Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Utarbeidelse og karakterisering av Nanoliposomes for å felle av bioaktive hydrofile globular proteiner

Published: August 31, 2019 doi: 10.3791/59900
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chemistry Institute, Federal University of Rio de Janeiro

Summary

Denne studien beskriver klassisk hydrering ved hjelp av tynne lipid film metode for nanoliposome forberedelser etterfulgt av nanopartikkel karakterisering. En 47 kDa-hydrofile og globular protein, Tarin, er vellykket innkapslet som en strategi for å forbedre stabiliteten, unngå rask klaring, og fremme kontrollert utgivelse. Metoden kan tilpasses hydrofobe molekyler innkapsling.

Abstract

Liposome nanocapsules har vært brukt til mange formål i farmasøytisk, kosmetikk og næringsmiddelindustrien. Attributtene til liposomer inkluderer deres biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, ikke-immunogenisitet, ikke-toksisitet, og evne til å lure både hydrofile og hydrofobe forbindelser. Den klassiske hydration av tynne lipid filmer i en organisk løsemiddel brukes her som en teknikk for å kapsler Tarin, en plante Lektiner, i nanoliposomes. Nanoliposome størrelse, stabilitet, fast effekt og morfologiske karakterisering er beskrevet i detalj. De nanoliposomes er forberedt ved hjelp av 1, 2-dioleoyl-sn-glyserol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino (polyetylen glykol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), og cholesterylhemisuccinate (CHEMS) som hovedbestanddeler. Lipider er først oppløst i kloroform å få en tynn lipid film som senere rehydrert i ammonium sulfat løsning som inneholder proteinet til å være fanget og inkubert over natten. Deretter brukes sonikering og ekstrudering teknikker for å generere nanosized unilamellære blemmer. Størrelsen og polydispersitet indeksen for nanovesikler bestemmes av dynamisk lysspredning, mens nanovesicle morfologi vurderes ved å skanne elektron mikroskopi. Å avgjøre effektiviteten bestemmes av forholdet mellom mengden av unencapsulated protein og original mengden av opprinnelig lastet protein. Homogene liposomer oppnås med en gjennomsnittlig størrelse på 155 NM og polydispersitet indeksverdi på 0,168. En høy fast effekt på 83% oppnås.

Introduction

Antallet studier som undersøker effektive medikament leveringssystemer har steget de siste årene. Men begrensninger som rask clearance, dårlig biodistribusjon og løselighet ved fysiologisk pH og utilstrekkelig mobil opptak må fortsatt være overgått. Bruken av nanosystems har dukket opp som nylig fremgang i kreft medisin, anvendes for å øke intracellulære konsentrasjonen av narkotika inne kreftceller samtidig minimere toksisitet i friske celler. Dessuten, nanopartikler innhentet fra et annet utvalg av materialer (dvs. polymerer, dendrimerer, liposomer, virus, karbon nanorør, og metaller som jernoksid og gull) blir for tiden anvendes for å forbedre anticancer effekter og redusere systemisk toksisitet1. Liposome nanocapsules spesielt har vært brukt til mange formål i farmasøytisk, kosmetikk og næringsmiddelindustrien. I de senere årene har ulike nutraceutical produkter som vitaminer, enzymer og urte ekstrakter blitt formulert ved hjelp av liposome teknologi2.

Liposomer er sfæriske blemmer bestående av en eller flere konsentriske lipid bilayers spontant dannet av spredningen av fosfolipider i vandig Media3,4. Polar hodene på fosfolipider er plassert på ytre og indre overflater av membraner, i kontakt med det vandige miljøet. I kontrast, fatty acid kjeder danner hydrofobe kjernen av membraner og er beskyttet mot vann5. Noen egenskaper av liposomer som gjør dem attraktive stoffet leveringssystemer inkluderer deres biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, ikke-immunogenisitet, ikke-toksisitet, og evne til å lure både hydrofile og hydrofobe forbindelser6.

Liposomer kan tilberedes ved hjelp av ulike prosesser trinn som agitasjon, sonikering, ekstrudering, lyophilization, frysing og tine. Klassiske metoder inkluderer reversfase fordampning, løsemiddel injeksjon, og vaskemiddel dialyse. Den mest brukte metoden er tynn lipid film hydration, også kjent som Bangham ' s metode, som brukes til å skaffe flytande-lipid former7,8,9,10,11. Lamellarity (antall fosfolipid bilayers) og partikkelstørrelse er klassiske parametre som brukes til å karakterisere liposomer som enten 1) unilamellære blemmer (ULVs), dannet av en unik fosfolipid bilayer og varierende i størrelse som følger: i) liten unilamellære blemmer (SUV, ~ 0.02-0.20 μm), II) store unilamellære blemmer (elsker, ~ 0.2-1,0 μm), og III) gigantiske unilamellære blemmer (GUVs, > 1 μm); eller 2) multilamellar blemmer (mlver, > 0.1 μm)3,12. Vesicle størrelse er en viktig parameter når de vurderer for terapeutisk bruk, for eksempel i kreft behandling, i hvilke størrelser på < 200 NM er ideelle for å tillate nanovesikler å krysse endothelial barriere og nå tumoral vev4.

Heri, innkapsling prosedyren etter den klassiske hydration av en tynn lipid film teknikk7 ble beskrevet ved hjelp Tarin, en plante Lektiner karakterisert som en hydrofile globular protein13,14,15 . Nanosized blemmer produseres ved å inkludere sonikering og ekstrudering trinn i hoved-teknikken, noe som resulterer i stabile liposomal nanovesikler med høy fast effekt16.

Protocol

1. utarbeidelse av Tarin liposomal nanocapsules16

Merk: alle forberedelser bør tilberedes i tre eksemplarer for å oppnå et større volum (7 mL) og aktivere prøven til å bli sentrifugert i en ultracentrifuge (se detaljer nedenfor).

  1. Veie de liposome komponentene ved hjelp av en analytisk balanse, som vist i tabell 1.
  2. Oppløse lipid komponenter i kloroform ved hjelp av en 250 mL volum kolbe som passer i en roterende fordamper for å unngå tap av materiale.
  3. Rør blandingen ved 150 RPM i 15 min.
  4. Fjern kloroform ved hjelp av en roterende fordamper under følgende forhold:
    1. Juster volum flasken til standardposisjonen (25 °) for optimal effektivitet, mens du er i kontakt med vannet fra varme badet.
      Merk: utstyrs armen bør være tilbøyelig til 25 ° for å opprettholde kontakt mellom den volum flasken og vannbadet, mens den ikke påvirker fordamping eller skader prøven. Standardposisjonen kan variere avhengig av utstyrs merke.
    2. Still inn kondensator temperaturen til minimum 3 ° c.
    3. Still temperaturen på varme badet til 40 ± 1 ° c.
    4. Sett rotasjonen til 120 RPM.
    5. Juster vakuum til 207 mbar og kokepunkt til 20 ° c.
    6. Etter ~ 25 min, fjerne flasken og kast fordampet løsemiddel, igjen i kondensatoren, hensiktsmessig.
      Merk: en tynn og ugjennomsiktig film, bestående av de liposome komponentene, dannes i dette trinnet og kan lett visualisere. Det fordampet løsningsmidlet som gjenstår i kondensatoren må oppbevares i avfalls mottakere (klor) som skal håndteres av et spesialisert selskap for hensiktsmessig kasting.
  5. Fukt lipid filmen for å nå en 0,01 M lipid konsentrasjon i 0,3 M ammonium sulfat oppløsning (pH = 7,4) som inneholder Tarin ved 1 mg/mL til et endelig volum på 10 mL.
    1. Rør blandingen i 40 min. og ruge over natten ved 4 ° c.
      Merk: dette trinnet kan betraktes som et stopp punkt. Overnatting inkubasjons er ikke obligatorisk.
  6. Etter inkubasjons sonikere suspensjonen i 1 min ved 25 ° c (romtemperatur; RT) for å redusere vesicle størrelse og unngå aggregering.
    Merk: størrelsesreduksjon ble utført i en ultrasonisk sonicator under følgende forhold: 130 W og 40 kHz.
  7. Utfør en 12-syklus ekstrudering gjennom en 0,2 μm polykarbonat pore membran.
    Merk: før ekstrudering prosessen, teste mini-Ekstruder montering med vann for å unngå prøve lekkasje. En 0,1 μm pore membran er også egnet. I dette tilfellet, pre-varme mini-Ekstruder holderen over lipid overgangen temperatur for å lette ekstrudering, og samtidig opprettholde fysikalsk karakteristikker av både lipider og proteiner.
    1. Monter de delene av mini-Ekstruder som beskrevet i produsentens bruksanvisning.
    2. Plasser polykarbonat membran mellom to pre-vått filter støtter og plassere den i holderen.
    3. Sett inn en 1 mL tom sprøyte i enheten, fyll den andre sprøyten til det totale volumet med den liposomal suspensjonen, og sett den på motsatt side.
    4. Utfør en 12-syklus ekstrudering gjennom en 0,2 μm polykarbonat pore membran. Skyv prøven fra en sprøyte til en annen, sakte. Samle ekstrudert suspensjon i en pre-avkjølt tube.
      Merk: polykarbonat-membranen bør bare skiftes ut når prøve overføring fra en sprøyte til en annen blir vanskelig. Den liposomal suspensjonen skal bli tydelig under ekstrudering prosessen som et resultat av størrelsesreduksjon på grunn av dannelsen av SUV-er. Omtrent 0,2 mL av prøven kan gå tapt i dette trinnet.
  8. Skill liposomer fra ultracentrifugation.
    Merk: Oppretthold prøvene i et is bad til ultracentrifuge er klar til bruk. Skill SUV-er fra de resterende komponentene og ammonium sulfat ved å ultracentrifugation ved hjelp av en ultracentrifuge med en sving-bøtte rotor (se detaljer nedenfor).
    1. Veie prøven i Titan røret som passer til rotoren og balansere rørene. Kontroller minimums volumet som kreves i henhold til rotoren som brukes for å unngå skade på rørene, og Juster om nødvendig liposomal fjærings volum med ammonium sulfat.
      Merk: swing bøtte bør alltid være støttet på stativet når utsiden av sentrifuger for å unngå riper i "sebra striper" (dvs. de svarte og hvite striper på bunnen), som brukes av sentrifuger for å bestemme rotasjonshastighet.
    2. Slå på vakuum før du bruker sentrifuger for å tillate det å kjøle.
    3. Monter Titan rørene i sving bøtta.
      Merk: Løft rørene til den posisjonen de antar når de kjører for å sikre at de er perfekt montert.
    4. Slipp vakuumet, åpne sentrifuge døren og plasser rotoren inne.
      Merk: Vær oppmerksom på sirkelen merket på undersiden av rotoren, som må passe i motsatt retning av samme sirkel merke i sentrifuger selv.
    5. Lukk sentrifuge døren, trykk på Vacuum og vent til vakuumet kommer fra 200 til < 20 mikron eller fra 26 pa til < 3 pa.
    6. Juster parametrene i ultracentrifuge displayet til 150 000 x g (tilsvarende 29 600 RPM for den nevnte swing bøtte) for 90 min ved 4 ° c (akselerasjon: Max, retardasjon: Max).
      Merk: Konverter alltid hastigheten til x g hvis den spesifikke sentrifuge er satt i RPM. Bruk sentrifuger nettsted for å konvertere enheten i henhold til rotoren som brukes.
    7. Trykk på Recall, kontroller betingelsene og trykk på Start for å kjøre.
      Merk: Vent til sentrifuger når ønsket hastighet.
    8. Etter 90 min, slipp vakuum ved å trykke på Vacuum knappen og åpne sentrifuger døren når vakuum når 200-700 mikron (tilsvarende 26-93 pa).
    9. Slå av sentrifuge, fjerne rotoren fra innsiden, og la den på benken med bøtter å tørke.
    10. Opprettholde ultracentrifuged prøvene på isen.
  9. Forsiktig, separate supernatanten fra pellet ved å dreie røret opp ned i en disponibel 15 mL sentrifugerør for å skille supernatanten og pellet.
    Merk: Oppbevar supernatanten som inneholder det unencapsulated proteinet ved 4 ° c. Det vil bli brukt til å bestemme innkapsling effektivitet. Pellet vises som en gjennomskinnelig gelé.
  10. Suspendere pellet med innkapslet protein i HEPES bufret saltvann (3 mL 1x HBS).
    Merk: HBS 2x (lagerløsning) fremstilles ved å fortynne følgende mengder reagenser i destillert vann: 140 mM NaCl, 1,5 mM na2HPO4, 50 mm HEPES, deretter justere pH til 7,4 og endelig volum til 100 ml. Na2HPO4 kan erstattes med NaHCO3eller utelates for å unngå interferens hvis liposome konsentrasjon skal fastsettes. HBS 2x lagerløsning skal fortynnes i destillert vann for å få HBS 1x før bruk.

2. innkapsling effektivitet

Merk: Bestem innkapsling effektivitet ved hjelp av Peterson protokoll17for å unngå lipid forstyrrelser i protein kvantifisering. Alle prøver (BSA-standarder og liposome-supernatanten) bør analyseres i tre eksemplarer. Også utarbeide en blank tube.

  1. Tilberedning av lager reagenser og arbeidsløsninger17
    1. For lager reagenser klargjør du kobber-Tartrate (CTC) ved å blande 10 mL 20% natrium tak, 200 μL av 0,1% kobber sulfat, 200 μL av 0,2% kalium Tartrate med 9,6 mL destillert vann. Forbered 100 mL på 10% natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS) og 0,8 N natriumhydroksid (NaOH).
    2. For arbeidsløsninger klargjør du 10 mL 0,15% natrium natriumdeoksykolat (DOC) og 72% Trekloredikksyre syre (TCA). Oppløse 10 mg av storfe serum albumin (BSA) i 10 mL destillert vann for å få en 1 mg/mL standard løsning. Klargjør reagens A ved å legge til like deler av CTC, NaOH, SDS og H2O. klargjør reagens B ved å fortynne Folin-Ciocalteu fenol-reagens 1:5 i destillert vann.
      Merk: reagens A krever 1 mL for hvert reaksjons rør, mens reagens B krever 0,5 mL. For å bestemme de endelige volumene av reagenser A og B, må du først definere antall reaksjons rør som skal brukes, med tanke på tre distinkte konsentrasjoner av BSA, blank og prøver i tre eksemplarer. Reagens A må være godt homogenisert før bruk og kan oppbevares ved 25 ° c (RT) i 2 uker. Reagens B er også stabil ved 25 ° c (RT) hvis den oppbevares i en gul flaske.
  2. Nedbør
    Merk: dette trinnet utføres i mikrosentrifugen rør.
    1. Fortynne liposome supernatanten med vann til et endelig volum på 1 mL inneholdende 5-100 mikrogram protein.
      Merk: blankt rør skal fylles med 1 mL destillert vann.
    2. Tilsett 0,1 mL 0,15% DOC, homogenisere av virvlingen og ruge i 10 min ved RT.
    3. Tilsett 0,1 mL på 72% TCA, bland godt, og sentrifuger på 3 000 x g og RT i 15 min.
      Merk: DOC-TCA fremmer protein nedbør, danner to forskjellige faser. Målet protein kan utvinnes av sentrifugering, unngå lipid forstyrrelser.
    4. Kast forsiktig supernatanten ved å verting slangen nedover og legge den på et absorberende papir. Lagre pellet for påfølgende trinn.
      Merk: pellet kan være svært vanskelig å se, men røret bør snus opp ned selv om det ikke er synlig.
  3. Spektrofotometri
    1. Suspendere pellets innhentet fra trinn 2.2.4 i 1 mL destillert vann. Bland godt for å sikre at pellet er oppløst og overføre prøven til et nytt reagensrør.
    2. Klargjør fortynninger av albumin (BSA)-standarder til et endelig volum på 1 mL.
      Merk: protein standardene må være klargjort mellom 5-100 μg/mL.
    3. Tilsett 1 mL reagens A til rørene fra trinn 2.3.1 og 2.3.2 uten unntak, bland godt og ruge i 10 minutter ved RT.
      Merk: SDS kan lindre mulige lipid forstyrrelser mens hjelpe til protein oppløseliggjøringen.
    4. Tilsett 0,5 mL reagens B til rørene fra trinn 2.3.1 og 2.3.2, bland godt, og ruge i 30 min ved RT mens beskyttet mot lyset.
      Merk: follin-Ciocalteu fenol-reagens er en blanding av phosphomolybdate og phosphotungstate som brukes til fargemetrisk analyser av noen nitrogen-inneholdende forbindelser, for eksempel proteiner. Kobber kompleks øker reaktivitet av fenoler mot denne reagens, produsere en blå/lilla kompleks i henhold til proteinkonsentrasjon.
    5. Bestem absorbances ved 750 NM ved hjelp av en spektrofotometer.
    6. Beregn protein konsentrasjonen i supernatanten basert på standardkurven som følger.
      1. Plot absorbansen verdi (ABS) vs. BSA konsentrasjon (mg/ml) for å oppnå vinkel koeffisienten (k) vurderer en lineær tendens linje.
      2. Bestem den supernatanten protein konsentrasjonen (C) ved forholdet mellom absorbansen verdi og vinkelkoeffisient (k), og Multipliser deretter med det totale volumet som følger:
        Equation 1
  4. Bestem innkapsling effektivitet i henhold til følgende formel:
    Equation 2
  5. hvor lastet protein = 10 mg, nonencapsulated protein = verdi av C innhentet i trinn 2.3.6.2.
    Merk: i dette tilfellet brukes totalt 10 mg Tarin oppløst i ammonium sulfat oppløsning (1 mg/ml) til å utføre innkapsling prosedyren, siden denne konsentrasjonen er tilstrekkelig til å oppnå tilfredsstillende in vitro-effekter13,16, 18 i år.

3. fastsettelse av størrelse og stabilitet

Merk: størrelsesfordeling og polidispersity indeks (PdI) av liposomal preparater evalueres av dynamisk lysspredning (DLS). En PdI nær 0,1 indikerer en homogen forberedelse. For stabilitet bestemmelse, lagre liposomer ved 4 ° c og sjekk størrelsesfordeling og størrelse gjennomsnitt regelmessig.

  1. Slå på DLS-utstyret 30 min før bruk for å varme opp laser lampen.
  2. Overfør den liposomal forberedelsen som ble oppnådd i trinn 1,10, til en disponibel størrelses Cuvette.
  3. Angi utstyrs parametrene på følgende måte: dispergeringsmiddel type = vann (RI = 1,33); materiale = lipider (RI = 1,45); og RT.
  4. Trykk start og vent mens utstyret fullfører lesingen.
  5. Fjern Cuvette og slå av utstyret.
    Merk: enten Overfør prøven fra Cuvette tilbake til en gangs 15 mL sentrifuge slange for senere analyser, eller kast den hvis det er tilstrekkelig mengde for nye lyder.

4. morfologiske karakterisering

Merk: liposome karakterisering utføres i henhold til Murtey og Ramasamy19. Prøver som inneholder nanoliposomes oppnådd i trinn 1,10 er fremstilt i tre eksemplarer.

  1. Fest glasset coverslips (13 mm diameter) i bunnen av en Petri parabolen med dobbeltsidig tape. Skjær tapen i små biter (passende størrelse for å fikse coverslips), Fjern det beskyttende papiret under, og fest det på undersiden av Petri parabolen. Ved hjelp av pinsett, Fjern beskyttelsespapiret på toppen av tapen og fest coverslips på den.
    Merk: Vær forsiktig i følgende trinn for ikke å løsne coverslips, og bruk en sterk tape.
  2. Coat coverslips med Poly-L-lysin. Plasser våte filter papirer inne i Petri-fatet for å opprettholde fukt og ruge for 1 time ved RT (25 ° c).
  3. Etter belegg, skyll coverslips med destillert vann.
  4. Fyll coverslips med en dråpe i prøven fra trinn 1,10 og la dem tørke i 1 time ved RT.
  5. For å fikse prøvene, dekk dem med 4% glutaraldehyde fremstilt i 0,1 M fosfat buffer, pH = 7,2. Plasser våte filter papirer inne i Petri fatet og forsegle fatet for å opprettholde fuktnivåer. Ruge ved 4 ° c for 48 h.
  6. Skyll coverslips 3x i 5 minutter med samme fosfat buffer.
  7. Tørke prøver som følger: 35% etanol 1x i 15 min, 50% etanol 1x i 15 min, 75% etanol 1x for 15 min, 95% etanol 2x for 15 min, og absolutt etanol 3x i 20 min.
  8. Kjemisk tørk av prøvene ved nedsenkning 2x i 1 − 2 mL hexamethyldisilazane (HMDS) i 10 minutter.
    Merk: HMDS skal manipuleres forsiktig inne i en avtrekksvifte. Prøvene skal få lov til å tørke over natten inne i en desikator eller inne i avtrekks panseret på RT.
  9. Monter de tørkede prøvene på en spire med en karbon ledende tape.
  10. Frese overflaten av dekkglass i et vakuum med et elektrisk ledende lag (20 NM tykkelse) av gull-Palladium.
  11. Ta opp bilder med et skanne elektronmikroskop (SEM) ved lav vakuum modus og lav spenning (20 kV).

Representative Results

Figur 1 beskriver nanoliposome forberedelse16,20,21. Fosfolipider, 1, 2-dioleoyl-sn-glyserol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino (polyetylen glykol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), og cholesterylhemisuccinate (CHEMS), den viktigste liposome bestanddeler, ble først oppløst i kloroform å få lipid filmen. Lipid filmen ble deretter rehydrert i ammonium sulfat løsning som inneholder hydrofile protein (Tarin) å være fanget, og inkubasjons ble utført over natten. Deretter ble sonikering og ekstrudering teknikker anvendes for å generere små unilamellære blemmer. Det ultracentrifugation trinnet skilte liposomal forberedelser fra gratis lipider og unencapsulated protein, mens supernatanten ble brukt til fastsettelse av effekt.

Nanoliposomes som ble produsert ved hjelp av den nevnte metodikken viste en størrelsesfordeling fra 51 − 396 NM og en gjennomsnittlig størrelse på 155 NM (tabell 2). Forberedelsene var homogen, siden polydispersitet indeksen var 0,168. En høy fast effekt på 83% kan nås hvis liposomer er ekstrudert gjennom en 0,2 μm pore størrelse membran (tabell 2).

Morfologiske nanoliposome egenskaper ble evaluert av SEM. figur 2A, B viser runde-formede liposomal blemmer i størrelsesområdet 121 NM og analysert ved 20 kv, mens figur 2C, D viser utilstrekkelig forberedt Prøver. Nanoliposomes var rett og slett luft tørket uten tidligere fiksering eller annen behandling som er beskrevet i denne studien. Som et resultat ble det observert større og skadet blemmer i området 332 μm og analysert ved 5 kV.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av nanoliposome forberedelser. DOPE, PEG, og CHEMS, den viktigste liposome bestanddeler, ble først oppløst i kloroform å få lipid film (1, 2, 3). Lipid filmen ble deretter rehydrert i en saltvann buffer som inneholder hydrofile protein (Tarin) å være fanget, og inkubasjons ble utført over natten (4). Deretter ble sonikering og ekstrudering teknikker brukes til å generere SUV (5, 6). Det ultracentrifugation trinnet skilte liposomal forberedelser fra fri lipider og unencapsulated protein, mens supernatanten ble brukt til fastsettelse av en fast effekt (7). Dette tallet er modifisert fra Correa et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Nanoliposome photomicroscopy av SEM. (A, B) Bilder av runde-formede liposomal blemmer i størrelsesområdet 121 NM og analysert ved 20 kV. (C, D) Bilder av utilstrekkelig forberedt prøver. Mishandlet prøver tillatt for observasjon av større og/eller skadet blemmer, som ikke kan motstå vakuum og/eller SPENNINGSFORHOLD ved 5 kV. Dette tallet er modifisert fra Correa et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Liposome komponenter Vekt (g) Konsentrasjon (mM) Endelig volum
Dope 0,0420 5,7 10 mL
MPEG 2000-DSPE 0,1059 3,8
CHEMS 0,0024 0,5

DOPE-1, 2-dioleoyl-sn-glyserol-3-phosphoethanolamine); MPEG 2000-DSPE-1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino (polyetylen glykol)-2000] (ammonium salt); CHEMS – cholesterylhemisuccinate.

Tabell 1: utarbeidelse av Tarin liposomal nanocapsules.

Membran pore størrelse (μm) Størrelsesfordeling (NM) Gjennomsnittlig størrelse (NM) Polydispersitet-indeks (PdI) Topp (NM) Effektiv
0,2 51-396 155 0.168 94 ± 39 0,83

Størrelse og polydispersitet indeksen ble evaluert av dynamisk lysspredning, mens innkapsling effektivitet ble fastslått i henhold til Peterson17.

Tabell 2: størrelse, polidispersity indeks og fast effekt av nanoliposome tilberedning.

Discussion

Protokollen som beskrives her ble testet av Correa et al.16 til kapsler Tarin, en immunmodulerende og antitumoral Lektiner renset fra Colocasia esculenta22. Metodikken ga vellykkede resultater, noe som åpner for produksjon av stabile nanoliposomes av passende størrelse for terapeutiske anvendelser. Formuleringen presenterer kontrollert utgivelse ved ulike pH-nivåer under fysiologiske forhold. Det er også potenserer Tarin Farmakologiske egenskaper, slik som hemming av menneskelig glioblastom U-87 MG og brystkreft MDA-MB-231 cellelinjer og stimulering av mus benmargceller. Den liposomal preparatet viste ingen toksiske effekter hos friske mus celler16.

Den klassiske metoden, først beskrevet av Bangham et al.7, tillater produksjon av store multilamellar liposome blemmer, heterogen i størrelse og form. Tilpasninger av denne metoden, som rapportert i denne studien, er med hell anvendes ved å inkludere flere trinn som sonikering og ekstrudering gjennom en 0,2 μm polykarbonat membran. Dette tillater produksjon av en mer homogen dispersjon om størrelse i nanometer området16,23,24. Derfor, for å sikre vellykkede resultater, bør innkapsling protokollen og liposomal formulering beskrevet her være strengt fulgt.

Den nanoliposome sammensetningen ble nøye utvalgt for å sikre dannelsen av en bilayer membran med DOPE, MPEG 2000-DSPE, og CHEMS som hovedbestanddeler. Disse er naturlige dyr membran bilayer bestanddeler og sistnevnte kan tildele flyt til nanoliposome arkitektur, noe som sikrer bred anvendelse for bioaktive sammensatte levering i mennesker.

Nanoliposome pegylation er avgjørende for å garantere liposome strukturstabilitet. Fraværet av PEG fører til størrelses utvidelse, en høy polydispersitet indeks, og lav Optimale resultater kan fås med DOPE som den viktigste liposome komponenten. Dette er imidlertid en høy pris fosfolipid. De finansielle kostnadene ved nanoliposome produksjon kan oppnås ved å erstatte dop med andre lignende lipider som DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). CHEMS er et kolesterol molekyl naturlig finnes i dyr cellemembraner, som ikke skal utelukkes fra formuleringen, siden det er viktig å sikre lipid bilayer flyt og malleability16.

Andre aspekter ved innkapsling protokollen kan også tilpasses. Kloroform som brukes til å oppløse de liposomal komponentene, kan enkelt skiftes ut av metanol uten noen effekt på størrelse snitt, homogenitet og effektivitet i en felle. Det kan imidlertid forekomme protein lekkasje ved oppbevaring under 4 ° c16. Den natten inkubasjons trinn med ammonium sulfat løsning som inneholder Tarin er ikke obligatorisk; Imidlertid, for bekvemmelighet den kan utført med nei skade å nanoliposomal Biofysiske kjennetegnene, innkapsling, eller stabilitet effektiv tap, idet bevist av Correa et al.16. Ekstrudering trinnet utføres ved romtemperatur, noe som kan redusere strømningshastigheten mellom sprøyter hvis en 0,1 μm pore størrelse membran brukes.

For å løse dette problemet, bruk av en 0,2 μm pore størrelse membran eller oppvarming av Ekstruder holderen over lipid overgangen temperaturen bør vurderes. Analytikeren må være forsiktig med å skade lipider eller protein som kan deaktiveres og mister biologisk aktivitet. Alternativt kan liposomal forberedelser være dialyzed mot HBS istedenfor ultracentrifugation, ved hjelp av en cut-off membran i henhold til protein molekylvekt. Valget av kjemisk natur buffer der nanoliposomes er suspendert etter ultracentrifugation er direkte relatert til den påfølgende anvendelse. Siden perspektiver av denne studien inkluderer in vivo og in vitro analyser, suspensjon i HEPES bufret saltvann var tilstrekkelig for å sikre ingen cytotoksisk effekter og en pH-område i nærheten av fysiologiske forhold.

Liposomer bør være fint behandlet, lik levende celler, for å oppnå høyere kvalitet SEM-bilder. Fiksering og tørking prosedyrer er viktig for å sikre visualisering av mindre intakt blemmer som støtter verdier høyere enn 20 kV under vakuum forhold. Figur 2 A, B viser nanosized blemmer som er kompatible med ekstrudering prosedyren. Visualisering av blemmer fra 51-396 NM er mulig hvis tilstrekkelig prøve utarbeidelse følge denne prosedyren er utført. Trinnene inkluderer fiksering, tørking ved å øke etanol konsentrasjoner, og kjemisk dehydrering for å unngå dannelse av aggregater og sprukket blemmer forårsaket av vakuum og elektron strålen. På den annen side, figur 2C, D viser liposome blemmer tørket under romtemperatur og ikke utsettes for noen behandlinger som er beskrevet her, noe som betyr at de var forberedt mangelfullt. Som et resultat av utilstrekkelig prosedyre dannes gigantiske blemmer, selv etter ekstrudering gjennom en 0,2 μm pore størrelse membran. Sprukket blemmer er også observert i begge panelene som følge av vakuum og elektronstråle skade.

Nanoliposome blemmer har blitt utforsket som en innkapsling og levering system for hydrofobe molekyler, inkludert resveratrol (3, 5, 4 '-trihydroxystilbene), en bioaktive sammensatte mot tykktarmskreft celler. Den innkapsling prosedyren kan overvinne de fattige løselighet av lipofile forbindelser i tillegg til å gi biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, ikke-immunogenisitet, og ikke-toksisitet egenskaper iboende liposome nanocapsules25. Protokoll tilpasninger må tas i betraktning avhengig av administrasjons rute og formål, for eksempel utvikling av nye liposome formuleringer for oral administrering.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for COPPE/UFRJ, Electronic mikroskopi Laboratory, og flerbruker Materials karakterisering Laboratory fasiliteter; til Dr. Adalberto Vieyra, Dr. Jennifer Lowe, og Rafael Lindoso, professorer ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, for bruk av ultracentrifuge; til Dr. Alexandre Guedes Torres og Daniel Perrone, professorer ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, for bruk av roterende fordamper; til professor Roland Bodmeier og Dr. Andriy Dashevskiy fra Freie Universität i Berlin, som bidro med ressurser, ga nye metoder, og veiledet ACNTF under en 6 måneders Erasmus +-stipend i Tyskland; til Dr. Rossana Thiré og Aline Fernandes, professor og tekniker ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, for bruk av Zetasizer Malvern; til Bluma Guenther og Taissa Rodrigues, professor og tekniker ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, for bruk av SEM; til Dr. Rachel Ann Hauser Davis, forsker ved Fundação Oswaldo Cruz, for fortellerstemme. Denne studien ble delvis finansiert av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brasil (KAPPER)-Finance Code 001 (Grant no. 1627392; 1811605); av Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant nr. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 og E-26/202.860/2016); av Conselho Nacional de Desenvolvimento Uvv e Tecnológico (CNPq) (Grant no. 406601/2018-6), og Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich Co A4418
Analitycal Ballance Mettler H10Tw Mettler Inc. 417870
Beckman DU-640 Spectrophotometer Beckman Coulter 8043-30-1090
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich Co 5470
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump Thermo Fischer Scientific 05-001-022PM
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) Sigma-Aldrich Co C6512
Chloroform Sigma-Aldrich Co 48520-U CAUTION
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) Sigma-Aldrich Co 209198
Coverslips (13mm diameter) Thermo Scientific Nunc EW-01839-00
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) Lipoid GMBH 565600.1
Ethanol Absolute Sigma-Aldrich Co 32205
Folin -Ciocalteu phenol reagent Sigma-Aldrich Co F9252
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich Co G5882
HEPES Sigma-Aldrich Co H3375
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich Co 440191 CAUTION
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope JEOL LTD
Mini Extruder 7 Avanti Polar Lipids 610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Lipoid GMBH 588200.1
Optima L-90k Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
Phosphate Buffer Sigma-Aldrich Co P3619
Poli-L-lysine Sigma-Aldrich Co P8920
Potassium L-tartrate monobasic Sigma-Aldrich Co 243531
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich Co S7795
Sodium chloride Sigma-Aldrich Co S7653
Sodium Deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich Co D6750
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich Co L3771
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich Co S8045
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich Co RES20908-A7
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope Tescan #657874
Trichloroacetic Acid (TCA) Sigma-Aldrich Co 91230
Zetasizer Nano ZSP Malvern Panalytical LTD
Ultrasonic cleaning bath model 2510 Branson

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1 (2009).
  2. Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
  3. Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
  4. Ferreira, D. dS., Lopes, S. C. dA., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
  5. Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
  6. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
  7. Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
  8. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  9. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
  10. Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
  11. Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
  12. Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
  13. Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
  14. Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
  15. Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
  16. Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471 (2019).
  17. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  18. Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240 (2018).
  19. Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. Janecek, M., Kral, R. , InTechOpen. (2016).
  20. Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
  21. dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737 (2016).
  22. Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
  23. Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
  24. Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3 (2003).
  25. Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).

Tags

Bioteknologi nanopartikler størrelse stabilitet felle effektivitet morfologiske karakterisering bioteknologi Tarin 47 kDa tetramerisk protein
Utarbeidelse og karakterisering av Nanoliposomes for å felle av bioaktive hydrofile globular proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corrêa, A. C. N. T. F.,… More

Corrêa, A. C. N. T. F., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59900, doi:10.3791/59900 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter