Summary
כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.
Abstract
חצי מכל התעתיקים האנושיים נחשבים למווסתים על ידי מיקרו-נאס. לפיכך, ביטוי המונח מיקרואורנה יכול לחשוף את המנגנונים הבסיסיים במצבי מחלה ולספק מטרות טיפוליות וביטויים. כאן, אנו מפרטים כיצד לכמת במדויק microRNAs. בקצרה, שיטה זו מתארת את הבידוד של microRNAs, מחברת אותם למתאמים המתאימים לרצפי התפוקה הגבוהה, מגביר את המוצרים הסופיים ומכינים ספריה לדוגמה. לאחר מכן נסביר כיצד ליישר את הרצף המתקבל לסיכות השיער, ולכמת, לנרמל ולחשב את הביטוי הדיפרנציאלי שלהם. מגוונת ואיתנה, תהליך העבודה הניסיוני המשולב וניתוח ביולוגי מאפשר למשתמשים להתחיל בהפקת רקמות ולסיים עם כימות הכמת של מיקרואורנה.
Introduction
התגלה לראשונה ב 19931, כעת מוערך כי כמעט 2000 microRNAs נמצאים בגנום האדם2. MicroRNAs הם קטנים שאינם קידוד RNAs כי הם בדרך כלל 21-24 נוקלאוטידים ארוך. הם הרגולטורים לאחר ההמרה של ביטוי גנים, לעתים קרובות מחייב לאתרים המשלימים באזור 3-untranslated (3-UTR) של גנים היעד כדי לדכא את הביטוי חלבון לבזות mRNA. כימות מיקרו-משתמשים יכולים לתת תובנה רבת ערך לביטוי גנים ופרוטוקולים מספר פותחו למטרה זו3.
פיתחנו פרוטוקול מוגדר, מיובן וארוך לרצפי RNA קטנים, ולניתוח קריאות מנורמלות באמצעות כלים ביואינפורמטיקה בקוד פתוח. חשוב מכך, הפרוטוקול שלנו מאפשר את הזיהוי הסימולטני של שני המבנים האנדוגניים והמוצרים שנמסרו באופן שונה המייצרים מינים של מיקרוני אורנה, בעוד הפחתת קריאות המפה למיני RNA קטנים אחרים, כולל RNAs ( rRNAs), העברת מוצרים קטנים (tsRNAs) מתוצרת RNA, מוצרי השפלה קטנים והשפלות של mRNA. למרבה המזל, microRNAs הם 5-זרחליום ו-2-3 הphosphorylated4, תכונה זה יכול להיות ממונפת כדי להפריד אותם ממוצרי rnas קטנים אחרים mrna השפלה. מספר אפשרויות מסחריות קיימות עבור שיבוט ורצפי מיקרואורנה, שלעיתים קרובות מהיר וקל יותר לקולנוע; עם זאת, האופי הקנייני של ריאגנטים קיט ושינויים תכופים שלהם עושה השוואת מדגם פועל מאתגרת. האסטרטגיה שלנו ממטבת איסוף רק את הגודל הנכון של microRNAs באמצעות אקרילide ו agarose ג'ל שלבי הטיהור. בפרוטוקול זה, אנו מתארים גם פרוצדורה ליישור קריאות רצף ל-microRNAs באמצעות כלי קוד פתוח. קבוצה זו של הוראות תהיה שימושית במיוחד עבור משתמשי אינפורמטיקה מתחילים, בין אם שיטת ההכנה של הספרייה שלנו או שיטה מסחרית משמש.
פרוטוקול זה נעשה בשימוש במספר מחקרים שפורסמו. לדוגמה, הוא שימש כדי לזהות את המנגנון שעליו האנזים Dicer משאיר הקטן RNAs במרחק של שני נוקלאוטידים מן הלולאה הפנימית של מבנה לולאה גזע-כביכול "החוק ספירת לולאה"5. אנו גם בעקבות שיטות אלה כדי לזהות את השפע היחסי של משלוח RNAs קטן (מרין) הביע רקומביננטי adeno-וקטורים ויראליים הקשורים (rAAVs), כדי לזהות את הסף של ביטוי מרין כי יכול להיות נסבל לפני הכבד רעילות הקשורה בביטוי שרין עודף6. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו גם את מיקרו-מיקרונאס בכבד המגיבים להיעדר מיקרו-ארנה-122-מיקרומין הכבד מתבטאת במידה רבה, תוך שהיא גם מתכונת השפלה של מיקרוארנה7. מכיוון שאנחנו השתמשנו בפרוטוקול שלנו בעקביות בניסויים רבים, היינו מסוגלים להתבונן בlongitudinally ההכנות למדגם, ולראות שאין תופעות אצווה ניכרת.
בשיתוף פרוטוקול זה, המטרה שלנו היא לאפשר למשתמשים לייצר באיכות גבוהה, כימות הזדהות של Mic, כמעט כל רקמה או קו התא, באמצעות ציוד במחיר סביר, ריאגנטים, וכלים ביואינפורמטיקה חופשית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת וושינגטון.
הכנה לספריית RNA קטנה
1. בידוד RNA
- לבודד RNA ממקור ביולוגי באמצעות מגיב רגיל בידוד RNA, או ערכת המעשירה עבור microRNAs. לרקמות, מוטב להתחיל בדגימות שהוקפאו בחנקן נוזלי ובקרקע לאבקה באמצעות מרגמה ומלט מצוננים.
- למדוד את שלמות RNA של כל דוגמה על מכשיר שיכול לכמת RNA ולספק מספר שלמות RNA (RIN). . יש ל> 7
מתאם הארכה 2 .3
- הכינו תגובת השקיה בצינורות הסטריפ של ה-PCR, על-ידי שילוב: 11 μl של RNA (1-3 μg, באמצעות אותה כמות עבור כל מדגם), 1.5 μl של מאגר התגובות של 10 x T4 ליגאז, ATP חינם, 1 μl של פולי אתילן גליקול (פג), ו 0.5 μl של 3 '-מקשר (100 μm יוניברסל שיבוט mirna ker).
הערה: העדר ATP מסייע להעשיר את miRNAs וממזער את השכפול של מוצרי השפלה של mRNA. פג משמשת כסוכנת מולקולרית לצפיפות, ומגבירה את הפעילות המוצלחת. המקשר האוניברסלי miRNA שיבוט יש 3 ' חסימת הקבוצה (אמין) כדי למנוע הקשר העצמי, מעגליות, ו לקשר ל-RNA בסוף 5. - לחמם את הדגימות ב 95 ° c על הציקלייט עבור 30-40 s. מגניב על הקרח במשך 1 דקות. הוסף 1 μl של T4 לליגאז 2 ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 h. הכן את ג'ל (שלב 2.3) בעוד הדגימות מודגרות.
הערה: הדגירה בטמפרטורת החדר עוזרת למנוע הקשר בין מקשר למקשר. יש לנו גם השתמש בהצלחה T4 ליגאז 1. - היכונו 30 מ ל של 15% פוליאקרילמיד ג'ל עם 8 מ ' אוריאה (עבור 20x20 ס מ ג'ל): 14.4 g של אוריאה, 3 מ ל של 10x טריס-באגירה חומצה מיאלואידית (TBE), 11.2 mL של 40% 19:1 אקרילאמיד, ו H2O ל 30 mL. הפתרון הוא הטוב ביותר התפרקה ב 42 ° c. מיד לפני הליהוק, להוסיף 150 μl של 10% אמוניום פרסולפט (APS) ו-30 μl של טטרמתילילתילאדיאמין (temed) עבור פילמור.
- יוצקים בין 0.8 מ"מ לוחות זכוכית מופרדים בגבס פלסטיק והוספת מסרק. לאחר הג הוא מתחזק (כ 20 דקות), להוסיף 0.5 x TBE לטנק ולשטוף בארות של שיורית אוריאה ידי מלטף במרץ.
- Pre-הפעל את ג'ל בקבוע 375 V עבור 25 דקות ללא דגימות כך אוריאה יכול להיכנס ג'ל, ולאחר מכן לשטוף את הבארות שוב.
הערה: ניתן לצמצם את כמות המתח בהתאם לסוג אספקת החשמל ומערכת האלקטרופורזה המשמשת. - לאחר הדגימות מתבצע ליגדירוג, להוסיף 15 μL של לצבוע אקרילי לדגימות (עבור יחס 1:1), אז הטמפרטורה 5 דקות ב 95 ° c על הציקלה1.
- להכין 25 ng/μL של 37 ו 44 גודל סמנים bp, מדולל בחלק אחד אקרילי לטעון צבע. הרצפים מפורטים בטבלה 1.
- העמיסו את הדגימות על ג'ל פוליאקרילמיד, ומשאירים לפחות נתיב אחד בין המדגם. טען 20 μL של לפחות שתי קבוצות של סמנים, בתבנית סימטרית כדי לעקוב אחר כיוון ג'ל.
- הפעל את הג באופן קבוע 375 V עבור 15 דקות הראשון ולאחר מכן להגדיל את הקבוע 425 V עבור המשך ההפעלה הנותרת. לרוץ עד בbromophenol כחול הוא כ 1-4 ס מ מלמטה, אשר לוקח כ 2 h.
הערה: במקרה הצורך, הג עשוי להיות מופעל במתח קבוע נמוך יותר למשך פרק זמן ארוך יותר עד שכחול ברומנול הוא כ-1-4 ס מ מלמטה. - הסירו את הג מלוחות הזכוכית באמצעות מפריד צלחות, והניחו את הג על מגן מפלסטיק לעמוד. לדלל 5 μL של אתידיום ברומיד ב 500 μL של מים מזוקקים, ו פיפטה על מסלולי סמן בדיוק מעל סמן התכלת העליון (ראה איור 1A).
התראה: השתמש בכפפות לאתידיום ברומיד והיפטר מפסולת בהתאם לתקנות המקומיות. . בואו נשב 5 דקות - תחת אולטרה סגול (UV) אור, חותכים את הג מן העליון לסמן התחתון בכל נתיב באמצעות להב גילוח נקי (ראה איור 1A). העברה לכיכר 4 x 4 ס מ של איטום מעבדה, ואז חותכים את ג'ל עם כ 4 חתכים אופקית ו 3 אנכית כדי לייצר 12 ריבועים קטנים (ראה איור 1B).
- פיפטה 400 μL של 0.3 מ ' מופעל על כיכר הסרט איטום, וחתיכות ג'ל משפך לתוך 1.5 mL צינורות סיליפיזציה (ראה איור 1C). . מתפרעים בדגימות של 4 ° c
הערה: החזקת שפופרות נמוכות של 1.5 mL יכולה להיות מוחלף לצינורות הסיליגניים. - לאחר לפחות 12 שעות של עצבנות ב -4 ° c, להחזיר את הדגימות ולשים אותם על הקרח, יחד עם צינור חרוט של 100% אתנול.
- העבר 400 μL של סופרנטאנט לצינור חדש, ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של 100% אתנול ו 1 μL של 15 מ"ג/mL הגליקוגן coprecipitant. הקפידו לאסוף את הסופר-סופרנט ככל האפשר, להסתחרר ב -4 ° c וללטף יותר לפי הצורך. מקום בשעה-80 ° צלזיוס עבור 1 h, או-20 ° c עבור 2 שעות או יותר. Coprecipitant גליקוגן משפר את הניראות וההתאוששות של הגלולה.
- ספין ב 4 ° צ' ב 17,000 x g עבור 20-30 דקות. להסיר את כל העקבות של אתנול ולתת כדור אוויר יבש עבור 5 דקות.
מקשר שלוש.
- השהה מחדש את הגלולה על ידי ליטוף ב 6.5 μL של nuclease-מים ללא תשלום. לתת את הגלולה לשבת במים כמה דקות קודם יעזור עם השעיה מחדש.
- לאחר לסובב את הגלולה ולהשעות מחדש במים, להוסיף 0.5 μl של 100 μm 5 '-מקשר (עם ברקודים; לראות את הטבלה 1), 1 μl של T4 ליגאז מאגר RNA, 1 μl של ATP 10 מ"מ, ו-1 μl של פג. מחממים ב-90 ° c במשך 30 ס מ, ואז מניחים על קרח. להוסיף 1 μl של T4 RNA ליגאז 1 ולתת דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
- הוסף 400 μL של 0.3 M הנאל, ואחריו 400 μL של חומצה פנול/כלורופורם. מערבולת 30 s-1 דקות (הפתרון ייראה מעונן), ולאחר מכן ספין ב 4 ° צ' עבור 10-15 דקות במהירות מקסימלית ב מיקרוצנטריפוגה (~ 17,000 x g). משוך את השכבה העליונה והמקום בצינור חדש 1.5 mL.
הערה: הימנע מללטף את השכבה התחתונה. - הוסף 350 μL של כלורופורם, מערבולת בקצרה, ולאחר מכן ספין ב 4 ° צ' עבור 10 דקות במהירות מקסימלית (~ 17,000 x g). שלוף את החלק העליון מאוחר יותר ומניחים בשפופרת 1.5 mL חדשה. הוסף 1.5 μL של coprecipitant גליקוגן ו-1 מ ל של 100% אתנול.
הערה: שוב, הימנע מללטף את השכבה התחתונה. - וורטקס בקצרה, ואז מניחים ב-80 ° c לפחות 1 h, או -20 ° c ללילה.
4. תמלול הפוכה (RT)
- הפעל את מחסום החום 42 ° c. לסובב את הדגימות ב 4 ° צ' ו ~ 17,000 x g עבור 20-30 דקות. להסיר את כל supernatant ולתת את האוויר הגלולה יבש עבור 5 דקות.
- להשעות מחדש את המדגם ב-8.25 μL של nuclease-מים ללא תשלום, לאחר מכן להוסיף: 0.5 μL של 100 μM RT פריימר (טבלה 1), ו 5 μl של התגובה 2X Rt שילוב מערכת סינתזה cdna. מודקון ב 42 ° c עבור 3 דקות.
- הוסף 1.5 μL של האנזים 10x RT לכל מדגם ו-דגירה ב 42 ° צ' עבור 30 דקות בתוך הציקלייט. מניחים ב-20 ° c או ממשיכים בהידרוליזה ובניטרול.
הערה: ערכות RT מספר יכול להיות מנוצל עבור שלבים 4.2 ו 4.3. - ביצוע הידרוליזה אלקליין נטרול: להפוך 1 מ מ 150 הידרוקסידי אשלגן (KOH) פתרון (150 μL של 1 M KOH, 20 μL של 1 מ ' טריס בסיס pH 7.5, ו 830 μL של H2O) ו-1 מ ל של הידרוחומצה הכלורית של 150 (HCl) (150 μl של הHCl 1 m ו של H2O).
- לפני הוספת דגימות, לקבוע את כמות HCl הצורך כדי לנטרל את הפתרון KOH. באופן כללי, סביב 20-24 μL של HCl לנטרל את 25 μL של KOH. בדוק את השילוב על פס pH כדי לוודא שהוא בטווח הנכון (pH 7.0 עד 9.5).
- הhydrolyze דגימות על-ידי הוספת 25 μL של 150 mM הפתרון KOH ו דגירה עבור 10 דקות ב 95 ° c.
- לנטרל את הדגימות על ידי הוספת סכום של 150 מ"מ HCl שנקבע בשלב 4.4, כדי להשיג pH לדוגמה הסופי בין 7.0 ו 9.5.
5. הגברה על הPCR
- , אחרי ניטרול להכין תגובת PCR עם: 29.5 μL של מים, 5 μL של מאגר 10 x Taq, 1 μL של dNTP, 2 μL של 25 μM קדימה (שולחן 1), 2 μl של 25 μm לאחור פריימר (טבלה 1), 0.5 Μl של taq, ו 10 μl של הפוכה הפוך cdna משלב 4.6 .
- הפעל את תגובת ה-PCR הבאה: 94 ° c עבור 2 דקות, ואז 20 מחזורים של 94 ° צ' עבור 45 s, 50 ° c עבור 75 s ו-72 ° c עבור 60 s.
- להריץ תגובת PCR השני של כ 2-4 מחזורי יותר באמצעות 5 μL של המוצר משלב 5.2. לערבב: 34.8 μL של מים, 5 μL של מאגר 10 x Taq, 1 μL של dNTP, 1 μL של 25 μM קדימה (טבלה 1), 1 μl של 25 μm לאחור פריימר (טבלה 1), ו 0.2 Μl של taq פולימראז. בצע את הפרמטרים התרמותרמיים אותו המתואר בשלב 5.2.
הערה: המטרה של לעשות שתי תגובות ה-PCR-עם הראשון עבור 20 מחזורים והשני רק 2-4 בדיוק-היא להבטיח כי כמות cDNA מוגבר הוא בטווח דינמי (כלומר, לא כמות רוויה).
6. ג'ל לטיהור הצמח
- הכינו ג'ל מעלה של 4% עם המסת התכה נמוכה. טען 40 μL או יותר של מוצר ה-PCR על ג'ל, יחד עם צבע הטעינה. לטעון 100 bp ו -25 גודל לחץ דם.
הערה: הסולם 25 bp מסייע להבדיל בין מוצר מוגבר לבין מוצרי מקשר-מקשר. דל התכה ג'ל agarose חייב להיות יצוק עם טיפול גדול יותר ג'ל agarose המסורתית, כל כך קרוב הוראות מן היצרן. - להפקת ג'ל, בחר את מספר המחזור הגלוי על ג'ל אך אינו רווי (בדרך כלל 22 – 24 מחזורים). בחר להקות אינטנסיביות דומות בעת הפעלת דגימות מרובות.
- חותכים את הרצועה כי הוא מעל הלהקה 125 bp (הלהקה כהה יותר על 25 הסולם bp; ראה איור 1D). באמצעות ערכת חילוץ ג'ל, בצע את הוראות היצרן להוספת מאגר על בסיס 4% ג'ל, ולאחר מכן ללחוץ כדי לפזר את הצמח במאגר בטמפרטורת החדר.
הערה: המסת ב 55 ° c מגבירה את הפוטנציאל לקשר בין מקשר למקשר. - בצע את ההוראות חילוץ ג'ל של היצרן ו elute ב 30 μL של מאגר הימנעות או מים. אם המוצר נראה חלש על ג'ל, ולאחר מכן להפחית את הימנעות 20 μL.
- למדוד ריכוז cDNA באמצעות טכניקה רגישה, ולהכין ספרייה לדוגמה לרצף. ההכנה תהיה תלויה בסוג הרצף שבשימוש.
הערה: דרישות מינימום עבור ספריית רצף הן בדרך כלל כמות של 10 μL של מוצר 10 μM. אם ריכוזי נמוך מדי, הבריכה והאתנול מזרז דגימות כדי להביא את הספרייה לריכוז הרצוי. - רצף את הדגימות באמצעות ציוד זמין. דוגמה נפוצה תהיה להפעיל דגימות באמצעות ערכה עבור 50 bp קריאות יחיד, כדי להשיג כ 15-25 מיליון קריאות בפורמט FASTQ פלט.
יישור וביואינפורמטיקה של רצף RNA קטן
7. העלאת נתונים
- הורד את קבצי FASTQ שנוצרו מכל רצף הפעלה. להוריד רשימה של רצפים של מיקרואורנה מmiRbase.org8,9,10.
- צור חשבון גלקסי ב www.usegalaxy.org ולהעלות קובץ FASTQ של הרצף קורא לחשבון זה.
- העלה קובץ טקסט של רצפי ברקוד לחשבון גלקסי, כגון ברקודים. txt, הזמין כקובץ טקסט (טבלה משלימה 1).
- העלה קובץ FASTA של סיכות שיער מיקרואורנה לחשבון גלקסי ממסד נתונים כמו miRBase.org. דוגמאות לעכבר (סיכות לעכברים. פא) או לאדם (סיכות הומניתיים. פא) מיקרוסמנים לפני כן מסופקים בטבלה 2 ובטבלה השלמה 3.
8. הסרת מתאם, מיון ברקודים וקיטום
- בכרטיסיה יד שמאל, נווט לטפלול קבצים גנומית > FASTA/FASTQ > רצפי מתאמים של Clip.
- בקובץ הקלט בתבנית FASTA או fastq, הזן קובץ fastq מהרשימה הנפתחת. שנה את אורך הרצף המינימלי ל-18. שנה מקור להזנת רצף מותאם אישית. הזן Ctgtaggc. שמור את כל פרמטרי ברירת המחדל האחרים. לחץ על ביצוע.
הערה: הרצף קורא כי הם קצרים מ 18 נוקלאוטידים קשה למפות באופן ייחודי ל-microRNAs ולהכיל מוצרי השפלה רבים. - בכרטיסיה יד שמאל, נווט לטיפול בקבצים גנומית > FASTA/FASTQ > מפצל ברקוד.
הערה: פונקציות וכותרות של גלקסי מעודכנות מעת לעת, כך שייתכן שפונקציית החיפוש תהיה נחוצה כדי למצוא כלי שווה ערך או את מיקומו. ערכות מסחריות המשתמשות בצבעי התחל באינדקס ממוינות לעתים קרובות לפי ברקוד. לכן, צעד זה והצעד לקצץ ברקוד אינם נחוצים אם מתחילים מערכה מסחרית. - עבור ברקודים לשימוש, הצבע על ברקודים. txt. כדי לפצל אתהספריה , השתמש בפריט בקובץ הנתונים שהופק בשלב הקודם. במספר אי-התאמות מותרים, הזן 1. לחץ על ביצוע.
- חתוך את 4 הנוקלאוטידים הראשונים: נווט אל מניפולציות טקסט ≫ חתוך תווים מובילים או נגררים. עבור ערכת נתונים של קלט, לחץ על סמל התיקיה, שהוא אוסף של ערכת נתונים. בחר את קובץ האצווה של דגימות, הכוללת את מפצל ברקוד התווית על נתונים. בקיטום מההתחלה עד למיקום זה, הזן 5. ב האם ערכת נתונים של קלט בתבנית FASTQ? הזן כן. לחץ על ביצוע. ההוצאה להורג עשויה להימשך מספר דקות.
9. יישור קריאות למקרונאס
- בגלקסיה, נווט לניתוח גנומיקה > רנ א-Seq > מפרשן התמליל11.
- עבור השאלה בחר הפניה החוצה מההיסטוריה שלך או השתמש באינדקס מוכלל? בחר באפשרות השתמש באחד מההיסטוריה. הזן את סיכות העכבר של הקובץ שהועלה. fa מהרשימה הנפתחת. בקובץ FASTA/Q, לחץ על סמל התיקייה כדי להשתמש באוסף נתונים ובחר את הקובץ הכולל קיטום באוסף. לחץ על ביצוע. ההוצאה להורג עשויה להימשך מספר דקות.
- בכרטיסיה היסטוריה מימין, לחץ על מפרשן באוסף. ... שהיא רשימה עם 19 פריטים לחץ על כל קובץ בודד ולחץ על סמל הדיסק כדי לשמור למחשב המקומי. יש לדחוס תחילה קבצים שהורדו בנפרד. ייתכן שיהיה צורך לשמור אותם מחדש עם סיומת. txt למטרת ייבוא לתוך גיליון אלקטרוני.
- פתח כל קובץ גיליון אלקטרוני ב-ושנה מחדש את העמודה Numreads לתנאי הטיפול. מזג את העמודות יחד כדי ליצור מטריצה של microRNAs בעמודה הראשונה ולקרוא ספירות לכל תנאי בעמודות עוקבות.
- כדי לחשב ביטוי מהותי של microRNAs עבור כל תנאי טיפול, השתמש בקובץ עם הקריאה הגולמית של אורנה מיקרומיקה כקלט לתוכניות כגון DESeq212. DESeq2 נמצא גלקסי בניתוח גנומיקה > רנ א-seq ≫ DESeq2 tab.
- המרת קריאות raw לספירות קריאה מנורמלות של אורנה. הספירות מנורמלות לעומק רצף הספריה של הספריה באמצעות החישוב הבא: [(קריאה גולמית/סה כ מיקרולות) * (1,000,000 – מספר מיקרורונאס) + 1].
הערה: חישוב זה מספק קריאות מנורמלות למיליון (RPM) ממופות microRNAs שניתן להשוותו באמצעות ערכות נתונים ותנאים ביולוגיים. הפלט הוא קובץ המופרד בטאבים. מפרשן מספק עמודת פלט של tpm , למרות שערך זה מנורמל על-ידי אורך סיכת מיקרואורנה, שאינו נחוץ בהקשר זה. - אם רלוונטי, חזור על היישור עם רצפי קלט מותאמים אישית (לדוגמה, וקטור) כדי לזהות קריאות הממפות את המפה למבנים שנמסרו, כגון מרין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכמטית של צעדים שמעורבים בהכנה לספרייה
סכמטית כללי של חילוץ, רצף ויישור של RNA קטנים מתוארים באיור 2.
דגימות כבד מזכר אחד ועכבר נקבה אחת נאספו והצמד קפוא בחנקן נוזלי. סה כ RNA חולץ והוערך עבור איכות וריכוז.
רצפי RNA קטנים התשואות מספיק RNA לרצף
3 μg של RNA משני שעקירות RNA עצמאיים שימשו כחומר התחלתי ברצף RNA קטן. דגימות הופעל על ג'ל אקרילי לגזור בין סמנים גודל המתאים 17-28 nt של RNA (איור 1A). דגימות היו קצוצים שברי בידוד RNA (איור 1B) והועבר שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL בעלת שמירה נמוכה (איור 1b). ברקודים bc7 ו-bc17 (שולחן 1) היו ליגבטים לקצה 5 ' של RNA קטן. ספריות RNA קטנות היו PCR מוגבר באמצעות 22 מחזורים של PCR כדי להניב 8.0 ו 11.2 ng/μL מוצר, בהתאמה. דגימות היו במאגר ו 10 מדגם ננומטר במאגר הוגש לרצף התפוקה גבוהה באמצעות 50 bp לקרוא אורך.
מיר-122 הוא הנפוץ ביותר מיקרואורנה בכבד העכבר
לאחר מיון ברקוד, 851,931 קורא ברקודים הכיל מן הכבד דגימת 1 ו 650,154 מן הכבד דגימת 2. מתוך הקריאות, 83.5% ו-90.0% ממופים ל-microRNAs בהתאמה, כאשר הקריאות הנותרות ממופות ל-rRNAs (1.8% ו-0.6% בהתאמה), שברי השפלה של tRNAs ו-mRNA. לאחר התאמת מיקרוני השיער האנושיים, הבחנו בקונקורדנציה חזקה בין הספירות הקריאות של מיקרואורנה בכל שכפול (R2 = 0.998; איור 3). סה כ התגלו 306 מינים של מיני אורנה, עם המספר הגדול ביותר של קריאות מיפוי למיר-122 (שולחן משלים 4). השפע בין דגימות הכבד לזכר ולנקבה היה דומה.
איור 1. הוצאת RNAs קטנים מג'ל אקרילמיד. (א) אקרילאמיד ג'ל ואזור שנחתך בהתאם לגודל של microRNAs. (ב) חתיכות ג'ל לפני ואחרי חיתוך לרסיסים קטנים יותר. (ג) תהליך העברת שברי ג'ל לצינורות סיליגניים. (ד) התגובה המולקולארית על ג'ל להמיס נמוך הממחיש את המוצר המשוכפל הנכון בהשוואה למוצר מקשר-מקשר וללא בלתי רווי (22 מחזורים) לעומת רוויה (24 מחזורי) דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. תרשים שרטוט של הפרוטוקול. ציר זמן המציג את השלבים העיקריים המעורבים בפרוצדורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. הכפלת התוצאות של שני שעקירות RNA עצמאיים. מגרש הבית של מיקרוארנה מונה מכבד עכבר זכר (ציר x) בהשוואה לכבד של העכבר הנשי (ציר y) באמצעות קנה מידה מבוסס log10. כל נקודה מייצגת את מספר הקריאות למיליון (RPM) עבור כל מיקרואורנה בודדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פריימר | רצף | |
| 3 ' מקשר 1 | הNH2-מדיה | |
| סמן בגודל נמוך יותר | השכרת מתקני השכרת מארזים וכלי הקרנה | |
| סמן גודל עליון | השכרת מתקני השכרת מארזים והשכרת מתקני ברירת המזתהמקרוקיקקרקרגcגנול | |
| barcode1 | מיכל ב, בתאל כנען | |
| barcode2 | בתאל שלמה בורקמק | |
| barcode3 | בתאל שלמה מצקיתמע | |
| barcode4 | בתאל שלמה שלמה | |
| barcode5 | בתאל שלמה שגיא | |
| barcode6 | בתאל שלמה שגיא | |
| barcode7 | בתאל שלמה בורגוביץ | |
| barcode8 | בתאל שלמה מצקיתמע | |
| barcode9 | בתאל שלמה הגוקימ | |
| barcode10 | מיכל בורקינוב | |
| barcode11 | מלון הרודס/בתאל אילת | |
| barcode12 | בתאל שלמה שגיא | |
| barcode13 | בתאל שלמה שגיא | |
| barcode14 | בתאל שלמה שגיא | |
| barcode15 | בתאל שלמה הורקינוב | |
| barcode16 | בתאל שלמה בורגוביץ | |
| barcode17 | בתאל שלמה בע | |
| barcode18 | בתאל שלמה שגיא | |
| פריימר | מחלקת התמיכה | |
| ה-PCR פריימר F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |
| מחקר הPCR | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG | |
. שולחן 1 רשימת התחל.
טבלה משלימה 1. רשימה של רצפי ברקוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 2. רשימה אוצרת של רצפים של עכבר מיקרומן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
שולחן משלים 3. רשימה של הרצפים האנושיים מיקרואורנה האנושית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 4. מקרי קריאה מיקרוטריים ומנורמלת של אורנה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות הזיהוי של מיקרורונאס לפני יותרמ-20שנה, תהליך הרצף של מיקרואורנה ממשיך להיות מפרך ודורש ציוד מיוחד, מעבדות הידרינג מאימוץ שגרתי של פרוטוקולים בבית14. טכניקות אחרות יכולות להעריך בו את microRNAs, כגון מיקרומערכים ולוחות ביטוי מרושני; עם זאת, גישות אלה מוגבלות בכך שהם רק מכמת את מיקרו-rna הנוכחים בקבוצת הגישוש שלהם. בגלל זה, הם מתגעגעים תכונות חשובות של רצף RNA קטן, כמו זיהוי של מיקרורונאס הרומן, ו של מיקרואיפורמינויטופס-השינויים נוקלאוטיבצד שיכולים להיות בעלי תפקוד ביולוגי חשוב6,7,15 .
בעת התחלת ניסוי חדש, השימוש בספק מסחרי הוא לעתים קרובות קל משום שהם מציעים תמיכה טכנית וקלות שימוש. מספר אפשרויות מסחריות זמינות עבור רצף מיקרואורנה, שניתן לקצר אותן כדי להקטין את עומס העבודה בעת עיבוד מספרים גדולים (> 100) של דגימות. ערכות מסחריות אלה הם ללא הרף להיות משופר, וזה גם יתרון וגם חיסרון. מצד אחד, החברות שעושות את הקיטים הללו פיתחו שיטות לכידת מיקרוארנה של אורנה, למשל, באמצעות מעגליות של 5 ו -3 הקצוות שלהם לפני הרצף או שימוש בלינקרים מנוונת עם רצפים אקראיים בכל קצה כדי להפחית את ההטיה. הם פיתחו גם שיטות להסרת מתאם-דימרס, לדוגמה, באמצעות הארכה של מתאמים בעלי כפולה או הכלאה של היבריאוונו, משלימים המשלימים. מצד שני, ערכות מסחריות ממליצים כנגד שינוי או שינוי בכל שלב. לכן, אם כל העדכונים נעשים בערכה, קשה או בלתי אפשרי להשוות נתונים הנגזרים מגרסאות ישנות וחדשות של ערכות, כמו גם נתונים הנגזרים מקיטים מיצרנים מסחריים שונים. כאן, אנו מתוארים פרוטוקול בעל כוח שוהה בפני חלופות מסחריות. ההתמקדות שלנו בצעדי הטיהור של ג'ל-בזמן שהם מוסיפים זמן לפרוטוקול-מאפשרת לכידת ומימוש עקבית של מיקרואורנה במשך שנים רבות השתמשנו בו. מספר הערכות של התוכסות בין ערכות מסחריות ופרוטוקולים בתוך הבית נעשו, ואנו מתייחסים הקורא כמה מחקרים אלה16,17,18,19. חשוב מכך, הצעדים שאנו מתווה לניתוח ביואינפורמטיקה של microRNAs יכולים להיות מועסקים ללא קשר לבחירת הערכה או הפרוטוקול הביתי.
רצף מיקרואורנה מוטרד לעתים קרובות על ידי בחירת ברקודים: במקרים מסוימים, היעילות הרבה של ברקודים שונים לא תהיה שווה ערך, המובילה להפצות מוטיות של רצפים בדגימות20. כעת מומלץ להשתמש בבסיסים מנוונת בסוף 5 ו -3 כדי למזער הטיות של מיקרורונאס21,22. בפרוטוקול זה, לא הבחנו בסוגיות הקשורות לבעיות האלה והבחנו בקריאות עקביות לשכפל טכני וביולוגי המוערך עם ברקודים שונים5,6,7,23, אבל חשוב להיות מודעים להם. שיטות למניעת הטיה הדדית כוללות את השילוב של התחל האינדקס בצבעי ה-PCR, או כדי להוסיף אחד או יותר מקרי RNA מקריים בקצה השני של 5 רצף המתאם (שולחן 1). היכרות עם אחד או יותר סינתטי-ב-RNA, כגון C. אלגיה -39 מיקרוארנה24, היא גם אופציה למטרות נורמליזציה, שהיא קריטית למצבים בעלי תפוקה נמוכה, כמו כימות מיקרו-משתמשים מאקזומים. כמו כן, עבור הקשר RNA, השתמשנו בהצלחה T4 ליגאז 1, אבל הקשר עם פחות הטיה כבר הפגינו עבור צורה קטועה של T4 לליגאז השני25. בסופו של דבר, סופר-Scripts III ו-IV הם אנזימים שעתוק הפוכה שאנחנו השתמשנו ללא בעיה.
בחירת מסד הנתונים של מיקרואורנה יכולה גם להשפיע על התוצאות המנורמלות הסופיות. אתגר עם מאגרי מידע של מיקרוארנה הוא כי מספר RNAs קטנים הרשומים כמו microRNAs הם למעשה שברי רכיבים חוזרים ולא מיקרו מיקרורונאס2. המאמצים נעשו כדי לפרוש מיקרורונאס שאינם תואמים לקריטריונים סטנדרטיים, כך שהגירסה הבאה של מסד נתונים מיקרואוראורנה מעודנת יותר; עם זאת, האיטראציה הבאה מכילה גם מועמדים חדשים הזקוקים לאישור. כאשר מיקרו-משתמשים שנגזרו על עצמם נכללים במערכים, הם יכולים להטות את התוצאות ולהציף נתונים מ-microRNAs קיימים. לפיכך, השימוש בקבוצות נתונים של מיקרורונאס ממינים שונים הוא חיוני26,27. יש לנו לחוות את הטוב ביותר כאשר היישור ברצפי RNA קטן קורא רשימות של מיקרורונאס שמרו וכללו סיכות אלה בטבלה השלמה 2 ו שולחן משלים 3. רשימות אלה התאמה הערכות של כ 500 ביטחון גבוה מיקרורונאס בגנום האדם2,26.
כמו בכל טכניקה, יש לאשר את התוצאות באמצעות גישה אורתוגונלית. הצלחנו לשכפל בהצלחה את התוצאות של רצפי rna קטנים עם כתמים בצפון rna המשלבים בדיקה רדיואולפית כדי לאשר את הגודל ואת השפע היחסי של micrornas מועמד6,7,23. ה-PCR הכמותי של מיקרורונאס באמצעות רצף מפוצל לקריאה, ואישור שינויי היעד של mRNA באמצעות qPCR והכתמים המערביים הם אפשרויות נוספות לאימות.
לסיכום, סיפקנו שיטה לבידוד ולרצף של microRNAs ולבצע מערכים נגד מאגרי מידע קיימים. העלות הרבה של הריאגנטים והציוד והשימוש בכלי קוד פתוח לניתוח צריכים להפוך פרוטוקול זה לנגיש לכל אחד. לבסוף, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה בכל רקמה או קו תא כדי להניב קריאות באיכות גבוהה מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
ברצוני להודות לחברי המעבדות של אנדרו פייר ומארק קיי להדרכה והצעות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
