Summary
Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.
Abstract
De helft van alle menselijke transcripties wordt verondersteld te worden gereguleerd door microRNAs. Daarom kan het kwantificeren van de microRNA-uitdrukking onderliggende mechanismen in ziektetoestanden onthullen en therapeutische doelen en biomarkers bieden. Hier wordt gedetailleerd beschreven hoe u Microrna's nauwkeurig kwantificeren. In het kort beschrijft deze methode het isoleren van Microrna's, het ligeren ervan aan adapters die geschikt zijn voor sequentiëren met hoge doorvoer, het versterken van de eindproducten en het voorbereiden van een voorbeeld bibliotheek. Vervolgens leggen we uit hoe de verkregen sequentiëren leesbewerkingen kunnen uitlijnen op microRNA haarspelden, en kwantificeren, normaliseren en berekenen van hun differentiële uitdrukking. Veelzijdig en robuust, deze gecombineerde experimentele workflow en bio informatica analyse stelt gebruikers in staat om te beginnen met weefsel extractie en finish met microRNA kwantificering.
Introduction
Voor het eerst ontdekt in 19931, is nu geschat dat bijna 2000 Microrna's aanwezig zijn in het menselijk genoom2. Microrna's zijn kleine niet-Codeer Rna's die meestal 21-24 nucleotiden lang zijn. Het zijn posttranscriptionele regulatoren van genexpressie, vaak bindend voor complementaire locaties in de 3-onvertaalde regio (3-UTR) van doel genen om eiwit expressie te onderdrukken en mRNA te degraderen. Het kwantificeren van Microrna's kan waardevol inzicht geven in genexpressie en er zijn verschillende protocollen voor dit doel ontwikkeld3.
We hebben een gedefinieerd, reproduceerbaar en lang staand protocol ontwikkeld voor kleine RNA-sequencing en voor het analyseren van genormaliseerde leesbewerkingen met open source bioinformatica tools. Belangrijk is dat ons protocol de gelijktijdige identificatie van zowel endogene Microrna's als exogenously geleverde constructies die microRNA-achtige soorten produceren mogelijk maakt, terwijl leest die naar andere kleine RNA-soorten, waaronder ribosomale Rna's ( rRNAs), overdracht van RNA-afgeleide kleine Rna's (Tsrna's), herhaald afgeleide kleine Rna's, en mRNA afbraakproducten. Gelukkig zijn microrna's 5-fosforyleerd en 2-3 gehydroxyleerde4, een functie die kan worden gebruikt om ze te scheiden van deze andere kleine rna's en mRNA afbraakproducten. Er bestaan verschillende commerciële opties voor het klonen en sequentiëren van microRNA die vaak sneller en gemakkelijker te multiplex zijn; echter, de gepatenteerde aard van Kit reagentia en hun frequente modificaties maakt het vergelijken van monster runs uitdagend. Onze strategie optimaliseert het verzamelen van alleen de juiste grootte van Microrna's door middel van acrylamide en agarose gel zuiveringsstappen. In dit protocol beschrijven we ook een procedure voor het uitlijnen van sequentie lezen op microRNAs met behulp van open source tools. Deze set instructies zal vooral nuttig zijn voor beginnende informatica gebruikers, ongeacht of onze bibliotheek bereidingsmethode of een commerciële methode wordt gebruikt.
Dit protocol is gebruikt in verschillende gepubliceerde studies. Het werd bijvoorbeeld gebruikt om het mechanisme te identificeren waarmee het dicer-enzym kleine haarspeld Rna's op een afstand van twee nucleotiden uit de interne lus van de stuurlus structuur-de zogenoemde "lustellings regel"5. We volgden ook deze methoden om de relatieve overvloed van geleverde kleine haarspeld Rna's (shRNA) te identificeren, uitgedrukt uit recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAVs), om de drempel van shRNA-expressie te identificeren die voorafgaand aan de lever kan worden getolereerd toxiciteit die gepaard gaat met overmatige shRNA-expressie6. Met dit protocol identificeerden we ook Microrna's in de lever die reageren op de afwezigheid van microRNA-122-een sterk uitgedrukt hepatisch microRNA-terwijl het afbraak patroon van deze microRNA7ook kenmerkend is. Omdat we ons protocol consequent in tal van experimenten hebben gebruikt, hebben we de voorbereidingen in de lengterichting in de lengterichting kunnen observeren en zien dat er geen waarneembare batch-effecten zijn.
Bij het delen van dit protocol is het ons doel om gebruikers in staat te stellen hoge kwaliteit, reproduceerbare kwantificering van Microrna's te genereren in vrijwel elke weefsel-of cellijn, met behulp van betaalbaar materiaal en reagentia, en gratis bioinformatica tools.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Washington.
Kleine RNA bibliotheek voorbereiding
1. RNA-isolatie
- Isoleer RNA van een biologische bron met behulp van een standaard RNA-isolatie reagens of een kit die verrijkt wordt voor Microrna's. Voor weefsels, het is het beste om te beginnen met monsters snap-bevroren in vloeibare stikstof en gemalen tot een poeder met behulp van een voorgekoelde mortel en stamper.
- Meet de RNA-integriteit van elk monster op een instrument dat RNA kan kwantificeren en een RNA-integriteits nummer (RIN) verschaft. RINs moet worden > 7.
2.3 ' ligatie van de adapter
- Maak een ligatie reactie in PCR-strip buisjes door te combineren: 11 μL RNA (1-3 μg, met dezelfde hoeveelheid voor elk monster), 1,5 μL van 10x T4 RNA ligase-reactiebuffer, ATP-vrij, 1 μL polyethyleen glycol (PEG) en 0,5 μL van 3 '-linker (100 μM universeel miRNA-kloon Lin ker).
Opmerking: de afwezigheid van ATP helpt bij het verrijken van miRNAs en minimaliseert het klonen van mRNA afbraakproducten. PEG fungeert als een moleculaire verdringing agent, verbetering van de succesvolle ligatie. De universele miRNA klonen linker heeft een 3 ' blokkerende groep (amine) om te voorkomen dat zelf-ligatie, circularisatie, en ligatie aan RNA op het einde van de 5 '. - Verwarm de monsters bij 95 °C op een Thermocycler voor 30-40 s. koel op ijs gedurende 1 minuut. Voeg 1 μL T4 RNA ligase 2 toe en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. bereid de gel (stap 2,3) terwijl de monsters inbroed.
Opmerking: incubatie bij kamertemperatuur helpt voorkomen dat linker-linker ligatie. We hebben ook met succes gebruikt T4 RNA ligase 1. - Bereid 30 mL van een 15% polyacrylamidegel met 8 M ureum (voor een gel van 20 cm): 14,4 g ureum, 3 mL 10x tris-gebufferd ethyleendiaminetetraazijnzuur (TBE), 11,2 mL 40% 19:1 acrylamide en H2O tot 30 ml. Oplossing wordt het beste opgelost bij 42 °C. Voeg onmiddellijk vóór het gieten 150 μL van 10% ammonium persulfaat (APS) en 30 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe voor polymerisatie.
- Giet tussen 0,8 mm gescheiden glazen platen in een kunststof gegoten en insert kam. Zodra de gel is gestijgd (ongeveer 20 min), Voeg 0,5 x TBE toe aan de tank en spoel de putten van residueel ureum door krachtig te pipetteren.
- Pre-run de gel op een constante 375 V gedurende 25 minuten zonder monsters, zodat ureum de gel kan binnengaan, en vervolgens de putten opnieuw wassen.
Opmerking: de hoeveelheid spanning moet mogelijk worden verlaagd, afhankelijk van het type voeding en het elektroforese systeem dat wordt gebruikt. - Nadat de monsters zijn afgelend, voegt u 15 μL acrylamide-laad kleurstof toe aan de monsters (voor een verhouding van 1:1) en denatureert u 5 min bij 95 °C op een Thermocycler.
- Bereid 25 ng/μL van 37 en 44 BP grootte markers, verdund met één deel acrylamide laad kleurstof. Reeksen worden weergegeven in tabel 1.
- Laad de monsters op de polyacrylamidegel en laat ten minste één rijstrook tussen elk monster. Laad 20 μL van ten minste twee sets markers, in een asymmetrisch patroon om de geloriëntatie te volgen.
- Voer de gel op een constante 375 V voor de eerste 15 min en vervolgens te verhogen tot een constante 425 V voor de resterende run. Lopen tot broomfenolblauw is ongeveer 1-4 cm van de bodem, die ongeveer 2 uur duurt.
Opmerking: indien nodig kan de gel gedurende langere tijd met een lagere constante spanning worden uitgevoerd totdat de broomfenolblauw ongeveer 1-4 cm van de bodem is. - Verwijder de gel van de glasplaten met behulp van een plaat separator en plaats de gel op een plastic pagina beschermer. Verdun 5 μL ethidiumbromide bromide in 500 μL gedistilleerd water en Pipetteer de markerings stroken net boven de bovenste licht blauwe marker (Zie Figuur 1a).
Let op: gebruik handschoenen voor ethidiumbromide bromide en gooi afval weg in overeenstemming met de lokale regelgeving. Laat zitten voor 5 min. - Snijd onder ultraviolet (UV) licht de gels van de bovenste naar de onderste marker in elke rijstrook met schoon scheermesje (Zie Figuur 1a). Breng over naar een 4 x 4 cm vierkant van een laboratorium afdichtings film, snijd vervolgens de gel met ongeveer 4 sneden horizontaal en 3 verticaal om 12 kleine vierkantjes te produceren (Zie Figuur 1b).
- Pipetteer 400 μL van 0,3 M NaCl op de afdichtings film vierkante en trechter stukjes in 1,5 mL Gesiliconiseerde buizen (Zie figuur 1c). De monsters op een nutator bij 4 °C 's nachts agiteren.
Opmerking: andere buizen met lage retentie 1,5 mL kunnen worden vervangen door Gesiliconiseerde buizen. - Na ten minste 12 h van agitatie bij 4 ° c, haalt u de monsters op en zet ze op ijs, samen met een conische buis van 100% ethanol.
- Breng 400 μL supernatant over naar een nieuwe buis en voeg vervolgens 1 mL 100% ethanol en 1 μL van 15 mg/mL glycogeen coprecipitant toe. Zorg ervoor om zoveel mogelijk supernatant te verzamelen, te draaien bij 4 °C en meer te pipetteren indien nodig. Plaats bij-80 °C gedurende 1 uur of-20 °C gedurende 2 uur of langer. Glycogeen coprecipitant verbetert de zichtbaarheid en het herstel van pellets.
- Spin bij 4 °C bij 17.000 x g gedurende 20-30 min. Verwijder alle sporen van ethanol en laat de pellet lucht drogen gedurende 5 min.
3.5 ' linker ligatie
- De pellet opnieuw opschorten door pipetteren in 6,5 μL Nuclease-vrij water. De pellet in water te laten zitten voor een paar minuten zal eerst helpen met re-suspensie.
- Na het draaien van de pellet en het resuspenseren in water, Voeg 0,5 μL van 100 μM 5 '-linker (met streepjescodes; Zie tabel 1), 1 ΜL T4 RNA ligase buffer, 1 μl van 10 mm ATP en 1 μl peg. Verwarm bij 90 °C gedurende 30 sec., plaats dan op ijs. Voeg 1 μL T4 RNA ligase 1 toe en laat 2 uur inbroeren bij kamertemperatuur.
- Voeg 400 μL 0,3 M NaCl toe, gevolgd door 400 μL zuur fenol/chloroform. Vortex 30 s-1 min (oplossing zal er bewolkt uitzien), en vervolgens draaien bij 4 °C gedurende 10-15 min bij maximale snelheid in een micro centrifuge (~ 17.000 x g). Trek de bovenste laag en plaats in nieuwe 1,5 mL buis.
Opmerking: Vermijd pipetteren van de onderste laag. - Voeg 350 μL chloroform toe, Vortex kort, en draai vervolgens bij 4 °C gedurende 10 min bij maximale snelheid (~ 17.000 x g). Trek de bovenkant later en plaats in nieuwe 1,5 mL buis. Voeg 1,5 μL glycogeen coprecipitant en 1 mL 100% ethanol toe.
Opmerking: Vermijd nogmaals pipetteren van de onderste laag. - Vortex kort, plaats dan bij-80 °C gedurende ten minste 1 uur, of-20 °C 's nachts.
4. omgekeerde transcriptie (RT)
- Schakel het hitte blok van 42 °C in. Draai de monsters bij 4 °C en ~ 17.000 x g gedurende 20-30 min. Verwijder alle supernatant en laat de pellet lucht drogen gedurende 5 min.
- Herstel het gepelleteerde monster opnieuw in 8,25 μL Nuclease vrij water en voeg toe: 0,5 μL van 100 μM RT primer (tabel 1) en 5 ΜL 2x RT-reactie mix van een cDNA-synthese pakket. Incuberen bij 42 °C gedurende 3 min.
- Voeg 1,5 μL 10x RT-enzym toe aan elk monster en inincuberen bij 42 °C gedurende 30 minuten in een Thermocycler. Plaats bij-20 °C of ga verder met hydrolyse en neutralisatie.
Opmerking: verschillende RT-kits kunnen worden gebruikt voor stappen 4,2 en 4,3. - Alkalische hydrolyse en neutralisatie uitvoeren: Maak 1 mL van 150 mM kaliumhydroxide (KOH)-oplossing (150 μL van 1 M KOH, 20 μL van 1 M Tris-basis pH 7,5 en 830 μL H2O) en 1 ml zoutzuur van 150 mm (HCL) (150 μl van 1 m HCl en 850 μl van H2O).
- Voordat u aan de voorbeelden toevoegt, bepaalt u de hoeveelheid HCl die nodig is om de KOH-oplossing te neutraliseren. Over het algemeen neutraliseert ongeveer 20-24 μL HCl de 25 μL KOH. Controleer de combinatie op een pH-strip om ervoor te zorgen dat deze zich in het juiste bereik bevindt (pH 7,0 tot 9,5).
- Hydrolyseer de monsters door 25 μL van 150 mM KOH-oplossing toe te voegen en gedurende 10 minuten bij 95 °C te inbroeren.
- Neutraliseer de monsters door de in stap 4,4 bepaalde hoeveelheid van 150 mM HCl toe te voegen om een eindmonster pH tussen 7,0 en 9,5 te verkrijgen.
5. PCR-versterking
- Bereid na neutralisatie een PCR-reactie met: 29,5 μL water, 5 μL 10x Taq-buffer, 1 μL dNTP, 2 μL 25 μM voorwaartse primer (tabel 1), 2 μl van 25 μm omgekeerde primer (tabel 1), 0,5 μL Taq, en 10 μL van het omgekeerde getranscribeerd cdna uit stap 4,6 .
- Voer de volgende PCR-reactie uit: 94 °C gedurende 2 minuten en vervolgens 20 cycli van 94 °C voor 45 s, 50 °C voor 75 s en 72 °C voor 60 s.
- Voer een tweede PCR-reactie uit van ongeveer 2-4 meer cycli met 5 μL product uit stap 5,2. Mengsel: 34,8 μL water, 5 μL 10x Taq-buffer, 1 μL dNTP, 1 μL van 25 μM voorwaartse primer (tabel 1), 1 μl van 25 μm omgekeerde primer (tabel 1) en 0,2 μL Taq polymerase. Volg dezelfde Thermocycler parameters zoals beschreven in stap 5,2.
Opmerking: het doel van het doen van twee PCR-reacties – met de eerste voor 20 cycli en de tweede voor slechts 2-4 meer – is om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid cDNA versterkt in een dynamisch bereik is (d.w.z. geen verzadigde hoeveelheid).
6. agarose gel zuivering
- Bereid een 4% agarose gel met laagsmeltende agarose. Laad 40 μL of meer van het PCR-product op de gel en laad kleurstof. Laad 100 BP en 25 BP-formaat markeringen.
Opmerking: de 25 BP ladder helpt om versterkt product van linker-linker ligatie producten te onderscheiden. Low-smeltende agarose gels moeten met meer zorg worden gegoten dan traditionele agarose gels, dus volg de instructies van de fabrikant op de voet. - Voor gel-extractie selecteert u het cyclusnummer dat zichtbaar is op de gel, maar niet verzadigd (gewoonlijk 22 – 24 cycli). Kies soortgelijke intensiteit bands bij het uitvoeren van meerdere samples.
- Snijd de band die boven de 125 BP band (de donkerdere band op 25 BP ladder; Zie figuur 1d). Volg met behulp van een gel extraction Kit de instructies van de fabrikant voor het toevoegen van een buffer op basis van een 4% gel en schud vervolgens om agarose in buffer bij kamertemperatuur op te lossen.
Opmerking: oplossen op 55 ° c verhoogt de mogelijkheid voor linker-linker ligatie. - Volg de instructies voor de gel-extractie van de fabrikant en elueer in 30 μL elzen-of waterbuffer. Als het product er zwak uitzag op de gel, Reduceer dan de elutie tot 20 μL.
- Meet de cDNA-concentratie met behulp van een gevoelige techniek en bereid de Sample Library voor op sequencing. De voorbereiding zal afhangen van het type sequencing dat wordt gebruikt.
Opmerking: minimum vereisten voor een sequentiebibliotheek zijn meestal een 10 μL-volume van 10 μM product. Als de concentraties te laag zijn, nemen pool-en ethanol monsters neer om de bibliotheek naar de gewenste concentratie te brengen. - Volg de voorbeelden met behulp van de beschikbare apparatuur. Een veelvoorkomend voorbeeld zou zijn om samples uit te voeren met behulp van een Kit voor 50 BP single leest, om ongeveer 15-25 miljoen leesbewerkingen in een FASTQ-uitvoerformaat te verkrijgen.
Kleine RNA sequentie uitlijning en bio-informatica
7. uploaden van gegevens
- Download FASTQ-bestanden gegenereerd op basis van elke sequentiëren uitvoeren. Download een lijst van microRNA haarspeld sequenties uit miRbase.org8,9,10.
- Genereer een Galaxy-account op www.usegalaxy.org en upload een FASTQ-bestand van Sequence-leesbewerkingen naar dit account.
- Upload een tekstbestand met barcode sequenties naar het Galaxy-account, zoals barcodes. txt, dat beschikbaar is als tekstbestand (aanvullende tabel 1).
- Upload een FASTA bestand van microRNA haarspelden naar de Galaxy account uit een database zoals miRBase.org. Voorbeelden van muizen (mousehairpins. FA) of humane (humanhairpins. FA) microRNA-precursoren zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 2 en in de aanvullende tabel 3.
8. verwijderen van de adapter, barcode sortering en trimmen
- Navigeer in het linkertabblad naar genomic-bestands manipulatie > FASTA/FASTQ ≫ clip adapter sequenties.
- Voer in het invoerbestand in de FASTA-of FASTQ-indelingfastq-bestand in de vervolgkeuzelijst in. Wijzig de minimale sequentie lengte in 18. Wijzig de bron om een aangepaste reeks in te voeren. Voer Ctgtaggcin. Alle andere standaardparameters behouden. Klik op uitvoeren.
Opmerking: sequentie leesbewerkingen die korter zijn dan 18 nucleotiden zijn moeilijk in te stellen op een unieke wijze aan Microrna's en bevatten veel afbraakproducten. - Navigeer in het linkertabblad naar genomic-bestands manipulatie > FASTA/FASTQ ≫ barcode splitter.
Opmerking: Galaxy functies en headers worden periodiek bijgewerkt, dus de zoekfunctie kan nodig zijn om een gelijkwaardig hulpmiddel of de locatie ervan te vinden. Commerciële kits met behulp van geïndexeerde primers zijn vaak al gesorteerd op streepjescode. Daarom zijn deze stap en de streepjescode trim stap niet nodig als u begint met een commerciële Kit. - Voor het gebruik van barcodeswijst u barcodes. txtaan. Voor bibliotheek om te splitsen, gebruikt u clip op gegevens bestand dat in de vorige stap is geproduceerd. Voer 1in het aantal toegestane mismatchesin. Klik op uitvoeren.
- Trim de eerste 4 nucleotiden: Navigeer naar tekst manipulaties > voorloop-of volg tekens bijsnijden. Voor invoergegevensset, klikt u op het mappictogram, dit is een verzameling van de gegevensset. Selecteer het batchbestand met de voorbeelden, waaronder de barcode splitter op gegevens. Voer in Trim vanaf het begin tot aan deze positie 5in. In is invoergegevensset in FASTQ-formaat? Voer Jain. Klik op uitvoeren. De uitvoering kan enkele minuten duren.
9. uitlijning van leesbewerkingen op microRNAs
- Navigeer in Galaxy naar Genomics Analysis > RNA-Seq ≫ zeilvis transcriptie kwantificering11.
- Voor de vraag Selecteer een referentie transcriptome uit uw geschiedenis of gebruik een ingebouwde index? Selecteer gebruik een van de geschiedenis. Voer het geüploade bestand mousehairpins. FA uit de vervolgkeuzelijst in. Klik in het bestand FASTA/Q op het mappictogram om een DataSet-verzameling te gebruiken en selecteer het bestand met Trim bij verzameling. Klik op uitvoeren. De uitvoering kan enkele minuten duren.
- Klik in het tabblad geschiedenis aan de rechterkant op Sailfish on Collection... dit is een lijst met 19 items. Klik op elk afzonderlijk bestand en klik op het schijfpictogram om op te slaan op de lokale computer. Afzonderlijk gedownloade bestanden moeten eerst worden gedecomprimeerd. Ze moeten mogelijk ook opnieuw worden opgeslagen met de extensie. txt voor het importeren in een spreadsheet.
- Open elk werkbladbestand in en geef de kolom Numlees opnieuw een naam aan de behandelings voorwaarde. Voeg de kolommen samen om een matrix van microRNAs te genereren in de eerste kolom en lees aantallen per voorwaarde in volgende kolommen.
- Als u voor elke behandelings voorwaarde differentieel uitgedrukt Microrna's wilt berekenen, gebruikt u het bestand met onbewerkte microRNA-Lees tellingen als invoer voor Programma's zoals DESeq212. DESeq2 is aanwezig in Galaxy in de Genomics analyse > RNA-seq > tab DESeq2 .
- Onbewerkte leesbewerkingen converteren naar genormaliseerde microRNA lezen tellingen. Tellingen worden genormaliseerd naar de diepte van de bibliotheek volgorde van de bibliotheek via de volgende berekening: [(onbewerkte Lees-/totaal-microRNA-leesbewerkingen) * (1.000.000 – aantal Microrna's geteld) + 1].
Opmerking: deze berekening biedt een genormaliseerde leesbewerkingen per miljoen (RPM) toegewezen Microrna's die kunnen worden vergeleken tussen gegevenssets en biologische omstandigheden. De uitvoer is een door tabs gescheiden bestand. Sailfish biedt een TPM -uitvoerkolom, hoewel deze waarde wordt genormaliseerd door microRNA haarspeld lengte, die in deze context niet nodig is. - Indien relevant, herhaalt u de uitlijning met aangepaste invoer reeksen (bijvoorbeeld een vector) om leesbewerkingen te identificeren die worden gekoppeld aan geleverde constructies, zoals shRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schematische voorstelling van stappen bij de voorbereiding van bibliotheken
Een algemene schematische voorstelling van kleine RNA-extractie,-sequencing en-uitlijning wordt beschreven in Figuur 2.
Lever monsters van een mannelijke en een vrouwelijke muis werden verzameld en snap bevroren in vloeibare stikstof. Totaal RNA werd geëxtraheerd en geëvalueerd op kwaliteit en concentratie.
Kleine RNA-sequencing levert voldoende RNA op voor sequencing
3 μg RNA van twee onafhankelijke RNA extracties werden gebruikt als uitgangsmateriaal voor kleine RNA-sequencing. Monsters werden uitgevoerd op een acrylamidegel en afgesneden tussen grootte markeringen overeenkomend met 17-28 NT van RNA (Figuur 1a). Monsters werden in fragmenten gesneden voor RNA-isolatie (Figuur 1b) en overgebracht naar een lageretentie 1,5 ml centrifugebuis (figuur 1c). Barcodes bc7 en bc17 (tabel 1) werden aan het 5 ' uiteinde van het kleine RNA geligd. Kleine RNA-bibliotheken waren PCR-versterkt met 22 cycli PCR om respectievelijk 8,0 en 11,2 ng/μL product te leveren. Monsters werden samengevoegd en een 10 nM samengevoegd monster werd ingediend voor sequentiëren met hoge doorvoer met behulp van een 50 BP Lees lengte.
MiR-122 is de meest voorkomende microRNA in de lever van de muis
Na het sorteren van de streepjescode bevat 851.931 Lees streepjescodes uit lever monster 1 en 650.154 uit lever monster 2. Van de leesbewerkingen, respectievelijk 83,5% en 90,0% toegewezen aan microRNAs, met de resterende leesbewerkingen naar rRNAs (respectievelijk 1,8% en 0,6%), Trna's en mRNA afbraak fragmenten. Na uitlijning op humane microRNA haarspelden, we waargenomen sterke concordantie tussen microRNA lezen tellingen in elke replicaat (R2 = 0,998; Figuur 3). In totaal werden 306 microRNA-soorten aangetroffen, met het grootste aantal leesbewerkingen voor miR-122 (aanvullende tabel 4). De abundantie van MicroRNA was vergelijkbaar tussen mannelijke en vrouwelijke lever monsters.
Figuur 1. Extractie van kleine Rna's uit een acrylamidegel. A) acrylamidegel eneengebied dat is geknipt dat overeenkomt met de grootte van Microrna's. B) gelstukken voor en na snijden in kleinere fragmenten. C) proces voor het overbrengen van gelfragmenten in Gesiliconiseerde buizen. D) PCR-reactie op laag smelt agarose-gel die het juiste gekloonde product aantoont in vergelijking met het linker linker product en onverzadigde (22 cycli) versus verzadigde (24 cycli) monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Schematische voorstelling van protocol. Een tijdlijn die de belangrijkste stappen van de procedure weergeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Reproduceerbaarheid van de resultaten van twee onafhankelijke RNA-extracties. Scatterplot van microRNA lezen tellingen van een mannelijke muis lever (x-as) in vergelijking met een vrouwelijke muis lever (y-as) met behulp van een op log10 gebaseerde schaal. Elk punt vertegenwoordigt het aantal leesbewerkingen per miljoen (RPM) toegewezen microRNA-telling voor elke afzonderlijke microRNA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Primer | Volgorde | |
| 3 ' linker 1 | rAppCTGTAGGCACCATCAAT – NH2 | |
| markering kleiner formaat | rArUrCrGrCrArUrGrCrUrGrArCrGrUrArCrUrArGGTAACCGCATCATGCGTC | |
| bovenste maat markering | rArArUrCrArGrCrGrGrArUrUrGrCrArUrGrArArCrGrUrArCrArUrArGGTAACCGCATCATGCGTC | |
| barcode1 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArGrCrG | |
| barcode2 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrGrUrC | |
| barcode3 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrUrGrG | |
| barcode4 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArCrUrU | |
| barcode5 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrGrGrU | |
| barcode6 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrUrA | |
| barcode7 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrArUrG | |
| barcode8 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrGrC | |
| barcode9 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrCrArG | |
| barcode10 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrArC | |
| barcode11 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrUrCrU | |
| barcode12 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrArArU | |
| barcode13 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArArGrA | |
| barcode14 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrArA | |
| barcode15 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrGrG | |
| barcode16 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrUrG | |
| barcode17 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrArU | |
| barcode18 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrArU | |
| RT primer | EEN van de meest | |
| PCR primer F | Een van de weinige van de GEKKEN-en/of het is een... | |
| PCR primer R | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG | |
Tabel 1. Lijst van primers.
Aanvullende tabel 1. Lijst met streepjescode reeksen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2. Samengestelde lijst met muis microRNA precursor sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 3. Samengestelde lijst van menselijke microRNA precursor sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 4. Onbewerkte en genormaliseerde microRNA lezen tellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de identificatie van microRNAs meer dan 20 jaar geleden13, blijft het proces van microRNA-sequencing bewerkelijk en vereist gespecialiseerde apparatuur, waardoor laboratoria worden gehinderd om routinematig in-House protocollen14te hanteren. Andere technieken kunnen gelijktijdig Microrna's evalueren, zoals microRNA micro arrays en Multiplexed expressie panelen; deze benaderingen zijn echter beperkt omdat ze alleen de microRNAs in hun testset kwantificeren. Hierdoor missen ze belangrijke kenmerken van kleine RNA-sequencing, zoals de identificatie van nieuwe microrna's, en van microRNA-isovormen-nucleoside veranderingen die belangrijke biologische functie kunnen hebben6,7,15 .
Bij het starten van een nieuw experiment is het gebruik van een commerciële leverancier vaak het gemakkelijkst omdat ze technische ondersteuning en gebruiksgemak bieden. Er zijn verschillende commerciële opties beschikbaar voor microRNA-sequencing, die Multiplexed kunnen zijn om de workload te reduceren bij het verwerken van grote aantallen (> 100) van samples. Deze commerciële kits worden voortdurend verbeterd, wat zowel een voordeel als een nadeel is. Aan de ene kant hebben de bedrijven die deze kits maken nieuwe microRNA Capture-methoden ontwikkeld, bijvoorbeeld door circularisatie van hun 5-en 3-uiteinden voorafgaand aan de sequencing of het gebruik van ontaarde linkers met willekeurige sequenties aan elk uiteinde om ligatie bias te verminderen. Ze hebben ook methoden ontwikkeld om adapter-dimers te verwijderen, bijvoorbeeld door ligatie van dubbel-streng adapters of hybridisatie van aanvullende oligonucleotiden. Aan de andere kant, commerciële kits aanbevelen tegen wijziging of wijziging van een stap. Daarom, als er updates aan een kit worden gedaan, is het moeilijk of onmogelijk om gegevens afgeleid van oude en nieuwe versies van kits te vergelijken, evenals gegevens die zijn afgeleid van kits van verschillende commerciële leveranciers. Hier hebben we een protocol beschreven dat kracht heeft in het gezicht van commerciële alternatieven. Onze focus op gel zuivering stappen-terwijl ze tijd toevoegen aan het protocol-maakt consistente microRNA Capture en reproduceerbaarheid in de vele jaren die we hebben gebruikt. Verschillende evaluaties van de reproduceerbaarheid tussen commerciële kits en in-House protocollen zijn gemaakt, en we verwijzen de lezer naar een paar van deze studies16,17,18,19. Belangrijk is dat de stappen die we schetsen voor bioinformatica analyse van Microrna's kunnen worden gebruikt, ongeacht de keuze van de kit of in-House protocol.
MicroRNA-sequencing is vaak problematisch door de keuze van barcodes: in sommige gevallen is de ligatie-efficiëntie van de verschillende barcodes mogelijk niet gelijkwaardig, wat leidt tot partijdige verdelingen van sequenties in de monsters20. Het wordt nu aanbevolen om ontaarde basen op het 5-en 3-uiteinde te gebruiken om ligatie-vooroordelen van specifieke microRNAs21,22te minimaliseren. In dit protocol hebben we deze ligatie problemen niet waargenomen en hebben we consistente uitlezingen waargenomen voor technische en biologische replicaten geëvalueerd met verschillende barcodes5,6,7,23, maar het is belangrijk om zich bewust te zijn van hen. Methoden om ligatie bias te voorkomen omvatten de opname van index primers in de PCR-primers, of om een of meer willekeurige RNA-nucleosiden toe te voegen aan het 3-uiteinde van de 5-adaptersequentie (tabel 1). Introductie van een of meer synthetische Spike-in RNA, zoals de C. elegans miR-39 microRNA24, is ook een optie voor normalisatie doeleinden, die van cruciaal belang is voor situaties met lage opbrengst, zoals het kwantificeren van microrna's van exosomes. Evenzo, voor RNA ligatie, we hebben met succes gebruikt T4 RNA ligase 1, maar ligatie met minder bias is aangetoond voor een afgeknotte vorm van T4 RNA ligase 225. Tot slot zijn superscript III en IV alternatieve reverse transcriptie enzymen die we zonder probleem hebben gebruikt.
De keuze van de microRNA-database kan ook de uiteindelijke genormaliseerde resultaten beïnvloeden. Een uitdaging bij het samen hebben van microRNA-databases is dat verschillende nieuwe kleine Rna's die als microRNAs worden vermeld, eigenlijk fragmenten zijn van herhaalde elementen en niet bonafide microRNAs2. Er zijn inspanningen geleverd om Microrna's met pensioen te laten die niet aan de standaardcriteria voldoen, zodat de volgende versie van een microRNA-database verfijnder wordt; de volgende iteratie bevat echter ook nieuwe kandidaten die een bevestiging nodig hebben. Wanneer herhaalde Microrna's worden opgenomen in overeenstemmingen, kunnen ze de resultaten scheeftrekken en gegevens van bestaande Microrna's overwelven. Daarom is het gebruik van goed samengestelde datasets van microrna's van verschillende soorten essentieel26,27. We hebben de grootste reproduceerbaarheid ervaren bij het uitlijnen van kleine RNA-sequentiëren leest naar samengestelde lijsten van geconmaste Microrna's en hebben deze haarspelden opgenomen in aanvullende tabel 2 en aanvullende tabel 3. Deze lijsten komen overeen met schattingen van ongeveer 500 hoog vertrouwen microrna's in het menselijk genoom2,26.
Zoals met elke techniek, resultaten moeten worden bevestigd met een orthogonale aanpak. We hebben met succes kleine RNA-sequentie resultaten gereproduceerd met kleine RNA-noordelijke blots die van-sondes bevatten om de grootte en relatieve overvloed van kandidaat-microRNAs6,7,23te bevestigen. Kwantitatieve PCR van Microrna's met behulp van Split-Read sequencing en bevestiging van target mRNA wijzigingen met qPCR en Western blotting zijn andere opties voor validatie.
Samenvattend hebben we een methode opgegeven om Microrna's te isoleren en te sequenties en om overeenstemmingen uit te voeren met bestaande microRNA-databases. De betaalbaarheid van de reagentia en apparatuur en het gebruik van open source tools voor analyse moeten dit protocol voor iedereen toegankelijk maken. Tot slot kan dit protocol in elke weefsel-of cellijn worden gebruikt om zeer reproduceerbare, kwalitatief hoogstaande leesbewerkingen te leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen de leden van de laboratoria van Andrew Fire en Mark Kay bedanken voor hun begeleiding en suggesties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
