständig erholt haben, und schalten Sie den Isofluran-Verdampfer aus. Fahren Sie dann mit der Ex-vivo-Bildgebung der Mäuselunge fort, um die Genexpression des Venusreporters zu bewerten (Abschnitt 4.3).
- Verwenden Sie die Imaging-Software-Tools, um die erfassten Biolumineszenzdaten zu analysieren. Verwenden Sie das Tool ROI (Interessengebiet), um das spezifische Signal zu bestimmen und Flussmessungen im Interessenbereich (in der Regel um die Brust) durchzuführen (Abbildung 4A, unten). Obwohl die ROI-Form irrelevant ist, werden größere ROIs im Allgemeinen bevorzugt, um den gesamten Signaldiffusionsbereich zu erfassen.
- Klicken Sie auf Messen. Bewerten Sie die Biolumineszenz in Photonen, da sie eine absolute Photonenemissionsmessung bietet, die mit Ausgangsmessungen vergleichbar ist, die von verschiedenen Parametern oder bildgebenden Instrumenten bereitgestellt werden.
- Fluoreszenzanalyse bei mit BIRFLU infizierten Mäusen (Abbildung 3 und Abbildung 4B)
- Sammeln Sie die Mauslunge nach in vivo Bildgebung, wie zuvor beschrieben23.
- Kurz gesagt, einschläfern Mäuse mit einer tödlichen Dosis von TBE (500 mg/kg). Desinfizieren Sie die Einschnittstelle mit 70% Ethanol. Mit einem Skalpell einen Schnitt vom Brustbein bis zur Unterseite des Bauches machen und dann von der Unterseite des Schnittes mit einer Schere von der Unterseite des Schnittes zu den Seiten schneiden. Als nächstes schneiden Sie die Lebervene (zweite physikalische Euthanasie-Methode), um das Tier zu bluten.
HINWEIS: Um ein hohes Hintergrundsignal während der Bildgebung zu vermeiden, ist es wichtig, die Blutmenge in der Lunge zu minimieren (siehe unten).
- Kurz gesagt, einschläfern Mäuse mit einer tödlichen Dosis von TBE (500 mg/kg). Desinfizieren Sie die Einschnittstelle mit 70% Ethanol. Mit einem Skalpell einen Schnitt vom Brustbein bis zur Unterseite des Bauches machen und dann von der Unterseite des Schnittes mit einer Schere von der Unterseite des Schnittes zu den Seiten schneiden. Als nächstes schneiden Sie die Lebervene (zweite physikalische Euthanasie-Methode), um das Tier zu bluten.
- Legen Sie die Maus in dorsale Recumbency, und verwenden Sie die Schere, um die Pleura zu schneiden und öffnen Sie den Rippenkäfig. Anschließend entfernen Sie die Lunge, indem Sie das Ende der Luftröhre mit einer Schere schnipsen, während Sie die Lunge vorsichtig mit Zangen halten.
- Legen Sie die Lunge in eine Sechs-Brunnen-Platte mit 2 ml 1x 1x PBS und waschen Sie die Lunge dreimal mit 1x PBS.
HINWEIS: Um eine Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden, reinigen und desinfizieren Sie die Zersebungswerkzeuge zwischen den einzelnen Tieren.
- Legen Sie die Lunge in eine Sechs-Brunnen-Platte mit 2 ml 1x 1x PBS und waschen Sie die Lunge dreimal mit 1x PBS.
- Starten Sie die Bildaufnahmesoftware, indem Sie auf Initialisierung klicken und die Parameter für die Bildgebung festlegen, einschließlich der Einstellung des Bildgebungsmodus auf Fluoreszenz, automatische einsparen, Die Belichtungszeit gegenüber Auto, Anregung (500 nm) und Emissionsfilter (540 nm).
- Wenn die Maschine initialisiert wird, legen Sie die Lunge in ein schwarzes Hintergrundtablett, um sicherzustellen, dass die Gewebe voneinander getrennt sind, führen Sie das Fach in die Bildmaschine ein, und klicken Sie auf Bildverarbeitungssystemprogramm nach dem Schließen der Bildtür ( Abbildung 4B, oben).
- Nach der Bildgebung die Gewebe sofort entfernen und auf Eis (4 °C) lagern, wenn die Proben noch am selben Tag verarbeitet werden; oder auf einem Rohr und Trockeneis, um sie schnell einzufrieren, bevor sie bei -80 °C gelagert werden, wenn die Proben später an einem anderen Tag verarbeitet werden.
- Wählen Sie für die Bildverarbeitung das ROI-Tool aus und zeichnen ROIs um jede einzelne Lunge. Klicken Sie auf Messen. Subtrahieren Sie dann anhand der resultierenden durchschnittlichen Strahlungseffizienzmessungen die Werte von den mit Mock infizierten Mäusen (Abbildung4B, unten).
HINWEIS: Mit BIRFLU gibt es eine gute Korrelation der Konzentrationen des Nluc- und Venus-Ausdrucks und der Signalverteilung. Daher ist es wichtig, den Nluc-Ausdruck (ganze Maus) und Venus (excised lungs) aus demselben Tier zu analysieren und die gleiche Ausrichtung beizubehalten.
- Sammeln Sie die Mauslunge nach in vivo Bildgebung, wie zuvor beschrieben23.
- Auswertung der BIRFLU-Replikation in der Mäuselunge (Abbildung 3 und Abbildung 4C)
- Homogenisieren Sie die Lungen von Mäusen für die virale Titration durch Plaque-Assay wie zuvor beschrieben23.
- Legen Sie die Lunge in einen Dounce Homogenisator mit 1 ml gekühlten Infektionsmedien. Homogenisieren Sie die Lunge mit dem Stößel für 1 min bei Raumtemperatur, bis es vollständig zerfallen ist und lagern Sie die Proben in einem sterilen Rohr bei 4 °C.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x g für 10 min und sammeln Sie den Überstand in einem sterilen Rohr. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, wenn sie am selben Tag verwendet werden, oder frieren Sie sie bei -80 °C ein, um virale Titer zu einem späteren Zeitpunkt zu bewerten.
HINWEIS: Für jede Lungenprobe sollte ein neuer Dounce Homogenisator verwendet werden. - Um den Plaque-Assay durchzuführen, am Tag vor der Durchführung der viralen Titration, Samen sechs-Well-Platten mit MDCK-Zellen (5 x 105 Zellen/gut) in Gewebekultur-Medien. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2, um am nächsten Tag 90% Zusammenfluss zu erreichen. Bestätigen Sie vor der Infektion, dass die Zellen eine Monoschicht unter einem Lichtmikroskop bilden.
- 1:10 serielle Verdünnungen des Überstandes aus den homogenisierten Proben (Schritt 4.4.1) in Infektionsmedien vorbereiten. Bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit 540 l Infektionsmedien vor, fügen Sie 60 l aus der homogenisierten Lungenprobe in das erste Röhrchen, mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten, und übertragen Sie dann mit einer neuen Spitze 60 l in das nächste Rohr. Wiederholen Sie diesen seriellen Verdünnungsprozess bis zur letzten Verdünnung.
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung reichen 7 Verdünnungen aus, um virale Titter durch Plaque-Assay aus der Lunge infizierter Mäuse zu bestimmen. - Waschen Sie die MDCK-Zellen (Schritt 4.4.3) zweimal mit 1x PBS und übertragen Sie 500 l der seriell verdünnten Proben auf jeden Brunnen in der Sechs-Well-Platte. Legen Sie die Platten auf eine Schaukelplattform und ermöglichen virale Absorption für 1 h bei Raumtemperatur auftreten.
- Nach 1 h virusischer Absorption das virale Inokulum entfernen, 2 ml/Well des Overlay-Mediums mit 1 g/ml TPCK-behandeltem Trypsin hinzufügen und dann die Zellen 3 Tage lang bei 33 °C unter 5% CO2 inkubieren.
- Fix infizierte Zellen (Schritt 4.4.6) mit 1 ml/Gut von 4% Formaldehyd in 1x PBS bei Raumtemperatur für 2 h verdünnt, dann vorsichtig entfernen Sie das Overlay-Medium und fügen Sie 1 ml 1x PBS zu jedem Brunnen. Zur Visualisierung der Venus, bilden Sie die Sechs-Well-Platten mit einem Bildgebungssystem zur Detektion von Fluoreszenz.
HINWEIS: Virale Plaques können mit einer Bildbearbeitungssoftware eingefärbt werden (siehe Tabelle der Materialien). - Um die Nluc-Expression zu bewerten, visualisieren Sie virale Plaques durch Immunfärbung mit einem Anti-Nluc pAb. Entfernen Sie dazu die 1x PBS, permeabilisieren Zellen mit 0,5 ml/Well der Permeabilisationslösung für 15 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Permeabilisationslösung, waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS und blockieren Sie mit 0,5 ml/Gut der Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Blockierlösung aus Schritt 4.4.9 und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml/Well des pAb anti-Nluc verdünnt 1:1.000 in Verdünnungslösung für 1 h bei 37 °C.
- Verwenden Sie ABC Alkaline Phosphatase Kit und DAB Peroxidase Substrate Kit nach der Empfehlung des Herstellers für die Visualisierung von Nluc-expressing Plaques.
- Kurz gesagt, waschen Sie Zellen ab 4.4.10 dreimal mit 1x PBS und inkubieren Sie sie mit 0,5 ml/Well von biotinylierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern für 1 h bei 37 °C.
- Entfernen Sie den sekundären Antikörper, waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS und brüten Sie mit der ABC-Lösung für 1 h bei 37 °C. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS und visualisieren Sie die viralen Plaques mit dem DAB HRP Substrat Kit. Scannen Sie die immunbefleckten Plaques mit einem herkömmlichen Scanner.
HINWEIS: Andere ähnliche Kits für die Immunfärbung könnten verwendet werden.
- Die viralen Plaques mit kristallvioletter Lösung für 1 h bei Raumtemperatur färben. Entsorgen Sie das Kristallviolett, waschen Sie die Platten dreimal mit Wasser, lassen Sie die Platten trocknen und scannen Sie die Platten erneut.
- Um virale Titer zu bestimmen, zählen Sie die Plaques, die nach der kristallvioletten Färbung aufgedeckt wurden. Scannen Sie die Plaques mit einem herkömmlichen Scanner. Berechnen Sie Virustiter als Plaque-Bildeinheiten (PFU) pro ml (PFU/ml).
- Um die BIRFLU-Stabilität in vivo zu bewerten, berechnen Sie den Prozentsatz der Reporter-exezierenden Viren, indem Sie die Anzahl der kristallviolett gefärbten Plaques (Anzahl der infektiösen Viren, Schritt 4.4.12) zählen und mit der Anzahl der Venus- und Nluc-exezierenden Plaques vergleichen ( Schritt 4.4.7 bzw. Schritt 4.4.11).
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x g für 10 min und sammeln Sie den Überstand in einem sterilen Rohr. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, wenn sie am selben Tag verwendet werden, oder frieren Sie sie bei -80 °C ein, um virale Titer zu einem späteren Zeitpunkt zu bewerten.
Representative Results
Generierung und Charakterisierung von BIRFLU in vitro (Abbildung 1 und Abbildung 2)
Ein rekombinantes Replikations-kompetentes IAV, das zwei verschiedene Reportergene (BIRFLU) ausdrückt, wurde mit modernster Molekularbiologie und plasmidbasierten Reverse-Genetik-Techniken konstruiert (Abbildung 1). Hier haben wir uns entschieden, Nluc aufgrund mehrerer Vorteile gegenüber anderen Luziferasen zu verwenden, einschließlich seiner geringen Größe, ATP-Unabhängigkeit, größere Intensität und optimiertem Substrat48,60. Nluc wurde in das HA-Segment von IAV PR8 geklont, gefolgt vom Schweineteschovirus (PTV) 2A Dekolleté-Stelle (2A) vor dem offenen Leserahmen (ORF) von HA (Abbildung 1). Der ORF von HA enthielt stille Mutationen, um die ursprünglichen Verpackungssignale zu entfernen und eine mögliche Rekombination zu vermeiden. Das komplette HA-Verpackungssignal wurde vor Nluc hinzugefügt, um eine ordnungsgemäße Einbindung des modifizierten HA-Segments in die Virion- und Nluc- und HA-Expression aus demselben viralen RNA-Segment zu ermöglichen (Abbildung 1). Darüber hinaus wurde das fluoreszierende Protein Venus in ein modifiziertes IAV PR8 NS-Segment geklont, das die beiden viralen Proteine NS1 und NEP aus einem einzigen Transkript32,36,41,54, 57. Zu diesem Zweck wurde Venus mit dem C-Terminal von NS1 verschmolzen und der gesamte NEP ORF wurde flussabwärts der PTV 2A-Spaltungsstelle geklont, die zwischen den NS1-Venus- und NEP-Sequenzen platziert wurde (Abbildung 1). Letztlich wurden diese beiden modifizierten HA- und NS-Virusplasmidkonstrukte in Kombination mit dem Rest der IAV PR8-Reverse-Genetik-Plasmide verwendet, um BIRFLU zu erzeugen (Abbildung 1). Die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung von BIRFLU wurde bereits55beschrieben.
In Abbildung 2charakterisierten wir in vitro BIRFLU durch Bestimmung der Venus-, Nluc- und NP-Expressionsniveaus unter Verwendung von Fluoreszenz- und indirekten Immunfluoreszenzansätzen ( Abbildung2A,B). Konfluentmonolayer von MDCK-Zellen waren entweder mock-infiziert oder infiziert (MOI 0.1) mit WT- oder BIRFLU PR8-Viren und bei 18 h nach der Infektion wurde die Venusexpression direkt mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet (Abbildung 2A,B). Die Nluc- (Abbildung 2A) und die NP- (Abbildung 2B) -Expression wurden durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern visualisiert, die für jedes Protein spezifisch sind. Wie erwartet, Venus und Nluc Expression wurden nur in Zellen mit BIRFLU infiziert und nicht in Zellen mit WT PR8 Virus infiziert. Darüber hinaus ergab die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie die NP-Expression sowohl in WT- als auch in BIRFLU PR8-infizierten Zellen. In mockinfizierten Zellen wurde erwartungsgemäß kein Ausdruck von Venus, Nluc oder NP nachgewiesen (Abbildung A,B).
Zur Bewertung der Nluc-Expressionsniveaus in vitro wurden MDCK-Zellen (MOI 0,001) mit WT- oder BIRFLU-PR8-Viren infiziert und die Nluc-Aktivität in Gewebekulturüberständen wurde mit 24, 48, 72 und 96 h nach der Infektion bewertet (Abbildung2C). Nur Nluc Aktivität wurde in Gewebekultur Überstand von MDCK-Zellen mit BIRFLU infiziert nachgewiesen (Abbildung 2C). Die Nluc-Aktivität in den Gewebekulturüberständen wurde bereits 24 h nach der Infektion mit höheren Expressionswerten bei 96 h nach der Infektion nachgewiesen, höchstwahrscheinlich, weil die zytopathische Wirkung (CPE), die während der Virusinfektion induziert wurde, das Nluc-Protein zurückließ. in die Zelle. Um die Tauglichkeit von BIRFLU in kultivierten Zellen zu bewerten, wurde auch die Wachstumskinetik von WT- und BIRFLU PR8-Viren bewertet (Abbildung 2D) und das Vorhandensein von infektiösen Viren in Gewebekulturüberstand wurde durch Immunfokus-Assay bestimmt (Abbildung 2D ). Bemerkenswert ist, dass die BIRFLU-Replikationskinetik mit der des WT PR8-Virus vergleichbar war, obwohl die BIRFLU-Replikation etwas verzögert wurde und nicht die gleichen viralen Titer wie WT PR8 erreichte. BIRFLU konnte jedoch Titer von 5 x 107 PFU/ml erreichen (Abbildung 2D), was darauf hindeutet, dass die Expression von zwei Reportergenen im viralen Genom die BIRFLU-Replikation in MDCK-Zellen nicht signifikant beeinträchtigt.
Verfolgung der BIRFLU-Infektion bei Mäusen (Abbildung 3 und Abbildung 4)
Abbildung 3 ist ein schematisches Flussdiagramm zur Beurteilung der BIRFLU-Dynamik in einem Mausmodell der IAV-Infektion. Fünf bis sieben Wochen alte weibliche BALB/C-Mäuse wurden entweder mit 1x PBS oder intranaally mit 1 x 106 PFU birFLU infiziert. Nach 3 Tagen nach der Infektion wurden Mäuse mit Isofluran befruchtet und dann mit Nluc-Substrat retro-orbital injiziert. Alle Mäuse wurden sofort in das IVIS-Instrument gelegt und das Nluc-Signal wurde in vivo mit dem IVIS bewertet. Als nächstes wurden Mäuse eingeschläfert und die Lunge geerntet. Anschließend wurden die ausgeschnittenen Lungen ex vivo mit dem In-vivo-Imager analysiert, um die Fluoreszenzintensität über die Venusexpression zu bestimmen. Schließlich wurden die Lungen der Mäuse homogenisiert und virale Titter und Stabilität durch Plaque-Assay bestimmt. Plaques wurden durch die direkte Fluoreszenz der Venus, durch Immunfärbung mit Antikörpern speziell für Nluc und durch kristallviolette Färbung beurteilt.
Zuvor beschriebene replikationskompetente Reporter-exprimierende IAVs exprimieren ein einzelnes Reportergen, am häufigsten entweder ein fluoreszierendes oder ein biolumineszierendes Protein, als Ersatz für Virusinfektionen und Replikation. BIRFLU ist jedoch in der Lage, beide Arten von Reportergenen bei einer Virusinfektion auszudrücken. Um die Korrelation zwischen Biolumineszenz (In-vivo-Bildgebung) und Fluoreszenz (Ex-vivo-Bildgebung) nach BIRFLU-Infektion zu bewerten, wurden fünf- bis sieben Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse mit 1x PBS mockinfiziert oder mit BIRFLU (106 PFU) intranasal geimpft. . Die Nluc-Aktivität (Abbildung 4A) wurde durch Verabreichung von Nluc-Substrat, das nach einer Infektion nach einer In-vivo-Bildgebungsinstrument retro-orbital injiziert wurde, untersucht. Wir haben uns entschieden, die Biolumineszenz an Tag 3 zu bewerten, weil frühere Studien darauf hindeuteten, dass die IAV-Replikation, einschließlich PR8, Spitzen zwischen den Tagen 2 und 4 nach der Infektion24,54. Die Biolumineszenz wurde überwacht (Abbildung 4A, oben) und zur Berechnung des durchschnittlichen Gesamtflusses (Flux (log10 p/s) (Abbildung4A, unten). Wie vorhergesagt, zeigten Mäuse, die mit BIRFLU geimpft wurden, eine hohe Biolumineszenzaktivität, aber bei Mock-infizierten Mäusen wurde kein Signal nachgewiesen. Danach wurden die Lungen infizierter Mäuse geerntet und die Venusexpression mittels Ex-vivo-Bildgebung bewertet (Abbildung4B, oben). Darüber hinaus wurde die durchschnittliche Strahlungseffizienz der Fluoreszenz berechnet (Abbildung4B, unten). Die ausgeschnittenen Mäuselungen wurden auch homogenisiert, um die viralen Titter und die genetische Stabilität von BIRFLU in vivo zu bestimmen (Abbildung 4C,D). Die genetische Stabilität von BIRFLU wurde durch Plaque-Assay mit den viren isoliertaus Mäuselungen und fluoreszierender Mikroskopie (Venus, oben), Immunostainierung (Nluc, Middle) und kristallvioletter Färbung (unten) analysiert. BIRFLU, die sich aus Mäusen erholten, konnte Plaques bilden und drückt beide Reportergene stabil aus (Abbildung 4C). Insbesondere beobachteten wir eine gute Korrelation zwischen Biolumineszenz und Fluoreszenzsignalen mit Virusreplikation.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der IAV PR8 WT- und BIRFLU-Virionenstruktur und der Genomsegmente. IAV sind von einem Lipid-Doppelschichtmittumsatous umgeben, das die beiden großen viralen Glykoproteine Hemagglutinin (HA; schwarz) und Neuraminidase (NA; blau) enthält. IAV enthalten acht einsträngige, negative RNA-Segmente (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M und NS). Jedes virale Segment enthält nicht-kodierende Regionen (NCR) an den Enden 3' und 5' (Black boxes). Auch am 3' und 5' Ende der viralen (v)RNAs sind die Verpackungssignale, die für die effiziente Kapselung von vRNAs in aufkeimende Virionen (weiße Boxen) verantwortlich sind. IAV PR8 HA und NS virale Segmente und Produkte sind schwarz indiziert. Sequenzen von Nluc, Venus und PTV 2A sind in roten, grünen bzw. gestreiften Boxen angegeben. Die schematische Darstellung der modifizierten HA- und NS-Segmente, die Nluc bzw. Venus in BIRFLU ausdrücken, sind ebenfalls angegeben. Diese Figur wurde von Nogales et al.55adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: In-vitro-Charakterisierung von BIRFLU. (A, B) Analyse der Proteinexpression durch direkte Fluoreszenz und Immunfluoreszenz. MDCK-Zellen wurden mit PR8-WT- oder BIRFLU-Viren infiziert (MOI 0.1). Infizierte Zellen wurden bei 18 h nach der Infektion fixiert, um die Venusexpression durch direkte fluoreszierende Mikroskopie direkt zu visualisieren und die Nluc -A) und virale NP -B) Expression mit spezifischen Antikörpern und indirekter Immunfluoreszenz zu visualisieren. Kerne wurden mit DAPI befleckt. Repräsentative Bilder (20-fache Vergrößerung) werden gezeigt. Skalenbalken = 100 m. (C, D) Wachstumskinetik von PR8 WT und BIRFLU. Nluc Activity (C) und virale Titer (D) in Gewebekultur Überstand aus MDCK-Zellen infiziert (MOI 0.001) mit WT und BIRFLU PR8 Viren wurden zu den angegebenen Zeiten nach der Infektion bewertet. Die Daten stellen das Mittel der SD von Triplicaten dar. Virale Titter wurden durch Immunfokus-Assay (FFU/mL) bestimmt. Gepunktete Linie bezeichnet die Nachweisgrenze (200 FFU/ml). Diese Figur wurde von Nogales et al.55adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Schematische Darstellung für die Studie von BIRFLU bei Mäusen. Die Expression von Nluc- und Venus-Reportergenen wurde bei Mäusen untersucht, die mit 1 x 106 PFU birFLU mittels in vivo- oder ex vivo-Bildgebung infiziert waren. Kurz gesagt, am Tag 1, 5 bis 7 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden verspottet (1x PBS) oder mit 1 x 106 PFU birFLU intranasal geimpft. Am Tag 3 nach der Infektion wurden Mäuse leicht mit Isofluran anästhesiert und Nluc-Substrat wurde retro-orbital injiziert. Das Nluc-Signal wurde direkt mittels In-vivo-Bildgebung bewertet. Unmittelbar nach der Bildgebung wurden Mäuse eingeschläfert und die Expression der Venus in der ganzen ausgeschnittenen Lunge mittels Ex-vivo-Bildgebung analysiert. Die zurückgewonnene Mäuselunge wurde homogenisiert, um die Virusreplikation und Stabilität durch Plaque-Assay zu bewerten. Pfeile zeigen Korrelation zwischen Fluoreszenz (Venus), Immunostainierung (Nluc) und kristallvioletter Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: In-vivo-Biolumineszenz und Fluoreszenzexpression. Weibliche fünf bis sieben Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden verspottet (1x PBS) oder mit 1 x 106 PFU BIRFLU intranasal geimpft. Am Tag 3 nach der Infektion wurde die Nluc-Aktivität (A) in der ganzen Maus bestimmt. Repräsentative Bilder einer einzelnen Maus mit Einer Strahlungsskala (p/sec/cm2/sr). Die Strahlenwerte für die Biolumineszenz wurden quantisiert und der durchschnittliche Gesamtfluss wird angezeigt (Flux (Log10 p/s). Nach der Nluc-Bildgebung wurde die Lunge für die Ex-vivo-Bildgebung geerntet (B). Repräsentative Bilder aus der ganzen Lunge werden gezeigt. Um die Venusexpression zu quantifizieren, wurden die Mittelwerte der Interessengebiete (ROIs) von mockinfizierten Mäusen auf Lungen-Autofluoreszenz normalisiert und Faltenänderungen berechnet. Um die genetische Stabilität von BIRFLU in vivo zu analysieren, wurden Viren, die aus der Lungendeslunge von Mäusen gewonnen wurden, mittels Plaque-Assay mittels fluoreszierender Mikroskopie (Venus, oben), Immunostainierung (Nluc, Middle) und kristallvioletter Färbung (unten) (C) analysiert. Repräsentative Bilder von einer Maus werden angezeigt. Zur Bewertung der Virusreplikation wurden ganze Lungen nach der Bildgebung homogenisiert und zur Infizierung von MDCK-Zellen und zur Bestimmung von Virustitern mittels Plaque-Assay (PFU/mL) (D) verwendet. Pfeile zeigen Korrelation zwischen Fluoreszenz (Venus), Immunostainierung (Nluc) und kristallvioletter Färbung. Balken stellen den Mittelwert von Lungenvirus-Tittern dar. Diese Figur wurde von Logales et al.55adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gewebekultur Medien und Lösungen | komposition | lagerung | benutzen |
| Gewebekulturmedien: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 10 % Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-Glutamin (PSG) (DMEM 10 % FBS 1% PSG). | 445 ml DMEM, 50 ml FBS und 5 ml 100x PSG. | 4 °C | Wartung von MDCK-Zellen |
| Medien nach der Infektion: DMEM 0.3% Bovine Albumin (BA), 1% PSG (DMEM 0.3 % BA 1% PSG). | 491 ml DMEM, 4,2 ml 35 % BA und 5 ml 100x PSG | 4 °C | Wartung von MDCK-Zellen nach einer Virusinfektion |
| 10x Phosphat gepufferte Saline (PBS) | 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. ddH2O bis 1 L hinzufügen. pH auf 7,3 einstellen | zimmertemperatur | So bereiten Sie 1x PBS vor |
| 1x PBS | 10x PBS mit ddH2O verdünnen | zimmertemperatur | Waschzellen |
| Infektionsmedien: 1x PBS, 0,3% BA, 1% Penicillin-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS). | 487 ml 1x PBS steril, 4,2 ml 35% BA und 5 ml 100x 1% PS(100 U/ml) | 4 °C | Virale Infektionen |
| Fixierungs-/Permeabilisationslösung: 4% Formaldehyd, 0,5% Triton X-100 in 1x PBS verdünnt. | 400 ml neutral gepuffertes Formalin 10%, 5 ml Triton X-100 und 595 ml 1x PBS | zimmertemperatur | Fixierung und Permeabilisierung von MDCK-Zellen. |
| Blockierlösung: 2,5% Rinderserum Albumin (BSA) in 1x PBS. | 2,5 g BSA in 97,5 ml 1x PBS | 4 °C | Blockierlösung für Immunfluoreszenz und Plaque-Assays. |
| Antikörperverdünnungslösung (1% BSA in 1x PBS) | 1 g BSA in 99 ml 1x PBS | 4 °C | Verdünnung von primär- und sekundären Antikörpern. |
| 0,1% kristallviolette Lösung | 1 g Kristallviolett in 400 ml Methanol. 600 ml ddH2O hinzufügen | zimmertemperatur | Färbung von MDCK-Zellen in Plaque-Assays. |
| Tosylsulfonylphenylalanylchlormethylketon (TPCK)-behandeltes Trypsin | Bereiten Sie eine 1.000x Stofflösung bei 1 mg/ml in ddH2O vor | -20 °C | Bei Virusinfektionen. |
Tabelle 1: Gewebekulturmedien und -lösungen.
Discussion
Die Forscher haben sich auf rekombinante Reporter-exezierende Viren als lebenswichtige molekulare Werkzeuge verlassen, um das aktuelle Verständnis von Virusreplikation und Pathogenese zu verstehen und zu erweitern26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. Die am häufigsten bevorzugten Reportergene sind Luziferasen und fluoreszierende Proteine, hauptsächlich aufgrund der technologischen Fortschritte bei der Identifizierung, Entwicklung verbesserter Varianten und Detektion durch Bildgebungstechnologien43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Rekombinante Reporterviren werden häufig verwendet, um virologische Assays zu beschleunigen, die Dynamik von Viren in vitro und in vivo zu untersuchen und die Wirksamkeit derzeit zugelassener oder neuer Impfstoff- und Therapieansätze zu testen26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Leider beschränkten sich im Fall von IAV frühere Studien auf die Expression eines einzelnen Reportergens, was die Art der Studie behindert, die durchgeführt werden könnte 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. Um diese Einschränkung zu vermeiden, haben wir einen replikationskompetenten Bi-Reporter IAV generiert, der eine Nluc-Luziferase und ein Venusfluoreszenzprotein (BIRFLU) ausdrückt.
In diesem Bericht beschreiben wir die In-vitro-Charakterisierung von BIRFLU und die experimentellen Ansätze, MIT BIRFLU virale Infektionen in vivo mit Hilfe eines Mausmodells der IAV-Infektion zu verfolgen. BIRFLU Nluc und Venus Expression korreliert mit viralen Titern. Darüber hinaus blieb BIRFLU stabil und drückte weiterhin beide Reportergene aus, nachdem sie aus der Lunge infizierter Mäuse geborgen worden waren. Dieser Ansatz bietet Forschern eine ausgezeichnete Gelegenheit, IAV in kultivierten Zellen und in Tiermodellen zu untersuchen, einschließlich der Identifizierung und Entwicklung neuer therapeutischer Alternativen zur Behandlung von IAV-Infektionen.
Obwohl BIRFLU mit dem Backbone von PR8 generiert wurde, könnten andere rekombinante IAV mit unterschiedlichen Typen-, Subtype- oder Viralstamm-Backbones mit demselben experimentellen Ansatz generiert werden. Ebenso haben wir in diesem Bericht die experimentellen Verfahren für die Verwendung von BIRFLU in einem Mausmodell von IAV beschrieben. BIRFLU könnte jedoch eine wertvolle Technologie zur Bewertung von IAV-Infektionen in anderen Tiermodellen sein.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Forschung zum Influenzavirus im LABOR LM-S wird teilweise durch das New York Influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C) finanziert, ein Mitglied des NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS) Contract No. HHSN272201400005C (NYICE) und vom Department of Defense (DoD) Peer Reviewed Medical Research Program (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4 ° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| 5 to 7 week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
References
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