Summary
Denne artikel indeholder en trinvis vejledning til undersøgelse af protein subcellulær lokaliserings dynamik og til overvågning af morfologiske ændringer ved hjælp af Fluorescens mikroskopi i høj opløsning i Bacillus subtilis og Staphylococcus aureus.
Abstract
Undersøgelser af faktorer, der påvirker celledeling og celle form i bakterier, udføres almindeligvis sammen med højopløsnings Fluorescens mikroskopi, da observationer foretaget på et populationsniveau måske ikke i virkeligheden afspejler, hvad der sker på et enkelt celleniveau. Live-Cell timelapse mikroskopi giver undersøgere mulighed for at overvåge ændringer i celledeling eller celle morfologi, som giver værdifuld indsigt om subcellulære lokalisering af proteiner og timing af genekspression, som det sker, til potentielt støtte i besvarelsen af vigtige biologiske spørgsmål. Her beskriver vi vores protokol til overvågning af fænotypiske ændringer i Bacillus subtilis og Staphylococcus aureus ved hjælp af et højopløsnings-devolution-mikroskop. Formålet med denne rapport er at tilvejebringe en enkel og klar protokol, som kan vedtages af andre efterforskere, der er interesseret i at gennemføre eksperimenter med Fluorescens mikroskopi for at studere forskellige biologiske processer i bakterier og andre organismer.
Introduction
Området for bakteriel cellebiologi er blevet betydeligt forbedret af de seneste fremskridt i mikroskopi teknikker1,2. Blandt andre instrumenter, mikroskoper, der er i stand til at gennemføre timelapse Fluorescens mikroskopi eksperimenter forbliver et værdifuldt værktøj. Efterforskere kan overvåge forskellige fysiologiske hændelser i realtid ved hjælp af fluorescerende proteiner såsom grøn fluorescerende protein (GFP)-baseret transkriptional og translationel reporter fusioner, fluorescerende D-aminosyrer (FDAA)3, eller bruge andre pletter til mærkning af cellevæg, MEMBRAN og DNA. Det er derfor ikke overraskende, at Fluorescens mikroskopi fortsat er populær blandt mikrobielle celle biologer. Ud over blot at vise de endelige fænotyper, giver oplysninger om, hvordan de observerede fænotyper opstår ved hjælp af timelapse mikroskopi kunne tilføje betydelig værdi til resultaterne og potentielt give fingerpeg om, hvad cellulære processer målrettes af potentielle Drug kandidater4.
Protokollerne til at gennemføre højopløsningsbilleder ved hjælp af et fuldt motoriseret, inverteret, bredt felt fluorescens mikroskop (Se tabellen over materialer) er angivet i denne artikel. Disse protokoller kan tilpasses behovene i andre fluorescens mikroskoper, der er i stand til at gennemføre timelapse mikroskopi. Selv om den software, der diskuteres her, svarer til den specifikke producent-leverede software som angivet i tabellen over materialer, software, der almindeligvis leveres af andre mikroskop fabrikanter eller den frit tilgængelige ImageJ5, har tilsvarende værktøjer til at analysere mikroskopi data. For betingelser, hvor timelapse ikke er befordrende, kunne tidsforløb eksperimenter udføres som beskrevet i denne artikel. De protokoller, der er beskrevet her, giver en detaljeret vejledning til undersøgelse af fænotypiske ændringer i to forskellige bakteriearter: B. subtilis og S. aureus. Se tabel 1 for anvendte stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generelle vækstbetingelser
- Der inokuleres 2 mL passende vækstmedium suppleret med antibiotika (hvor det er påkrævet) med en enkelt koloni af den eller de stamme, der skal imældes. Disse frøkulturer inkubates natten over ved 22 °C i en ryste inkubator.
Bemærk: de specifikke bakterievækst betingelser, der anvendes i denne artikel, er angivet i afsnittet om repræsentative resultater. - Fortyndes overnight kulturer 1:20 i friske medier i en 125 mL kolbe, supplement med antibiotika (hvor det er nødvendigt).
- Dyrk kultur (er) ved 37 °C i en ryste inkubator indtil Mid-logaritmisk fase (OD600 = 0,5).
Bemærk: inducer eller inhibitor kan tilsættes direkte til dyrknings kulturen (-erne) i den relevante vækstfase. - Høst celler på ønskede dyrkningsbetingelser for mikroskopi prøveforberedelse som beskrevet i det følgende afsnit.
2. forberedelse af prøver
- Forbered 1% agopstået ved at kombinere 0,25 g molekylær biologi klasse, lav EEO, agopstået med enten 25 mL vækstmedium suppleret med passende antibiotika (hvor det er nødvendigt) for timelapse mikroskopi eller sterilt vand. Opvarm blandingen ved hjælp af en mikrobølgeovn i ca. 30 s og hæld den i en steril 100 mm x 15 mm Petri skål, og lad den størkne.
- Tag en 5 – 50 μL alikvot af cellekulturen afhængigt af behovet og pletter cellerne. Pletter celler med passende farvestoffer på dette stadium (f. eks tilføje fluorescerende farvestof FM4-64 (membran plet) for et eksperiment (figur 1)).
- Der afpipetteres en 5 μL alikvot af dyrknings prøven eller den farvede prøve, der skal indlægges på bunden af en 35 mm glasbund kultur skål (med 14 mm mikrobrønd diameter og ubestrøget No. 1,5 dækseddel; Se tabellen over materialer).
Forsigtig: Brug ikke poly-L-lysin coated dæksedler især for timelapse mikroskopi som de kunne fremkalde forskellige vækstmønster (vi har observeret dette med poly-D-lysin samt; data ikke vist) og/eller påvirke protein dynamik6. - For at minimere brugen af farvestoffer, Stain 3 – 4 μL cellesuspension (høstet ved OD600 = 0,5; ca. 2,7 x 107 og 3,4 x 107 for B. subtilis og S. aureus henholdsvis pr. 1 ml kultur) direkte på glasbunden skålen.
- Anbring en pre-cut agopstået plade (11 mm i diameter eller af enhver ønsket størrelse for at overlappe arealet af dæksedlen; skær ved hjælp af den åbne ende af et sterilt rør eller et barberblad) oven på prøven, og Tap forsigtigt for at sikre, at den agopstået plade ligger fladt mod dæksedlen.
- Der afpipetteres en 5 μL alikvot af dyrknings prøven eller den farvede prøve, der skal indlægges på bunden af en 35 mm glasbund kultur skål (med 14 mm mikrobrønd diameter og ubestrøget No. 1,5 dækseddel; Se tabellen over materialer).
- Efter billeddannelse (Se følgende afsnit), hvis antallet af celler i synsfeltet ikke er ønskeligt, justeres celletætheden i prøven via fortynding eller koncentration ved centrifugering og ændring af forholdet mellem cellerne i prøven ved hjælp af vækstmedium/buffer efter behov.
Bemærk: for at minimere autofluorescens, der stammer fra dyrkningsmediet, kan cellerne vaskes i buffer (f. eks. i standard 1x fosfatbuffer saltvand) og resuspenderes i passende mængde buffer før billeddannelse. Det er muligt, at mindre celler eller vesikler i dette trin ikke kan bevares efter centrifugering og derfor vil gå tabt. - Tilsæt vand ved hjælp af en pipette (~ 5 μL dråber) til rummet inde i kultur skålen (omkring dæksedlen) for at forhindre, at agrose pad tørrer, og for at hjælpe med at opretholde luftfugtigheden i løbet af billedet erhvervelse, især for timelapse eksperimenter.
- Tillad kultur retter at ækvibrere til temperaturen inde i inkubations kammeret, et indbygget uigennemsigtigt rum, der leveres af fabrikanten, af mikroskopet i 15-20 min.
Bemærk: Tænd for varmeelementet, og Indstil inkubations kammeret til en ønsket temperatur flere timer før billeddannelse. Dette vil sikre, at hardwaren stabiliserer sig til den nye temperatur. Ved længerevarende billedbehandling med tidsforskydning skal der anbringes et bægerglas eller en kolbe med vand i mikroskop kammeret, væk fra arbejdsområdet, for at opretholde luftfugtigheden.
3. billeddannelse
- På eksperimentets dag skal du tænde for mikroskopets system. Start billedbehandlings softwaren (Se tabel over materialer) ved at klikke på det relevante ikon på skrivebordet. Initialiser mikroskopet ved at klikke på indstillingen Initialiser mikroskop (knappen afbildet med et mikroskop på den) i softwarens start-up-dialogboks. Sørg for, at målet er helt sænket ved hjælp af mikroskopet grov justering før initialiseringen.
Bemærk: efter initialisering skal yderligere tre dialogbokse vises ud over menuen Start: resolve3D, dataindsamling og filter Monitor. - Placer en dråbe på 1,517 (brydningsindeks) olie på 100x olie nedsænkning mål leveret af fabrikanten (numerisk blænde = 1,4, arbejdsafstand = 0,12 mm; Se tabel over materialer).
Bemærk: det er vigtigt at vælge den passende nedsænknings olie til den temperatur, hvormed billeddannelse udføres. - Læg den glasbund, der indeholder prøven, ind i metalhuset (kisten), og skub forsigtigt ind i scene klemmen.
- Brug den grove justeringsknap til at hæve målet, indtil olien får kontakt med glasbunden af skålen. Brug øjestykket og finjusterings knappen til at bringe prøven i fokus. Når cellerne er i fokus, skal du dreje knappen fra øjen stykket til kameratilstand ved at flytte vælgerkontakten placeret på forsiden af mikroskopet til venstre.
- Begynd eksperimentet med billedbehandlings softwaren. I vinduet resolve3D skal du vælge ikonet design/Kør eksperiment , der er afbildet af en kolbe. Der skal vises en ny dialogboks med titlen design/Run eksperiment.
- Angiv antallet af Z-stakke og eksempel tykkelse ved hjælp af fanen design og derefter skæring i dialogboksen design/Kør eksperiment .
Bemærk: for eksperimenter i repræsentative resultater sektion, 17 Z-stakke ved 200 Nm interval for stillbilleder og fire Z-stakke ved 200 Nm interval for timelapse mikroskopi blev brugt. - Hvis du vil måle tykkelsen af cellerne i eksemplet, skal du manuelt justere Z-planet trinvist ved hjælp af pil op og pil ned i dialogboksen resolve3D . Marker, hvor cellerne går ud-af-fokus som den øvre og nedre grænse for billed erhvervelse. Importer disse oplysninger, inden eksperimentet køres.
- For at minimere fototoksicitet og foto blegning under billedbehandling i timelapse skal du reducere antallet af Z-stakke og vælge cellens midterplan til billed anskaffelse.
- Angiv antallet af Z-stakke og eksempel tykkelse ved hjælp af fanen design og derefter skæring i dialogboksen design/Kør eksperiment .
- Vælg det relevante filtersæt til eksperimentet ved hjælp af fanen design og derefter kanaler i dialogboksen design/Kør eksperiment (tritc: ex 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
- Vælg også en reference til samlingen af POL/DIC-oplysninger. Juster procent transmissionen (lysintensitet) og eksponeringsvarigheden for individuelle kanaler, som er valgt før afbildning, ved at vælge de relevante indstillinger i dialogboksen resolve3D .
Bemærk: i et test synsfelt, der ikke tages i betragtning for eksperimentet, testes disse indstillinger for at identificere, om de valgte parametre får meningsfulde fluorescens data uden manglende svagt signal eller overmætning. Importer derefter disse parametre for den eksperimentelle opsætning.
- Vælg også en reference til samlingen af POL/DIC-oplysninger. Juster procent transmissionen (lysintensitet) og eksponeringsvarigheden for individuelle kanaler, som er valgt før afbildning, ved at vælge de relevante indstillinger i dialogboksen resolve3D .
- Åbn listen punkter ved at vælge knappen punktliste i dialogboksen resolve3D . Der vises en ny dialogboks med titlen liste over punkter. Markér flere visningsfelter, der skal bruges i eksperimentet, ved at finde relevante visningsfelter ved hjælp af mikroskopets stadie kontrolelementer og vælge indstillingen Marker punkt i dialogboksen punktliste.
Bemærk: der skal vælges et erstatnings punkt, hver gang mikroskopet omfokuseres på et punkt i point listen. Dette kan gøres ved at fokusere mikroskopet på det relevante punkt på listen og derefter vælge knappen Erstat punkt . Det er vigtigt ikke at røre ved den analoge grove/fine justeringsknap, når der fokuseres igen; Brug kun softwaren til at justere fokus. - Angiv parametre for timelapse ved først at vælge fanen Design og derefter timelapse i dialogboksen design/Kør eksperiment. Marker afkrydsningsfeltet timelapse. Indtast de relevante timelapse-parametre i form af timelapse-billeder/samlet tid.
- Angiv punkter, der skal angives fra punkt listen, ved først at vælge fanen design og derefter punkter i dialogboksen design/Kør eksperiment. Vælg listen besøgs punkter, og Indtast punkter, der skal opdeles i tekstboksen adskilt af kommaer eller bindestreger, hvis det er en komplet sekvens.
- Før du påbegynder et eksperiment, skal du redigere filnavne og filplaceringer ved hjælp af fanen Kør i dialogboksen design/Kør. Filplacering kan ændres ved at vælge knappen Indstillinger , vælge data mappen og derefter vælge den relevante mappe eller oprette en ny. Rediger filnavne ved at indtaste det nye filnavn i tekstboksen billedfilnavn.
- Begynd eksperimentet ved at vælge knappen Afspil i dialogboksen Begynd eksperiment .
Bemærk: for timelapse, løbende kontrollere fokus på hvert synsfelt i hele eksperimentet ved hjælp af DIC indstilling (for at undgå unødvendig foto blegning) og fokusere og opdatere oplysningerne i punkt listen som celler tendens til at gå ud af fokus over tid.
4. billedbehandling
- Åbn de ønskede RAW (R3D) billedfiler til generering af tal.
Bemærk: senest gemte filer kan være placeret ved hjælp af data mappe knappen i Imaging softwarens start-up dialogboks. - Kør dekoncentrerings programmet for at fjerne fluorescens lys, der ikke er i fokus,7,8, for at producere en devolveret D3D-billedfil. Vælg fanen proces i dialogboksen Start-up, og vælg derefter devolve. Der vises en ny dialogboks med titlen devolve.
- Indstil dekoncentrerings parametrene ved at trække det relevante billed nummer (placeret i øverste venstre hjørne af hver billedfil) til input i dialogboksen dekoncentrering. Vælg knappen flere indstillinger i dialogboksen dekoncentrering, og fjern markeringen i afkrydsningsfeltet Beskær kant efter behandling (ellers kan billederne ikke overlejres i forhold til den tilsvarende dic-fil).
- Klik på knappen gør det i dialogboksen dekoncentrering for at devolve RAW-billedfil.
Bemærk: dekoncentrerings parametrene kan justeres som angivet i softwareproducentens vejlednings manual for de ønskede resultater.
- Hvis det er nødvendigt, udføre manuel baggrundsstøj subtraktion og lysstyrke/kontrast justering i enhver eller alle bølgelængde (farve) kanaler. Gør dette ved at vælge knappen kontrast justering på den devolverede billedfil.
- Gem billedet som en TIFF-fil ved først at vælge indstillingen fil øverst i D3D -dialogboksen. Vælg derefter Gem som TIFF, Identificer og vælg passende Z-stakke (der er i fokus), Vælg eller fjern markeringen af de ønskede filtersæt.
- Udfør data kvantificering ved hjælp af software leveret af producenten eller frit tilgængelige programmer som ImageJ5.
- For celle størrelses kvantificering skal du klikke på fanen værktøj på den relevante D3D-billedfil og derefter vælge indstillingen mål afstande . Mål afstande ved at vælge start-og slutpunkter på den ønskede billedfil ved hjælp af musen gennem venstre klik.
Bemærk: det er bedst at zoome ind på billedet under kvantificering af Cellestørrelse. - For fluorescens signal kvantificering Brug indstillingen data inspektør under fanen værktøj på den relevante D3D-billedfil.
Bemærk: det er bedst at zoome ind på billedet og kun at have relevante filtre valgt ved udfyldelse af fluorescens signalkvantificering. - For at kvantificere fluorescens signalet skal du tegne en boks med kolonne/række grupperet indstilling til specifik dimension. Vælg et område med signal, der skal kvantificeres, og Optag værdien. Mål baggrunds signalet ved at bruge samme størrelses boks til at markere et område umiddelbart uden for cellerne. Træk baggrundsværdien fra den værdi, som er registreret fra det fluorescens signal, som er opnået i cellen.
- For celle størrelses kvantificering skal du klikke på fanen værktøj på den relevante D3D-billedfil og derefter vælge indstillingen mål afstande . Mål afstande ved at vælge start-og slutpunkter på den ønskede billedfil ved hjælp af musen gennem venstre klik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GpsB-fænotyper
Tidligere har vi vist, at SA-GpsB er et essentielt protein, da nedbrydning af GpsB ved hjælp af et antisense RNA-resultat i celle lysis9. Her beskriver vi, hvordan fremkomsten af forskellige celle division fænotyper og ændringer i protein lokalisering kunne fanges ved hjælp af timelapse mikroskopi protokol beskrevet i denne artikel. Til dette formål, S. aureus stammer RB143 [SH1000 husly pEPSA5 (Tom vektor)] og GGS8 [SH1000 husly pGG59 (PXyl-gpsbantisensebla Cat)] rapporterede tidligere9, blev dyrket som følger. Stammerne RB143 og GGS8 blev inokuleret i 2 mL trypticase soja bouillon (TSB) suppleret med 5 μg/mL chloramphenicol (chlor) i et 15 mL prøveglas og blev inkuberet natten over ved 22 °C under omrystning. De overnight kulturer blev fortyndet 1:20 i 10 mL frisk TSB + chlor i en 125 mL kolbe og dyrket ved 37 °C med omrystning indtil Mid-logaritmisk fase (OD600 = 0,5). Induceren, 1% xylose, blev føjet til kulturmediet for at udløse ekspression af antisense RNA af gpsb , og kulturen blev dyrket til yderligere 3 timer. cellerne blev derefter plettet med fluorescerende farvestof FM4-64 (membran bejdset), hvor det var nødvendigt, ved tilsætning af 0,5 μl af en 10 μg/ml bestand af FM4-64 direkte på 5 μl alikvot af kulturen på mikroskopet som beskrevet i afsnittet protokol. Som vist i figur 1 og video 1, tilsætning af XYLOSE at inducere GGS8 stamme resulterede i en "syg" celle fænotype, som beskrevet tidligere9, mens Tom vektorkontrol (RB143) syntes magen til vores kontrol-celler dyrket i fravær af inducer.
Vores gruppe rapporterede også, at overproduktion af S. aureus gpsb (SA-gpsb) forstyrrer celledelingen i B. subtilis9. Vi bruger dette overekspressions fænotype som eksempel for at demonstrere den protokol, der er beskrevet her. Til dette formål blev der anvendt en B. subtilis stamme GG9 (amye::Phyperspank-gpsbsaSPC; ftsaz:: ftsaz-gfpωerm)9. Subcellulære lokalisering af fluorescently-mærket FtsZ, en nøglecelle division protein, der markerer celle division sites10,11, blev brugt til at overvåge status for celledeling. Prøven for mikroskopi blev fremstillet som følger. En enkelt koloni af GG9 blev inokuleret i 2 mL Luria-Bertani (LB) medium og inkuberet natten over ved 22 °C i en inkubator shaker. De overnight kulturer var 1:20 i 10 mL frisk LB, og dyrkes ved 37 °C med omrystning indtil Mid-logaritmisk fase (OD600 = 0,5). GG9 celler (5 μL alikvot), der skal indlægges, blev placeret på bunden af en glasbund kultur skål og dækket med en 1% agrose pad lavet med LB suppleret med 250 μM (slutkoncentration) af isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) for at inducere ekspression af sa-gpsB (figur 2 og video 2). Timelapse mikroskopi og celle længde kvantificering blev udført som beskrevet i afsnittet protokol.
Hæmning af FtsZ
FtsZ, som er et protein, der er afgørende for celledeling, betragtes som et attraktivt stofmål, og flere grupper udvikler FtsZ-hæmmere som en måde at udvikle nye antibiotika på12. Lokaliseringsmønstre for FtsZ eller et af de proteiner, der er forbundet med det, såsom ZapA, kan bruges som reporter til at studere og/eller identificere nye antimikrobielle forbindelser. Vi bruger den protokol, der er givet her for at demonstrere denne tilgang ved hjælp af S. aureus RB197 [SH1000 husly pRB42 (Pcd-Zapasa-gfp bla ERM)]9 og B. subtilis PE92 (ftsaz:: ftsaz-gfpωerm)13 stammer. RB197 og PE92 stammer blev dyrket som beskrevet ovenfor i TSB (indeholdende 5 μg/mL erythromycin; og 1,25 μM CdCl2 for at inducere henholdsvis Zapa-GFP) og lb. Ved Mid-logaritmisk fase blev en velkarakteriseret ftsz-hæmmer, PC19072314,15, tilsat 2 μg/ml endelig koncentration, og dens virkning på S. aureus og B. subtilis celler blev overvåget ved hjælp af mikroskopi med forskellige tidsintervaller (figur 3 og figur 4). Kvantificering af celle diameteren af S. aureus og celle længden af B. subtilis blev udført som beskrevet i afsnittet protokol.
Figur 1: Mikrograf med høj opløsning af S. aureus -celler, som viser syg fænotype. Fluorescens mikrografer af S. aureus stammer, som enten har en tom vektor (venstre; RB143) eller en inducerbar kopi af antisense RNA af Gpsbsa (højre; GGS8) ved tilstedeværelse og fravær af 1% xylose (inducer). Celler opmærksom plettet med FM4-64 membran bejdset (bestande opløst i sterilt vand) og afbildet ved hjælp af tritc filter sæt. Skala bjælke: 1 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative data, der viser celle divisions hæmning i B. subtilis. (A) timelapse Mikrografer af B. SUBTILIS stamme GG9 med billeder erhvervet med 20 minutters intervaller for 120 min ved hjælp af DIC/FITC kanaler. Fluorescens data for FtsZ-GFP (grøn) vises. Pilene følger en celle i hele eksperimentet. Skala bjælke: 1 μm.B) kvantificering af celle længder på alle tidspunkter. Den gennemsnitlige celle længde med fejllinjer, der angiver standardafvigelsen (n = 50), vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tids kursus undersøgelse af celle division hæmning i S. aureus. (A) Mid-logaritmiske fase celler af stamme RB197 ubehandlet (top) eller behandlet (bund) med ftsz inhibitor (PC190723), efter 30 min vækst, aliquoter af voksende kulturer blev taget hver 10 min for 90 min og afbildet ved hjælp af DIC og FITC filtersæt. Fluorescens fra ZapA-GFP vises. Skala bjælke: 1 μm.B) kvantificering af mikroskopi data. Gennemsnitlig cellebredde med fejllinjer med angivelse af standardafvigelse (n = 50) og procentdel af celler (n = 50), der viser korrekt ZapA-GFP-lokalisering (Mid-celle og periferi) vises. Data punkter af celler behandlet med inhibitor er vist med rødt. Figurer med grøn kontur svarer til den højre Y-akse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: undersøgelse af celle divisionens hæmning af en syntetisk hæmmer i B. subtilis. B. subtilis stamme PE92 blev enten ubehandlet eller behandlet med en ftsz-hæmmer (PC190723) i Mid-logaritmisk fase og blev overvåget for de efterfølgende 90 min. aliquoter af voksende kulturer blev taget hver 10 min for mikroskopi og billeder blev erhvervet ved hjælp af DIC/FITC kanaler. Fluorescens fra FtsZ-GFP vises. Skala bjælke: 1 μm.B) kvantificering af mikroskopi data. Gennemsnitlig celle længde med fejllinjer med angivelse af standardafvigelse (n = 50) og procentdel af celler (n = 50), der viser korrekt mellem cellet FtsZ-GFP-lokalisering vises. Data punkter af celler behandlet med inhibitor er vist med rødt. Figurer med grøn kontur svarer til den højre Y-akse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: timelapse mikroskopi af S. aureus celler udvikler syg fænotype. Stamme GGS8 (Gpsb antisense) behandlet med 1% xylose. Cellerne blev plettet med FM4-64 membran pletter og afbildet med 10 min intervaller for 60 min ved hjælp af tritc kanalen som beskrevet i protokollen. Venligst klik her for at downloade denne video.
Video 2: overekspression af sa-gpsB fører til hæmning af celledelingen i B. subtilis. Timelapse video, der viser filamentation og ændring i FtsZ-GFP-lokalisering i GG9. Billeder blev taget med 20 minutters intervaller for 120 min ved hjælp af DIC og FITC kanaler. Venligst klik her for at downloade denne video.
| Arter | Stamme | Genotype | Reference | |
| S. aureus | RB143 | SH1000 pEPSA5, bla, kat | Eswara et al, 2018 | |
| S. aureus | GGS8 | SH1000 pGG59 (pEPSA5 backbone) PXyl-gpsbanti sense, bla, Cat | Eswara et al, 2018 | |
| S. aureus | RB197 | SH1000 pRB42 (pJB67 backbone) Pcd-Zapasa-gfp, bla, Cat | Eswara et al, 2018 | |
| B. subtilis | GG9 | amyE::P hyperspank-gpsBsa SPC; ftsAZΩftsAZ-gfp ERM | Eswara et al, 2018 | |
| B. subtilis | PE92 | ftsAZ:: ftsAZ-gfp Ωerm | Brzozowski et al, 2019 | |
Tabel 1: anvendte stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi er forblevet en grundpille i undersøgelser vedrørende mikrobielle organismer. På grund af deres micron-skala Cellestørrelse, har enkelt celleniveau undersøgelser traditionelt påberåbt sig elektronmikroskopi (EM). Selv om EM er blevet en ganske kraftfuld teknik i de seneste år, det har sine egne iboende begrænsninger ud over begrænset bruger adgang16. Forbedringer i Fluorescens mikroskopi teknikker og udvikling af forskellige fluorescerende sonder, såsom FDAA3, har givet mikrobielle celle biologer med en bred vifte af værktøjer til at studere forskellige cellulære processer i levende celler. Forskere er også aktivt at opbygge fluorescerende værktøjer til at overvåge ændringer, for eksempel i niveauet af signalering molekyler såsom c-di-GMP blandt andre, i levende celler17,18. Hertil kommer, at høj opløsning timelapse Fluorescens mikroskopi giver forskerne mulighed for at overvåge ændringer, som de sker, og studere relevante fænotyper.
Vi har givet detaljerede protokoller til at gennemføre mikroskopi eksperimenter med en høj opløsning fluorescens mikroskop (Se tabel over materialer). Trinnene i protokollerne kan dog ændres, så de passer til brugerens behov og det anvendte mikroskop. Vi bruger S. aureus og B. subtilis som vores model organismer til at vise, hvordan man kan overvåge forskellige celle division fænotyper, spore ændringer i protein lokalisering, og kvantificere dataene. Hertil kommer, at i tilfælde, hvor timelapse ikke er befordrende, viser vi ved hjælp af en FtsZ-hæmmer, hvordan man opsætter et tids kursus eksperiment.
Den iboende begrænsning med Fluorescens mikroskopi er den opløsning, der er fastsat ved diffraktion-grænsen, som kan overvindes til en vis grad ved hjælp af avancerede mikroskopi teknikker med super opløsning på19,20. Andre spørgsmål såsom fototoksicitet og foto blegning kan omgås ved at indsamle færre Z-stakke eller minimere varigheden og/eller hyppigheden af udsættelse for laser. Andre vejlednings materialer, der er specifikke for Mikroskopi af levende celler, er tilgængelige21. Bortset fra gram-positive organismer B. subtilis og S. aureus, ved hjælp af denne opsætning, vi har med succes afbildet gram-negative bakterien Escherichia coli, gær Saccharomyces cerevisiae, og fyrretræsnematoden caenorhabditis elegans.
Ud over de eksperimenter, der er beskrevet her, kunne lignende metoder bruges til at identificere forbindelser, der er målrettet specifikke cellulære processer i en høj gennemløb mode. Algoritmer, der automatiserer kvantificerings processen, kan også inkorporeres i store datasæt22,23. Der er et enormt behov for at studere forskellige bakteriearter for at imødegå den antibiotika-resistenskrise, og flere undersøgelser er berettiget til at forstå mekanismerne i grundlæggende biologiske processer og til at identificere nye terapeutiske forbindelser. Forskellige Fluorescens mikroskopi teknikker har fået magt og momentum til at hjælpe forskerne med at tackle disse udfordringer blandt andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker vores Lab medlemmer for deres kommentarer til denne artikel. Dette arbejde blev finansieret af et opstarts stipendium fra University of South Florida (PE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
