Summary
Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.
Abstract
Onderzoeken van factoren die van invloed zijn op celdeling en celvorm in bacteriën worden vaak uitgevoerd in combinatie met hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie, aangezien waarnemingen op een populatieniveau niet echt kunnen weerspiegelen wat er op één celniveau gebeurt. Live-cel timelapse microscopie stelt onderzoekers in staat om de veranderingen in celdeling of celmorfologie te monitoren die waardevolle inzichten bieden met betrekking tot subcellulaire lokalisatie van eiwitten en timing van genexpressie, zoals het gebeurt, om potentieel te helpen bij het beantwoorden van belangrijke biologische vragen. Hier beschrijven we ons protocol voor het monitoren van fenotypische veranderingen in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus met behulp van een high-resolution deconvolutie Microscoop. Het doel van dit verslag is om een eenvoudig en duidelijk protocol te bieden dat kan worden aangenomen door andere onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie-experimenten om verschillende biologische processen in bacteriën en andere organismen te bestuderen.
Introduction
Het gebied van bacteriële celbiologie is aanzienlijk verbeterd door recente ontwikkelingen in microscopie technieken1,2. Naast andere instrumenten blijven microscopen die in staat zijn om timelapse-fluorescentiemicroscopie-experimenten uit te voeren een waardevol hulpmiddel. Onderzoekers kunnen verschillende fysiologische gebeurtenissen in real-time monitoren met behulp van fluorescerende eiwitten zoals, groene fluorescerende proteïne (GFP) gebaseerde transcriptionele en translationele reporter Fusions, fluorescerende D-aminozuren (FDAA)3, of andere vlekken gebruiken voor het labelen van de celwand, het membraan en het DNA. Het is daarom geen verrassing dat fluorescentiemicroscopie populair blijft onder microbiële celbiologen. Naast het simpelweg tonen van de end fenotypes, het verstrekken van informatie over hoe de waargenomen fenotypes ontstaan met behulp van timelapse microscopie kan aanzienlijke waarde toevoegen aan de bevindingen en potentieel bieden aanwijzingen over wat cellulaire processen worden gericht door potentiële drug kandidaten4.
De protocollen voor het uitvoeren van beeldvorming met hoge resolutie met behulp van een volledig gemotoriseerde, omgekeerde, breed-veld fluorescentiemicroscoop (Zie de tabel met materialen) zijn in dit artikel beschikbaar. Deze protocollen kunnen worden aangepast aan de behoeften van andere fluorescentie microscopen die in staat zijn om timelapse-microscopie uit te voeren. Hoewel de hier besproken software overeenkomt met de specifieke door de fabrikant geleverde software zoals aangegeven in de tabel met materialen, software die gewoonlijk wordt geleverd door andere Microscoop fabrikanten of de vrij beschikbare imagej5, hebben gelijkwaardige tools voor het analyseren van microscopie gegevens. Voor de omstandigheden waarin timelapse niet bevorderlijk is, kunnen tijd-cursus experimenten worden uitgevoerd zoals beschreven in dit artikel. De hier beschreven protocollen bieden een gedetailleerde handleiding voor het bestuderen van de fenotypische veranderingen in twee verschillende bacteriesoorten: B. subtilis en S. aureus. Zie tabel 1 voor gebruikte stammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. algemene groei voorwaarden
- Inoculeren 2 mL geschikt groeimedium, aangevuld met antibiotica (indien nodig) met een enkele kolonie van de stam (en) die moet worden afgebeeld. Incuberen deze zaad culturen 's nachts bij 22 °C in een schud incubator.
Opmerking: de specifieke bacteriële groeiomstandigheden die in dit artikel worden gebruikt, worden verstrekt in het gedeelte representatieve resultaten. - Verdun 's nachts culturen 1:20 in verse media in een kolf van 125 mL, aan te vullen met antibiotica (indien nodig).
- Kweek cultuur (en) bij 37 °C in een schud incubator tot halverwege de logaritmische fase (OD600 = 0,5).
Opmerking: inductor of remmer kan direct worden toegevoegd aan de teelt cultuur (en) in de juiste groeifase. - Oogst cellen op gewenste kweek condities voor microscopie monstervoorbereiding zoals beschreven in de volgende sectie.
2. monstervoorbereiding
- Bereid 1% agarose door het combineren van 0,25 g moleculaire biologie graad, lage EEO, agarose met ofwel 25 mL groeimedium aangevuld met geschikte antibiotica (indien nodig) voor timelapse microscopie of steriel water. Verwarm het mengsel met behulp van een magnetron voor ongeveer 30 s en giet het in een steriele 100 mm x 15 mm Petri schaal en laat het stollen.
- Neem een aliquot van de celkweek van 5 – 50 μL afhankelijk van de behoefte en vlek de cellen. Vlek cellen met geschikte kleurstoffen in dit stadium (bijv. Voeg fluorescerende kleurstof FM4-64 (membraan vlek) toe voor een experiment (Figuur 1)).
- Pipetteer een aliquot van 5 μL van het kweek monster of het gebeitst monster op de bodem van een 35 mm glasbodem kweek schotel (met 14 mm titer diameter en ongecoat No. 1,5 coverslip; Zie de tabel met materialen).
Let op: gebruik geen poly-L-lysine gecoate covers Lips vooral voor timelapse microscopie als ze kunnen verschillende groeipatroon veroorzaken (we hebben dit gezien met poly-D-Lysine ook; gegevens niet weergegeven) en/of invloed op eiwit Dynamics6. - Om het gebruik van kleurstoffen te minimaliseren, vlek 3 – 4 μL celsuspensie (geoogst op OD600 = 0,5; ongeveer 2,7 x 107 en 3,4 x 107 voor B. subtilis en S. aureus respectievelijk per 1 ml cultuur) direct op het glazen bodem gerecht.
- Plaats een voorgesneden agarose plaat (11 mm in diameter of van elke gewenste grootte om het oppervlak van de dekslip te overlappen; snijd met behulp van het open uiteinde van een steriele buis of een scheermesje) bovenop het monster en tik zachtjes om ervoor te zorgen dat de agarose plaat plat tegen de dekslip ligt.
- Pipetteer een aliquot van 5 μL van het kweek monster of het gebeitst monster op de bodem van een 35 mm glasbodem kweek schotel (met 14 mm titer diameter en ongecoat No. 1,5 coverslip; Zie de tabel met materialen).
- Als het aantal cellen in het gezichtsveld niet wenselijk is na beeldvorming (zie volgende sectie), past u de celdichtheid van het monster via verdunning of concentratie aan door centrifugeren en wijzigt u de verhouding van cellen in het monster met behulp van groeimedium/buffer indien nodig.
Opmerking: om de autofluorescentie die uit het kweekmedium komt te minimaliseren, kunnen cellen worden gewassen in buffer (bijvoorbeeld in standaard 1x fosfaatbuffer-zoutoplossing) en opnieuw worden opgehangen in de juiste hoeveelheid buffer voorafgaand aan beeldvorming. Het is mogelijk dat in deze stap kleinere cellen of blaasjes na centrifugeren niet behouden blijven en dus verloren zullen gaan. - Voeg water toe met een pipet (~ 5 μL druppels) op de ruimte in de kweek schaal (rond de Afdeklijst) om te voorkomen dat het agarose pad droogt en om de vochtigheid tijdens de beeld verwerving te helpen behouden, vooral voor timelapse-experimenten.
- Laat de kweek gerechten naar de temperatuur in de incubatie kamer, een ingebouwd, opaak compartiment van de fabrikant, van de Microscoop voor 15 – 20 min.
Opmerking: Schakel het verwarmingselement in en stel de incubatie kamer enkele uren voorafgaand aan de beeldvorming in op een gewenste temperatuur. Dit zal ervoor zorgen dat de hardware stabiliseert naar de nieuwe temperatuur. Voor langdurige timelapse-beeldvorming, plaats een bekerglas of kolf met water in de Microscoop kamer, weg van het werkgebied, om de vochtigheid te behouden.
3. Imaging
- Zet op de dag van het experiment het Microscoop systeem aan. Start de imaging software (Zie tabel met materialen) door op het juiste pictogram op het bureaublad te klikken. Initialiseer de Microscoop door te klikken op de optie Microscoop initialiseren (knop afgebeeld met een Microscoop erop) in het opstart dialoogvenster van de software. Zorg ervoor dat de doelstelling volledig is verlaagd met behulp van de fijnafstelling van de Microscoop voorafgaand aan de initialisatie.
Opmerking: na de initialisatie worden naast het menu Start ook drie extra dialoogvensters weergegeven: resolve3D, gegevensverzameling en filter monitor. - Plaats een druppel van 1,517 (brekingsindex) olie op de 100x olie onderdompeling doelstelling geleverd door de fabrikant (numerieke diafragma = 1,4, werkafstand = 0,12 mm; Zie tabel van de materialen).
Opmerking: het is belangrijk om de juiste Dompel olie te kiezen voor de temperatuur waarop beeldvorming wordt uitgevoerd. - Laad de glazen bodem schotel met monster in de metalen behuizing (kist) en schuif zachtjes in de stage klem.
- Gebruik de grove instelknop om de doelstelling te verhogen totdat de olie contact maakt met de glazen bodem van het gerecht. Gebruik het oogstuk en de fijnafstelling knop om het monster scherp te stellen. Zodra de cellen scherp zijn, draait u de knop van het oogstuk naar de cameramodus door de keuzeschakelaar op de voorkant van de Microscoop naar links te bewegen.
- Begin met experimenteren met de imaging software. Selecteer in het venster resolve3D het pictogram experiment ontwerpen/uitvoeren dat door een kolf wordt afgebeeld. Een nieuw dialoogvenster moet worden weergegeven met de titel ontwerp/uitvoeren experiment.
- Stel het aantal Z-stapels en monster dikte in met behulp van het tabblad ontwerp en vervolgens snijden in het dialoogvenster ontwerp/uitvoering experiment .
Opmerking: voor de experimenten in representatieve resultaten sectie, 17 Z-stacks bij 200 nm interval voor stilstaande beelden en vier Z-stacks bij 200 nm interval voor timelapse microscopie werden gebruikt. - Als u de dikte van de cellen in het voorbeeld wilt meten, moet u het Z-vlak stapsgewijs handmatig aanpassen met behulp van de pijlen omhoog en omlaag in het dialoogvenster resolve3D . Markeer waar de cellen zich buiten de focus bevinden als de bovenste en onderste limiet voor het verzamelen van afbeeldingen. Importeer deze informatie voordat u het experiment uitvoert.
- Om fototoxiciteit en fotobleaching tijdens timelapse-beeldvorming te minimaliseren, verlaagt u het aantal Z-stacks en kiest u het middenvlak van de cellen voorbeeld verwerving.
- Stel het aantal Z-stapels en monster dikte in met behulp van het tabblad ontwerp en vervolgens snijden in het dialoogvenster ontwerp/uitvoering experiment .
- Selecteer de juiste Filterset voor het experiment met behulp van het tabblad ontwerp en vervolgens kanalen in het dialoogvenster ontwerpen/uitvoeren experiment (tritc: ex 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
- Selecteer ook een verwijzing voor de verzameling van POL/DIC-informatie. Pas de procentuele transmissie (lichtintensiteit) en de blootstellingsduur aan voor afzonderlijke kanalen die vóór de beeldvorming zijn geselecteerd door de gewenste opties te selecteren in het dialoogvenster resolve3D .
Opmerking: in een testveld van weergave dat niet in aanmerking komt voor het experiment test deze instellingen om te bepalen of de geselecteerde parameters zinvolle fluorescentie gegevens verkrijgen zonder een zwak signaal te missen of te oververzaveren. Importeer vervolgens deze parameters voor de experimentele set-up.
- Selecteer ook een verwijzing voor de verzameling van POL/DIC-informatie. Pas de procentuele transmissie (lichtintensiteit) en de blootstellingsduur aan voor afzonderlijke kanalen die vóór de beeldvorming zijn geselecteerd door de gewenste opties te selecteren in het dialoogvenster resolve3D .
- Open de lijst met punten door de knop puntenlijst in het dialoogvenster resolve3D te selecteren. Er moet een nieuw dialoogvenster worden weergegeven met de titel puntenlijst. Markeer verschillende weergavevelden die in het experiment moeten worden gebruikt door de juiste weergave gebieden te zoeken met behulp van de besturingselementen voor de Microscoop en de optie markeerpunt in het dialoogvenster puntenlijst te selecteren.
Opmerking: er moet een Vervang punt worden geselecteerd telkens wanneer de Microscoop wordt geherconcentreerde op een punt in de puntenlijst. Dit kan worden gedaan door de Microscoop op het juiste punt in de lijst te richten en vervolgens de knop punt vervangen te selecteren. Het is belangrijk om de analoge Grove/fijnafstelling knop niet aan te raken bij het opnieuw scherpstellen; Gebruik alleen de software om de scherpstelling aan te passen. - Stel timelapse-parameters in door eerst het ontwerp te selecteren en vervolgens timelapse -tabblad in het dialoogvenster ontwerpen/uitvoeren experiment. Schakel het selectievakje timelapse in. Voer de juiste timelapse-parameters in termen van timelapse-afbeeldingen/totale tijd.
- Stel punten in die moeten worden afgebeeld in de puntenlijst door eerst het ontwerp te selecteren en vervolgens het tabblad punten in het dialoogvenster ontwerpen/uitvoeren experiment. Selecteer de optie puntenlijst bezoeken en voer punten in die in het tekstvak moeten worden afgebeeld, gescheiden door komma's of afbreekstreepjes als dit een volledige reeks is.
- Voordat u begint met een experiment, bewerk bestandsnamen en bestandslocaties met behulp van het tabblad uitvoeren in het dialoogvenster ontwerp/uitvoeren. Bestandslocatie kan worden gewijzigd door de knop instellingen te selecteren, de gegevensmap te selecteren en vervolgens de juiste map te selecteren of een nieuwe te maken. Wijzig de bestandsnamen door de nieuwe bestandsnaam in het tekstvak afbeeldings bestandsnaam in te voeren.
- Begin het experiment door de knop afspelen te selecteren in het dialoogvenster experiment starten .
Opmerking: Controleer voor timelapse voortdurend de focus op elk gezichtsveld tijdens het experiment met behulp van DIC-instelling (om onnodige fotobleking te voorkomen) en herfocus en werk de informatie in de puntenlijst bij als cellen de neiging hebben om uit de focus te gaan na verloop van tijd.
4. beeldverwerking
- Open de gewenste RAW (R3D)-afbeeldingsbestanden voor het genereren van figuren.
Opmerking: onlangs opgeslagen bestanden kunnen worden weergegeven met behulp van de knop gegevensmap in het opstart dialoogvenster van de imaging-software. - Voer het deconvolutie-programma uit om out-of-focus fluorescentielicht7,8te verwijderen om een deconvolved D3D-beeldbestand te produceren. Selecteer het tabblad proces in het dialoogvenster Opstarten en selecteer vervolgens deconvolve. Er verschijnt een nieuw dialoogvenster met de titel deconvolve.
- Stel de parameters deconvolutie in door het juiste afbeeldingsnummer (in de linkerbovenhoek van elk afbeeldingsbestand) naar de invoer in het dialoogvenster deconvolutie te slepen. Selecteer in het dialoogvenster deconvolutie de knop meer opties en schakel het selectievakje uitsnijd rand off na verwerking uit (anders kunnen de afbeeldingen niet boven het corresponderende dic-bestand worden gelegd).
- Klik op de knop doe het in het dialoogvenster deconvolutie om het RAW-afbeeldingsbestand te deconvolve.
Opmerking: de deconvolutie-parameters kunnen worden aangepast zoals aangegeven door de handleiding van de softwarefabrikant voor de gewenste resultaten.
- Indien nodig, voer handmatige achtergrondruis aftrekken en helderheid/contrast aanpassing in een of alle golflengte (kleur) kanalen. Hiertoe selecteert u de knop contrast aanpassing op het deconvolved-afbeeldingsbestand.
- Sla de afbeelding op als een TIFF-bestand door eerst de optie bestand boven aan het dialoogvenster D3D te selecteren. Selecteer vervolgens opslaan als TIFF, Identificeer en selecteer de juiste Z-stapels (die zich binnen de focus bevinden), selecteer of deselecteer de gewenste filter sets.
- Voer gegevens kwantificering uit met behulp van door de fabrikant geleverde software of vrij beschikbare Programma's zoals ImageJ5.
- Voor kwantificering van celgrootte klikt u op het tabblad tool op het juiste D3D-afbeeldingsbestand en selecteert u vervolgens de optie afstanden meten . Meet afstanden door begin-en eindpunten te selecteren op het gewenste beeldbestand met de muis door links klikken.
Opmerking: u het beste inzoomen op de afbeelding tijdens de kwantificering van de celgrootte. - Voor fluorescentie signaal kwantificering gebruik de optie gegevenscontrole onder het tabblad tool op het juiste D3D image-bestand.
Opmerking: u het beste inzoomen op de afbeelding en alleen relevante filters selecteren bij het voltooien van de fluorescentie signaal kwantificering. - Als u het fluorescentie signaal wilt kwantificeren, tekent u een vak met kolom/rij-optie ingesteld op specifieke dimensie. Selecteer een gebied met het te kwantificeren signaal en noteer de waarde. Meet het achtergrond signaal met behulp van hetzelfde formaat vak om een gebied direct buiten de cellen te selecteren. Trek de achtergrondwaarde af van de waarde die is opgenomen uit het fluorescentie signaal dat in de cel is verkregen.
- Voor kwantificering van celgrootte klikt u op het tabblad tool op het juiste D3D-afbeeldingsbestand en selecteert u vervolgens de optie afstanden meten . Meet afstanden door begin-en eindpunten te selecteren op het gewenste beeldbestand met de muis door links klikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GpsB-fenotypes
Eerder hebben we aangetoond dat sa-GpsB een essentieel eiwit is als uitputting van GpsB met een antisense RNA-resultaat in cel lysis9. Hier beschrijven we hoe de opkomst van verschillende celdeling fenotypes en veranderingen in eiwit lokalisatie kan worden vastgelegd met behulp van de timelapse microscopie protocol beschreven in dit artikel. Voor dit doel, S. aureus stammen RB143 [SH1000 cellen pEPSA5 (lege Vector)] en GGS8 [SH1000 cellen pGG59 (Pxyl-gpsbantisensebla kat)] gerapporteerd eerder9, werden als volgt geteeld. Stammen RB143 en GGS8 werden geënt in 2 mL tryptische soja Bouillon (TSB) aangevuld met 5 μg/mL chlooramfenicol (Chlor) in een test buisje van 15 mL en werden gedurende een nacht bij 22 °C geïncubeerd tijdens het schudden. De nachtelijke culturen werden verdund 1:20 in 10 mL verse TSB + chloor in een kolf van 125 mL en geteeld bij 37 °C met schudden tot halverwege de logaritmische fase (OD600 = 0,5). De inductor, 1% xylose, werd toegevoegd aan het kweekmedium om de expressie van antisense RNA van Gpsb te triggeren en de cultuur werd voor nog eens 3 uur geteeld. vervolgens werden de cellen gekleurd met fluorescerende kleurstof FM4-64 (membraan vlek), indien nodig, door toevoeging van 0,5 μL van een voorraad van 10 μg/ml FM4-64 rechtstreeks op de 5 μL aliquot van de Microscoop-schaal, zoals beschreven in het protocol gedeelte. Zoals weergegeven in Figuur 1 en Video 1, resulteerde toevoeging van xylose voor het opwekken van GGS8 stam in een "ziek" celfenotype, zoals eerder beschreven9, terwijl lege Vector controle (RB143) vergelijkbaar leek met onze controle-cellen die werden gekweekt in de afwezigheid van inductor.
Onze fractie meldde ook dat overproductie van S. aureus gpsb (SA-gpsb) de celdeling verstoort in B. subtilis9. We gebruiken deze overexpressie fenotype als voorbeeld om het hier beschreven protocol aan te tonen. Daartoe is een B. subtilis strain GG9 (amye::Phyperspank-gpsbsaSPC; ftsaz:: ftsaz-gfpωerm)9gebruikt. Subcellulaire lokalisatie van fluorescently-gelabeld FtsZ, een belangrijke cel divisie eiwit dat markeert de cel divisie sites10,11, werd gebruikt voor het bewaken van de status van celdeling. Het monster voor microscopie werd als volgt bereid. Een enkele kolonie van GG9 werd in 2 mL Luria-Bertani (LB) medium inocculeerd en 's nachts geïncubeerd bij 22 °C in een incubator Shaker. De nachtelijke culturen waren 1:20 in 10 mL verse LB, en gekweekt bij 37 °C met schudden tot halverwege de logaritmische fase (OD600 = 0,5). GG9 cellen (5 μL aliquot) die worden afgebeeld, werden op de bodem van een kweek schotel met glazen bodem geplaatst en bedekt met een 1% agarose pad gemaakt met LB aangevuld met 250 μM (eindconcentratie) van Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) om de uitdrukking van sa-gpsB te induceren (Figuur 2 en video 2). Timelapse microscopie en cellengte kwantificering werden uitgevoerd zoals beschreven in de sectie Protocol.
Remming van FtsZ
FtsZ, een eiwit dat essentieel is voor celdeling, wordt beschouwd als een aantrekkelijk medicijn doelwit en meerdere groepen ontwikkelen FtsZ-remmers als een manier om nieuwe antibiotica te ontwikkelen12. Lokalisatie patronen van FtsZ of een van de eiwitten die ermee verbonden zijn, zoals ZapA, kunnen worden gebruikt als verslaggever om nieuwe antimicrobiële verbindingen te bestuderen en/of te identificeren. We gebruiken het protocol dat hier wordt geleverd om deze aanpak aan te tonen met behulp van S. aureus RB197 [SH1000 cellen pRB42 (Pcd-zapasa-GFP bla ERM)]9 en B. subtilis PE92 (ftsaz:: ftsaz-gfpωerm)13 stammen. RB197 en PE92 stammen werden geteeld zoals hierboven beschreven in TSB (bevattende 5 μg/mL erytromycine; en 1,25 μM CdCl2 voor het opwekken van de uitdrukking van zapa-GFP) en lb respectievelijk. Halverwege de logaritmische fase, werd een goed gekarakteriseerde FtsZ-remmer,PC190723 14,15, toegevoegd bij 2 μg/ml eindconcentratie en het effect ervan op de S. aureus en B. subtilis cellen werden gemonitord met behulp van microscopie op verschillende tijdstippen (Figuur 3 en Figuur 4). Kwantificering van de celdiameter van S. aureus en Cellengte van B. subtilis werd uitgevoerd zoals beschreven in de protocol sectie.
Figuur 1: Microscoop met hoge resolutie van S. aureus cellen die ziek fenotype vertonen. Fluorescentie micro foto's van S. aureus stammen die een lege Vector herbergen (links; RB143) of een induceerbaar exemplaar van antisense RNA van Gpsbsa (rechts; GGS8) in aanwezigheid en afwezigheid van 1% xylose (inducer). Cellen awaren bevlekt met FM4-64 membraan vlek (voorraden opgelost in steriel water) en afbeelding gemaakt met behulp van tritc Filterset. Schaalbalk: 1 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve gegevens met remming van de celdeling in B. subtilis. (A) timelapse-micro grafieken van B. SUBTILIS stam GG9 met beelden verworven met 20-min intervallen voor 120 min met behulp van de dic/FITC kanalen. Fluorescentie gegevens van FtsZ-GFP (groen) worden weergegeven. Pijlen volgen één cel gedurende het experiment. Schaalbalk: 1 μm.B) kwantificering van cellengten op alle tijdstippen. De gemiddelde cellengte met foutbalken die de standaarddeviatie aangeven (n = 50) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: tijdsverloop onderzoek naar remming van de celdeling in S. aureus. A) mid-logaritmische fase cellen van stam RB197 onbehandeld (boven) of behandeld (onder) met FtsZ-remmer (PC190723), na een groei van 30 min, werden er om de 10 minuten aliquots van kweek culturen genomen voor 90 min en afbeelding gemaakt met dic-en FITC-filter sets. Fluorescentie van ZapA-GFP wordt getoond. Schaal: 1 μm.B) kwantificering van microscopie gegevens. Gemiddelde celbreedte met foutbalken die wijzen op standaarddeviatie (n = 50) en percentage van cellen (n = 50) weergeven van de juiste ZapA-GFP lokalisatie (Mid-cel en periferie) worden weergegeven. Gegevenspunten van cellen die met een remmer worden behandeld, worden in rood weergegeven. Vormen met een groene omtrek komt overeen met de rechter Y-as. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: onderzoek naar remming van de celdeling door een synthetische remmer in B. subtilis. B. subtilis stam PE92 was ofwel onbehandeld of behandeld met een FtsZ-remmer (PC190723) tijdens de mid-logaritmische fase en werd gemonitord voor de daaropvolgende 90 min. aliquots van kweek culturen werden elke 10 min voor microscopie genomen en beelden werden verworven met behulp van dic/FITC kanalen. Fluorescentie van FtsZ-GFP wordt getoond. Schaal: 1 μm.B) kwantificering van microscopie gegevens. Gemiddelde cellengte met foutbalken die de standaarddeviatie aangeven (n = 50) en het percentage cellen (n = 50) dat de juiste mid-Cell FtsZ-GFP-lokalisatie weergeeft, wordt weergegeven. Gegevenspunten van cellen die met een remmer worden behandeld, worden in rood weergegeven. Vormen met een groene omtrek komt overeen met de rechter Y-as. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: timelapse microscopie van S. aureus cellen ontwikkelen ziek fenotype. Stam GGS8 (Gpsb antisense) behandeld met 1% xylose. Cellen werden gekleurd met FM4-64 membraan vlek en gefotografeerd op 10 min intervallen voor 60 min met behulp van het TRITC kanaal zoals beschreven in het protocol. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: overexpressie van sa-gpsb leidt tot remming van de celdeling in B. subtilis. Timelapse video toont filamentatie en verandering in FtsZ-GFP lokalisatie in GG9. Beelden werden genomen om 20 min intervallen voor 120 min met behulp van DIC en FITC kanalen. Klik hier om deze video te downloaden.
| Soort(en) | Stam | Genotype | Verwijzing | |
| S. aureus | RB143 | SH1000 pEPSA5, bla, kat | Eswara et al, 2018 | |
| S. aureus | GGS8 | SH1000 pGG59 (pEPSA5 ruggengraat) Pxyl-gpsbantisense, bla, kat | Eswara et al, 2018 | |
| S. aureus | RB197 | SH1000 pRB42 (pJB67 backbone) Pcd-Zapasa-GFP, bla, Cat | Eswara et al, 2018 | |
| B. subtilis | GG9 | amyE::P hyperspank-gpsBsa SPC; ftsAZΩftsAZ-GFP ERM | Eswara et al, 2018 | |
| B. subtilis | PE92 | ftsAZ:: ftsAZ-GFP Ωerm | Brzozowski et al, 2019 | |
Tabel 1: gebruikte stammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microscopie bleef een steun Piler in studies met betrekking tot microbiële organismen. Gezien hun micron schaal celgrootte, eencellige studies hebben traditioneel vertrouwd op elektronenmicroscopie (EM). Hoewel EM in de afgelopen jaren behoorlijk een krachtige techniek is geworden, heeft het naast beperkte gebruikers toegang16ook zijn eigen intrinsieke beperkingen. Verbeteringen in fluorescentiemicroscopie technieken en de ontwikkeling van verschillende fluorescentie sondes, zoals FDAA3, hebben microbiële celbiologen voorzien van een breed scala aan hulpmiddelen om verschillende cellulaire processen in levende cellen te bestuderen. Onderzoekers bouwen ook actief fluorescerende gereedschappen om veranderingen te monitoren, bijvoorbeeld in het niveau van signalering van moleculen zoals c-di-GMP onder anderen, in levende cellen17,18. Bovendien kunnen onderzoekers met hoge resolutie timelapse fluorescentiemicroscopie veranderingen monitoren terwijl ze zich voordoen en relevante fenotypes bestuderen.
We hebben gedetailleerde protocollen gegeven om microscopie-experimenten uit te voeren met een hoge-resolutie fluorescentiemicroscoop (Zie tabel met materialen). De stappen in de protocollen kunnen echter worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker en de gebruikte Microscoop. We gebruiken S. aureus en B. subtilis als onze model organismen om te laten zien hoe verschillende celdelings fenotypes kunnen worden bewaakt, de veranderingen in de eiwit lokalisatie te volgen en de gegevens te kwantificeren. Bovendien, voor gevallen waarin timelapse niet bevorderlijk is, laten we zien met behulp van een FtsZ-remmer, hoe een tijds cursus experiment op te zetten.
De inherente beperking met fluorescentiemicroscopie is de resolutie die wordt bepaald door de diffractie-grens, die tot op zekere hoogte kan worden overwonnen met behulp van geavanceerde super-resolution microscopie-technieken19,20. Andere kwesties zoals fototoxiciteit en fotobleaching kunnen worden omzeild door minder Z-stacks te verzamelen of de duur en/of frequentie van blootstelling aan laser te minimaliseren. Er zijn21andere geleidings materialen beschikbaar die specifiek zijn voor de Live-cel microscopie. Afgezien van gram-positieve organismen B. subtilis en S. aureus, met behulp van deze set-up, we hebben met succes afbeelding gemaakt gram-negatieve bacterie Escherichia coli, gist Saccharomyces cerevisiae, en nematode Caenorhabditis elegans.
Naast de hier beschreven experimenten, soortgelijke methodologieën kunnen worden gebruikt voor het identificeren van verbindingen die gericht zijn op specifieke cellulaire processen op een high-throughput mode. Algoritmen die het kwantificerings proces automatiseren, kunnen ook worden opgenomen voor grote gegevenssets22,23. Er is een immense behoefte om verschillende bacteriesoorten te bestuderen om de antibiotica-resistentie crisis aan te pakken en meer studies zijn gerechtvaardigd om de mechanismen van elementaire biologische processen te begrijpen en nieuwe therapeutische verbindingen te identificeren. Verschillende fluorescentiemicroscopie technieken hebben de kracht en impuls gekregen om onderzoekers te helpen bij het aanpakken van deze uitdagingen onder anderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken onze lableden voor hun opmerkingen over dit artikel. Dit werk werd gefinancierd door een start-up subsidie van de Universiteit van Zuid-Florida (PE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
