Summary
يُعرض هنا بروتوكول لتقنية أحادية الخلية، تقوم على الفحص المجهري لتحديد معدلات الرعي في اليوكاريوتس المفترسة المائية بدقة عالية ودقة تصنيفية.
Abstract
توضيح التفاعلات الغذائية، مثل predation وآثارها، هي مهمة متكررة لكثير من الباحثين في علم البيئة. دراسة المجتمعات الميكروبية لديها العديد من القيود، وتحديد الحيوانات المفترسة، فريسة، ومعدلات المفترسة غالبا ما يكون من الصعب. المعروضة هنا هي طريقة الأمثل على أساس إضافة فريسة وصفت الفلورسنت كتعقب، والذي يسمح لكمية موثوق بها من معدلات الرعي في eukaryotes المفترسة المائية وتقدير نقل المغذيات إلى مستويات أعلى من التغذية.
Introduction
prokaryotes Heterotrophic هي عنصر بيولوجي رئيسي في النظم المائية وتمثل جزءا كبيرا من الكتلة الحيوية العوالق1،2،3. العوامل التي تتحكم في وفرة، والتنوع، والنشاط هي حاسمة لفهم دورها في الدراجات البيوجيوكيميائية (أي مصير الكربون العضوي والمواد الغذائية الأخرى وتدفق الطاقة من prokaryotes إلى مستويات أعلى من التغذية). الرعي البروتوزوان هو واحد من هذه العوامل الهامة. البكتيريا من nanoflagellates غير متجانسة وأهداب يفرض سيطرة قوية من أعلى إلى أسفل على وفرة prokaryotic، وظيفة المجتمع، وهيكل، والتنوع، وحتى مورفولوجيا الخلوية ومعدل النمو من مجموعات بكتيرية معينة4، 5,6. في بعض النظم، وprotists بمثابة السبب الرئيسي للوفيات البكتيرية6،7.
النهج القياسي المستخدم لتقييم بكتيريا البروتوزوان، التي استخدمت لبعض الوقت الآن، ينطوي على استخدام البكتيريا التي تحمل اسم الفلورسنت (FLB) كنظائر فريسة والفحص المجهري. ويمكن تحديد معدلات الانتفاعي الخاصة بالخلايا من خلال تحديد عدد جزيئات الفرائس المسماة في فراغ الأغذية البروتستانية على مدى دورة زمنية مختارة8. وهناك عدة مزايا لهذا النهج. يتم إضافة التتبع إلى العينات الطبيعية مع الحيوانات المفترسة الطبيعية وتجمعات الفرائس. هناك الحد الأدنى من التلاعب عينة قبل الحضانة، والحد الأدنى من تغيير العينة من قبل التتبع FLB المضافة، وأوقات الحضانة قصيرة لضمان النتائج السليمة التي تم الحصول عليها في ظل ظروف قريبة في الموقع. وبدلاً من ذلك، في البيئات التي تنقصها أعداد المناوجيين أو العوالق الحيوانية (مثل النظم البحرية البحرية البحرية)، يمكن الكشف عن معدلات اختفاء FLB المضافة إلى العينات بكميات منخفضة (2٪ -3٪ التتبع) عن طريق قياس التدفق في المدى الطويل (12-24 ساعة) تجارب الحضانة. ثم، يتم قياس أرقام FLB في نقاط البداية والنهاية (دمج تأثير جميع البكتيريا) عن طريق قياس التدفق (للاطلاع على التفاصيل، انظر المنشور السابق9). ومع ذلك، فإن هذه المعلمة لا تمثل سوى مجموع معدلات البكتيريا المجمعة التي لا يمكن أن تعزى مباشرة إلى أي مجموعات أو أنواع معينة من البروتستان والعوالق الحيوانية.
وبشكل عام، فإن التحديد الكمي لمعدلات الوفيات البكتيرية الخاصة بالأنواع البروتستانية أو النمط المورفي في البيئة المائية بدقة وبمعنى إيكولوجي يمكن أن يكون أمراً صعباً. بعض الرعاة هم رعاة انتقائية، وحجم وشكل الخلية من المتتبع FLB المضافة قد تشوه المعدلات الطبيعية من ابتلاع فريسة10،11. وعلاوة على ذلك، نشاط بروتستان والتمثيل الغذائي هي درجة حرارة عالية حساسة12; لذلك، فإن كمية التتبع FLB المضافة تحتاج إلى التلاعب بعناية لكل نوع عينة الفردية (ليس فقط على أساس وفرة الطبيعية، وحجم، ومورفولوجيا البكتيريا والأنواع السائدة من البكتيريا، ولكن أيضا على درجة الحرارة). وتركز معظم الدراسات على نشاط الرعي البروتستان يُدفع بالجملة؛ ومع ذلك، فإن بكتيريا أنواع معينة من البروتستان غالبا ما يحمل قيمة معلومات أعلى بكثير، وقد يكون من الأفضل. في هذه الحالة، هناك حاجة إلى المعرفة التصنيفية للأنواع البروتيست الموجودة في عينة وفهم سلوكهم. وبالتالي، هناك حاجة إلى كميات كبيرة من الوقت والعمل للحصول على نتائج سليمة على معدلات الأنواع الخاصة من البكتيريا التي تعزى إلى مجموعة أو أنواع معينة من البروتستان.
وعلى الرغم من هذه الصعوبات، لا يزال هذا النهج الأداة الأنسب المتاحة حاليا لتقييم بكتيريا البروتستان في البيئات الطبيعية. تُعرض هنا طريقة شاملة وسهلة المتابعة لاستخدام FLB كمتتبع في دراسات الإيكولوجيا الميكروبية المائية. وتُحسب جميع الجوانب الإشكالية المذكورة في هذا النهج، ويرد وصف لسير العمل المحسن، مع تجربتين من بيئات متناقضة، فضلا عن الأنواع المتناقضة من الهداب كأمثلة على ذلك.
وقد أجريت دراسة الحالة الأولى في بيئة epilimnetic من خزان المياه الموريموففي في الجمهورية التشيكية، والتي تبين وفرة الرعي والبكتيرية مماثلة لمعظم المسطحات السطحية للمياه العذبة (انظر5و7). وقد أجريت دراسة الحالة الثانية في بيئة محددة للغاية داخل الفخاخ من النبات آكلة اللحوم المائية Utricularia reflexa، الذي يستضيف أعدادا عالية للغاية من كل من الهداب اتوافيك الرعي(Tetrahymena utriculariae) والخلايا البكتيرية. وتظهر حسابات معدلات الرعي الخاصة بالخلايا والمخزونات الدائمة البكتيرية في كلا النوعين من العينات. ثم تناقش مجموعة من التفسيرات الإيكولوجية للنتائج، ويقترح أخيرا أمثلة على دراسات المتابعة الممكنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع عينة
-
جمع عينة مياه الخزان:دراسة الحالة الأولى (Exp I؛ نظام وفرة الحيوانات المفترسة والفرائس الطبيعية المنخفضة في الموقع)
- جمع عينات المياه من الموقع المطلوب في عمق مناسب. الاحتفاظ بالعينات في مبرد يتم التحكم في درجة حرارته مملوءة بدرجة حرارة في الموقع (تجنب صدمة درجة الحرارة؛ وتجدر الإشارة إلى أن معدلات امتصاص البروتيين تعتمد على درجة الحرارة) أثناء النقل إلى المختبر.
ملاحظة: تم إجراء أخذ العينات لدينا في خزان ريموف على شكل الوادي المتوسط اليوريفي (بوهيميا الجنوبية، المجلد 34.5 × 106 م3،العمق الأقصى 43 م، متوسط وقت الاحتفاظ 100 يوم، ثنائي). ويقع موقع أخذ العينات على عمق 30 مترا، بالقرب من السد. تم جمع عينة مختلطة على عمق 0.5 متر من قبل عينات فريدنجر 2-l. - تابع القسم 1-2 في أقرب وقت ممكن.
- جمع عينات المياه من الموقع المطلوب في عمق مناسب. الاحتفاظ بالعينات في مبرد يتم التحكم في درجة حرارته مملوءة بدرجة حرارة في الموقع (تجنب صدمة درجة الحرارة؛ وتجدر الإشارة إلى أن معدلات امتصاص البروتيين تعتمد على درجة الحرارة) أثناء النقل إلى المختبر.
-
جمع السوائل من الفخاخ من النباتات الانعكاسية Utricularia آكلة اللحوم: دراسة الحالة الثانية (إكسب الثاني؛ نظام مع وفرة المفترس والفريسة عالية، حجم عينة صغيرة للغاية)
- يهز بلطف النباتات تحت الماء، وإزالة من حاوية زراعة، ووضعها على المواد ماصة لامتصاص المياه الزائدة. اعتمادا على متانة النباتات وحجم الفخاخ، واختيار 8-10 الأفراد النبات.
- تقسيم كل تبادل لاطلاق النار إلى أجزاء متساوية تقريبا عن طريق عد العقد ورقة تحمل أجهزة المحاصرين. كل قطعة تبادل لاطلاق النار سوف تعمل على جمع عينات مختلطة تمثل الشباب، في منتصف العمر، والفخاخ القديمة.
- قم بإرفاق قارورة زجاجية رقيقة وقارورة Eppendorf لجمع العينات بمضخة تمعجية. انتقل إلى إدراج طرف الشعرية في فتح فخ. باستخدام مضخة فراغ، تمتص كل السوائل من كل فخ حتى يتم جمع 900 ± 100 درجة مئوية من السائل فخ لكل فئة العمر فخ.
- استخدم عينات فرعية ثلاثية من 200 ميكرولتر من سائل الفخ المجمع لتجارب الرعي البروتستان. معالجة هذه على الفور على النحو المفصل في القسم 3. الحفاظ على ما تبقى ± 300 درجة مئوية من العينة لجميع التحليلات الأخرى للمكونات الميكروبية التي تعيش في السائل، على النحو المفصل أدناه (القسم 2).
- انتقل فورا ً إلى القسم 2
2. تثبيت العينات التي تم جمعها
- Exp I and II: إصلاح عينات فرعية من الماء/الفخ للتعداد البكتيري (القسم 4؛ حوالي 20 مل و0.3 مل، على التوالي) مع الفورمالديهايد لمدة ساعة واحدة على الأقل للحصول على حجم نهائي 2%: تركيز الحجم في كل عينة.
ملاحظة: التعامل مع الفورمالديهايد حصرا في غطاء محرك السيارة الدخان، وارتداء القفازات في جميع الأوقات في حين التلاعب العينات.
3. عينة الترشيح
- تخفيف العينة (إكسب الأول): لا حاجة إلى تخفيف لعينات مياه الخزان. (إكسب 2): تمييع عينة السائل فخ 10x-100x مع المياه MQ خالية من الجسيمات لتحقيق توزيع مناسب للميكروبات المستهدفة على أسطح التصفية قبل العد عن طريق الفحص المجهري.
- تصفية 1-2 مل (إكسب 1) من مياه الخزان أو 10-30 ميكرولتر (إكسب 2) من العينة الفرعية للسائل فخ للعد البكتيري على مرشحات سوداء 0.2 ميكرومتر حجم المسام، وذلك باستخدام قمع الترشيح (قطر 25 ملم).
- وصمة عار المرشحات مع DAPI (4', 6-دياميدينو-2'-فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد, 0.2% التركيز النهائي) لمدة 4 دقائق.
ملاحظة: تجنب تلوث الجلد وسطح العمل، وارتداء القفازات. - ضع المرشح مع الميكروبات المركزة على قطرة من زيت الغمر (للميكروسكوب الفلورسنت) على شريحة المجهر. ضع قطرة زيت أخرى على مركز المرشح وغطيها بغطاء، مع التأكد من توزيع الزيت بالتساوي.
- عند هذه النقطة، ويفضل معالجة العينات على الفور، أو بدلا من ذلك، تخزينها في الثلاجة (-20 درجة مئوية) لعدة أسابيع إلى أشهر حتى مزيد من التحليل.
4. تعداد الأرقام البكتيرية على المرشحات
- ضع الشريحة تحت مجهر الظهارة (مع مجموعة فلتر المقابلة لDAPI الفلوروكروم). ضع شبكة عد 10 × 10 في أحد العين. نقل الشريحة إلى موضع عشوائي.
- قياس الخلايا البكتيرية (الفلورة الزرقاء) في منطقة شبكة العد (تحت التكبير 1000x). في عمليات العد، قم بتضمين الخلايا التي تعبر الحواف اليسرى والعليا من شبكة العد، مع استبعاد الخلايا الموجودة عبر الحواف اليمنى والسفلية.
- الانتقال إلى موضع عشوائي آخر وتكرار التعداد على شبكات العد 10-15 على الأقل، تصل إلى 500 خلية محسوبة في المجموع.
- إنشاء عامل تحويل لمجهر معين والتكبير، استناداً إلى معرفة نسبة مساحة شبكة واحدة إلى إجمالي منطقة الترشيح الفعالة للمرشح. ثم، قم بتقسيم العدد الإجمالي للخلايا التي يتم حسابها بعدد الشبكات التي تم عدها، مما يؤدي إلى متوسط عدد البكتيريا لكل شبكة.
- ضرب المعلمة الأخيرة بعامل التحويل الذي تم إنشاؤه وتطبيع العدد الناتج لكل مل من العينة (اعتماداً على حجم العينة التي تمت تصفيتها) للحصول على الوفرة البكتيرية الإجمالية لكل مل.
5. تحديد وفرة البروتستان
- إصلاح عينة المياه (إكسب الأول) أو السائل فخ (إكسب الثاني) عينات فرعية مع إما الجلوتالارهايد (تركيز نهائي 1٪، وأكثر ملاءمة للعينات مع وجود الكلوروفيل تحتوي على الجسيمات التي سيتم معالجتها أيام إلى أسابيع بعد التثبيت) أو باستخدام تقنية إزالة لون formol-thiosulfate المحددة أدناه.
ملاحظة: كلا تقنيات الحفظ منع egestion من المواد التي ابتلعها من vacuoles الغذاء من protists8. - فيما يتعلق بتقنية إزالة لون السولمول ثيوسلفات، أضف 100 ميكرولتر/1 ميكرولتر من محلول لوغول إلى 20 مل/200 ميكرولتر من العينة الفرعية للسوائل المائية/الفخ (إكسب I/إكسب 2، على التوالي).
- اتبع على الفور مع إضافة 0.5 مل / 50 درجة مئوية من رسميين بورات المخزنة مؤقتا ثم 20 درجة مئوية / 2 ميكرولتر من 3٪ ثيوسولفات الصوديوم (إكسب I / إكسب الثاني، على التوالي).
ملاحظة: ثيوسولفات الصوديوم decolorizes اللون الأصفر من Lugol لتمكين مراقبة الخلايا تحت المجهر الظهارة8. - تصفية حجم معروف من عينة (اعتمادا على عدد protists الهدف) على 1 ميكرومتر المسام حجم مرشحات البولي الأسود.
- تقدير عدد الأنواع البروتية عن طريق عد ما لا يقل عن 200 خلية تحت التكبير 600x باستخدام شبكة العد (انظر أعلاه).
- تقليل حجم العينة تحت فراغ في قمع الترشيح عن طريق فراغ منخفض إلى ما يقرب من 2 مل. ثم, الإفراج عن تحت الضغط وإضافة الفلوروكروم DAPI (4',6-دياميديينو-2-فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد13,0.2% التركيز النهائي) لمدة 2 دقيقة.
6- تحديد الهيكل المجتمعي للأهال في عينات العوالق
ملاحظة: المجتمعات الهليسية في موائل المياه العذبة متنوعة للغاية14،15،16،18،وتصميمها المجهري هو التحدي. فرز المجموعات ciliate في النقابات الوظيفية10،14،16،17 يسمح لتحليل أكثر تفصيلا من مختلف مجموعات أهداب كبكتيريا البحرية.
- تقييم بنية المجتمع من خلال الجمع بين ما يلي:
- عينات ملطخة DAPI في المجهرية epifluorescence (لتوطين الخلايا الهدبية مع الفلورة مشرق من النوى الكلي والجزئي من مختلف الأحجام ومورفولوجيا) جنبا إلى جنب مع استيعاب البكتيريا وصفت الفلورسنت (FLB8؛ للحصول على التفاصيل، انظر أدناه)، وتتبع قدرة الهداب اتال تتغذى على البكتيريا.
- مراقبة عينة حية في حالات مختارة17،19. لمزيد من التفاصيل حول المناهج والمعايير المذكورة أعلاه المستخدمة لتجميع الهالات في فئات تصنيفية مختلفة، راجع المنشورات السابقة16،17.
ملاحظة: أشارت الدراسات المذكورة إلى أن من بين الأهداب، الأنواع المنتشرة من Stichotrichia (جنس الهالتريا وبيلاغوهالتريا)وOligotrichia (وهي Rimostrombidium spp.) هي أهم المستهلكين البحرية من العوالق البكتريولوجية في الغالبية العظمى من موائل المياه العذبة10،17،18.
7- تقدير معدلات الرعي في الهدبية
- حساب معدلات الاستفادة من الهداب على البكتيريا على أساس التغيرات في متوسط عدد التتبع [أي FLB8 لكل أهداب تتعلق وقت الحضانة (5-15 دقيقة)] وكمية التتبع من FLB وأضاف، مما يمثل على الأكثر ل 5٪ -15٪ من مجموع البكتيريا.
- لمقارنة معدلات التناول بين مختلف الأنواع البروتستان، تطبيع معدلات التناول كما عدد البكتيريا لكل أهداب في الساعة، مع حسابات على أساس الوقت الحضانة الفعلية ونسبة التتبع FLB وأضاف.
ملاحظة: يُصوَّر في الشكل 1المخطط العام لتطبيق طريقة FLB لتقدير معدلات البكتيريا الضخمة والخاصة بكل من الخلايا أو الأنواع في العينات الطبيعية. - إعداد FLB من السلالات البكتيرية الأصلية إلى بيئة المياه العذبة8
- حدد حجم مناسب (متوسط حجم الخلية = MCV) ومورفولوجيا البكتيريا بحيث تحاكي بشكل فعال الأحجام النموذجية للبكتيريا العوالق / الخلايا البكتيرية في النظام المائي الذي يجري التحقيق فيه.
ملاحظة: بالنسبة للإكسب الأول، تم استخدام خليط من سلالات معزولة من موقع دراسة جنس Limnohabitans وPolynucleobacter (أي نموذجية، العوالق الجرثومية وفيرة للغاية في البحيرات والبرك)20. لمزيد من التفاصيل حول مورفولوجيا وأحجام السلالات، انظر المنشورات السابقة3،17،18،21. - حصاد الخلايا البكتيرية من الثقافة عن طريق الطرد المركزي (5000 × ز)لمدة 15 دقيقة في مرحلة ثابتة في وقت مبكر ومزجها في نسبة عددية التي تنتج MCV ± SD من الخلايا في الخليط المقابل لMCV نموذجية من البكتيريا في الموقع المختار.
- تعليق الكريات في 10 مل من المالحة المخزنة الفوسفات (PBS؛ درجة الحموضة = 9).
- إضافة 2 ملغ من صبغ الفلورة الصفراء والخضراء 5-(4,6-ثنائي كلوروتريازين-2-yl) أمينوفلورسين (DTAF، يربط إلى البروتينات) إلى تعليق الخلية في العازلة الفوسفات المالحة، وحضانة في حمام المياه 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- بعد الحضانة، الطرد المركزي الخلايا إلى أسفل، decant الحل DTAF، وغسل والطرد المركزي 3X مع PBS.
- بعد الغسيل النهائي، إعادة تعليق الخلايا في 20 مل من المخزن المؤقت PPi-المالحة.
- دوامة تعليق FLB وماصة 1.5 مل aliquots في 2 مل قارورة التبريد، ثم الحفاظ على المجمدة (في -20 درجة مئوية) في PPط-المالحة العازلة حتى الاستخدام.
- قبل تصفية PPط-المالحةالعازلة من خلال مرشح البولي 0.2m للاستخدام في الخطوة التالية.
- لتحديد تركيز FLB، نقل aliquot صغيرة (عادة 20-40 درجة مئوية) إلى 2 مل من الجسيمات خالية PPI-المالحةالعازلة، sonicate في 30 W لعدة رشقات نارية 2 ثانية، وتصفية على 0.2 ميكرومتر مرشح أسود البولي للتعداد عن طريق epifluorescenceence الفحص المجهري (1000X التكبير) تحت إعدادات التصفية البصرية لDTAF (448 نانومتر / 520-540 نانومتر).
- حدد حجم مناسب (متوسط حجم الخلية = MCV) ومورفولوجيا البكتيريا بحيث تحاكي بشكل فعال الأحجام النموذجية للبكتيريا العوالق / الخلايا البكتيرية في النظام المائي الذي يجري التحقيق فيه.
- تقنية التتبع لتقدير بكتيريا الهداب
- بالنسبة لتجارب الرعي في الموائل الطبيعية العوالقية، الاستغناء عن عينات 300 مل في قوارير 1 لتر مغسولة جيدا ً وحضانة في درجة حرارة الموقع لمدة 15 دقيقة (للسماح للبروتيين بالتعافي من صدمة المناولة).
- إضافة تتبع FLB لتشكيل 5٪ -15٪ من مجموع البكتيريا، مع المبالغ المضافة اعتمادا على الموسم ودرجة حرارة المياه.
ملاحظة: هناك طيف واسع جداً يعتمد على الموسم في معدلات التناول بالأنواع الخاصة بالهالة التي تغطي عدة أوامر من الحجم (أي من 101-104 بكتيريا تهداب-1 في الساعة)10،16، 17،18،22،23،24. - في فترات من البروز المعزز ة من الهدابات مع معدلات التحمل العالية (عادة خلال فصل الصيف)، كما تشغيل حضانة موازية مع إضافات FLB منخفضة جدا، مما يشكل فقط 2٪ -4٪ من مجموع البكتيريا لتجنب التحميل المفرط من الفراغات ciliate من قبل التتبع FLB (انظر أمثلة في الشكل 2).
- احتضان أهداب / العوالق عينات مع FLB لمدة 5-15 دقيقة.
- هناك احتمالان لتثبيت العينة لمنع egestion من المواد التي ابتلعها من vacuoles الغذاء من protists8. إنهاء الحضانة بإضافة 1٪ الجلوتالالديهايد (التركيز النهائي الذي هو أكثر ملاءمة للعينات مع الجسيمات التي تحتوي على الكلوروفيل، مثل الطحالب). بدلاً من ذلك، استخدم 100 ميكرولتر/10 ميكرولتر من محلول لوغول إلى 20 مل/200 ميكرولتر من عينة السوائل المائية/الفخ، تليها مباشرة إضافة 0.5 مل/10 ميكرولتر من رسميلين المخزنة ببورات ثم 200 ميكرولتر/2 ميكرولتر من 3% ثيوسولفات الصوديوم (إكسب I/إكسب الثاني، على التوالي).
- بعد إضافة المثبت، والسماح للعينات بقية لمدة ساعة واحدة على الأقل في الظلام في 4 درجة مئوية لضمان الحفاظ على شامل للخلايا أهداب.
- أخذ عينات فرعية من العوالق الطبيعية من 4-30 مل/10-30 ميكرول (إكسب I/إكسب 2، على التوالي؛ يعتمد الحجم على وفرة الهداب) ووصمة عار مع DAPI (التركيز النهائي 0.2٪ الوزن / المجلد؛ للاطلاع على التفاصيل، انظر الخطوة 3.2 أعلاه).
- تمر من خلال 1 ميكرومتر مرشحات سوداء وتفقد عن طريق الفحص المجهري للعد ciliates (600x التكبير) وتعداد عدد تتبع FLB بلعها (في الغالب في التكبير 1000x) كما هو مفصل في المنشورات السابقة2،17 . فحص العينات في غضون 7 أيام بعد الحفظ.
- ولتقدير مجموع الرعي البروتوزوان/الأنواع الخاصة، اضرب متوسط معدلات التناول بجميع الهداب، أو الأنواع الهدبية فقط كما تم اكتشافها بوفرة في الموقع.
- ويرد على النحو التالي مثال لحساب معدلات الاستهلاك لكل خلية من البيانات الموقعية من خزان مياه ريموف:
- افترض أن التركيز البكتيري هو 3.55 × 106 بكتيريا / مل وتعقب FLB وأضاف هو 0.25 × 106 FLB / مل، الذي ينتج مجموع 3.8 × 106 بكتيريا / مل من مجموع الجسيمات البكتيرية (البكتيريا الطبيعية + FLB = 100٪ من جزيئات فريسة) المتاحة لعلماء البُتَوَتِّيِيّين في العينة الطبيعية.
ملاحظة: تمثل أجهزة تتبع FLB المضافة بالتالي 6.58% (مشروع 0.25/0.038) من إجمالي الجسيمات البكتيرية. متوسط عدد FLB لكل الرسن sp. هو 6.2 FLB في 5 دقائق الحضانة. - لتطبيع التناول في الساعة، استخدم الحساب التالي: (6.2 × 12)/(6.58/100) = 1131 بكتيريا لكل خلية/ساعة من الهالتريا.
ملاحظة: لمزيد من الأمثلة على توزيعات معدلات الإنقباق الفردية لـ Halteria sp. التي تم اكتشافها تحت درجات حرارة المياه المتغيرة، والمبالغ (كنسب مئوية) من تعقب FLB المضافة، وأوقات حضانة مختلفة مع FLB، راجع الشكل 3.
- افترض أن التركيز البكتيري هو 3.55 × 106 بكتيريا / مل وتعقب FLB وأضاف هو 0.25 × 106 FLB / مل، الذي ينتج مجموع 3.8 × 106 بكتيريا / مل من مجموع الجسيمات البكتيرية (البكتيريا الطبيعية + FLB = 100٪ من جزيئات فريسة) المتاحة لعلماء البُتَوَتِّيِيّين في العينة الطبيعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مثال التجربة ركضت في خزان المياه Římov (بوهيميا الجنوبية، تشيكوسلوفاكيا)، وهو موقع طبيعي مع أقل الطبيعية في الموقع المفترس ووفرة فريسة. يتم الإبلاغ عن البيانات التمثيلية للأنواع الهدبية الشاملة الرسنة grandinella، وهو مرعى وفيرة وفعالة من البيكوالعوالق (<2 م) الجسيمات10،16،17،18 ،22. ويبين الشكل 3 قطع اقطاب الصناديق والشعيرات من أرقام فلب لكل خلية من الهالتريا من خزان ريموف(الشكل 3ألف)،التي أعيد حسابها لمعدلات التناول البكتيري في الساعة(الشكل 3باء) الكشف عنها في أربع تجارب فردية أجريت في نيسان/أبريل وأيار/مايو وآب/أغسطس وأيلول/سبتمبر. وكان هناك تباين كبير في معدلات التناول بالهالة، ويعزى ذلك إلى حد كبير إلى الاختلافات الزمنية في درجة حرارة المياه.
وتجدر الإشارة إلى أن المعلمة Q10 تعكس حقيقة أن العمليات الميكروبية تعمل بسرعة 2.5 مرة تقريبا ً مع زيادة في درجة الحرارة قدرها 10 درجة مئوية12، والتي تحمل أيضاً معدلات التناول بالهداب على البكتيريا. مع هذه القاعدة الفسيولوجية في الاعتبار، تم استخدام نسب مختلفة إلى حد كبير من FLB وأوقات الحضانة لمواسم مختلفة (لمزيد من التفاصيل، انظر الشكل 3A). وهكذا، تم تعويض تأثير درجة الحرارة المتوقعة، ونتج عن الإعداد التجريبي متوسط الأمثل والقيم الوسيطة لمعدلات التحمل ما بين 5-10 FLB لكل خلية أهداب. عموما، هذه الكميات من FLB بلعها يمكن عدها بسهولة (انظر الأمثلة في الشكل 2،صورتين اليسرى)، وتوليد تقديرات دقيقة للتتبع (في الغالب بين 1-15 FLB لكل أهداب) معدلات التحمل. ومع ذلك، بسبب تعديل FLB التتبع وأضاف (٪) وأوقات مختلفة من حضانة العينة القيم المطلقة (معبرا عنها كعدد من البكتيريا ترعى أهداب في الساعة) تختلف اختلافا كبيرا (p < 0.01, Kruskal-Wallis اختبار; تليها اختبار المقارنة المتعددة دان, p < 0.05; انظر الأمثلة في الشكل 3B)من بين التجارب. وتوضح البيانات أيضا ً التغير الطبيعي النموذجي في معدلات البكتيريا المطلقة في مجموعات العوالق في هالتريا غراندينيلا، مع تطابق وثيق بين قيمها المتوسطة والمتوسطة (الشكل 3).
في وجود أهداب اتّصال ية عالية الكفاءة في العينات، مثل الهدابات المعترّقة، يمكن أن تصبح بشكل كبير "مُصنّفة أكثر من أن" من قبل FLB بكميات متتبع نموذجية تتراوح بين 5% و10% من مجموع البكتيريا (انظر صورة الجانب الأيمن في الشكل 2). وهذا قد يحد بشدة من التحديد الكمي الدقيق لـ FLB التي تم تناولها. في مثل هذه الحالات، يقترح تشغيل حضانة موازية إضافية مع كميات منخفضة فقط من FLB تمثل فقط 1.5٪ -3٪ من مجموع البكتيريا. ومع ذلك، عموما يمكن التلاعب على حد سواء مبالغ التتبع وكذلك أوقات الحضانة لتحسين عدد FLB لكل خلية(الشكل 2).
مثال تجربة [إيي]: يعرض المعطيات من نظامة مع كبيرة مفترسة وفريسة وفرة, حيث فقط صغيرة عينة حجم يكون يتوفّر أن تجريبيّا يقدّم جرثوميّة معدلات من ال [هبّت] [ترثيمينا] [أوتريكلّي] 25.بل هو الرعاة البكتيرية المعتدلة الذين يعيشون في وفرة عالية حصرا في الفخاخ من النباتات آكلة اللحوم Utricularia reflexa 26،27. ويبين الشكل 4 قطع الأراضي المربعة والشعيرات لعدد من FLB لكل خلية من الخلايا من T. utriculariae في إطار بيئات تجريبية مختلفة(الشكل 4ألف، باء)التي يعاد حسابها في معدلات التناول البكتيري في الساعة(الشكل 4 C،D) الكشف عن هادىن الشباب وناضجة والقديمة. ومن المثير للاهتمام في الفخاخ، تم الكشف عن مجموعات الكلوروبلاست الحاملة للأهداب T. utriculariae، في حين تم عزل السكان الأبوكلوريك من T. utriculariae من الفخاخ والحفاظ على تعليق بكتيري مختلط ينمو على حبوب القمح في الظلام (للاطلاع على التفاصيل، انظر الشكل 1 في منشور سابق26).
وتعيش مجموعات الكلوروبلاست الحاملة للكلورولات في مصائد مضاءة بالضوء؛ وبالتالي، فإن الكلوروبلاست يمكن أن توفر مصدر الكربون العضوي ة إضافية والأكسجين إلى المضيف ciliate. وكان من الفرضيات التي تم اختبارها أن مجموعات الأبوكلورية ترعى البكتيريا بشكل أسرع بكثير، حيث تمثل البكتيريا المصدر الجسيمي الوحيد للكربون العضوي المتاح للمجموعات الفرعية المعزولة المزروعة في الظلام في الهداب.
في الواقع، في حين لم تكن هناك اختلافات كبيرة في معدلات البكتيريا من الهدابات الذين يعيشون في الفخاخ الشباب وناضجة والقديمة من التفكير Utricularia (الشكل 4A، C)،والسكان apochloric من T. utriculariae ترعى البكتيريا بشكل ملحوظ (p < 0.01, Kruskal-Wallis test; followed by the Dunn's multiple-comparison test, p < 0.05), ما يقرب من 3x أسرع من ciliates الكلوروبلاست التي تعيش في الفخاخ الشباب, ناضجة, والقديمة(الشكل 4C, D). لاحظ أنه مرة أخرى، تم تعديل كل من مبالغ التتبع وكذلك أوقات الحضانة(الشكل 4A، B، أعلى) لتحسين عدد FLB لكل خلية (عموما بين 1-15)، مع متوسط ومتوسط القيم حول 5 FLB / ciliate. هذه الأرقام يمكن تمييزها في الفراغات الغذائية ciliate ويسمح العد دقيقة التتبع. ومع ذلك، وأعرب عن أعداد مطلقة من البكتيريا التي ترعى في الساعة، ورعي السكان الكلوروبلاست وapochloric ما يقرب من 350 و 1000 البكتيريا تهداب في الساعة، على التوالي. جلبت هذه المجموعة التجريبية رؤى جديدة في الصفات الأيضية والفيزيولوجية لاثنين من المجموعات الفرعية متميزة من نفس الأنواع الهدبية الذين يعيشون تحت قيود بيئية مختلفة بشكل لافت للنظر25،26، 27.
الشكل 1 سير العمل من استخدام البكتيريا ذات العلامات الفلورية (FLB) لتقدير معدلات الرعي الخاصة بالخلايا والأنواع من نسبة التتبع المبتلع FLB إلى العدد الإجمالي للبكتيريا الطبيعية في العينة. وللحصول على مزيد من التفاصيل، انظر الفرع 7 من البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 أمثلة على الخلايا الهدبية من العوالق من بركة سمك المغذيات. وتظهر الأمثلة من البركة مع FLB يمكن عدها في الخلايا الهدبية (عموما 1-10 التتبع FLB لكل خلية، واليسار اثنين microphotograps) مقارنة مع ciliate peritrichous Pelagovorticella natans (الصورة الدقيقة الجانب الأيمن). حتى خلال فترة قصيرة، 5 دقائق الحضانة، أصبح "الإفراط في المسمى" من قبل FLB التتبع، مما يجعل الكم من FLB بلعها غير دقيقة أو شبهمستحيلة . في هذه الحالة، ويقترح لخفض كمية التتبع إلى 1.5٪ -3٪ من مجموع البكتيريا. ومع ذلك، عموما يمكن التلاعب كل من كميات التتبع وأوقات الحضانة لتحسين عدد FLB بلعها لكل خلية. وللحصول على مزيد من التفاصيل، انظر الفرع 7 من البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 قطع أرض صندوق وشعيرات من أرقام FLB لكل خلية من الرسنsp. من خزان Římov (Exp I) (A)، أعيد حسابها إلى معدلات التناول البكتيري في الساعة (B). وقد تم الكشف عن البيانات في إطار بيئات موسمية مختلفة، تمثلها أربعة أمثلة في الفترة من نيسان/أبريل إلى أيلول/سبتمبر. الجزء العلوي من لوحة A يظهر معلومات عن درجة حرارة المياه، وأضاف تتبع FLB مختلفة (٪)، وأوقات مختلفة من حضانة العينة. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تعديل المعلمات الأخيرتين لتحسين عدد FLB لكل خلية، مع متوسط (خط كامل) ومتوسط (خط متقطع) القيم تقريبا بين 5-10 FLB لكل خلية أهداب(A). وتظهر القضبان النسبتين المئوية 25 و75 من جميع البيانات (50-180 خلية تم تفتيشها) وشعيرات تقف على المئة 1 و 99. (ب)تشير الأحرف الصغيرة المختلفة إلى اختلافات كبيرة في معدلات البكتيريا الخاصة بالخلايا من الهالتريا sp. خلال الفترة المشمولة بالدراسة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 قطعة أرض من أرقام FLB لكل خلية: وتظهر المؤامرات من الكلوروبلاست تحمل Tetrahymena utriculariae من العلاجات الثلاثية من الفخاخ الشباب، ناضجة، والقديمة من التفكير Utricularia (إكسب الثاني) (A)،إعادة حساب لمعدلات التناول البكتيري في الساعة(C). تمت مقارنة البيانات مع معدلات التناول البكتيري من السكان apochloric مكررة من T. utriculariae (B, D)معزولة عن الفخاخ ولكن الحفاظ على تعليق البكتيرية المختلطة المتنامية على حبوب القمح في الظلام. في الجزء العلوي من لوحات A و B، وأضاف تتبع FLB مختلفة (٪) وتظهر أوقات مختلفة من حضانة العينة. وتجدر الإشارة إلى أنه تم تعديل المعلمات الأخيرتين لتحسين عدد FLB لكل خلية، مع متوسط (خط كامل) ومتوسط (خط متقطع) القيم تقريبا بين 5-10 FLB لكل خلية أهداب(A، B). وتظهر القضبان النسبتين المئوية الخامسة و95 من جميع البيانات (50-100 خلية تم تفتيشها)، وتقف شعيرات الشعيرات في الفي المئة 1 و 99. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فك التفاعل الغذائي في النظم المائية هو دائما تحديا28، وخاصة في جداول العوالق نانو التي تنطوي على protists وفريستهم ، والبكتيريا. عندما يتعلق الأمر بمسارات امتصاص المواد الغذائية والقياس الكمي، فإن تطبيق الأساليب المستخدمة بنجاح في مستويات غذائية أعلى أقل من الممكن، وذلك بسبب التعقيد العالي للتفاعلات الحيوية. وتشمل هذه، على سبيل المثال، نُهُج وضع علامات مستقرة على النظائر المشعة. يوضح هذا البروتوكول مزايا استخدام الفحص المجهري والبكتيريا التي تحمل اسم الفلورسنت كجهاز تتبع لمسار تدفق الكربون وشبه القياس/التقدير (الفريسة البكتيرية: المراعي البروتستان المختلفة بما في ذلك المراعي mixotrophic29) مسارات من خلال قاعدة الشبكات الغذائية الميكروبية. وإحدى هذه المزايا هي الدقة العالية لنهج الخلية الواحدة، والأخرى هي القرار غير المسبوق فيما يتعلق بهيكل مجتمع الرعي والتمييز بين مختلف النقابات الوظيفية، والأنواع (إكسب 1)، وحتى التجمعات السكانية الفرعية من نفس الأنواع (إكسب 2).
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
وهناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول يمكن أن تكفل استخدام مزايا المنهجية بكامل إمكاناتها. أولاً، الفهم الأساسي للبيئة المدروسة قبل بدء التجربة مفيد دائماً. ويشمل ذلك الفحص المجهري لتنوع ووفرة المراعي المحتملة الموجودة، وأحجام الفرائس البكتيرية، وتوزيع الفرائس على حد سواء 1) في عمود الماء (على سبيل المثال، لمحة رأسية من الظهارة إلى نقص التمني) و 2) في حالة الخزانات على شكل الوادي ، على السدود في تدفق المقطع. ثانيا، سوف التلاعب الدقيق مع العينات التي تم جمعها ضمان النتائج التمثيلية. درجة الحرارة هو عامل مهم للغاية تؤثر على معظم العمليات الميكروبية12، بما في ذلك معدلات الرعي protist (الشكل 3).
ثالثاً، إن التلاعب بكمية التتبع المضافة استناداً إلى القياس الكمي للخلايا البكتيرية أو نوع الرعاة في العينة سيضمن القضاء على المشاكل المتعلقة بالإفراط في وضع العلامات(الشكل 2). وتجدر الإشارة إلى أن هناك طيفاً واسعاً جداً في معدلات التناول بأنواع محددة من الهدبية (للاطلاع على التفاصيل، انظر الخطوة 7-2)؛ وبالتالي، فإن تطبيق البروتوكول على النحو المناسب، من الضروري معرفة مسبقة بالأنواع الرئيسية من الهداب مع معدلات الاستفادة من الدورات الزمنية. ينصح بشدة لتشغيل التجارب الأولية مع كميات مختلفة من التتبع لتجنب الهالة المحتملة تحت وضع العلامات (لا يتم تناول أي أو عدد قليل جدا من FLB في كل خلية أهداب، مما أسفر عن بيانات غير سليمة إحصائيا) أو الإفراط في وضع العلامات (يظهر كأعداد كبيرة من FLB تشكيل "تكاثف FLB الغيوم" أو قطعان في الفراغات الغذائية أهداب معبأة من قبل التتبع، وبالتالي الحد بشدة من التحديد الكمي الدقيق؛ راجع المثال العلوي الأيمن في الشكل 2). وتجدر الإشارة أيضا إلى أن أوقات الحضانة مع FLB هي عموما أقصر من 30 دقيقة، لأن متوسط وقت الهضم من picoplankton بواسطة ciliates حوالي 1.5 ساعة، ويبدأ الهضم (خلايا بيكوالوبكة بلوبع يفقد شكله واللون نموذجي) تقريبا بعد 45-60 دقيقة30. وبالمثل، يجب تحقيق التخفيف الأمثل وتوزيع العينات على المرشح قبل المشاهدة المجهرية للحصول على نتائج دقيقة.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يتم توضيح الخطوات الرئيسية والتعديلات المحتملة وتعديلات استكشاف الأخطاء وإصلاحها للتقنية في الشكل 1 والشكل 2. بالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه في حالات التركيزات العالية من جزيئات الدتريك، وخلايا العوالق النباتية، أو مستعمراتها في العوالق، مثل هذه العينات 1) ينبغي أن تضعف في المقابل لتحقيق مرحلة يمكن أن تكون فيها خلايا الرعي الفردية تميز على سطح مرشح و 2) تخضع للقياس الكمي من محتويات vacuole الغذاء.
القيود
يكمن القيد الرئيسي للتطبيق الناجح لهذه الطريقة في وجود مختلف المخلفات العضوية أو الجسيمات غير العضوية/العضوية الوفيرة مع البكتيريا المرفقة أو المجاميع بكميات تمنع عرض عينة واضحة تحت الوفرة المجهر وتقدير دقيق لكمية التتبع المضافة. وتجدر الإشارة إلى أن تقنية التتبع المقدمة تعمل في المقام الأول مع البكتيريا الحرة (أي المعلقة) التي لا تعلق على الجسيمات. ومع ذلك، استنادا إلى تجربتنا الخاصة ومراجع الأدب (انظر المنشورات السابقة2،4،8،10،16،18،21 ،26)،المنهجية المقدمة مناسبة لمعظم البيئات المائية. وترد أمثلة على نظامين طبيعيين متناقضين يختلفان في الحالة الغذائية، ومحتوى المخلفات، وتنوع المراعي وأعدادهما(الشكل 3 والشكل 4).
أهمية النهج فيما يتعلق بالأساليب القائمة
الأهم من معرفة وفرة من taxon / taxa من البكتيريا ومعدلات البكتيريا الخاصة بهم الأنواع، يمكن حساب معدل البكتيريا السائبة من الضريبة بروتستان (أو مجموع تجميع الهداب). إذا تم تطبيق هذا النهج على بيئات العوالق الطبيعية بالتزامن مع كل من الرايات غير المتجانسة والهدابات (التي تمثل الرعي الرئيسي للبكتيريا العوالق2،6،7) ، وprotistan يمكن تقدير وقت دوران السكان البكتيرية الناجمعن الرعي في بيئة معينة16،17،18،22. ولهذه البيانات أهمية أساسية في تقدير ديناميات تدفق الكربون في الشبكات الغذائية الميكروبية.
الطلبات المقبلة
هناك بيئات محددة أخرى حيث يمكن استخدام هذا الأسلوب، مع بعض التعديلات، بنجاح. وتشمل هذه النظم أنظمة الحمأة المنشطة، والنظم الإيكولوجية للرومن، والرواسب المائية، وأحواض الأسماك الضخامية17. ومع ذلك، يتطلب التطبيق في هذه البيئات الغنية بالمغذيات والميكروبات اختبارات أولية لتحسين البروتوكول فيما يتعلق بالحجم المناسب، والمورفولوجيا، وأعداد التتبع FLB التي يمكن أن تحاكي توزيع الحجم النموذجي والخصائص الأخرى من البكتيريا فريسة المتأصلة في البيئة.
وفي الوقت الراهن، هناك اهتمام متزايد بالجمع بين هذا النهج والفلورة المحفزة للمراسل في الموقع (CARD-FISH)، التي يتم فيها الكشف عن هوية خلية الرعي (مثل الفلاجيلات غير المتجانسة) مع وجود علامة محددة ويستند FISH-التحقيق ومعدل الانقباة على محتوى FLB في vacuoles الغذاء من الخلية flagellate على نفس الشريحة المجهرية31. نهج متطور وجديد يسمى التهجين المزدوج32 هو مزيج من تحقيقات FISH على مستويات الخلية المفترسة والبكتيريا الجارحة (التي وصفت أيضا على وجه التحديد من قبل سلالة فيوجينية، وهو مسبار الأسماك البكتيرية الخاصة النسب). هذا النهج هو أنيق ولكن أيضا تستغرق وقتا طويلا ويتطلب مهارات محددة والخبرة31،32،في حين أن تطبيق مختلف التعديلات نهج الاستفادة FLB يمكن أن تعتمد بسهولة أكبر للاستخدام الروتيني في المختبرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم المؤسسة التشيكية للعلوم في إطار منحة البحث 13-00243S و19-16554S الممنوحة لـ K. Š. وD.S.، على التوالي. كما تم دعم هذه المقالة من قبل مشروع "المعالجة البيولوجية كأداة لتحسين نوعية المياه من خزانات السدود" (لا CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417)، بتمويل من الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية، في بحوث البرنامج التشغيلي، والتنمية والتعليم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 - dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 - add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
- Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
- Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
- Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
- Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
- Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
- Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
- Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
- Sherr, E. B., Sherr, B. F. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. , Lewis Publishers. Boca Raton, Florida. 695-701 (1993).
- Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
- Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
- Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
- Kirchman, D. L. Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2018).
- Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
- Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
- Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
- Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
- Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
- Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
- Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , in press (2019).
- Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
- Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209 (2013).
- Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
- Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
- Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
- Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225 (2018).
- Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
- Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
- Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
- Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
- Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
- Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
- Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).
