Summary
Cet article fournit un guide étape par étape pour étudier la dynamique de localisation sous-cellulaire des protéines et pour surveiller les changements morphologiques à l'aide de la microscopie à haute résolution de fluorescence dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.
Abstract
Les études des facteurs influençant la division cellulaire et la forme cellulaire chez les bactéries sont couramment effectuées en conjonction avec la microscopie à haute résolution de fluorescence, car les observations faites au niveau de la population peuvent ne pas vraiment refléter ce qui se produit à un seul niveau cellulaire. La microscopie en accéléré en cellule vive permet aux chercheurs de surveiller les changements dans la division cellulaire ou la morphologie cellulaire qui fournissent des informations précieuses sur la localisation subcellulaire des protéines et le moment de l'expression des gènes, comme il arrive, pour potentiellement aider à répondre à d'importantes questions biologiques. Ici, nous décrivons notre protocole pour surveiller les changements phénotypiques dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus utilisant un microscope de deconvolution à haute résolution. L'objectif de ce rapport est de fournir un protocole simple et clair qui peut être adopté par d'autres chercheurs intéressés à mener des expériences de microscopie à fluorescence pour étudier différents processus biologiques chez les bactéries ainsi que d'autres organismes.
Introduction
Le domaine de la biologie cellulaire bactérienne a été considérablement amélioré par les progrès récents dans les techniques de microscopie1,2. Entre autres instruments, les microscopes capables de mener des expériences de microscopie à fluorescence en timelapse demeurent un outil précieux. Les chercheurs peuvent surveiller divers événements physiologiques en temps réel à l'aide de protéines fluorescentes telles que les fusions transcriptionnelle et translationnelle de la protéine fluorescente verte (GFP), les acides fluorescents D-amino (FDAA)3, ou utiliser d'autres taches pour étiqueter la paroi cellulaire, la membrane et l'ADN. Il n'est donc pas surprenant que la microscopie par fluorescence demeure populaire chez les biologistes des cellules microbiennes. En plus de simplement montrer les phénotypes finaux, fournir des informations sur la façon dont les phénotypes observés surgissent à l'aide de la microscopie timelapse pourrait ajouter une valeur significative aux résultats et potentiellement offrir des indices quant à ce que les processus cellulaires sont ciblés par les candidats médicaments potentiels4.
Les protocoles d'imagerie à haute résolution à l'aide d'un microscope à fluorescence entièrement motorisé, inversé et à large champ (voir le Tableau des matériaux)sont fournis dans cet article. Ces protocoles pourraient être adaptés aux besoins d'autres microscopes à fluorescence capables de procéder à une microscopie en timelapse. Bien que le logiciel discuté ici corresponde au logiciel fourni par le fabricant spécifique comme indiqué dans le tableau des matériaux, logiciel couramment fourni par d'autres fabricants de microscope ou le libre disponible ImageJ5, ont des outils équivalents pour analyser les données de microscopie. Pour les conditions où le timelapse n'est pas propice, des expériences de cours dans le temps pourraient être menées comme décrit dans cet article. Les protocoles décrits ici fournissent un guide détaillé pour étudier les changements phénotypiques chez deux espèces bactériennes différentes : B. subtilis et S. aureus. Voir tableau 1 pour les souches utilisées.
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Protocol
1. Conditions générales de croissance
- Inoculer 2 ml de milieu de croissance approprié complété par des antibiotiques (si nécessaire) avec une seule colonie de la souche à imager. Incuber ces cultures de semences pendant la nuit à 22 oC dans un incubateur secouant.
REMARQUE : Les conditions de croissance bactérienne spécifiques utilisées dans cet article sont fournies sous la section des résultats représentatifs. - Diluer les cultures de nuit 1:20 dans les médias frais dans un flacon de 125 ml, compléter avec des antibiotiques (si nécessaire).
- Cultiver la culture (s) à 37 oC dans un incubateur secouant jusqu'à la phase mi-logarithmique (OD600 à 0,5).
REMARQUE : L'inducteur ou l'inhibiteur pourrait être ajouté directement à la culture de croissance (s) à la phase de croissance appropriée. - Cellules de récolte aux conditions de culture souhaitées pour la préparation de l'échantillon de microscopie comme décrit dans la section suivante.
2. Préparation de l'échantillon
- Préparer 1% agarose en combinant 0,25 g de qualité de biologie moléculaire, faible EEO, agarose avec soit 25 ml de milieu de croissance complété avec des antibiotiques appropriés (si nécessaire) pour la microscopie timelapse ou de l'eau stérile. Chauffer le mélange à l'aide d'un four à micro-ondes pendant environ 30 s et le verser dans un plat stérile de 100 mm x 15 mm Petri et le laisser solidifier.
- Prenez un aliquot de 5 à 50 L de la culture cellulaire en fonction des besoins et tachent les cellules. Cellules de tache avec les colorants appropriés à ce stade (p. ex., ajouter le colorant fluorescent FM4-64 (tache de membrane) pour une expérience (figure 1)).
- Pipette a 5 l'aliquot de l'échantillon de culture ou de l'échantillon taché pour être photographié sur le fond d'un plat de culture de fond de verre de 35 mm (avec un diamètre microwell de 14 mm et un bordereau non couché no 1.5; voir le tableau des matériaux).
CAUTION: Ne pas utiliser poly-L-lysine enduits de couvertures en particulier pour la microscopie timelapse car ils pourraient induire différents modèles de croissance (nous avons observé cela avec la poly-D-lysine ainsi; données non montrées) et / ou affecter la dynamique des protéines6. - Pour réduire au minimum l'utilisation des colorants, tachez la suspension cellulaire de 3 à 4 l (récoltée à600 OD et 0,5; environ 2,7 x 107 et 3,4 x 107 pour B. subtilis et S. aureus respectivement par culture de 1 ml) directement sur le plat en verre.
- Placer une dalle d'agarose prédécoupée (11 mm de diamètre ou de n'importe quelle taille désirée pour chevaucher la zone de la glissière; couper à l'extrémité ouverte d'un tube stérile ou d'une lame de rasoir) sur le dessus de l'échantillon et taper doucement pour s'assurer que la dalle d'agarose est couchée à plat contre la glissière.
- Pipette a 5 l'aliquot de l'échantillon de culture ou de l'échantillon taché pour être photographié sur le fond d'un plat de culture de fond de verre de 35 mm (avec un diamètre microwell de 14 mm et un bordereau non couché no 1.5; voir le tableau des matériaux).
- Après l'imagerie (voir la section suivante), si le nombre de cellules dans le champ de vision n'est pas souhaitable, ajuster la densité cellulaire de l'échantillon par dilution ou concentration par centrifugation et modifier le rapport des cellules dans l'échantillon en utilisant le milieu de croissance / tampon au besoin.
REMARQUE : Pour minimiser l'autofluorescence émanant du milieu de culture, les cellules peuvent être lavées en tampon (par exemple dans la saline tampon de 1x phosphate standard) et remises en suspension dans la quantité appropriée de tampon avant l'imagerie. Il est possible que dans cette étape de plus petites cellules ou vésicules ne peuvent pas être conservés après centrifugation et seront donc perdus. - Ajouter de l'eau à l'aide d'une pipette (5 gouttes ll) à l'espace à l'intérieur du plat de culture (autour de la couverture) pour empêcher le tampon d'agarose de sécher, et pour aider à maintenir l'humidité au cours de l'acquisition de l'image, en particulier pour les expériences timelapse.
- Laissez les plats de culture acquerquer à la température à l'intérieur de la chambre d'incubation, un compartiment opaque intégré fourni par le fabricant, du microscope pendant 15 à 20 min.
REMARQUE : Allumez l'élément chauffant et fixez la chambre d'incubation à une température désirée plusieurs heures avant l'imagerie. Cela permettra de s'assurer que le matériel se stabilise à la nouvelle température. Pour l'imagerie en timelapse prolongée, placez un bécher ou un flacon avec de l'eau à l'intérieur de la chambre de microscope, loin de la zone de travail, pour maintenir l'humidité.
3. Imagerie
- Le jour de l'expérience, allumez le système de microscope. Démarrez le logiciel d'imagerie (voir Tableau des matériaux) en cliquant sur l'icône appropriée sur le bureau. Initialisez le microscope en cliquant sur l'option Microscope Initialize (bouton représenté avec un microscope dessus) sur la boîte de dialogue de démarrage du logiciel. Assurez-vous que l'objectif est entièrement abaissé à l'aide du microscope ajustement grossier avant l'initialisation.
REMARQUE : Après l'initialisation, trois boîtes de dialogue supplémentaires devraient apparaître en plus du menu de démarrage : resolve3D, collecte de données et moniteur de filtre. - Placez une baisse de 1.517 (indice réfractif) d'huile sur l'objectif d'immersion d'huile 100x fourni par le fabricant (Ouverture numérique 1,4, Distance de travail 0,12 mm; voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Il est important de choisir l'huile d'immersion appropriée pour la température à laquelle l'imagerie est effectuée. - Chargez le plat en verre contenant de l'échantillon dans le boîtier métallique (cercueil) et glissez doucement dans la pince de scène.
- Utilisez le bouton d'ajustement grossier pour augmenter l'objectif jusqu'à ce que l'huile entre en contact avec le fond de verre du plat. Utilisez le morceau d'oeil et le bouton d'ajustement fin pour mettre l'échantillon au point. Une fois que les cellules sont au point tourner le bouton de la pièce de l'œil en mode caméra en déplaçant l'interrupteur de sélecteur situé sur l'avant du corps du microscope vers la gauche.
- Commencez l'expérience à l'aide du logiciel d'imagerie. Sur la fenêtre resolve3D, sélectionnez l'icône d'expérience Design/run représentée par un flacon. Une nouvelle boîte de dialogue doit apparaître intitulée conception /expérience d'exécution.
- Définir le nombre de z-stacks et l'épaisseur de l'échantillon à l'aide de la conception, puis la section de l'onglet sur la conception / exécuter la boîte de dialogue expérience.
REMARQUE : Pour les expériences dans la section des résultats représentatifs, 17 z-stacks à 200 nm d'intervalle pour les images fixes et quatre z-stacks à 200 nm d'intervalle pour la microscopie timelapse ont été utilisés. - Pour mesurer l'épaisseur des cellules de l'échantillon, ajustez manuellement le plan Z progressivement en utilisant les flèches de haut en bas sur la boîte de dialogue resolve3D. Marquez l'endroit où les cellules ne sont plus pointées comme la limite supérieure et inférieure pour l'acquisition d'images. Importer ces informations avant d'exécuter l'expérience.
- Pour aider à minimiser la phototoxicité et le photoblanchiment pendant l'imagerie en timelapse, réduisez le nombre de piles Z et choisissez le milieu du plan des cellules pour l'acquisition d'images.
- Définir le nombre de z-stacks et l'épaisseur de l'échantillon à l'aide de la conception, puis la section de l'onglet sur la conception / exécuter la boîte de dialogue expérience.
- Sélectionnez l'ensemble de filtre approprié pour l'expérience à l'aide de la conception, puis canalise l'onglet sur la boîte de dialogue d'expérience de conception/exécution (TRITC : EX 542/27 ; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
- En outre, sélectionnez une référence pour la collecte d'informations POL/DIC. Ajuster la transmission en pourcentage (intensité lumineuse) et la durée d'exposition pour les différents canaux sélectionnés avant l'imagerie en sélectionnant les options appropriées sur la boîte de dialogue resolve3D.
REMARQUE : Dans un champ de vision d'essai qui n'est pas pris en compte pour le test d'expérience, ces paramètres identifient si les paramètres sélectionnés obtiennent des données significatives de fluorescence sans manquer de signal faible ou de sursaurisation. Ensuite, importer ces paramètres pour la mise en place expérimentale.
- En outre, sélectionnez une référence pour la collecte d'informations POL/DIC. Ajuster la transmission en pourcentage (intensité lumineuse) et la durée d'exposition pour les différents canaux sélectionnés avant l'imagerie en sélectionnant les options appropriées sur la boîte de dialogue resolve3D.
- Ouvrez la liste de points en sélectionnant le bouton liste de points sur la boîte de dialogue resolve3D. Une nouvelle boîte de dialogue doit apparaître intitulée liste de points. Marquez plusieurs champs de vision à utiliser dans l'expérience en trouvant des champs de vision appropriés à l'aide des contrôles d'étape au microscope et en sélectionnant l'option point de marque sur la boîte de dialogue de liste de points.
REMARQUE : Un point de remplacement devra être sélectionné chaque fois que le microscope est recentré sur un point de la liste de points. Cela peut être fait en concentrant le microscope sur le point approprié dans la liste, puis en sélectionnant le bouton de point de remplacement. Il est important de ne pas toucher le bouton d'ajustement analogique grossier/fin lors du recentrage; utiliser uniquement le logiciel pour ajuster la mise au point. - Définiz les paramètres timelapse en sélectionnant d'abord la conception, puis l'onglet timelapse sur la boîte de dialogue d'expérience de conception/exécution. Sélectionnez la case à cocher timelapse. Entrez les paramètres de timelapse appropriés en termes d'images timelapse/temps total.
- Définir les points à être représentés à partir de la liste de points en sélectionnant d'abord la conception, puis les points onglet sur la boîte de dialogue d'expérience de conception /exécution. Sélectionnez l'option liste de points de visite et entrez les points à imager dans la boîte de texte séparée par des virgules ou des traits d'union s'il s'agit d'une séquence complète.
- Avant de commencer une expérience, modifiez les noms de fichiers et les emplacements de fichiers à l'aide de l'onglet exécuter sur la boîte de dialogue de conception/exécution. L'emplacement du fichier peut être modifié en sélectionnant le bouton Paramètres, en sélectionnant le dossier de données, puis en sélectionnant le dossier approprié ou en créant un nouveau. Modifier les noms de fichiers en entrant dans le nouveau nom de fichier dans la boîte de texte de nom de fichier d'image.
- Commencez l'expérience en sélectionnant le bouton de lecture sur la boîte de dialogue d'expérience de début.
REMARQUE : Pour le timelapse, vérifiez continuellement l'attention à chaque champ de vision tout au long de l'expérience en utilisant le paramètre DIC (pour éviter le photoblanchiment inutile) et recentrez et mettez à jour l'information dans la liste des points, car les cellules ont tendance à se concentrer au fil du temps.
4. Traitement d'image
- Ouvrez les fichiers d'images brutes (R3D) souhaités pour la génération de chiffres.
REMARQUE : Les fichiers récemment enregistrés peuvent être localisés à l'aide du bouton de dossier de données sur la boîte de dialogue de démarrage du logiciel d'imagerie. - Exécuter le programme de déconvolution, pour supprimer la lumière de fluorescence hors foyer7,8, afin de produire un fichier d'image D3D déconvolved. Sélectionnez l'onglet processus sur la boîte de dialogue de démarrage, puis sélectionnez déconvolve. Une nouvelle boîte de dialogue apparaîtra intitulée déconvolve.
- Définiz les paramètres de déconvolution en faisant glisser le numéro d'image approprié (situé dans le coin supérieur gauche de chaque fichier d'image) à l'entrée sur la boîte de dialogue de déconvolution. Sur la boîte de dialogue de déconvolution, sélectionnez le bouton plus d'options, et désélectionnez le rolloff de la frontière de culture après le traitement de la case à cocher (sinon les images ne peuvent pas être superposées sur le fichier DIC correspondant).
- Cliquez sur le bouton do it sur la boîte de dialogue deconvolution pour décongestionner le fichier d'image brute.
REMARQUE : Les paramètres de déconvolution pourraient être ajustés comme indiqué par le manuel d'orientation du fabricant du logiciel pour les résultats souhaités.
- Si nécessaire, effectuez une soustraction manuelle de bruit de fond et un réglage de luminosité/contraste dans n'importe quel ou tous les canaux de longueur d'onde (couleur). Pour ce faire, en sélectionnant le bouton d'ajustement de contraste sur le fichier d'image déconvolved.
- Enregistrez l'image en tant que fichier TIFF en sélectionnant d'abord l'option de fichier en haut de la boîte de dialogue D3D. Sélectionnez ensuite enregistrer comme TIFF, identifier et sélectionner les z-piles appropriées (qui sont au point), sélectionnez ou déssélectionnez les ensembles de filtres souhaités.
- Effectuer la quantification des données à l'aide de tout logiciel fourni par le fabricant ou de programmes librement disponibles tels que ImageJ5.
- Pour la quantification de la taille des cellules, cliquez sur l'onglet outil sur le fichier d'image D3D approprié, puis sélectionnez l'option distances de mesure. Mesurez les distances en sélectionnant les points de départ et d'extrémité sur le fichier d'image désiré à l'aide de la souris par clics gauches.
REMARQUE : Il est préférable de zoomer sur l'image pendant la quantification de la taille de la cellule. - Pour la quantification du signal de fluorescence, utilisez l'option inspecteur de données sous l'onglet outil sur le fichier d'image D3D approprié.
REMARQUE : Il est préférable de zoomer sur l'image et d'avoir uniquement des filtres pertinents sélectionnés lors de la réalisation de la quantification du signal de fluorescence. - Pour quantifier le signal de fluorescence, dessinez une boîte avec une option colonne/ligne fixée à une dimension spécifique. Sélectionnez une zone avec signal à quantifier et enregistrez la valeur. Mesurez le signal d'arrière-plan en utilisant la même boîte de taille pour sélectionner une zone immédiatement à l'extérieur des cellules. Soustrayez la valeur de fond de la valeur enregistrée du signal de fluorescence obtenu dans la cellule.
- Pour la quantification de la taille des cellules, cliquez sur l'onglet outil sur le fichier d'image D3D approprié, puis sélectionnez l'option distances de mesure. Mesurez les distances en sélectionnant les points de départ et d'extrémité sur le fichier d'image désiré à l'aide de la souris par clics gauches.
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Representative Results
Phénotypes GpsB
Précédemment nous avons montré que Sa-GpsB est une protéine essentielle comme épuisement du GpsB utilisant un ARN antisens a comme conséquence la lyse cellulaire9. Ici nous décrivons comment l'émergence de divers phénotypes de division cellulaire et des changements dans la localisation de protéine pourraient être capturés utilisant le protocole de microscopie de timelapse décrit dans cet article. À cette fin, S. aureus souches RB143 [SH1000 hébergeant pEPSA5 (vecteur vide)] et GGS8 [SH1000 hébergeant pGG59 (Pxyl-gpsBantisense blacat)] rapporté précédemment9, ont été cultivés comme suit. Les souches RB143 et GGS8 ont été inoculées dans 2 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) complétée par du chloramphenicol (chlor) de 5 g/mL dans un tube à essai de 15 ml et ont été incubées pendant la nuit à 22 oC en secouant. Les cultures de la nuit ont été diluées 1:20 dans 10 ml de TSB frais - chlor dans un flacon de 125 ml et cultivées à 37 oC avec des secousses jusqu'à la phase mi-logarithmique (OD600 - 0,5). L'inducteur, 1% xylose, a été ajouté au milieu de culture pour déclencher l'expression de l'ARN antisens de GPSB et la culture a été cultivée pour un autre 3 h. Les cellules ont ensuite été tachées de colorant fluorescent FM4-64 (tache de membrane), si nécessaire, par l'ajout de 0,5 l d'un stock de 10 g/mL de FM4-64 directement sur le 5 aliquot de la culture sur le microscope. Comme le montre la figure 1 et la vidéo 1, l'ajout de xylose pour induire la souche GGS8 a donné lieu à un phénotype de cellules « malades », tel que décrit précédemment9, tandis que la lutte antivectorielle vide (RB143) semblait similaire à notre contrôle — cellules cultivées en l'absence d'inducteur.
Notre groupe a également signalé que la surproduction de S. aureus GpsB (Sa-GpsB) perturbe la division cellulaire dans B. subtilis9. Nous utilisons ce phénotype surexpression comme exemple pour démontrer le protocole décrit ici. À cette fin, une souche B. subtilis GG9(amyE::Phyperspank-gpsBSaspc; ftsAZ::ftsAZ-gfp'erm) a été utilisée9. La localisation subcellulaire de FtsZ, une protéine clé de division cellulaire qui marque les sites de division cellulaire10,11, a été utilisée pour surveiller l'état de la division cellulaire. L'échantillon pour la microscopie a été préparé comme suit. Une seule colonie de GG9 a été inoculée dans un milieu de 2 ml Luria-Bertani (LB) et incubée pendant la nuit à 22 oC dans un shaker d'incubateur. Les cultures de nuit étaient 1:20 dans 10 ml de LB frais, et ont grandi à 37 oC avec des secousses jusqu'à la phase mi-logarithmique (OD600 - 0,5). Les cellules GG9 (5 l aliquot) à imager ont été placées sur le fond d'un plat de culture de fond de verre et recouvertes d'un tampon d'agarose de 1 % fait de LB complété de 250 M (concentration finale) d'isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pour induire l'expression de Sa-GPSB (figure 2 et vidéo 2). La microscopie de timelapse et la quantification de longueur de cellules ont été exécutées comme décrit dans la section de protocole.
Inhibition de FtsZ
FtsZ, étant une protéine essentielle pour la division cellulaire, est considéré comme une cible de médicaments attrayant et de multiples groupes développent des inhibiteurs FtsZ comme un moyen de développer de nouveaux antibiotiques12. Les modèles de localisation de FtsZ ou l'une des protéines qui lui sont associées, comme ZapA, peuvent être utilisés comme reporter pour étudier et/ou identifier de nouveaux composés antimicrobiens. Nous utilisons le protocole fourni ici pour démontrer cette approche en utilisant S. aureus RB197 [SH1000 hébergeant pRB42 (PCd-zapASa-gfp bla erm)]9 et B. subtilis PE92 (ftsAZ::ftsAZ-gfp-erm)13 souches. Les souches RB197 et PE92 ont été cultivées comme décrit ci-dessus dans le BST (contenant 5 'g/mL d'érythromycine; et 1,25 'M CdCl2 pour induire l'expression de zapA-gfp) et LB respectivement. À mi-logarithmique, un inhibiteur ftsZ bien caractérisé, PC19072314,15, a été ajouté à une concentration finale de 2 g/mL et son effet sur les cellules S. aureus et B. subtilis a été surveillé à l'aide de microscopie à différents intervalles de temps(figure 3 et figure 4). La quantification du diamètre cellulaire de S. aureus et de la longueur cellulaire de B. subtilis a été effectuée comme décrit dans la section du protocole.
Figure 1 : Micrographie à haute résolution des cellules de S. aureus affichant le phénotype malade. Micrographies de fluorescence des souches de S. aureus abritant soit un vecteur vide (à gauche; RB143) ou une copie inducible de l'ARN antisens de GPSBSa (à droite; GGS8) en présence et absence de 1% de xylose (inducteur). Les cellules étaient tachées de taches de membrane FM4-64 (stocks dissous dans de l'eau stérile) et représentées à l'aide d'un ensemble de filtres TRITC. Barre d'échelle : 1 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Données représentatives montrant l'inhibition de la division cellulaire dans B. subtilis. (A) Micrographies Timelapse de la souche Gg9 de B. subtilis avec des images acquises à intervalles de 20 min pendant 120 min à l'aide des canaux DIC/FITC. Les données de fluorescence de FtsZ-GFP (vert) sont affichées. Les flèches suivent une cellule tout au long de l'expérience. Barre d'échelle : 1 m. (B) Quantification des longueurs de cellules à tous les points de temps. La longueur moyenne des cellules avec des barres d'erreur indiquant l'écart standard (n '50) est indiquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Enquête de cours de temps de l'inhibition de division cellulaire dans S. aureus. (A) Cellules de phase mi-logarithmiques de la souche RB197 non traitées (en haut) ou traitées (en bas) avec l'inhibiteur FtsZ (PC190723), après une croissance de 30 min, des aliquots de cultures en croissance ont été prélevés toutes les 10 min pendant 90 min et représentés à l'aide d'ensembles de filtres DIC et FITC. La fluorescence de ZapA-GFP est montrée. Barre d'échelle : 1 m. (B) Quantification des données de microscopie. La largeur moyenne des cellules avec des barres d'erreur indiquant l'écart standard (n - 50) et le pourcentage de cellules (n - 50) affichant la localisation appropriée de ZapA-GFP (mi-cellule et périphérie) sont montrées. Les points de données des cellules traitées avec l'inhibiteur sont montrés en rouge. Les formes avec le contour vert correspond à l'axe Y droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Enquête sur l'inhibition de la division cellulaire par un inhibiteur synthétique dans B. subtilis. La souche B. subtilis PE92 n'a pas été traitée ou traitée avec un inhibiteur ftsZ (PC190723) à mi-logarithmique et a été surveillée pendant les 90 min suivants. Les Aliquots de cultures en croissance ont été pris toutes les 10 min pour la microscopie et des images ont été acquises à l'aide de canaux DIC/FITC. La fluorescence de FtsZ-GFP est montrée. Barre d'échelle : 1 m. (B) Quantification des données de microscopie. La longueur moyenne des cellules avec des barres d'erreur indiquant l'écart standard (n - 50) et le pourcentage de cellules (n - 50) affichant une localisation appropriée ftsZ-GFP à cellule moyenne sont indiquées. Les points de données des cellules traitées avec l'inhibiteur sont montrés en rouge. Les formes avec le contour vert correspond à l'axe Y droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo 1 : Microscopie timelapse des cellules de S. aureus développant le phénotype malade. Strain GGS8(gpsB antisense) traité avec 1% de xylose. Les cellules ont été tachées avec la tache de membrane de FM4-64 et imaged à des intervalles de 10 min pendant 60 min utilisant le canal de TRITC comme décrit dans le protocole. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2: La surexpression de Sa-GPSB conduit à l'inhibition de la division cellulaire dans B. subtilis. Vidéo Timelapse montrant la filamentation et le changement dans la localisation FtsZ-GFP dans GG9. Les images ont été prises à intervalles de 20 min pendant 120 min à l'aide des canaux DIC et FITC. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
| Espèces | Souche | Génotype | Référence | |
| S. aureus | RB143 (en) | SH1000 pEPSA5, bla, chat | Eswara et coll., 2018 | |
| S. aureus | GGS8 GGS8 | SH1000 pGG59 (épine dorsale pEPSA5) Pxyl-gpsBantisense, bla, chat | Eswara et coll., 2018 | |
| S. aureus | RB197 (en) | SH1000 pRB42 (épine dorsale pJB67) PCd-zapASA-gfp, bla, chat | Eswara et coll., 2018 | |
| B. subtilis | GG9 GG9 | amyE::Phyperspank-gpsBSA spc; ftsAZ-ftsAZ-gfp erm | Eswara et coll., 2018 | |
| B. subtilis | PE92 (en) | ftsAZ::ftsAZ-gfp | Brzozowski et coll., 2019 | |
Tableau 1 : Strains utilisés.
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Discussion
La microscopie est restée un pilier dans les études relatives aux organismes microbiens. Compte tenu de la taille des cellules à l'échelle du micron, les études sur le niveau d'une seule cellule ont traditionnellement été utilisées sur la microscopie électronique (EM). Bien que l'EM soit devenue une technique assez puissante ces dernières années, elle a ses propres limites intrinsèques en plus de l'accès limité des utilisateurs16. Les améliorations apportées aux techniques de microscopie à fluorescence et le développement de différentes sondes fluorescentes, telles que FDAA3, ont fourni aux biologistes des cellules microbiennes une vaste gamme d'outils pour étudier divers processus cellulaires dans les cellules vivantes. Les chercheurs construisent également activement des outils fluorescents pour surveiller les changements, par exemple dans le niveau des molécules de signalisation telles que c-di-GMP entre autres, dans les cellules vivantes17,18. De plus, la microscopie à haute résolution de fluorescence en timelapse permet aux chercheurs de surveiller les changements au fur et à mesure qu'ils se produisent et d'étudier les phénotypes pertinents.
Nous avons fourni des protocoles détaillés pour mener des expériences de microscopie avec un microscope à fluorescence à haute résolution (voir Tableau des matériaux). Cependant, les étapes des protocoles pourraient être modifiées pour répondre aux besoins de l'utilisateur et au microscope utilisé. Nous utilisons S. aureus et B. subtilis comme organismes modèles pour montrer comment surveiller divers phénotypes de division cellulaire, suivre les changements dans la localisation des protéines et quantifier les données. En outre, pour les cas où le timelapse n'est pas propice, nous montrons à l'aide d'un inhibiteur FtsZ, comment mettre en place une expérience de cours dans le temps.
La limitation inhérente à la microscopie fluorescence est la résolution fixée par la limite de diffraction, qui pourrait être surmontée dans une certaine mesure à l'aide de techniques avancées de microscopie de super-résolution19,20. D'autres questions telles que la phototoxicité et le photoblanchiment pourraient être contournées en recueillant moins de piles Z ou en minimisant la durée et/ou la fréquence d'exposition au laser. D'autres matériaux de guidage spécifiques à la microscopie à cellules vivantes sont disponibles21. En dehors des organismes Gram-positifs B. subtilis et S. aureus, en utilisant cette mise en place, nous avons réussi à imager gram-négatif bactérie Escherichia coli, levure Saccharomyces cerevisiae, et nématode Caenorhabditis elegans.
En plus des expériences décrites ici, des méthodologies similaires pourraient être utilisées pour identifier les composés qui ciblent des processus cellulaires spécifiques d'une manière à haut débit. Les algorithmes qui automatisent le processus de quantification peuvent également être incorporés pour les grands jeux de données22,23. Il est immense nécessaire d'étudier différentes espèces bactériennes pour faire face à la crise de résistance aux antibiotiques et d'autres études sont justifiées pour comprendre les mécanismes des processus biologiques de base et identifier de nouveaux composés thérapeutiques. Diverses techniques de microscopie à fluorescence ont gagné en puissance et en dynamisme pour aider les chercheurs à relever ces défis, entre autres.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leurs commentaires sur cet article. Ces travaux ont été financés par une subvention de démarrage de l'Université de Floride du Sud (PE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
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