Summary
Os vírus da influenza A (IAVs) são patógenos respiratórios contagiosos que causam epidemias anuais e pandemias ocasionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para rastrear infecções virais in vivo usando uma novela recombinante luciferase e fluorescência-expressando o bi-repórter IAV (BIRFLU). Esta abordagem fornece aos pesquisadores uma excelente ferramenta para estudar IAV in vivo.
Abstract
Vírus da gripe A (IAVs) causam doença respiratória humana que está associada a consequências económicas e de saúde significativas. Tal como com outros vírus, estudar IAV requer o uso de abordagens secundárias trabalhosas para detectar a presença do vírus em células infectadas e/ou em modelos animais de infecção. Essa limitação foi recentemente contornada com a geração de IAVs recombinantes expressando proteínas de repórter fluorescentes ou bioluminescentes (luciferase) facilmente rastreáveis. No entanto, os pesquisadores foram forçados a selecionar genes de repórter fluorescentes ou luciferases devido à capacidade restrita do genoma do IAV para incluir sequências estrangeiras. Para superar esta limitação, nós geramos uma replicação recombinante-o bi-repórter competente IAV (BIRFLU) que expressa estàvel um gene fluorescente e de um luciferase do repórter para controlar facilmente infecções de IAV in vitro e in vivo. Para tanto, os segmentos virais não estruturais (NS) e hemaglutinina (HA) viral da influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) foram modificados para codificar a Vênus fluorescente e as proteínas bioluminescentes da luciferase Nanoluc, respectivamente. Aqui, nós descrevemos o uso de BIRFLU em um modelo do rato da infecção de IAV e a deteção de ambos os genes do repórter usando um sistema in vivo da imagem latente. Notavelmente, observamos uma boa correlação entre as expressões de ambos os repórteres e a replicação viral. A combinação de técnicas de ponta em biologia molecular, pesquisa animal e tecnologias de imagem, fornece aos pesquisadores a oportunidade única de usar esta ferramenta para pesquisa de gripe, incluindo o estudo de interações vírus-hospedeiro e dinâmica de infecções virais. É importante ressaltar que a viabilidade de alterar geneticamente o genoma viral para expressar dois genes estrangeiros de diferentes segmentos virais abre oportunidades para usar essa abordagem para: (i) o desenvolvimento de novas vacinas IAV, (II) a geração de IAVs recombinantes que pode ser usado como vetores de vacinas para o tratamento de outras infecções do patógeno humano.
Introduction
O vírus da gripe A (IAV) é um vírus de RNA segmentado de sentido negativo, de forma única e envolto,da família Orthomyxoviridae 1,2,3. A Organização Mundial da saúde (OMS) estima 3-5 milhões de casos anuais de gripe e mais de 250.000 mortes por influenza no mundo4,5,6. Os grupos que são particularmente vulneráveis à gripe incluem os idosos, os indivíduos imunocomprometidos e as crianças7,8,9,10,11. Embora as vacinas estejam disponíveis e representem a intervenção mais comum e efetiva contra a infecção viral, o IAV é capaz de evoluir rapidamente e escapar da imunidade preexistente3,12,13 , 14 anos de , 15. a re-emergência de uma cepa pandêmica de H1N1 em 2009 e o surgimento de IAV patogénico reitera a constante ameaça à saúde pública humana no mundo4,16.
Durante uma epidemia ou pandemia, é crucial determinar rapidamente a patogenicidade e a transmissibilidade de vírus recém-isolados. As técnicas atualmente disponíveis para detectar o vírus são demoradas e, às vezes, requerem o uso de abordagens laboriosas, o que pode atrasar a realização dessas análises17,18,19,20. Além disso, os ensaios virais atuais são difíceis de escalar acima, que poderiam ser necessários durante o evento de um Outbreak. Finalmente, o uso de modelos animais validados de infecção, como camundongos, cobaias e furões são usados rotineiramente e são vitais no estudo de infecções da gripe, respostas imunes, e a eficácia de novas vacinas e/ou antivirais. No entanto, esses modelos são restritivos devido à incapacidade de observar a dinâmica viral em tempo real; Isto limita os estudos à imagem latente de estática de infecções virais21,22,23,24,25. Os animais utilizados nesses ensaios também são eutanasiados para determinar a carga viral, aumentando assim o número de animais necessários para a conclusão desses estudos26. Para contornar todas essas limitações, muitos pesquisadores dependem do uso de IAVs de replicação-competente, de expressão de repórter recombinante, capazes de acelerar os ensaios virológicos e detectar a carga viral e a disseminação in vivo em tempo real26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Importante, estes iAVS repórter-expressando são capazes de replicar similarmente ao selvagem-tipo (WT) iAVS na cultura de pilha e em modelos animais da infecção33,42.
As proteínas fluorescentes e bioluminescentes são dois sistemas de repórter comumente utilizados por pesquisadores devido à sua sensibilidade, estabilidade e facilidade de uso. Além disso, há um tremendo apoio e avanço nas tecnologias de detecção de proteínas fluorescentes e bioluminescentes43,44,45,46,47,48 . As proteínas fluorescentes e a luciferase têm propriedades diferentes que lhes permitem brilhar, diferindo especificamente em como os Estados excitados são gerados e como a emitância é detectada43,44,45, 46,47,48. As proteínas fluorescentes são excitadas primeiramente absorvendo a energia, que é liberada subseqüentemente como a luz em um comprimento de onda diferente enquanto as moléculas diminuem a um estado de energia mais baixo43. Por outro lado, a bioluminescência é derivada de uma reação química exotérmica que envolve um substrato, oxigênio e, às vezes, ATP, a fim de produzir luz45. Devido às propriedades de variação destes dois tipos de proteínas do repórter, um talvez mais vantajoso do que o outro dependendo do estudo do interesse. Quando as proteínas fluorescentes forem amplamente utilizadas observar a localização celular28,41, seus sinais in vivo têm a intensidade inadequada e são obscurecidos frequentemente pelo autofluorescence em tecidos vivos49. Portanto, os pesquisadores confiam nas luciferases para avaliar a dinâmica viral em organismos vivos, embora as proteínas fluorescentes possam ser preferidas para estudos ex vivo50,51,52,53. Ao contrário das proteínas fluorescentes, as luciferases são mais convenientes para estudos in vivo e mais aplicáveis em abordagens não invasivas26,27,28,29,30 , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. em última análise, com base no tipo de estudo, os investigadores devem escolher entre o uso de uma proteína de repórter fluorescente ou uma luciferase como a sua leitura, que submete o seu estudo a um trade-off de funcionalidades e sensibilidades, e severamente restringe a utilidade dos vírus do repórter recombinante. Além disso, há preocupações quanto à correlação entre a expressão de diferentes genes de repórter utilizando sistemas de fluorescência ou luciferase e replicação ou disseminação viral, o que pode comprometer a interpretação dos dados obtidos com repórter-expressando IAVs.
Nós superamos esta limitação gerando uma replicação recombinante-bi-repórter competente IAV (BIRFLU) que codifica para uma proteína fluorescente e uma luciferase no mesmo genoma viral55 (Figura 1). Aqui, nanoluc luciferase (nluc), uma proteína bioluminescente pequena e brilhante48, foi inserida a montante da seqüência de hemaglutinina (ha) no segmento de ha viral da influenza a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Além disso, Vênus, uma proteína fluorescente monomérica freqüentemente utilizada, foi inserida no segmento viral não estrutural (ns)32,33,36,41,55. Desde que o birflu codifica para genes do repórter fluorescente e do luciferase, o sinal da proteína do repórter pode ser usado como o leitura para determinar a replicação viral e a disseminação in vitro ou in vivo55. Informações adicionais sobre a geração e in vitro ou in vivo caracterização de BIRFLU pode ser encontrada em nossa recente publicação55. BIRFLU pode ser usado para testar a eficácia de medicamentos antivirais ou neutralizando anticorpos através de um novo ensaio de microneutralização à base de fluorescência e bioluminescente55. Além disso, BIRFLU pode igualmente ser usado para avaliar a dinâmica viral em um modelo do rato da infecção55. Neste manuscrito, nós descrevemos os procedimentos para caracterizar BIRFLU55 in vitro e como estudar a infecção do birflu nos ratos usando sistemas in vivo da imagem latente da luminescência para a deteção de nluc in vivo ou de Venus ex vivo.
A combinação de técnicas de ponta na biologia molecular, na pesquisa animal e nas tecnologias da imagem latente, traz a investigadores a oportunidade original de usar BIRFLU para a pesquisa de IAV, incluindo o estudo de interações do vírus-anfitrião, dinâmica da infecção viral; o desenvolvimento de novas abordagens vacinais para o tratamento terapêutico de infecções por IAV ou o uso potencial de IAV como um vetor de vacina para o tratamento de outras infecções patogênicos.
Protocol
Todos os protocolos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) e pelo Comitê de biossegurança institucional (IBC) da Universidade de Rochester, faculdade de medicina e odontologia. Todos os experimentos realizados em animais seguem as recomendações do guia para o cuidado e uso de animais de laboratório do Conselho Nacional de pesquisa58. O Vivarium e divisão de laboratório de medicina animal instalações da faculdade de medicina e Odontologia da Universidade de Rochester é credenciada pela Associação para a avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com os animais (AALAC) internacional e em conformidade com as leis federais e estaduais e os institutos nacionais de saúde (NIH) política. O equipamento adequado de proteção individual (EPI) é necessário quando se trabalha com camundongos. Políticas e requisitos semelhantes devem ser implementados na realização de experimentos delineados dentro deste manuscrito em cada instituição.
1. utilização de pequenos animais vertebrados
- Compre cinco a sete semanas de idade fêmeas BALB/c camundongos e mantê-los na instalação de cuidados com animais em condições específicas de patógeno-livre. Após a chegada de camundongos para as instalações determinadas, permitir período de descanso para 4-5 dias para permitir que os animais aclimatar ao seu novo ambiente.
- Seguindo os protocolos IACUC, coloque um máximo de 5 camundongos por gaiola.
Nota: Na conclusão da experiência, a fim de garantir que o animal está morto, camundongos foram eutanasiados usando dois procedimentos aprovados, levando em consideração que o segundo deve ser um método físico. Neste estudo, após a infecção por camundongos com BIRFLU e in vivo Imaging, os animais são eutanasiados com uma dose letal de 2, 2, 2-tribromoetanol (TBE), e cortando a veia hepática como o método secundário físico como temos mostrado anteriormente23.
2. biossegurança
Nota: Neste manuscrito, birflu foi gerado na espinha dorsal da gripe a/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), que é uma cepa de IAV de laboratório adaptada ao rato comum23,32,33,56. O vírus foi gerado usando abordagens de genética reversa baseadas em plasmídeo previamente descritas e uma descrição completa da geração, e a caracterização in vitro e in vivo do BIRFLU pode ser encontrada em nossa recente publicação55. Todos os procedimentos que envolvem infecções de IAV (in vitro ou in vivo) foram executados em um armário de segurança biológico o nível do Biossegurança (BSL)-2 circunstâncias.
Atenção: Um nível de biossegurança adequado deve ser determinado de acordo com uma avaliação do risco de biossegurança. Informações adicionais sobre a realização de avaliações de risco de biossegurança e o estabelecimento de contenção efetiva de biossegurança devem ser consultadas com a instituição onde os experimentos serão realizados.
- Limpe os armários de biossegurança com 70% de etanol ou de dióxido de cloro desinfetante antes e depois de realizar todos os procedimentos experimentais. Para o trabalho dos ratos, esterilize todo o material da dissecção (tesouras, fórceps de dissecação, etc.) e o homogeneizador do dounce antes e depois de seu uso.
- Descarte todo o material biológico produzido durante os procedimentos as diretrizes apropriadas do IBC e do IACUC.
3. caracterização in vitro de BIRFLU (Figura 2)
Nota: Consulte a tabela 1 para todas as composições de buffer e mídia.
- Analisar a expressão protéica por fluorescência (Figura 2a) e imunofluorescência indireta (Figura 2b)
- Um dia antes da infecção, sementes 24-bem placas com Madin-Darby canino rim (MDCK) células epiteliais (1 x 105 células/bem, triplicates) em meios de cultura de tecidos e manter as placas em uma incubadora de 37 ° c com 5% co2. Prepare poços suficientes para avaliar todos os anticorpos escolhidos em células infectadas por Mock e BIRFLU.
Nota: Recomendamos Visualizar as células um microscópio de luz para confirmar uma monocamada antes de iniciar a infecção viral. Uma monocamada de confluência de 90% de células MDCK no momento da infecção é recomendada. - Prepare diluições de WT ou BIRFLU IAVs em meios de infecção e infecte as células de MDCK semeadas com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 unidades formadoras de placas (PFU) por célula em um volume final de 0,25 mL/poço de meios de infecção.
- Retire o meio de cultura do tecido da etapa 3.1.1 e lave as células MDCK duas vezes com 1x fosfato-tampão salino (PBS). Adicione as diluições do vírus de 3.1.2 às pilhas de MDCK e coloc as placas em uma plataforma de balanço para 1 h na temperatura ambiente para permitir a adsorção viral.
Nota: As pilhas mock-Infected são incubadas somente com meios da infecção na ausência de vírus. - Após a adsorção viral (passo 3.1.3), retire o iníbulo viral por aspiração e adicione 1 mL de meios pós-infecção contendo 1 μg/mL de tripsina tratada com TPCK a cada poço. Incubar células para 18 h em uma incubadora de 5% CO2 humidificada a 33 ° c.
- Após 18 h de infecção, retire o sobrenadante da cultura do tecido das placas de 24 poços (3.1.4). Fixar e permeabilizar as células com 0,25 mL/poço de solução de fixação/permeabilização por 20 min à temperatura ambiente.
Nota: Prepare a solução da fixação/permeabilização em uma capa das emanações para impedir a exposição do formaldehyde. - Retire a solução de fixação/permeabilização do passo 3.1.5, lave as células duas vezes com 1X PBS, e incubar as células com 0,25 mL/poço de solução de bloqueio para 1 h à temperatura ambiente.
Nota: Prossiga para a próxima etapa ou armazene as células na solução de bloqueio a 4 ° c durante a noite. - Retire a solução de bloqueio (Step 3.1.6) e adicione 0,25 mL/poço (1 μg/mL) de um anticorpo monoclonal de rato (MAb) contra a nucleoproteína IAV, NP (HB-65) ou uma diluição 1:1000 de um anticorpo policlononal de coelho (pAb) contra NLuc (ver a tabela de materiais), ambos diluídos na solução da diluição do anticorpo (1X PBS, 2,5% BSA), e incubar as pilhas para 1 h em 37 ° c.
- Retire o anticorpo primário da etapa 3.1.7, lave as células três vezes com 1X PBS e incubar-os com 0,25 mL/poço de um Texas vermelho-conjugado anti-rato ou anti-coelho anticorpos secundários (ver a tabela de materiais) diluído 1:200 em anticorpo solução de diluição.
Nota: Os núcleos da pilha podem ser manchados ao mesmo tempo adicionando 0,5 μg/mL de 4 ', 6 '-diamidino-2-phenylindole (DAPI) à mesma solução secundária do anticorpo. Incubar as células por 1 h a 37 ° c no escuro. Outros anticorpos secundários conjugados com outros fluoróforos podem ser usados. - Remova o anticorpo secundário e o DAPI da etapa 3.1.8, lave as pilhas três vezes com o 1X PBS. Após a lavagem, deixe as células em 0,25 mL/poço de 1X PBS.
- Coloc a placa no estágio de um microscópio de fluorescência para detectar a expressão do repórter de Venus e de nluc, e o NP das pilhas contaminadas usando os filtros fluorescentes apropriados. Capture imagens usando um microscópio de fluorescência (ampliação 20x) e mesclar-los usando um software de edição de imagem (Figura 2a, B).
- Um dia antes da infecção, sementes 24-bem placas com Madin-Darby canino rim (MDCK) células epiteliais (1 x 105 células/bem, triplicates) em meios de cultura de tecidos e manter as placas em uma incubadora de 37 ° c com 5% co2. Prepare poços suficientes para avaliar todos os anticorpos escolhidos em células infectadas por Mock e BIRFLU.
- Analise a atividade de nluc (Figura 2C) e a replicação viral (Figura 2D).
- Um dia antes da infecção, sementes 12-bem placas com células MDCK (2 x 105células/bem, triplicates) usando meios de cultura de tecidos em uma incubadora de 37 ° c com 5% co2 para chegar a cerca de 90% confluência pelo tempo de infecção.
Nota: Antes da infecção, verifique as células um microscópio para verificar uma monocamada de células MDCK. - O dia da infecção prepara diluições dos vírus WT e BIRFLU em meios de infecção para infectar as células MDCK (etapa 3.2.1.) em triplicado com um MOI de 0, 1 PFU em 0,5 mL/bem. Retire o meio de cultura do tecido e lave as células MDCK duas vezes com 1X PBS.
- Adicione as diluições do vírus aos monocamadas de MDCK e permita a adsorção viral na temperatura ambiente por 1 h em uma plataforma de balanço. Após a adsorção viral, retire o iníbulo do vírus e adicione 1,5 mL de meios pós-infecção contendo 1 μg/mL de tripsina tratada com TPCK, a cada poço. Incubar células infectadas em uma incubadora de 5% CO2 humidificada a 33 ° c e coletar sobrenadantes nos pontos de tempo indicados indicados na etapa 3.2.4.
- Em 24, 48, 72, e 96 h a infecção do borne (p.i.) recolhe 150 μL do sobrenadante da cultura do tecido de cada poço e armazena as amostras em um tubo do microcentrifugador em-80 ° c para executar os ensaios de nluc e as titulações virais.
- Para realizar o ensaio de atividade de nluc, siga as indicações do fabricante. Primeiramente, descongele o sobrenadante da cultura do tecido armazenado em-80 ° c (etapa 3.2.4) no gelo.
Nota: Consulte as recomendações do fabricante e otimize o ensaio, se necessário. - Prepare a solução de ensaio de luciferase (ver a tabela de materiais) diluindo o substrato nluc 1:50 com o tampão de diluição. Em uma microplaca branca de fundo plano 96-well para ensaios de luciferase, misture 25 μL de solução de ensaio de luciferase com 10 a 25 μL das amostras de sobrenadantes de cultura de tecido coletadas. Incubar a mistura durante 2 – 3 min antes de medir a luminescência utilizando um luminômetro (Figura 2C).
Nota: A presença de partículas virais infecciosas nos sobrenadantes da cultura tecidual é determinada por ensaio de fluorescência imune-foco (Vênus) ou imunofluorescência indireta (coloração do antígeno viral) como descrito anteriormente23,32, 33,56. - Um dia antes das titulações virais, células MDCK semente em uma placa de 96 poços (2 x 104 células/bem, triplicates) com meios de cultura de tecidos e permitir que as células alcancem 90% confluência pelo tempo de infecção em uma incubadora fixado em 37 ° c com 5% co2.
- Use as amostras do sobrenadante da cultura do tecido que foram descongelados no gelo (etapa 3.2.4.). Adicione 90 μL de meio de infecção a cada um dos poços em uma nova placa 96-well e, em seguida, adicione 10 μL do sobrenadante de cultura de tecido descongelado (etapa 3.2.4) ao primeiro poço (linha A). Use um Pipet multicanal para misturar e transferir 10 μL da linha a para a linha B. mude as pontas entre diluições e misture bem.
Nota: Este procedimento deve ser repetido até a última linha (H). Recomendamos a realização de titulações virais em triplicados para a medida exata dos títulos virais. - Retire o meio de cultura do tecido das células MDCK nas placas 96-well (passo 3.2.7) e lave duas vezes com 1X PBS. Adicione 50 μL das diluições sobrenadantes da placa de réplica 96-well contendo as diluições de vírus (passo 3.2.8) para cada poço na placa 96-bem contendo células MDCK.
- Incubar a placa 96-well em uma plataforma de balanço por 1 h na temperatura ambiente para permitir a adsorção viral. Após a adsorção viral, retire o iníbulo e adicione 100 μL/poço de meios de pós-infecção contendo 1 μg/mL de tripsina tratada com TPCK. Incubar células infectadas por 12 h em uma incubadora de 33 ° c com 5% de CO2.
- Desde que BIRFLU expressa Venus, o número de pilhas contaminadas pode diretamente ser contado usando um microscópio de fluorescência. Alternativamente, os títulos virais podem ser determinados pela imunofluorescência indireta como descrita previamente usando um anticorpo de encontro a uma proteína viral23,56,57,59. Para este último, proceder para fixar/permeabilizar as células e mancha usando o anti-NP mAb HB-65 conforme descrito na seção 4,4.
- Determine os títulos virais contando o número de unidades de conformação fluorescente (FFU)/mL usando a fórmula: ((número de FFU) x 20 x 1/diluição (Figura 2D).
- Um dia antes da infecção, sementes 12-bem placas com células MDCK (2 x 105células/bem, triplicates) usando meios de cultura de tecidos em uma incubadora de 37 ° c com 5% co2 para chegar a cerca de 90% confluência pelo tempo de infecção.
4. caracterização in vivo de BIRFLU (Figura 3 e Figura 4)
- Infecção do rato
Nota: a infecção intranasal dos ratos foi feita como descrita previamente23. Para um protocolo mais detalhado de infecção por IAV in vivo usando o modelo de infecção do mouse, recomendamos a visualização do vídeo associado à publicação anterior23. Esta seção resume somente as etapas exigidas para a infecção do rato com BIRFLU.- Inspecione os camundongos para avaliar sua saúde e aparência física geral. Prepare a diluição de BIRFLU em 1X PBS para inocular camundongos com 1 x 106 Pfu de birflu em um volume total de 30 μl/mouse. Manter o vírus no gelo até a inoculação do mouse.
Nota: Os ratos mock-Infected (1X PBS) serão necessários como o controle interno para a imagem latente. Coloque ratos infectados simulados em uma gaiola diferente do que os animais infectados com BIRFLU. - Anestesiar camundongos BALB/c fêmeas de cinco a sete semanas de idade intraperitonealmente com 240 – 250 mg/kg de tribromoetanol (TBE) inserindo a agulha no caudal 2/3 do lado direito do abdome. Em seguida, retorne o mouse para a gaiola e aguarde cerca de 5 min. Verifique se o mouse está anestesiado antes da inoculação do vírus pela ausência do reflexo do dedo-da-pinça.
Nota: Sedativos injetáveis são recomendados sobre sedativos inalados para infecções da gripe in vivo, como este último pode modificar o comportamento e a captação do vírus pelo epitélio das vias aéreas. Além disso, eles também podem afetar as respostas imunes locais do pulmão e interferir com a imagem in vivo de camundongos infectados. Finalmente, os sedativos inalados reduziram a duração do efeito, o que seria um problema para a imagem latente in vivo dos animais infectados. - Inocular os camundongos intranasalmente com os 30 μL da diluição BIRFLU preparada. Verifique se os camundongos estão respirando corretamente antes de devolvê-los à gaiola.
- Inspecione os camundongos para avaliar sua saúde e aparência física geral. Prepare a diluição de BIRFLU em 1X PBS para inocular camundongos com 1 x 106 Pfu de birflu em um volume total de 30 μl/mouse. Manter o vírus no gelo até a inoculação do mouse.
- Monitorização da bioluminescência de camundongos infectados com BIRFLU (figura 4a)
Nota: nesta expressão de repórter manuscrito de nluc ou Vênus e replicação viral nos pulmões de camundongos infectados com BIRFLU são determinados em 3 dias após a infecção. Entretanto, a natureza da imagem latente do bioluminescência permite a monitoração repetida da expressão de nluc em animais birflu-contaminados individuais sem a necessidade de eutanizar os para cada tempo-ponto experimental. Um sistema de imagem in vivo com um colector de anestesia isoflurano é necessário para executar os procedimentos experimentais descritos. Consulte a tabela de material para obter detalhes sobre o instrumento de imagem e o software de imagens utilizados para a aquisição de imagens e análise de dados.- Raspar a caixa de camundongos para melhorar o sinal de bioluminescência. Abra o software de imagem e pressione inicializar. Em seguida, defina os parâmetros que serão usados, incluindo a definição do modo de imagem para bioluminescência, economia automática, tempo de exposição para auto, filtro aberto, etc.
- Uma vez que a máquina é inicializada inteiramente, gire sobre o sistema da anestesia do isoflurano. Coloque os animais na câmara de anestesia. Camundongos são simultaneamente e levemente anestesiados com uma mistura de gás de oxigênio e vaporizado 1 – 2% isoflurano.
- Uma vez que os ratos são anestesiados, administrar o substrato nluc (ver a tabela de materiais) diluído 1:10 em 1X PBS (volume final 100 μl/mouse) através de via retroorbital usando uma seringa com uma agulha de 22 G.
- Imediatamente após a administração do reagente de nluc, coloque os animais no instrumento de imagem com seus baús voltados para cima e focinhos no interior do cone múltiplo para manter o animal anestesiado durante a imagem. Imediatamente após fechar a porta do gerador de imagens, clique em adquirir no programa de software (figura 4a, superior).
- Após a imagem, retorne os ratos a suas gaiolas que monitoram os até que recuperaram inteiramente e desligam o vaporizer do isoflurano. Em seguida, prossiga com a imagem ex vivo de pulmões de camundongos para avaliar a expressão gênica do repórter Venus (seção 4,3).
- Use as ferramentas de software de imagem para analisar os dados de bioluminescência adquiridos. Utilize o ROI da ferramenta (região de interesse) para designar o sinal específico e realizar medições de fluxo na região de interesse (geralmente ao redor do tórax) (figura 4a, inferior). Embora a forma de ROI seja irrelevante, os ROIs maiores geralmente são preferidos para capturar toda a área de difusão do sinal.
- Clique em medir. Avalie a bioluminescência em fótons , uma vez que fornece uma medida absoluta de emissão de fótons que é comparável às medições de saída fornecidas por diferentes parâmetros ou instrumentos de imagem.
- Análise de fluorescência em camundongos infectados com BIRFLU (Figura 3 e Figura 4B)
- Colete os pulmões do rato após a imagem latente in vivo, como descrito previamente23.
- Brevemente, eutanizar camundongos com uma dose letal de TBE (500 mg/kg). Desinfecte o local da incisão com 70% de etanol. Com um bisturi, faça uma incisão do esterno até a base do abdômen e, em seguida, corte da parte inferior da incisão para os lados com uma tesoura. Em seguida, corte a veia hepática (segundo método de eutanásia física) para sangrar o animal.
Nota: Para evitar um sinal de fundo elevado durante a imagem, é importante minimizar a quantidade de sangue nos pulmões (ver abaixo).
- Brevemente, eutanizar camundongos com uma dose letal de TBE (500 mg/kg). Desinfecte o local da incisão com 70% de etanol. Com um bisturi, faça uma incisão do esterno até a base do abdômen e, em seguida, corte da parte inferior da incisão para os lados com uma tesoura. Em seguida, corte a veia hepática (segundo método de eutanásia física) para sangrar o animal.
- Coloque o rato em recumbency dorsal, e use a tesoura para cortar a pleura e abrir a caixa torácica. Subseqüentemente, remova os pulmões cortando a extremidade da traquéia com tesouras ao prender delicadamente os pulmões com fórceps.
- Coloque os pulmões em uma placa de seis poços com 2 mL de 1X PBS e lave os pulmões três vezes com 1X PBS.
Nota: Para evitar a contaminação entre as amostras, limpe e desinfete as ferramentas de dissecação entre cada animal.
- Coloque os pulmões em uma placa de seis poços com 2 mL de 1X PBS e lave os pulmões três vezes com 1X PBS.
- Inicie o software de aquisição de imagens clicando em inicializar e defina os parâmetros de imagem, incluindo o modo de imagem de configuração para fluorescência, economia automática, tempo de exposição para auto, excitação (500 nm) e filtros de emissão (540 nm).
- Quando a máquina é inicializada, coloque os pulmões em uma bandeja de fundo preto, garantindo que os tecidos são separados um do outro, introduzir a bandeja no gerador de imagens, e clique em adquirir no programa de sistema de imagem após fechar a porta de Imager ( Figura 4B, parte superior).
- Após a imagem, retire os tecidos imediatamente e guarde-os no gelo (4 ° c) se as amostras forem processadas no mesmo dia; ou em um tubo e gelo seco para congelá-los rapidamente, antes de armazená-los em-80 ° c, se as amostras serão processadas mais tarde em um dia diferente.
- Para processamento de imagem, selecione a ferramenta ROI e desenhe Rois em torno de cada um dos pulmões individuais. Clique em medir. Em seguida, usando as medições médias de eficiência radiante resultantes, subtrair os valores dos camundongos infectados por mock (Figura 4B, inferior).
Nota: com BIRFLU, há uma boa correlação dos níveis da expressão de nluc e de Venus, e da distribuição do sinal. Portanto, é importante analisar a expressão de nluc (rato inteiro) e Vênus (pulmões excisados) do mesmo animal, e manter a mesma orientação.
- Colete os pulmões do rato após a imagem latente in vivo, como descrito previamente23.
- Avaliação da replicação de BIRFLU em pulmões de camundongos (Figura 3 e Figura 4C)
- Homogeneizar os pulmões de camundongos para titulação viral por ensaio de placa como descrito anteriormente23.
- Coloque os pulmões em um homogeneizador de dounce com 1 mL de meios de infecção refrigerados. Homogeneizar os pulmões com o pilão por 1 min à temperatura ambiente até que ele tenha totalmente desintegrado e armazene as amostras em um tubo estéril a 4 ° c.
- Centrifugue as amostras a 300 x g durante 10 min e recolha o sobrenadante num tubo estéril. Guarde as amostras no gelo se elas serão usadas no mesmo dia ou congelá-las em-80 ° c para avaliar os títulos virais em um momento posterior.
Nota: Um novo homogeneizador de dounce deve ser usado para cada amostra de pulmão. - Para realizar o ensaio de placa, o dia anterior à realização de titulação viral, sementes de seis poços com células MDCK (5 x 105 células/poço) em meios de cultura de tecidos. Incubar as células durante a noite em 37 ° c com 5% CO2 para chegar 90% confluência no dia seguinte. Antes da infecção, confirme que as células formam uma monocamada um microscópio de luz.
- Prepare 1:10 diluições seriais do sobrenadante a partir das amostras homogeneizadas (passo 4.4.1) em meios de infecção. Prepare os tubos de microcentrífuga com 540 μL de meios de infecção, adicione 60 μL da amostra de pulmões homogeneizados ao primeiro tubo, misture pipetando para cima e para baixo e, em seguida, utilizando uma nova ponta, transfira 60 μL para o tubo seguinte. Repita este processo de diluição em série até à última diluição.
Nota: Em nossa experiência 7 diluições são suficientes para determinar títulos virais pelo ensaio da chapa dos pulmões de ratos contaminados. - Lave as células MDCK (passo 4.4.3) duas vezes com 1X PBS e transfira 500 μL das amostras serialmente diluídas para cada poço na placa de seis poços. Coloc as placas em uma plataforma de balanço e permita que a absorção viral ocorra por 1 h na temperatura ambiente.
- Após 1 h de absorção viral, retire o inábio viral, adicione 2 mL/poço de meio de sobreposição contendo 1 μg/mL de tripsina tratada com TPCK e, em seguida, incubar as células a 33 ° c abaixo de 5% CO2 por 3 dias.
- Fixar as células infectadas (passo 4.4.6) com 1 mL/poço de formaldeído a 4% diluído em 1X PBS à temperatura ambiente durante 2 h, Retire cuidadosamente o meio de sobreposição e adicione 1 mL de 1X PBS a cada poço. Para visualização de Vênus, a imagem das placas de seis poços com um sistema de imagem para a detecção de fluorescência.
Nota: Placas virais podem ser coloridas usando um software de edição de imagem (veja a tabela de materiais). - Para avaliar a expressão de nluc, visualize placas virais por imunocoloração usando um anti-nluc pAb. Para isso, retire o 1X PBS, permeabilize as células usando 0,5 mL/poço de solução de permeabilização por 15 min à temperatura ambiente.
- Retire a solução de permeabilização, lave as células três vezes com 1X PBS e bloqueie com 0,5 mL/poço de solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente.
- Retire a solução de bloqueio do passo 4.4.9 e incubar as células com 0,5 mL/poço do pAb anti-nluc diluído 1:1000 em solução de diluição para 1 h a 37 ° c.
- Use o kit de fosfatase alcalina ABC e o kit de substrato DAB peroxidase após a recomendação do fabricante para visualização de placas expressando nluc.
- Brevemente, lave as células de 4.4.10 três vezes com 1X PBS e incubar-os com 0,5 mL/poço de anticorpo secundário biotinylated do anti-coelho para 1 h em 37 ° c.
- Retire o anticorpo secundário, lave as células três vezes com 1X PBS e incubar com a solução ABC durante 1 h a 37 ° c. Lave as células três vezes com 1X PBS e visualize as placas virais com o kit de substrato DAB HRP. Digitalizar as placas imunomanchadas usando um scanner convencional.
Nota: Outros kits semelhantes para imunocoloração podem ser usados.
- Manchar as placas virais com a solução violeta de cristal para 1 h na temperatura ambiente. Descarte a violeta cristalina, lave as placas três vezes com água, deixe secar as chapas e escaneie as placas novamente.
- Para determinar Titers virais, conte as chapas reveladas após a mancha violeta de cristal. Digitalizar as chapas usando um scanner convencional. Calcule o Titer do vírus como unidades formando da chapa (PFU) por o mL (PFU/mL).
- Para avaliar a estabilidade de BIRFLU in vivo, calcule a porcentagem de vírus de expressão de repórter contando o número de chapas de cristal violeta-manchadas (número de vírus infecciosos, etapa 4.4.12) e compare com o número de Venus-e de nluc-expressando chapas ( Step 4.4.7 e Step 4.4.11, respectivamente).
- Centrifugue as amostras a 300 x g durante 10 min e recolha o sobrenadante num tubo estéril. Guarde as amostras no gelo se elas serão usadas no mesmo dia ou congelá-las em-80 ° c para avaliar os títulos virais em um momento posterior.
Representative Results
Geração e caracterização de BIRFLU in vitro (Figura 1 e Figura 2)
Uma IAV de replicação recombinante-competente expressando dois genes de repórter diferentes (BIRFLU) foi construída utilizando técnicas de biologia molecular de estado da arte e de genética reversa baseada em plasmídeo (Figura 1). Aqui, optou-se por usar nluc devido a várias vantagens sobre outras luciferases, incluindo seu tamanho pequeno, ATP-independência, maior intensidade e substrato otimizado48,60. Nluc foi clonado no segmento de HA do IAV PR8 seguido pelo site de clivagem (2A) do teschovirus porcino (PTV) 2A na frente do quadro de leitura aberto (ORF) de HA (Figura 1). O ORF do HA incluiu mutações silenciosas para remover os sinais originais da embalagem e para evitar todo o recombination possível. O sinal de empacotamento completo de HA foi adicionado na frente de nluc para permitir a incorporação apropriada do segmento modificado do HA no virion e na expressão de nluc e de HA do mesmo segmento viral do RNA (Figura 1). Além, a proteína fluorescente Venus foi clonada em um segmento modificado de IAV PR8 ns que codifica as duas proteínas virais ns1 e NEP de um único Transcript32,36,41,54, 57. Para esse fim, Vênus foi fundido para o C-terminal de NS1 e todo o NEP ORF foi clonado a jusante do site de clivagem PTV 2A que foi colocado entre as seqüências NS1-Venus e NEP (Figura 1). Em última análise, essas duas construções de plasmídeo viral de HA e NS modificadas foram utilizadas em combinação com o restante dos plasmínios de genética reversa do IAV PR8 para gerar BIRFLU (Figura 1). A caracterização in vitro e in vivo de BIRFLU tem sido descrita anteriormente55.
Na Figura 2, caracterizou-se in vitro birflu determinando os níveis de expressão de Vênus, NLUC e NP usando abordagens de fluorescência e imunofluorescência indireta (Figura 2a, B). Monocamadas confluentes de células MDCK foram simulados ou infectados (moi 0,1) com vírus WT ou birflu PR8 e, em 18 h pós-infecção, a expressão de Vênus foi diretamente avaliada por microscopia de fluorescência (Figura 2a, B). A expressão de nluc (Figura 2a) e NP (Figura 2b) foi visualizada por imunofluorescência indireta com anticorpos específicos para cada proteína. Como previsto, Vênus e expressão de nluc foram detectados apenas em células infectadas por BIRFLU e não em células infectadas pelo vírus WT PR8. Além, a microscopia indireta da imunofluorescência revelou a expressão do NP nas pilhas de WT e de BIRFLU PR8-infectadas. Nenhuma expressão de Vênus, nluc ou NP foi detectada, como esperado, em células infectadas (Figura A, B).
Para avaliar os níveis de expressão de nluc in vitro, as células de MDCK foram infectadas (MOI 0, 1) com vírus WT ou BIRFLU PR8 e a atividade de nluc em sobrenadantes de cultura tecidual foi avaliada em 24, 48, 72 e 96 h pós-infecção (Figura 2C). Somente a atividade de nluc foi detectada em sobrenadantes de cultura tecidual de células MDCK infectadas com BIRFLU (Figura 2C). A atividade de nluc nos sobrenadantes da cultura do tecido foi detectada tão cedo quanto 24 h borne-infecção com níveis mais elevados da expressão em 96 h borne-infecção, o mais provavelmente porque o efeito citopático (CPE) induzido durante a liberação da infecção viral a proteína de nluc retida na célula. Para avaliar a aptidão de BIRFLU em células cultivadas, a cinética de crescimento dos vírus WT e BIRFLU PR8 também foi avaliada (Figura 2D) e a presença de vírus infeccioso em sobrenadantes de cultura tecidual foi determinada pelo ensaio imunofoco (Figura 2D ). Notavelmente, a cinética de replicação do BIRFLU foi comparável à do vírus WT PR8, embora a replicação do BIRFLU tenha sido ligeiramente atrasada e não atinja os mesmos títulos virais que o WT PR8. No entanto, BIRFLU foi capaz de atingir títulos de 5 x 107 pfu/ml (Figura 2D), indicando que a expressão de dois genes de repórter no genoma viral não interfere significativamente com a replicação BIRFLU em células MDCK.
Rastreamento da infecção por BIRFLU em camundongos (Figura 3 e Figura 4)
A Figura 3 é um fluxograma esquemático para a avaliação da dinâmica de birflu em um modelo do rato da infecção de IAV. Os ratos BALB/C fêmeas de cinco-à-sete-semana-velhos eram ou mock-Infected com 1X PBS ou infected com 1 x 106 Pfu de birflu intranasally. Aos 3 dias após a infecção, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e então injetados com substrato de nluc retrô-orbitalmente. Todos os camundongos foram imediatamente colocados no instrumento IVIS e o sinal de nluc foi avaliado in vivo utilizando o IVIS. Em seguida, os camundongos foram eutanasiados e os pulmões foram colhidos. Os pulmões extirpado foram então analisados ex vivo usando o Imager in vivo para determinar a intensidade da fluorescência através da expressão de Venus. Por fim, os pulmões dos camundongos foram homogeneizados, e os títulos virais e a estabilidade foram determinados pelo ensaio da placa. As chapas foram avaliadas pela fluorescência direta de Vênus, por imunocoloração usando anticorpos específicos para nluc e por coloração violeta cristalina.
Descrito previamente replicação-competente repórter-expressando IAVs expresse um único gene do repórter, o mais freqüentemente um fluorescente ou uma proteína bioluminescente, como o substituto para a infecção viral e a replicação. No entanto, BIRFLU, é capaz de expressar os dois tipos de genes repórter sobre a infecção viral. Para avaliar a correlação entre a bioluminescência (in vivo Imaging) e a fluorescência (ex vivo Imaging) após a infecção por BIRFLU, camundongos BALB/c fêmeas de cinco a sete semanas de idade foram simulados com 1X PBS ou inoculado com BIRFLU (106 Pfu) intranasalmente . A atividade de nluc (figura 4a) foi avaliada pela administração do substrato de nluc injetado retroorbitalmente aos 3 dias após a infecção por meio de um instrumento de imagem in vivo. Optou-se por avaliar a bioluminescência no 3º dia, pois estudos prévios indicaram que a replicação do IAV, incluindo PR8, picos entre os dias 2 e 4 pós-infecção24,54. A bioluminescência foi monitorada (figura 4a, Top) e utilizada para calcular o fluxo total médio (Flux (log10 p/s) (figura 4a, fundo). Como previsto, camundongos inoculados com BIRFLU exibiu alta atividade de bioluminescência, mas nenhum sinal foi detectado em camundongos infectados por mock. Posteriormente, os pulmões de camundongos infectados foram colhidos e a expressão de Vênus foi avaliada por meio de imagem ex vivo (Figura 4B, Top). Além disso, calculou-se a eficiência radiante média de fluorescência (Figura 4B, fundo). Os pulmões extirpado dos ratos foram homogeneizados igualmente para determinar os títulos virais e a estabilidade genética de birflu in vivo (Figura 4C, D). A estabilidade genética de BIRFLU foi analisada através do ensaio de placas utilizando os vírus isolados dos pulmões dos camundongos e da microscopia fluorescente (Venus, Top), imunocoloração (nluc, médio) e coloração violeta cristalina (fundo). BIRFLU recuperado dos pulmões dos ratos foi capaz de formar chapas e expressa de forma estável ambos os genes de repórter (Figura 4C). Observou-se, notavelmente, uma boa correlação entre a bioluminescência e os sinais de fluorescência com a replicação viral.
Figura 1: representação esquemática dos segmentos de estrutura e genoma do IAV PR8 WT e BIRFLU virion. IAV são cercados por uma bicamada lipídica contendo as duas principais glicoproteínas virais hemaglutinina (HA; preto) e neuraminidase (NA; azul). IAV contem oito único-encalhado, negativo-sentido, segmentos do RNA (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, e NS). Cada segmento viral contém regiões não codificantes (NCR) nas extremidades 3 ' e 5 ' (caixas pretas). Também, na extremidade 3 ' e 5 ' do viral (v) RNAs são os sinais de empacotamento, responsáveis para o encapsidation eficiente de vRNAs em virions nascente (caixas brancas). Os segmentos e produtos virais IAV PR8 HA e NS são indicados em preto. Sequências de nluc, Venus e PTV 2A são indicadas em caixas vermelhas, verdes e listradas, respectivamente. A representação esquemática dos segmentos de HA e NS modificados expressando nluc e Venus, respectivamente, em BIRFLU também são indicados. Este número foi adaptado de Nogales et al.55. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: caracterização in vitro de BIRFLU. (A, B) Análise da expressão protéica por fluorescência direta e imunofluorescência. As pilhas de MDCK eram mock-Infected ou infected (MOI 0,1) com PR8 WT ou vírus de BIRFLU. As pilhas contaminadas foram fixadas em 18 h borne-infecção para visualizar diretamente a expressão de Venus pela microscopia fluorescente direta e para visualizar a expressão de nluc (a) e de NP viral (B) usando anticorpos específicos e a imunofluorescência indireta. Os núcleos foram manchados com DAPI. Imagens representativas (ampliação de 20x) são mostradas. Barras de escala = 100 μm. (C, D) Cinética de crescimento de PR8 WT e BIRFLU. A atividade de nluc (C) e os títulos virais (D) em sobrenadantes de cultura tecidual de células de MDCK infectadas (moi 0, 1) com WT e birflu PR8 foram avaliados nos tempos indicados após a infecção. Os dados representam as médias ± DP dos triplicados. Os títulos virais foram determinados pelo ensaio do imune-foco (FFU/ml). A linha pontilhada denota o limite de detecção (200 FFU/ml). Este número foi adaptado de Nogales et al.55. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: representação esquemática para o estudo de BIRFLU em camundongos. A expressão dos genes do repórter de nluc e de Venus foi avaliada nos ratos contaminados com 1 x 106 Pfu de birflu usando a imagem latente in vivo ou ex vivo. Resumidamente, no dia 1, 5 a 7 ratos BALB/c fêmeas de uma semana de idade foram mock-infectados (1X PBS) ou inoculados com 1 x 106 Pfu de birflu intranasalmente. No dia 3 borne-infecção, os ratos foram anestesiados levemente usando o isoflurano e a carcaça de nluc foi injetada retro-Orbitally. O sinal de nluc foi avaliado diretamente usando a imagem latente in vivo. Imediatamente depois da imagem latente, os ratos foram eutanasiados e a expressão de Venus em pulmões extirpado inteiros foi analisada usando a imagem latente ex vivo. Os pulmões de camundongos recuperados foram homogeneizados para avaliar a replicação viral e a estabilidade por ensaio de placa. As setas indicam correlação entre fluorescência (Vênus), imunocoloração (nluc) e coloração violeta cristalina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: bioluminescência in vivo e expressão de fluorescência. Fêmeas de cinco a sete semanas de idade BALB/c camundongos foram mock-infectados (1X PBS) ou inoculados com 1 x 106 Pfu de birflu intranasally. No dia 3 borne-infecção, a atividade de nluc (a) no rato inteiro foi determinada. Imagens representativas de um único rato que mostra a escala do Radiance (p/sec/cm2/Sr). Os valores de radiância da bioluminescência foram quantificados e o fluxo total médio é mostrado (Flux (log10 p/s). Após a imagem latente de nluc, os pulmões foram colhidos para a imagem latente ex vivo (B). Imagens representativas de pulmões inteiros são mostradas. Para quantificar a expressão de Venus, os valores médios das regiões de interesse (ROIs) foram normalizados à auto-fluorescência do pulmão dos ratos mock-Infected e as mudanças da dobra foram calculadas. Para analisar a estabilidade genética do BIRFLU in vivo, os vírus recuperados dos pulmões de camundongos foram analisados por meio de microscopia fluorescente (Venus, Top), imunocoloração (nluc, meio) e coloração violeta cristalina (fundo) (C). Imagens representativas de um rato são mostradas. Para avaliar a replicação do vírus, os pulmões inteiros foram homogeneizados após a imagem e utilizados para infectar células MDCK e determinar títulos virais por ensaio de placa (PFU/mL) (D). As setas indicam correlação entre fluorescência (Vênus), imunocoloração (nluc) e coloração violeta cristalina. As barras representam a média ± DP dos títulos de vírus pulmonares. Este número foi adaptado de Logales et al.55. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meios e soluções da cultura do tecido | Composição | Armazenamento | Usar |
| Meios da cultura do tecido: O meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal a 10% (FBS), 1% penicilina-estreptomicina-L-glutamina (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG). | 445 ml DMEM, 50 mL de FBS e 5 mL de 100x PSG. | 4 ° c | Manutenção de células MDCK |
| Mídia pós-infecção: dmem 0,3% Albumina bovina (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% ba 1% PSG). | 491 ml DMEM, 4,2 ml de 35% BA e 5 ml de 100x PSG | 4 ° c | Manutenção de células MDCK após infecção viral |
| soro fisiológico tamponado de fosfato 10x (PBS) | 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de na2HPO4. 7h2O, 2 g de KH2po4. Adicionar ddH2O até 1 L. Ajuste o pH para 7,3 | Temperatura ambiente | Para preparar 1X PBS |
| 1X PBS | Diluir 10x PBS com ddH2O | Temperatura ambiente | Células de lavagem |
| Meios de infecção: 1x pbs, 0,3% BA, 1% penicilina-ESTREPTOMICINA (PS) (PBS/BA/PS). | 487 mL 1X PBS estéril, 4,2 mL de 35% BA e 5 ml de 100x 1% PS (100 U/mL) | 4 ° c | Infecções virais |
| Solução de fixação/permeabilização: formaldeído a 4%, 0,5% Triton X-100 diluído em 1X PBS. | 400 mL de formalina tamponada neutra 10%, 5 ml de Triton X-100 e 595 mL de 1X PBS | Temperatura ambiente | Correção e permeabilização de células MDCK. |
| Solução de bloqueio: 2,5% albumina sérica bovina (BSA) em 1X PBS. | 2,5 g de BSA em 97,5 mL de 1X PBS | 4 ° c | Solução de bloqueio para ensaios de imunofluorescência e placa. |
| Solução de diluição de anticorpos (1% BSA em 1X PBS) | 1 g de BSA em 99 mL de 1X PBS | 4 ° c | Diluição de anticorpos primários e secundários. |
| 0,1% cristal violeta solução | 1 g de violeta de cristal em 400 mL de metanol. Adicionar 600 ml de ddH2O | Temperatura ambiente | Coloração de células MDCK em ensaios de placas. |
| Tosylsulfonyl fenilalanil clorometil cetone (TPCK)-tripsina Tratado | Prepare uma solução de 1, 000x stock em 1 mg/mL em ddH2O | -20 ° c | Para infecções virais. |
Tabela 1: meios e soluções de cultura de tecidos.
Discussion
Os investigadores confiaram em vírus de expressão de repórter recombinante como ferramentas moleculares vitais para compreender e expandir sobre a compreensão atual da replicação viral e da patogénese26,27,28, 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. os genes de repórter mais comumente favorecidos são luciferases e proteínas fluorescentes, principalmente devido aos avanços tecnológicos em sua identificação, desenvolvimento de variantes melhoradas e detecção por tecnologias de imagem43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. os vírus do repórter recombinante são frequentemente utilizados para acelerar os ensaios virológicos, estudar a dinâmica dos vírus in vitro e in vivo, e testar a eficácia de vacinas e abordagens terapêuticas atualmente aprovadas ou novas26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40, 41,54. Infelizmente, no caso do IAV, estudos passados limitaram-se à expressão de um único gene repórter, o que dificulta o tipo de estudo que poderia ser conduzido 26,27,28,29 , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. para evitar esta limitação, nós geramos uma replicação-competente bi-repórter IAV que expressa uma luciferase nluc e uma proteína fluorescente Venus (birflu).
Neste relato, descrevemos a caracterização in vitro de BIRFLU e as abordagens experimentais para o uso de BIRFLU para rastrear a infecção viral in vivo usando um modelo de camundongo de infecção por IAV. A expressão de BIRFLU nluc e de Venus correlacionou com os Titers virais. Além disso, BIRFLU permaneceu estável e continuou a expressar ambos os genes de repórter após ser recuperado dos pulmões de camundongos infectados. Esta abordagem oferece aos pesquisadores uma excelente oportunidade para estudar IAV em células cultivadas e em modelos animais, incluindo a identificação e desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para o tratamento de infecções por IAV.
Embora o BIRFLU tenha sido gerado usando a espinha dorsal de PR8, outro IAV recombinante usando o tipo diferente, o subtipo ou os backbones virais da tensão poderiam ser gerados usando a mesma aproximação experimental. Da mesma forma, neste relato descrevemos os procedimentos experimentais para o uso de BIRFLU em um modelo de camundongo do IAV. No entanto, BIRFLU poderia ser uma tecnologia valiosa para avaliar a infecção por IAV em outros modelos animais.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa sobre o vírus da gripe no laboratório de LM-S é parcialmente financiada pelo centro de excelência da gripe de Nova York (NYICE) (NIH 272201400005C), um membro dos centros de excelência do NIAID para o contrato de pesquisa e vigilância da gripe (CHERDEIROS) não. HHSN272201400005C (NYICE) e pelo departamento de defesa (DoD) peer revisado programa de pesquisa médica (PRMRP) conceder W81XWH-18-1-0460.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4 ° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| 5 to 7 week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
References
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