Summary
Denne artikkelen gir en steg-for-steg guide til å undersøke protein subcellulære lokalisering dynamikk og overvåke morfologiske endringer ved hjelp av høyoppløselig fluorescens mikroskopi i Bacillus subtilis og Staphylococcus aureus.
Abstract
Undersøkelser av faktorer som påvirker celledeling og celle form i bakterier, blir vanligvis utført i forbindelse med høyoppløselige fluorescens mikroskopi som observasjoner gjort på en befolkning nivå kan ikke virkelig gjenspeile hva som skjer på et enkelt cellenivå. Live-Cell timelapse mikroskopi lar etterforskere overvåke endringer i celledeling eller celle morfologi som gir verdifull innsikt om subcellulære lokalisering av proteiner og timing av genuttrykk, som det skjer, til potensielt hjelp til å besvare viktige biologiske spørsmål. Her beskriver vi vår protokoll for å overvåke fenotypiske endringer i Bacillus subtilis og Staphylococcus aureus ved hjelp av et deconvolution mikroskop med høy oppløsning. Målet med denne rapporten er å gi en enkel og klar protokoll som kan vedtas av andre etterforskere interessert i å gjennomføre fluorescens mikroskopi eksperimenter for å studere ulike biologiske prosesser i bakterier så vel som andre organismer.
Introduction
Feltet av bakteriell cellebiologi har blitt betydelig forbedret med nylige fremskritt i mikroskopi teknikker1,2. Blant andre instrumenter, mikroskop som er i stand til å gjennomføre timelapse fluorescens mikroskopi eksperimenter forblir et verdifullt verktøy. Etterforskere kan overvåke ulike fysiologiske hendelser i sanntid ved hjelp av fluorescerende proteiner som, grønn fluorescerende protein (GFP)-baserte transcriptional og translational reporter fusjoner, fluorescerende D-aminosyrer (FDAA)3, eller bruke andre flekker for merking cellen veggen, MEMBRAN og DNA. Det er derfor ingen overraskelse at fluorescens mikroskopi fortsatt er populær blant mikrobielle celle biologer. I tillegg til å bare vise slutten fenotyper, gi informasjon om hvordan de observerte fenotyper oppstår ved hjelp av timelapse mikroskopi kunne legge betydelig verdi til funnene og potensielt tilby ledetråder til hva cellulære prosesser blir målrettet av potensielle narkotika kandidater4.
Protokollene for å utføre avbildning med høy oppløsning ved hjelp av et fullt motorisert, invertert, bredt felts fluorescens mikroskop (se tabell over materialer) er gitt i denne artikkelen. Disse protokollene kan tilpasses for å dekke behovene til andre fluorescens mikroskop som er i stand til å gjennomføre timelapse mikroskopi. Selv om programvaren diskutert her tilsvarer den spesifikke produsenten levert programvare som angitt i tabellen materialer, programvare som vanligvis leveres av andre mikroskop produsenter eller fritt tilgjengelige ImageJ5, har tilsvarende verktøy for å analysere mikroskopi data. For forhold der timelapse ikke bidrar, kan eksperimenter med tids kurs gjennomføres som beskrevet i denne artikkelen. Protokollene beskrevet her gir en detaljert guide til å studere fenotypiske endringer i to forskjellige bakterielle arter: B. subtilis og S. aureus. Se tabell 1 for belastninger som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generelle vekstforhold
- Vaksinere 2 mL passende vekstmedium supplert med antibiotika (der det er nødvendig) med en enkelt koloni av stammen (e) for å bli avbildet. Ruge disse frø kulturene over natten ved 22 ° c i en skjelvende inkubator.
Merk: de spesifikke bakterielle vekst forholdene som brukes i denne artikkelen er gitt under representative resultater delen. - Fortynne natten kulturer 1:20 i frisk Media inne en 125 mL kolbe, komplettere med antibiotika (der hvor krevde).
- Dyrke kultur (r) ved 37 ° c i en risting inkubator til midten av logaritmisk fase (OD600 = 0,5).
Merk: induser eller inhibitor kan legges direkte til voksende kultur (r) i den aktuelle vekstfasen. - Høste celler på ønsket kultur forhold for mikroskopi prøve forberedelser som beskrevet i følgende avsnitt.
2. prøve forberedelser
- Forbered 1% agarose ved å kombinere 0,25 g av molekylærbiologi grade, lav EEO, agarose med enten 25 mL vekstmedium supplert med egnede antibiotika (der det er nødvendig) for timelapse mikroskopi eller sterilt vann. Varm blandingen ved hjelp av en mikrobølgeovn for ca 30 s og hell den i en steril 100 mm x 15 mm Petri parabol og la det stivne.
- Ta en 5 – 50 μL alikvot av celle kulturen avhengig av behovet og beis cellene. Stain celler med egnede fargestoffer på dette stadiet (f. eks, legge fluorescerende fargestoff FM4-64 (membran flekken) for et eksperiment (figur 1)).
- Pipetter en 5 μL alikvot av kulturen prøven eller farget prøve å bli avbildet på bunnen av en 35 mm glassbunn kultur parabolen (med 14 mm mikrotiterplateleser diameter og ubehandlede nei 1,5 dekkglass; se tabellen av materialer).
FORSIKTIG: ikke bruk Poly-L-lysin belagt coverslips spesielt for timelapse mikroskopi som de kunne indusere ulike vekstmønster (vi har observert dette med Poly-D-lysin i tillegg, data ikke vist) og/eller påvirke protein dynamikk6. - For å minimere bruken av fargestoffer, beis 3-4 μL celle fjæring (høstet ved OD600 = 0,5; ca 2,7 x 107 og 3,4 x 107 for B. subtilis og S. aureus henholdsvis per 1 ml kultur) direkte på glassbunn parabolen.
- Plasser en pre-cut agarose SKIVE (11 mm i diameter eller av ønsket størrelse for å overlappe området av dekkglass, kuttet med den åpne enden av et sterilt rør eller et barberblad) på toppen av prøven og trykk forsiktig for å sikre at agarose skive ligger flatt mot dekkglass.
- Pipetter en 5 μL alikvot av kulturen prøven eller farget prøve å bli avbildet på bunnen av en 35 mm glassbunn kultur parabolen (med 14 mm mikrotiterplateleser diameter og ubehandlede nei 1,5 dekkglass; se tabellen av materialer).
- Etter Imaging (se følgende avsnitt), hvis antall celler i synsfeltet er ikke ønskelig, justere celle tettheten av prøven via fortynning eller konsentrasjon av sentrifugering og endre forholdet mellom celler i prøven ved hjelp av vekstmedium/buffer etter behov.
Merk: for å minimere autofluorescence som kommer fra kultur mediet, kan cellene vaskes i buffer (for eksempel i standard 1x fosfat buffer saltvann) og resuspendert i riktig mengde buffer før bildebehandling. Det er mulig at i dette trinnet mindre celler eller blemmer ikke kan beholdes etter sentrifugering og vil dermed gå tapt. - Tilsett vann ved hjelp av en pipette (~ 5 μL dråper) til plassen inne i kultur parabolen (rundt dekkglass) for å hindre at agarose puten tørker, og for å opprettholde fuktighet i løpet av bildet oppkjøpet, spesielt for timelapse eksperimenter.
- Tillat kultur retter å likevekt til temperaturen inne i inkubasjons kammeret, en innebygd ugjennomsiktig kupé levert av produsenten, av mikroskopet i 15-20 min.
Merk: slå på varmeelementet og sett inkubasjons kammeret til ønsket temperatur flere timer før bildebehandling. Dette vil sikre at maskinvaren stabiliserer seg til den nye temperaturen. For langvarig timelapse avbildning, Plasser et beger eller kolbe med vann inne i mikroskop kammeret, borte fra arbeidsområdet, for å opprettholde fuktighet.
3. avbildning
- Slå på mikroskop systemet på dagen for eksperimentet. Start bildebehandlingsprogrammet (se tabell over materialer) ved å klikke på det aktuelle ikonet på skrivebordet. Initialiser mikroskopet ved å klikke på Initialiser mikroskop -alternativet (knappen avbildet med et mikroskop) i programvare oppstartsdialogboksen. Kontroller at målet er fullstendig senket ved hjelp av grov justeringen av mikroskopet før initialisering.
Merk: etter initialisering tre ekstra dialogbokser skal vises i tillegg til Start-menyen: resolve3D, datainnsamling, og filter Monitor. - Plasser en dråpe 1,517 (brytningsindeks) olje på den 100 mm olje nedsenking som leveres av produsenten (numerisk blenderåpning = 1,4, arbeidsavstand = 0,12 mm; se tabell over materialer).
Merk: det er viktig å velge riktig nedsenking olje for temperaturen der Imaging er utført. - Legg glasset bunnen parabolen inneholder prøven inn i metall huset (kiste) og skyv forsiktig inn i scenen klemmen.
- Bruk grov justeringsknotten til å heve målet til oljen kommer i kontakt med glass bunnen på fatet. Bruk øye brikken og den fine justeringsknotten til å få prøven i fokus. Når cellene er i fokus, Drei knotten fra øye stykket til kameramodus ved å flytte velgeren på fremsiden av mikroskopet til venstre.
- Begynn eksperimentet ved bruk av bilde programvaren. I resolve3D -vinduet velger du design/Kjør eksperiment ikonet avbildet av en kolbe. En ny dialogboks skal vises med tittelen utforming/kjøre eksperiment.
- Angi antall Z-stakker og utvalgs tykkelse ved hjelp av kategorien utforming og deretter snitting i dialogboksen Utform/Kjør eksperiment .
Merk: for eksperimenter i representative resultater delen, 17 Z-stabler på 200 NM intervall for stillbilder og fire Z-stabler på 200 NM intervall for timelapse mikroskopi ble brukt. - Hvis du vil måle tykkelsen på cellene i eksemplet, kan du manuelt justere Z-planet trinnvis ved hjelp av pil opp og pil ned i dialogboksen resolve3D . Merk der cellene går ut av fokus som øvre og nedre grense for bildeinnhenting. Importer denne informasjonen før du kjører eksperimentet.
- For å redusere Phototoksisitet og photobleaching under timelapse avbildning, Reduser antall Z-stabler og velg midtplanet av cellene for bildeoppkjøp.
- Angi antall Z-stakker og utvalgs tykkelse ved hjelp av kategorien utforming og deretter snitting i dialogboksen Utform/Kjør eksperiment .
- Velg riktig filter sett for eksperimentet ved hjelp av kategorien utforming og deretter kanaler i dialogboksen Utform/Kjør eksperiment (TRITC: ex 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
- Velg også en referanse for innsamling av POL/DIC-informasjon. Juster prosentvis overføring (lys intensitet) og varighet av eksponering for individuelle kanaler valgt før Imaging ved å velge de riktige alternativene i dialogboksen resolve3D .
Merk: i et test synsfelt som ikke vurderes for eksperimentet, må disse innstillingene identifiseres hvis de valgte parameterne får meningsfulle fluorescens data uten at det mangler et svakt signal eller oversaturating det. Deretter importerer du disse parameterne for det eksperimentelle oppsettet.
- Velg også en referanse for innsamling av POL/DIC-informasjon. Juster prosentvis overføring (lys intensitet) og varighet av eksponering for individuelle kanaler valgt før Imaging ved å velge de riktige alternativene i dialogboksen resolve3D .
- Åpne poenglisten ved å velge poeng liste knappen i dialogboksen resolve3D . En ny dialogboks skal vises med tittelen Points-listen. Merk flere visningsfelt som skal brukes i eksperimentet, ved å finne passende synsfelt ved hjelp av fase kontrollene for mikroskopet og velge alternativet for merke punkt i dialogboksen punktliste.
Merk: du må velge et erstatnings punkt hver gang mikroskopet refocused på et punkt i poenglisten. Dette kan gjøres ved å fokusere mikroskopet på det aktuelle punktet i listen og deretter velge Erstatt punkt -knappen. Det er viktig å ikke berøre den analoge grov/fin justeringsknotten når refocusing; bare bruke programvaren til å justere fokuset. - Angi timelapse parametere ved først å velge utforming og deretter timelapse -fanen i dialogboksen Utform/Kjør eksperiment. Merk av i avmerkingsboksen timelapse. Angi de riktige timelapse parametrene i form av timelapse bilder/total tid.
- Angi punkter som skal vises fra punktlisten ved først å velge utforming og deretter peker -fanen i dialogboksen Utform/Kjør eksperiment. Velg alternativet besøk punktliste, og angi punkter som skal vises i tekstboksen atskilt med komma eller bindestreker hvis det er en fullstendig sekvens.
- Før du starter et eksperiment, må du redigere filnavn og filplasseringer ved hjelp av kategorien Kjør i dialogboksen Utform/Kjør. Filplasseringen kan endres ved å velge Innstillinger -knappen, velge data mappen og deretter velge riktig mappe eller opprette en ny. Endre filnavn ved å skrive inn det nye filnavnet i tekstboksen for bildefilnavn.
- Start eksperimentet ved å velge avspillings knappen i dialogboksen Start eksperiment .
Merk: for timelapse, kontinuerlig sjekk fokus på hvert synsfelt gjennom hele eksperimentet ved hjelp av DIC innstillingen (for å unngå unødvendige photobleaching) og fokusere på nytt og oppdatere informasjonen i poenglisten som celler har en tendens til å gå ut av fokus over tid.
4. bildebehandling
- Åpne den ønskede RAW (R3D) bildefiler for generering av tall.
Merk: nylig lagrede filer kan være plassert ved hjelp av data mappe knappen på Imaging programvare oppstart dialogboksen. - Kjør deconvolution programmet, for å fjerne ut-av-fokus fluorescens lys7,8, for å produsere en deconvolved D3D bildefil. Velg kategorien prosess i dialogboksen oppstart, og velg deretter deconvolve. En ny dialogboks vil vises med tittelen deconvolve.
- Angi deconvolution parametre ved å dra det riktige bildenummeret (plassert i øvre venstre hjørne av hver bildefil) til inngangen i dialogboksen deconvolution. På deconvolution dialogboksen, velg flere alternativer knappen, og fjern markeringen av beskjærings grensen rolloff menylinjen etter behandling avkrysningsboks (ellers kan bildene ikke legges oppå den tilsvarende dic-filen).
- Falle i staver det gjøre den knapp på deconvolution dialogue bokse med å deconvolve ømt punkt image arkiv.
Merk: deconvolution parametre kan justeres som indikert av programvareprodusentens veiledning for å få ønskede resultater.
- Om nødvendig kan du utføre manuell bakgrunnsstøy subtraksjon og justering av lysstyrke/kontrast i alle eller alle bølgelengde kanaler (farge). Gjør dette ved å velge knappen for kontrast justering på den deconvolved bildefilen.
- Lagre bildet som en TIFF-fil ved først å velge fil alternativet øverst i dialogboksen D3D . Velg deretter lagre som TIFF, Identifiser og Velg passende Z-stabler (som er i fokus), Merk av eller fjern merket for ønskede filter sett.
- Utfør data kvantifisering ved hjelp av enhver produsent-levert programvare eller fritt tilgjengelige programmer som ImageJ5.
- For Cellestørrelse kvantifisering Klikk på verktøy fanen på den aktuelle D3D bildefilen, og velg deretter måle avstander alternativet. Mål avstander ved å velge Start og sluttpunkt på ønsket bildefil ved hjelp av musen gjennom venstre klikk.
Merk: det er best å zoome inn på bildet under Cellestørrelse kvantifisering. - For fluorescens signal kvantifisering bruke data inspektør alternativet under kategorien verktøy på den aktuelle D3D bildefilen.
Merk: det er best å zoome inn på bildet og bare ha relevante filtre valgt når du fullfører fluorescens signal kvantifisering. - For å kvantifisere fluorescens signalet, tegne en boks med kolonne/rad alternativet satt til en bestemt dimensjon. Velg et område med signal som skal kvantifisert, og Registrer verdien. Mål bakgrunns signalet ved å bruke samme størrelses boks for å velge et område umiddelbart utenfor cellene. Trekk bakgrunns verdien fra verdien som er registrert fra fluorescens signalet som er oppnådd i cellen.
- For Cellestørrelse kvantifisering Klikk på verktøy fanen på den aktuelle D3D bildefilen, og velg deretter måle avstander alternativet. Mål avstander ved å velge Start og sluttpunkt på ønsket bildefil ved hjelp av musen gjennom venstre klikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GpsB fenotyper
Tidligere har vi vist at sa-GpsB er et essensielt protein som forringelse av GpsB ved bruk av et antisens RNA-resultat i cellelyse9. Her beskriver vi hvordan fremveksten av ulike celledeling fenotyper og endringer i protein lokalisering kan fanges ved hjelp av timelapse mikroskopi protokollen beskrevet i denne artikkelen. For dette formålet, S. aureus stammer RB143 [SH1000 harboring pEPSA5 (Empty Vector)] og GGS8 [SH1000 harboring PGG59 (Pxyl-gpsBantisensBla Cat)] rapportert tidligere9, ble dyrket som følger. Stammer RB143 og GGS8 ble inokulert i 2 mL tryptic soya buljong (TSB) supplert med 5 μg/mL kloramfenikol (klor) i et 15 mL reagensrør og ble inkubert over natten ved 22 ° c mens risting. Den overnatter kulturer ble fortynnet 1:20 i 10 mL fersk TSB + klor i en 125 mL kolbe og dyrket på 37 ° c med risting til midten av logaritmisk fase (OD600 = 0,5). Induser, 1% xylose, ble lagt til kulturen medium for å utløse uttrykk for antisens RNA av gpsB og kulturen ble dyrket for en annen 3 h. celler ble deretter farget med fluorescerende fargestoff FM4-64 (membran beis), der det er nødvendig, ved tilsetning av 0,5 μL av en 10 μg/ml lager av FM4-64 direkte på 5 μL alikvot av kulturen på mikroskopet som beskrevet i protokollen delen. Som vist i figur 1 og Video 1, tillegg av xylose å indusere GGS8 stamme resulterte i en "syk" celle fenotype, som beskrevet tidligere9, mens tomme vektor kontroll (RB143) dukket opp lik vår kontroll-celler vokst i fravær av induser.
Vår gruppe rapporterte også at overproduksjon av S. aureus GpsB (sa-GpsB) forstyrrer celledeling i B. subtilis9. Vi bruker denne overuttrykte fenotype som et eksempel for å demonstrere protokollen som er beskrevet her. For dette formål, en B. subtilis stamme GG9 (amyE::Phyperspank-GpsBsaSPC; ftsAZ:: ftsAZ-gfpΩerm) ble brukt9. Subcellulære lokalisering av fluorescensmerkete-merket FtsZ, en nøkkel celle divisjon protein som markerer cellen divisjon nettsteder10,11, ble brukt til å overvåke status for celledeling. Prøven for mikroskopi ble fremstilt som følger. En enkelt koloni av GG9 ble inokulert i 2 mL Luria-Bertani (LB) medium og inkubert over natten ved 22 ° c i en inkubator shaker. Den overnatter kulturer var 1:20 i 10 mL fersk LB, og dyrket på 37 ° c med risting til midten av logaritmisk fase (OD600 = 0,5). GG9 celler (5 μL alikvot) å bli avbildet ble plassert på bunnen av et glassbunn kultur parabol og dekket med en 1% agarose pad laget med LB supplert med 250 μM (endelig konsentrasjon) av isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTH) å indusere uttrykk for sa-gpsB (figur 2 og video 2). Timelapse mikroskopi og celle lengde kvantifisering ble utført som beskrevet i protokoll seksjonen.
Hemming av FtsZ
FtsZ, som er et protein viktig for celledeling, regnes som et attraktivt medikament mål og flere grupper utvikler FtsZ-hemmere som en måte å utvikle nye antibiotika12. Lokalisering mønstre av FtsZ eller ett av proteiner knyttet til det, slik som ZapA, kan brukes som en reporter for å studere og/eller identifisere romanen antimikrobielle forbindelser. Vi bruker protokollen gitt her for å demonstrere denne tilnærmingen med S. aureus RB197 [SH1000 harboring PRB42 (PCD-zapAsa-gfp bla erm)]9 og B. subtilis PE92 (ftsAZ:: ftsAZ-gfpΩerm)13 stammer. RB197 og PE92 stammer ble dyrket som beskrevet ovenfor i TSB (inneholder 5 μg/mL erytromycin; og 1,25 μM CdCl2 for å indusere uttrykk for zapA-GFP) og lb hhv. På midten av logaritmisk fase, en godt karakterisert FtsZ inhibitor, PC19072314,15, ble tilsatt ved 2 μg/ml endelig konsentrasjon og dens effekt på S. aureus og B. subtilis celler ble overvåket ved hjelp av mikroskopi ved forskjellige tidsintervaller (Figur 3 og Figur 4). Kvantifisering av celle diameter av S. aureus og celle lengde B. subtilis ble utført som beskrevet i protokoll seksjonen.
Figur 1: høyoppløselig mikroskop av S. aureus -celler som viser syke fenotype. Fluorescens micrographs av S. aureus stammer harbouring enten tom vektor (venstre; RB143) eller en induserbart kopi av antisens RNA av gpsBsa (høyre; GGS8) i nærvær og fravær av 1% xylose (induser). Celler var beiset med FM4-64 membran flekken (aksjer oppløst i sterilt vann) og avbildet ved hjelp av TRITC filter sett. Scale bar: 1 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative data som viser celledeling hemming i B. subtilis. (A) timelapse micrographs av B. subtilis stamme GG9 med bilder ervervet på 20-min intervaller for 120 min ved hjelp av dic/FITC kanaler. Fluorescens data for FtsZ-GFP (grønn) vises. Piler følger én celle gjennom eksperimentet. Scale bar: 1 μm. (B) kvantifisering av celle lengder til enhver tid poeng. Gjennomsnittlig celle lengde med feilfelt som angir standardavvik (n = 50), vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: time Course gransking av celledeling hemming i S. aureus. (A) mid-logaritmisk fase celler av belastning RB197 ubehandlet (øverst) eller behandlet (nederst) med FTSZ inhibitor (PC190723), etter 30 min vekst, alikvoter av voksende kulturer ble tatt hver 10 min for 90 min og avbildet med dic og FITC filter sett. Fluorescens fra ZapA-GFP vises. Scale bar: 1 μm. (B) kvantifisering av mikroskopi data. Gjennomsnittlig cellebredde med feil stolper som angir standardavvik (n = 50) og prosentandel av celler (n = 50) som viser riktig ZapA-GFP lokalisering (Mid-celle og periferi) vises. Data punkter i celler behandlet med inhibitor vises i rødt. Figurer med grønn kontur tilsvarer den høyre Y-aksen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: gransking av celledeling hemming av en syntetisk inhibitor i B. subtilis. B. SUBTILIS stamme PE92 var enten ubehandlet eller behandlet med en FtsZ-hemmer (PC190723) i midten av logaritmisk fase og ble overvåket for påfølgende 90 min. alikvoter av voksende kulturer ble tatt hver 10 min for mikroskopi og bilder ble kjøpt ved hjelp av dic/FITC kanaler. Fluorescens fra FtsZ-GFP vises. Scale bar: 1 μm. (B) kvantifisering av mikroskopi data. Gjennomsnittlig celle lengde med feilfelt som angir standardavvik (n = 50) og prosentandel av celler (n = 50) som viser riktig mid-celle FtsZ-GFP lokalisering vises. Data punkter i celler behandlet med inhibitor vises i rødt. Figurer med grønn kontur tilsvarer den høyre Y-aksen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: timelapse mikroskopi av S. aureus -celler som utvikler syke fenotype. Stamme GGS8 (gpsB antisens) behandlet med 1% xylose. Celler ble farget med FM4-64 membran beis og avbildet på 10 min intervaller for 60 min ved hjelp av TRITC kanalen som beskrevet i protokollen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: overuttrykte av sa-gpsB fører til hemming av celledeling i B. subtilis. Timelapse video som viser filamentation og endring i FtsZ-GFP lokalisering i GG9. Bildene ble tatt på 20 min intervaller for 120 min bruker DIC og FITC kanaler. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
| Arter | Belastning | Genotype | Referanse | |
| S. aureus | RB143 | SH1000 pEPSA5, bla, katt | Eswara et al, 2018 | |
| S. aureus | GGS8 | SH1000 pGG59 (pEPSA5 ryggrad) Pxyl-gpsBantisens, bla, katt | Eswara et al, 2018 | |
| S. aureus | RB197 | SH1000 pRB42 (pJB67 ryggrad) PCD-zapAsa-gfp, bla, katt | Eswara et al, 2018 | |
| B. subtilis | GG9 | amyE::P hyperspank-gpsBsa SPC; ftsAZΩftsAZ-gfp erm | Eswara et al, 2018 | |
| B. subtilis | PE92 | ftsAZ:: ftsAZ-gfp Ωerm | Brzozowski et al, 2019 | |
Tabell 1: belastninger brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi har vært en bærebjelke i studier knyttet til mikrobielle organismer. Gitt deres mikron-skalaen cellen størrelse, enkelt-cellen plan flate studier ha tradisjonelt lettelse opp på elektron mikroskopi (EM). Selv om EM har blitt ganske kraftig teknikk de siste årene, har det sin egen iboende begrensninger i tillegg til begrenset bruker tilgang16. Forbedringer i fluorescens mikroskopi teknikker og utvikling av ulike fluorescerende sonder, som FDAA3, har gitt mikrobiell celle biologer med et stort utvalg av verktøy for å studere ulike cellulære prosesser i levende celler. Forskere er også aktivt med å bygge fluorescerende verktøy for å overvåke endringer, for eksempel i nivået på signalering molekyler som c-di-GMP blant andre, i levende celler17,18. I tillegg gir høyoppløselig timelapse fluorescens mikroskopi etterforskere mulighet til å overvåke endringer etter hvert som de skjer, og til å studere relevante fenotyper.
Vi har gitt detaljerte protokoller for å utføre mikroskopi eksperimenter med et fluorescens mikroskop med høy oppløsning (se tabell over materialer). Trinnene i protokollene kan imidlertid endres for å passe behovene til brukeren og mikroskopet som brukes. Vi bruker S. aureus og B. subtilis som vår modell organismer å vise hvordan du overvåker ulike celledeling fenotyper, spore endringer i protein lokalisering, og kvantifisere dataene. I tillegg, for tilfeller der timelapse ikke bidrar, viser vi ved hjelp av en FtsZ-hemmer, hvordan du setter opp en tid kurs eksperiment.
Den iboende begrensningen med fluorescens mikroskopi er oppløsningen satt av Diffraksjon grensen, noe som kan overvinnes til en viss grad ved hjelp av avansert super-oppløsning mikroskopi teknikker19,20. Andre spørsmål som Phototoksisitet og photobleaching kan være omgås ved å samle færre Z-stabler eller minimere varigheten og/eller hyppigheten av eksponering for laser. Andre veilednings materialer som er spesifikke for mikroskopi er tilgjengelige21. Bortsett fra gram-positive organismer B. subtilis og S. aureus, ved hjelp av denne satt opp, har vi med hell avbildet gram-negative bakterien Escherichia coli, gjær Saccharomyces cerevisiae, og nematode Caenorhabditis elegans.
I tillegg til forsøkene beskrevet her, kan lignende metoder brukes til å identifisere forbindelser som mål bestemte cellulære prosesser i en høy-gjennomstrømming mote. Algoritmer som automatiserer kvantifisering prosessen, kan også innlemmes for store datasett22,23. Det er et enormt behov for å studere ulike bakteriearter å ta opp antibiotikaresistens krisen og flere studier er berettiget til å forstå mekanismene for grunnleggende biologiske prosesser og å identifisere romanen terapeutiske forbindelser. Ulike fluorescens mikroskopi teknikker har fått kraft og momentum til å hjelpe forskere i å ta opp disse utfordringene blant andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker våre Lab medlemmer for sine kommentarer til denne artikkelen. Dette arbeidet ble finansiert ved oppstart stipend fra University of South Florida (PE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
