Summary
本研究描述了使用薄脂膜方法进行纳米脂质制备的经典水化，然后是纳米粒子表征。一种47 kDa亲水性和球状蛋白，塔林，被成功地封装为一种策略，以提高稳定性，避免快速清除，并促进受控释放。该方法可适用于疏水分子封装。
Abstract
脂类纳米胶囊已应用于制药、化妆品和食品行业。脂质体的属性包括其生物相容性、生物降解性、非免疫原性、非毒性以及诱捕亲水性和疏水性化合物的能力。有机溶剂中薄脂膜的经典水化技术，作为在纳米脂质体中封装植物黄体素的技术。详细介绍了纳米脂质的大小、稳定性、诱捕效率和形态特征。纳米脂质体是使用1，2-二氧化铝-sn-甘油-3-磷乙醇胺（DOPE），1，2-二苯酚-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-氨基（聚乙烯乙二醇）-2000]（铵盐;DSPE-MPEG 2000），和胆碱二聚丙酸酯（CHEMS）为主要成分。脂质首先溶解在氯仿中，以获得一种薄脂质膜，然后再水化在含有蛋白质的硫酸铵溶液中，在一夜之间被诱捕和孵育。然后，应用声波和挤出技术来生成纳米大小的单片囊泡。纳米晶片的大小和多分散度指数由动态光散射决定，而纳米晶菌形态通过扫描电子显微镜评估。诱捕效率由未封装的蛋白质量与最初加载的蛋白质的原始量之比决定。均质脂质体的平均尺寸为155nm，多分散指数值为0.168。实现了83%的高诱捕效率。
Introduction
近年来，调查高效药物输送系统的研究数量有所增加。然而，诸如快速清除、生物分布不良、生理pH值溶解性以及细胞接受不足等限制仍有待超越。纳米系统的使用已成为癌症治疗的最新进展，用于增加癌细胞内药物细胞内浓度，同时尽量减少健康细胞的毒性。此外，从不同材料范围（即聚合物、花边、脂质体、病毒、碳纳米管以及氧化铁和黄金等金属）获得的纳米颗粒目前正在用于增强抗癌效果和减少系统性毒性1.脂类纳米胶囊尤其适用于制药、化妆品和食品行业。近年来，各种营养产品，如维生素，酶，和草药提取物已经配制使用脂质体技术2。
脂质体是球形囊泡，由一个或多个同心脂质双层组成，由磷脂在水介质中分散自发形成3、4。磷脂的极性头位于膜的外表面和内表面，与水环境接触。相反，脂肪酸链形成膜的疏水核心，并免受水5。脂质体的某些属性，使他们有吸引力的药物输送系统包括其生物相容性，生物降解性，非免疫原性，无毒性，以及捕获亲水性和疏水性化合物的能力6。
脂体可以使用各种过程步骤制备，如搅拌、声波、挤出、冻干、冷冻和解冻。经典方法包括逆相蒸发、溶剂注射和洗涤剂透析。应用最多的方法是薄脂膜水化，又称邦汉姆法，用于获得7、8、9、10、11的脂质形式。层状（磷脂双层的数量）和颗粒大小是经典参数，用于将脂质体表征为 1） 单片体囊泡 （ULVs），由独特的磷脂双层形成，大小变化如下：i） 小型单层体囊泡 （SUV， ±0.02-0.20 μm）， ii） 大型单拉梅拉囊泡 （LUV， ±0.2-1.0 μm）， 和 iii） 巨大的单拉他拉囊泡 （GUVs， >1 μm）;或 2） 多拉梅拉囊泡 （MlV， >0.1 μm）3，12.囊泡大小是考虑用于治疗用途时的重要参数，如在癌症治疗中，其中<200 nm的大小是理想的允许纳米囊块穿过内皮屏障并到达肿瘤组织4。
在此，使用塔林（一种植物性球蛋白，特征为亲水球蛋白13、14、15）描述在薄膜薄膜技术7的经典水化之后的封装过程.纳米大小的囊泡是通过将声波和挤出步骤纳入主要技术来生产的，从而产生稳定的脂质体纳米囊泡，具有高诱捕效率16。
Protocol
1. 制备塔林脂质体纳米胶囊16
注：所有制剂应以三联形式制备，以获得更大的体积（7 mL），并使样品能够在超离心机中离心（见下文详情）。
- 使用分析平衡对脂体组分量进行称重，如表 1所示。
- 使用适合旋转蒸发器的 250 mL 体积烧瓶溶解氯仿中的脂质成分，以避免材料损失。
- 在 150 rpm 转速下搅拌混合物 15 分钟。
- 在以下条件下，使用旋转蒸发器拆下氯仿：
- 将容积烧瓶口调节到标准位置（25°），以获得最佳效率，同时与加热槽中的水接触。
注：设备臂应倾斜 25°，以保持体积烧瓶和水浴之间的接触，同时不影响蒸发效率或损坏样品。标准位置可能因设备品牌而异。 - 将冷凝器温度设置为至少 3°C。
- 将加热浴温度设置为 40 ± 1 °C。
- 将旋转设置为 120 rpm。
- 将真空调节至 207 mbar，将沸点调节至 20°C。
- 约25分钟后，取出烧瓶并丢弃蒸发的溶剂，留在冷凝器中。
注： 在此步骤中形成由脂体成分组成的薄而不透明的薄膜，易于可视化。冷凝器中剩余的蒸发溶剂必须储存到处置接收物（氯化）中，由专门公司处理，以便进行适当的丢弃。
- 将容积烧瓶口调节到标准位置（25°），以获得最佳效率，同时与加热槽中的水接触。
- 将脂质膜水合在0.3M硫酸铵溶液中达到0.01M脂质浓度（pH = 7.4），在1mg/mL下含有塔林，最终体积为10 mL。
- 搅拌混合物40分钟，在4°C孵育过夜。
注： 此步骤可视为停止点。隔夜孵化不是强制性的。
- 搅拌混合物40分钟，在4°C孵育过夜。
- 孵育后，在25°C（室温）将悬浮液声波1分钟;RT） 减少囊泡大小，避免聚合。
注：在以下条件下，超声波声波器中进行了尺寸减小：130 W 和 40 kHz。 - 通过 0.2 μm 聚碳酸酯孔膜执行 12 周期挤出。
注：在挤出过程之前，使用水测试微型挤出机组件，以避免样品泄漏。0.1 μm 孔膜也适用。在这种情况下，在脂质过渡温度以上预热微型挤出机支架，以方便挤出，同时保持脂质和蛋白质的物理化学特性。- 如制造商手册中所述，安装微型挤出机的部件。
- 将聚碳酸酯膜放在两个预湿滤芯支架之间，并将其放入支架中。
- 将 1 mL 空注射器插入设备，用脂体悬浮液将其他注射器填充到其总体积，并将其插入另一侧。
- 通过 0.2 μm 聚碳酸酯孔膜执行 12 周期挤出。慢慢地将样品从一个注射器推到另一个注射器上。在预冷却管中收集挤出悬架。
注：仅当样品从一个注射器转移到另一个注射器变得困难时，才应更换聚碳酸酯膜。由于SUV的形成导致尺寸减小，在挤出过程中，脂质体悬浮液应变得清晰。在此步骤中，可能会丢失约 0.2 mL 的样品。
- 通过超离心分离分离脂体。
注：将样品保持在冰浴中，直到超离心机准备好使用。使用带回转桶转子的超离心机，通过超离心将SUV与剩余部件和硫酸铵分离（参见下面的详细信息）。- 在适合转子的钛管中称重样品并平衡管。检查根据用于避免损坏管的转子所需的最小体积，并在必要时使用硫酸铵调整脂质体悬浮量。
注：在离心机外部时，应始终将回转铲斗支撑在支架上，以避免刮伤离心机用于确定旋转速度的"Zebra 条纹"（即底部的黑白条纹）。 - 使用离心机之前打开真空，使其冷藏。
- 将钛管放入回转铲斗中。
注：将管提升到运行时假定的位置，以确保管完全安装。 - 释放真空，打开离心机门，并将转子放在里面。
注意：注意转子底部的圆标记，该圆标记必须与同一圆标记的相反方向配合到离心机本身中。 - 关闭离心机门，按下真空，等待，直到真空达到 200 至 <20 微米或从 26 Pa 到 <3 Pa。
- 在 4 °C 下将超离心显示屏中的参数调整至150，000 x g（相当于上述回转铲斗的 29，600 rpm）90 分钟（加速度：最大，减速：最大值）。
注：如果特定离心机以 rpm为单位设置，则始终将速度转换为 x g。使用离心机网站根据使用的转子转换装置。 - 按"召回"，检查条件，然后按"开始运行"。
注：等待离心机达到所需速度。 - 90分钟后，按下真空按钮释放真空，当真空达到 200-700 微米（相当于 26-93 Pa）时打开离心机门。
- 关闭离心机，从内部拆下转子，并将其放在工作台上，让铲斗干燥。
- 在冰上保持超离心样品。
- 在适合转子的钛管中称重样品并平衡管。检查根据用于避免损坏管的转子所需的最小体积，并在必要时使用硫酸铵调整脂质体悬浮量。
- 小心地，将管倒置成一次性的 15 mL 离心管，将上清液和颗粒从颗粒中分离出来。
注：将含有未封装蛋白质的上清液储存在4°C处。它将用于确定封装效率。颗粒显示为半透明的果冻。 - 将含有封装蛋白的颗粒悬浮在HEPES缓冲盐水中（3 mL，1x HBS）。
注：HBS 2x（库存溶液）通过稀释蒸馏水中以下数量的试剂制备：140 mM NaCl，1.5 mM Na2HPO4， 50 mM HEPES，然后将 pH 值调整为 7.4，最终体积调整为 100 mL。Na2HPO4可以替换为 NaHCO3或省略，以避免干扰，如果脂体浓度要确定。在使用前，应将HBS 2x库存溶液稀释至蒸馏水中，以获得HBS1倍。
2. 封装效率
注：使用Peterson的协议17确定封装效率，以避免脂质干扰蛋白质定量。所有样品（BSA标准和脂量上清液）应分三元分析。还要准备一个空白管。
- 库存试剂和工作溶液的制备17
- 对于库存试剂，通过将 10 mL 的 20% 碳酸钠、200 μL 的 0.1% 硫酸铜、200 μL 的 0.2% 酸钾与 9.6 mL 的蒸馏水混合制备碳酸铜 （CTC）。制备100 mL的10%硫酸二钠（SDS）和0.8 N氢氧化钠（NaOH）。
- 对于工作溶液，准备10 mL 0.15%脱氧胆酸钠（DOC）和72%三氯乙酸（TCA）。将10毫克牛血清白蛋白（BSA）溶解在10mL蒸馏水中，获得1mg/mL标准溶液。通过在蒸馏水中稀释氟林-焦钙酚试剂1：5，加入四氯化物、NaOH、SDS和H2 O的等份制备试剂A。制备试剂A。
注：试剂A要求每个反应管1 mL，而试剂B需要0.5 mL。要确定试剂 A 和 B 的最终体积，首先确定要使用的反应管的数量，考虑三种不同浓度的 BSA、空白和三重样品。试剂A在使用前必须很好地均匀，可在25°C（RT）下储存2周。如果试剂B储存在琥珀瓶中，在25°C（RT）时也稳定。
- 降水
注：此步骤在微离心管中执行。- 用水稀释脂体上清液，最终体积为1 mL，含有5-100μg蛋白质。
注：空白管应加满1 mL蒸馏水。 - 加入0.1 mL 0.15%DOC，通过涡旋均匀化，在RT孵育10分钟。
- 加入0.1 mL的72%TCA，混合良好，并在3000 x g和RT下离心15分钟。
注：DOC-TCA促进蛋白质沉淀，形成两个不同的相。靶蛋白可以通过离心恢复，避免脂质干扰。 - 小心地丢弃上清液，将管子向下倾斜，然后放在吸水纸上。保存颗粒以进行后续步骤。
注：颗粒可能很难看到，但管应倒置，即使它不可见。
- 用水稀释脂体上清液，最终体积为1 mL，含有5-100μg蛋白质。
- 分 光 光度 法
- 在 1 mL 蒸馏水中悬浮从步骤 2.2.4 中获得的颗粒。彻底混合以确保颗粒溶解，并将样品转移到新的试管中。
- 准备稀释白蛋白 （BSA） 标准到 1 mL 的最终体积。
注：蛋白质标准必须在5-100微克/mL之间制备。 - 从步骤 2.3.1 和 2.3.2 向管中加入 1 mL 试剂 A，无一例外地混合，并在 RT 孵育 10 分钟。
注：SDS可以缓解可能的脂质干扰，同时帮助蛋白质溶解。 - 从步骤 2.3.1 和 2.3.2 向管中加入 0.5 mL 试剂 B，混合良好，在 RT 下孵育 30 分钟，同时防止光线照射。
注：Follin-Ciocalteu酚试剂是磷酸化剂和磷酸酯的混合物，用于某些含氮化合物（如蛋白质）的色度测定。铜复合物增加了苯酚对该试剂的反应性，根据蛋白质浓度产生蓝色/紫色复合物。 - 使用分光光度计确定 750 nm 处的吸光度。
- 根据标准曲线计算上清液中的蛋白质浓度，如下所示。
- 考虑到线性趋势线，图吸收值 （Abs）与BSA 浓度 （mg/mL） 以获得角系数 （ k）。
- 根据吸收值和角系数 （k） 之间的比率确定上清蛋白浓度 （C），然后乘以总体积如下：
- 根据以下公式确定封装效率：
- 其中加载蛋白 = 10 mg，非封装蛋白 = 步骤 2.3.6.2 中获得的C值。
注：在这种情况下，总共10毫克塔林溶解在硫酸铵溶液（1毫克/mL）用于执行封装程序，因为这种浓度足以获得令人满意的体外效果13，16， 18.
3. 尺寸和稳定性确定
注：通过动态光散射（DLS）评估脂质制剂的大小分布和策略分散度指数（PdI）。接近 0.1 的 PdI 表示均匀准备。为了稳定，将脂体储存在4°C，并定期检查大小分布和平均大小。
- 在使用前 30 分钟打开 DLS 设备以预热激光灯。
- 将步骤 1.10 中获得的脂体制剂转移到一次性大小比色皿中。
- 设置设备参数如下：分散剂类型 = 水（RI = 1.33）;材料 = 脂质（RI = 1.45）;和 RT.
- 在设备完成读取时，按"开始"并等待。
- 拆下比色皿并关闭设备。
注：将样品从比色皿移回一次性15 mL离心管进行后续分析，或者如果有足够的量进行新读取，则丢弃。
4. 形态表征
注：脂质体表征根据默蒂和拉马萨米19执行。含有步骤1.10中获得的纳米脂体样品以三元法制备。
- 用双面胶带将玻璃盖板（直径 13 mm）固定在培养皿底部。将胶带切成小块（适当尺寸以固定盖唇），取出下面的保护纸，并将其固定在培养皿的底部。在钳子的帮助下，取下胶带顶部的保护纸，并固定其盖玻片。
注意：在以下步骤中要小心不要释放盖玻片，并使用强胶带。 - 用多L-莱辛涂抹盖玻片。将湿滤纸放入培养皿内以保持水分，并在 RT （25 °C） 孵育 1 小时。
- 涂布后，用蒸馏水冲洗盖玻片。
- 用步骤 1.10 中的一滴样品填充盖玻片，并在 RT 处干燥 1 小时。
- 要固定样品，请用0.1M磷酸盐缓冲液制备的4%谷醛覆盖，pH = 7.2。将湿滤纸放入培养皿内并密封，以保持水分水平。在4°C孵育48小时。
- 使用相同的磷酸盐缓冲液冲洗盖玻片 3x 5 分钟。
- 脱水样品如下：35%乙醇15分钟，50%乙醇15分钟，75%乙醇15分钟，95%乙醇2x15分钟，绝对乙醇3x20分钟。
- 在六甲二甲苯（HMDS）中浸泡2倍，将样品浸泡1⁄2 mL，以化学干燥10分钟。
注：HMDS 应在烟罩内小心操作。样品应允许在干燥器内或 RT 的烟气罩内过夜干燥。 - 用碳导电胶带将干燥的样品安装在存根上。
- 在真空中溅出盖玻片的表面，用导电层（20 nm 厚度）的金铂。
- 在低真空模式和低电压（20 kV）下使用扫描电子显微镜 （SEM） 记录图像。
Representative Results
图1描述了纳米脂体制剂16，20，21。磷脂，1，2-二氧化铝-二甘醇-3-磷乙醇胺（DOPE），1，2-二磷酸酯-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-氨基（聚乙烯乙二醇）-2000年]（铵盐;DSPE-MPEG 2000）和主要脂质体成分胆碱二甲酸酯（CHEMS）首先溶解在氯仿中，以获得脂质膜。然后，将脂质膜重新冻结在硫酸铵溶液中，含有亲水蛋白（塔林）进行诱捕，并在一夜之间进行孵育。然后，应用声波和挤出技术来生成小型单片囊泡。超离心步骤将脂质制剂从游离脂质和未封装的蛋白质中分离出来，而上清液则用于确定诱捕效率。
使用上述方法生产的纳米脂体显示了51-396纳米和平均尺寸为155纳米（表2）的尺寸分布。由于多分散指数为0.168，因此制备是均匀的。如果脂体通过0.2 μm孔径膜挤出，则达到83%的高诱捕效率（表2）。
SEM评估了形态纳米脂质体特性。图2A，B显示121nm范围内的圆形脂质体囊泡，在20千伏下进行分析，而图2C、D显示准备不足样品。纳米脂体只是空气干燥，没有以前的固定或任何其他治疗，在这项研究中描述。因此，在332μm范围内观察到较大和损坏的囊泡，并在5kV下进行分析。
图1：纳米脂质制剂的原理表示。DOPE、PEG和CHEMS，主要脂质体成分，首先溶解在氯仿中，以获得脂质膜（1，2，3）。然后，脂质膜在含有亲水蛋白（塔林）的盐碱缓冲液中重新水化，并在一夜之间进行孵育（4 ）。然后，应用声波和挤出技术来生成SUV（5，6）。超离心步骤将脂质制剂从游离脂质和未封装的蛋白质中分离出来，而上清液则用于测定诱捕效率（7 ）。这个数字已由科雷亚等人16日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：SEM的纳米脂微显微镜。（A，B）圆形脂质体囊泡在121nm范围内的图像，在20kV下进行分析。（C，D）准备不足的样品的图像。经过虐待的样品可以观察较大的和/或损坏的囊泡，这些囊泡无法抵抗 5 kV 时的真空和/或电压条件。这个数字已由科雷亚等人16日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
| 脂体组件 | 重量 （g） | 浓度（mM） | 最终卷 |
| 涂料 | 0.0420 | 5.7 | 10 mL |
| MPEG 2000-DSPE | 0.1059 | 3.8 | |
| 切姆斯 | 0.0024 | 0.5 |
DOPE - 1，2-二氧化二醇-二甘醇-3-磷乙醇胺;MPEG 2000-DSPE - 1，2-二氧化硫-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[氨基（聚乙烯乙二醇）-2000]（铵盐）;化学 - 胆碱酰胆酸。
表1：培养塔林脂质体纳米胶囊。
| 膜孔径 （μm） | 尺寸分布（纳米） | 平均尺寸（纳米） | 多分散度指数（PdI） | 峰值（纳米） | 诱捕效率 |
| 0.2 | 51 - 396 | 155 | 0. 168 | 94 × 39 | 0.83 |
通过动态光散射对大小和多分散度指数进行了评价，根据彼得森17号测定了封装效率。
表2：纳米脂质制剂的尺寸、分散度指标和诱捕效率。
Discussion
科雷亚等人16日测试了本文所述的抗肿瘤素，这是一种从科洛奇亚埃斯库伦塔22中纯化的免疫调节和抗肿瘤肠素。该方法取得了成功的结果，使生产稳定纳米脂体适合治疗应用。该配方在生理条件下以不同的pH水平提供受控释放。它还可以强化塔林药理特性，如抑制人类胶质细胞瘤U-87MG和乳腺癌MDA-MB-231细胞系和刺激小鼠骨髓细胞。脂质体制剂在健康小鼠细胞中无毒性作用。
班汉姆等人首先描述的古典方法，允许生产大型多拉梅拉脂质体囊泡，大小和形状异质。如本研究所报道，通过包括通过0.2 μm聚碳酸酯膜进行声波和挤出等附加步骤，成功地应用了这种方法的适应。这允许在纳米范围16，23，24中产生一个更均匀的色散。因此，为了确保成功的结果，应严格遵守此处描述的封装协议和脂质体配方。
纳米脂体组合物经过精心挑选，以确保形成以DOPE、MPEG 2000-DSPE和CHEMS为主要成分的双层膜。这些是天然动物膜双层成分，后者可赋予纳米脂质结构流动性，确保生物活性化合物在人类中的广泛应用。
纳米脂质体钉化对于保证脂质体结构稳定性至关重要。PEG的缺失导致尺寸增大、多分散度指数高、诱捕效率低。以DOPE为主要脂体组分组，可以获得最佳效果。然而，这是一种高成本的磷脂。纳米脂质生产的财务成本可以通过用其他类似的脂质（如DOPC（1，2-二氧化二醇-sn-甘油-3磷胆碱）取代DOPE来实现。CHEMS是一种天然存在于动物细胞膜中的胆固醇分子，不应排除在配方之外，因为确保脂质双层流动性和可延展性非常重要。
封装协议的其他方面也可以调整。用于溶解脂质体成分的氯仿可以很容易地被甲醇取代，对大小平均、均匀性和诱捕效率没有影响。然而，在4°C16下储存时，可能会出现一些蛋白质泄漏。含有塔林的硫酸铵溶液的过夜孵化步骤不是强制性的;然而，为了方便起见，它可以在不受纳米脂质生物物理特性、封装或稳定性效率损失损害时进行，如Correa等人16所证明的那样。挤出步骤在室温下执行，如果使用 0.1 μm 孔径膜，可降低注射器之间的流速。
为了克服这个问题，应考虑使用0.2 μm孔径膜或加热超过脂质过渡温度的挤出机支架。分析人员必须小心，不要损坏脂质或蛋白质，这些脂质或蛋白质可以灭活，并失去生物活性。或者，脂质体制剂可以针对HBS进行透析，而不是超离心，根据蛋白质分子量使用截断膜。在超离心后悬浮的缓冲液的化学性质选择与其后续应用直接相关。由于这项研究的视角包括体内和体外检测，HEPES缓冲盐水中的悬浮液足以确保无细胞毒性作用和接近生理条件的pH范围。
脂质体应经过精细处理，类似于活细胞，以获得更高质量的SEM图像。固定和干燥程序对于确保在真空条件下支持高于 20 kV 值的较小完整囊泡的可视化非常重要。图 2A，B显示与挤出程序兼容的纳米大小的囊泡。如果按照此过程进行充分的样品制备，则可以可视化 51-396 nm 的囊泡。这些步骤包括固定、通过增加乙醇浓度干燥以及化学脱水，以避免真空和电子束引起的聚集体和破裂的囊泡的形成。另一方面，图2C，D显示脂体囊泡在室温下干燥，没有接受此处描述的任何处理，这意味着它们准备不足。由于程序不当，即使通过0.2 μm孔径膜挤出后，也会形成巨大的囊泡。由于真空和电子束损坏，两个面板中也观察到破裂的囊泡。
纳米脂质囊泡已被探索为疏水性分子的封装和传递系统，包括白藜芦醇（3，5，4'-trihydroxystilne），一种生物活性化合物对抗结肠直肠癌细胞。封装程序除了提供脂质体纳米胶囊25固有的生物相容性、生物降解性、非免疫原性和非毒性特性外，还可以克服亲脂化合物的溶解度差。必须根据管理途径和目的考虑对议定书的适应，例如开发用于口服的新的脂体制剂配方。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢COPPE/UFRJ、电子显微镜实验室和多用户材料特征化实验室设施;向巴西里约热内卢联邦大学的阿达尔贝托·维耶拉博士、詹妮弗·洛博士和拉斐尔·林多索教授介绍使用超离心机;给巴西里约热内卢联邦大学的教授亚历山大·盖德斯·托雷斯博士和丹尼尔·佩罗内博士，用于使用旋转蒸发器;向来自柏林弗雷埃大学的罗兰·博德迈尔教授和安德烈·达舍夫斯基博士介绍，他们帮助获得资源，提供了新的方法，并在德国为期6个月的伊拉斯谟®奖学金期间监督了ACNTF;致巴西里约热内卢联邦大学教授兼技术员罗莎娜·蒂雷博士和阿琳·费尔南德斯博士，使用泽塔西泽·马尔文;致巴西里约热内卢联邦大学教授兼技术员布鲁玛·根特和塔伊萨·罗德里格斯，供SEM使用;给雷切尔·安·豪瑟·戴维斯博士，奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会研究员，进行旁白。这项研究部分资金来自巴西高级银行（CAPES）财政法001（第1627392号;1811605号赠款）;由基金会卡洛斯·查加斯·菲略·德安帕罗 - 佩斯奎萨多埃斯塔多里约热内卢（FAPERJ）（赠款号）E-26/202.815/2018;E-26/202.815/2018;E-26/203.039/2015和E-26/202.860/2016）;由国家科学委员会（CNPq）（第406601/2018-6号）和菲南西亚多拉·德普罗耶托斯（FINEP）撰写。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
References
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