Summary
Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.
Abstract
Bakterilerde hücre bölünmesi ve hücre şeklini etkileyen faktörlerin araştırılması genellikle yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile birlikte yapılır, çünkü popülasyon düzeyinde yapılan gözlemler tek bir hücre düzeyinde meydana gelen leri tam olarak yansıtmayabilir. Canlı hücre timelapse mikroskopisi, araştırmacıların hücre bölünmesi veya hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemelerine olanak sağlar ve bu da proteinlerin hücre altı lokalizasyonu ve gen ekspresyonunun zamanlaması ile ilgili değerli içgörüler sağlar, ki bu da önemli biyolojik soruların cevaplanmasında potansiyel olarak yardımcı olur. Burada, bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'taki henotibik değişiklikleri yüksek çözünürlüklü dekonvolution mikroskobu kullanarak izlemek için protokolümüzü açıklıyoruz. Bu raporun amacı, bakterilerin yanı sıra diğer organizmalarda farklı biyolojik süreçleri incelemek için floresan mikroskobu deneyleri yapmak la ilgilenen diğer araştırmacılar tarafından benimsenebilecek basit ve net bir protokol sağlamaktır.
Introduction
Bakteri hücre biyolojisi alanı önemli ölçüde mikroskopi teknikleri son gelişmeler ile geliştirilmiştir1,2. Diğer aletlerin yanı sıra, timelapse floresan mikroskobik deneyler icra edebilen mikroskoplar değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Araştırmacılar gibi floresan proteinler kullanarak gerçek zamanlı olarak çeşitli fizyolojik olayları izleyebilirsiniz, yeşil floresan protein (GFP) tabanlı transkripsiyonel ve çevirisel muhabir füzyon, floresan D-amino asitler (FDAA)3, ya da hücre duvarı, membran ve DNA etiketleme için diğer lekeler kullanın. Bu nedenle floresan mikroskopimikrobiyal hücre biyologları arasında popüler liğini sürdürdüğünü hiç de şaşırtıcı değildir. Sadece son fenotipleri göstermenin yanı sıra, gözlenen fenotiplerin timelapse mikroskobu kullanılarak nasıl ortaya çıkarabileceğine dair bilgi sağlamak bulgulara önemli bir değer katacak ve potansiyel olarak potansiyel olarak potansiyel olarak potansiyel uyuşturucu adayları tarafından hangi hücresel süreçlerin hedeflendiğine dair ipuçları sunabilir4.
Bu makalede, tam motorlu, ters, geniş alan floresan mikroskobu (Malzeme Tablosunabakınız) kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapmak için protokoller verilmiştir. Bu protokoller timelapse mikroskoplar yapma yeteneğine sahip diğer floresan mikroskopların ihtiyaçlarına uyacak şekilde uyarlanabilir. Burada tartışılan yazılım, Malzeme Tablosu'ndabelirtildiği gibi üretici tarafından sağlanan özel yazılıma karşılık geliyor olsa da, genellikle diğer mikroskop üreticileri veya serbestçe kullanılabilen ImageJ5tarafından sağlanan yazılım, mikroskopi verilerini analiz etmek için eşdeğer araçlara sahiptir. Zaman aşımının elverişli olmadığı durumlar için, zaman-kurs deneyleri bu makalede açıklandığı şekilde yapılabilir. Burada açıklanan protokoller iki farklı bakteri türündeki henotik değişiklikleri incelemek için ayrıntılı bir kılavuz sağlar: B. subtilis ve S. aureus. Kullanılan suşlar için Tablo 1'e bakınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genel büyüme koşulları
- Uygun büyüme ortamının 2 mL'sini antibiyotiklerle desteklendirin (gerektiğinde) tek bir suş kolonisi ile görüntülenin. Bu tohum kültürlerini bir gecede 22 °C'de sallayarak bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu makalede kullanılan özel bakteriyel büyüme koşulları temsili sonuçlar bölümünde sağlanmaktadır. - Bir gecede kültürleri seyreltin 1:20 taze ortamda 125 mL şişe, antibiyotik ile ek (gerektiğinde).
- 37 °C'de orta logaritmik faza (OD600 = 0.5) kadar sallanan bir kuluçka makinesinde kültür(ler) yetiştirin.
NOT: İndükleyici veya inhibitör uygun büyüme aşamasında büyüyen kültür(ler) doğrudan eklenebilir. - Aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi mikroskopi numune sipresiyonu için istenilen kültür koşullarında hasat hücreleri.
2. Örnek hazırlama
- Moleküler biyoloji notu 0.25 g, düşük EEO, agarose ile 25 mL büyüme ortamı ile zaman atlamalı mikroskobik veya steril su için uygun antibiyotikler (gerektiğinde) ile takviye birleştirerek% 1 agarose hazırlayın. Karışımı mikrodalga yardımıyla yaklaşık 30 s ısıtın ve steril 100 mm x 15 mm Petri kabına dökün ve katılamasına izin verin.
- Hücre kültürünün ihtiyacına bağlı olarak 5-50 μL aliquot alın ve hücreleri leke. Bu aşamada uygun boyalarla leke hücreleri (örneğin, bir deney için floresan boya FM4-64 (membran lekesi) ekleyin(Şekil 1)).
- Pipet, 35 mm'lik cam alt kültür çanağının altına (14 mm mikrokuyu çapı ve kaplamasız No. 1.5 kapaklı; Malzeme Tablosunabakınız) görüntülenecek kültür numunesinin veya lekeli numunenin 5 μL aliquot'udur.
DİkKAT: Farklı büyüme deseni (biz de poli-D-lizin ile gözlemledik; veriler gösterilmez) ve /veya protein dinamiklerini etkileyebileceği için özellikle timelapse mikroskobu için poli-L-lizin kaplı kapakları kullanmayın6. - Boya kullanımını en aza indirmek için, 3-4 μL hücre süspansiyonu (OD600 = 0,5; b. subtilis ve S. aureus için sırasıyla 1 mL kültür için yaklaşık 2,7 x 107 ve 3,4 x 107 hasat) doğrudan cam alt çanak üzerinde.
- Önceden kesilmiş bir agarose levha (11 mm çapında veya coverslip alanı örtüşmek için istenilen boyutta; steril bir tüp veya jilet açık ucunu kullanarak kesilmiş) örnek üstüne yerleştirin ve yavaşça agarose levha kapak karşı düz yalan olduğundan emin olmak için dokunun.
- Pipet, 35 mm'lik cam alt kültür çanağının altına (14 mm mikrokuyu çapı ve kaplamasız No. 1.5 kapaklı; Malzeme Tablosunabakınız) görüntülenecek kültür numunesinin veya lekeli numunenin 5 μL aliquot'udur.
- Görüntülemeden sonra (aşağıdaki bölüme bakınız), görüş alanındaki hücre sayısı istenmiyorsa, seyreltme veya konsantrasyon yoluyla numunenin hücre yoğunluğunu santrifüj ile ayarlayın ve gerektiğinde büyüme ortamı/tampon kullanarak numunedeki hücrelerin oranını değiştirin.
NOT: Kültür ortamından yayılan otofloresansı en aza indirmek için hücreler tamponda yıkanabilir (örneğin standart 1x fosfat tampon uline) ve görüntülemeden önce uygun miktarda tampon olarak yeniden askıya alınabilir. Bu adımda santrifüjden sonra küçük hücrelerin veya veziküllerin tutulmaması ve bu nedenle kaybedilmesi mümkündür. - Agarose pedin kurumasını önlemek ve özellikle zaman atlamalı deneylerde görüntü edinimi sırasında nemi korumaya yardımcı olmak için kültür çanağının içindeki boşluğa (coverslip etrafında) pipet (~5°L damla) kullanarak su ekleyin.
- Kültür yemeklerinin, üretici tarafından sağlanan dahili opak bir bölme olan kuluçka odasının içindeki ısıya 15-20 dakika boyunca mikroskobun sıcaklığına dengelemesine izin verin.
NOT: Isıtma elemanını açın ve kuluçka odasını görüntülemeden birkaç saat önce istenilen sıcaklığa ayarlayın. Bu, donanımın yeni sıcaklığa sabitolmasını sağlar. Uzun süreli görüntüleme için, nem korumak için mikroskop odasının içine, çalışma alanından uzakta su içeren bir kabı veya şişe yerleştirin.
3. Görüntüleme
- Deney günü, mikroskop sistemini açın. Masaüstündeki uygun simgeyi tıklatarak görüntüleme yazılımını başlatın (Bkz. Malzeme Tablosu). Yazılımın başlangıç iletişim kutusundaki Initialize Microscope seçeneğini (üzerinde mikroskop la betimlenen düğme) tıklayarak mikroskobu başlatın. Başlatmadan önce mikroskop kabası ayarı kullanılarak hedefin tamamen düşürüldüğından emin olun.
NOT: Başlatma menüsüne ek olarak üç ek iletişim kutusu görüntülenmelidir: çözümleme3D, veri toplama ve filtre monitörü. - Üretici tarafından sağlanan 100x yağ daldırma hedefine 1,517 (kırılma indisi) yağı bir düşüş yerleştirin (Sayısal Diyafram = 1,4, Çalışma Mesafesi = 0,12 mm; bkz. Malzemeler Tablosu).
NOT: Görüntülemenin yapıldığı sıcaklık için uygun daldırma yağının seçimi önemlidir. - Numune içeren cam alt kabı metal gövdeye (tabut) yükleyin ve sahne kelepçesine yavaşça kaydırın.
- Yağ yemeğin cam alt ile temas edene kadar hedefi yükseltmek için kaba ayar topuz kullanın. Örneği odak haline getirmek için göz parçasını ve ince ayar topuzlarını kullanın. Hücreler odaklandıktan sonra, mikroskop gövdesinin önünde bulunan seçici anahtarı sola doğru hareket ettirerek düğmeyi göz parçasından kamera moduna çevirin.
- Görüntüleme yazılımını kullanarak denemeye başlayın. Çözümlü 3D penceresinde, bir şişeyle betimlenen Tasarım/çalıştır deneme simgesini seçin. Yeni bir iletişim kutusu tasarım/çalıştır denemesibaşlıklı görünmelidir.
- Tasarım ve ardından tasarım/çalıştır deneme iletişim kutusundaki bölüm sekmesini kullanarak Z yığınlarının sayısını ve örnek kalınlığını ayarlayın.
NOT: Temsili sonuçlar bölümündeyapılan deneylerde, hareketsiz görüntüler için 200 nm aralıkta 17 Z-deste, timelapse mikroskopi için 200 nm aralığında dört Z-deste kullanılmıştır. - Örnekteki hücrelerin kalınlığını ölçmek için, çözümlenmiş 3D iletişim kutusundaki yukarı ve aşağı okları kullanarak Z düzlemini el ile artımlı olarak ayarlayın. Hücrelerin görüntü edinimi için üst ve alt sınır olarak odak dışı gittikleri yeri işaretleyin. Denemeyi çalıştırmadan önce bu bilgileri aktarın.
- Timelapse görüntüleme sırasında fototoksisite ve fotobeyazrlama en aza indirmek için, Z-yığınları sayısını azaltmak ve görüntü edinimi için hücrelerin orta düzlemi seçin.
- Tasarım ve ardından tasarım/çalıştır deneme iletişim kutusundaki bölüm sekmesini kullanarak Z yığınlarının sayısını ve örnek kalınlığını ayarlayın.
- Tasarımı kullanarak deneme için uygun filtre kümesini seçin ve ardından tasarım/çalıştır deneme iletişim kutusundaki kanallar sekmesini seçin (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mKiraz: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
- Ayrıca, POL/DIC bilgilerinin toplanması için bir başvuru seçin. Çözümleme 3D iletişim kutusunda ki uygun seçenekleri seçerek görüntülemeden önce seçilen tek tek kanallar için yüzde iletimini (ışık yoğunluğunu) ve maruz kalma süresini ayarlayın.
NOT: Seçili parametrelerin zayıf sinyali kaçırmadan veya aşırı doyatmadan anlamlı floresan verileri elde edip etmediğini belirlemek için deney için düşünülmeyen bir görünüm alanında bu ayarları test edin. Daha sonra deneysel kurulum için bu parametreleri aktarın.
- Ayrıca, POL/DIC bilgilerinin toplanması için bir başvuru seçin. Çözümleme 3D iletişim kutusunda ki uygun seçenekleri seçerek görüntülemeden önce seçilen tek tek kanallar için yüzde iletimini (ışık yoğunluğunu) ve maruz kalma süresini ayarlayın.
- Çözümlü 3D iletişim kutusundaki Puanlistesi düğmesini seçerek puan listesini açın. Yeni bir iletişim kutusu, başlıklı puan listesigörünmelidir. Mikroskop aşaması denetimlerini kullanarak uygun görünüm alanlarını bularak ve puan listesi iletişim kutusundaişaret noktası seçeneğini seçerek denemede kullanılacak çeşitli görünüm alanlarını işaretleyin.
NOT: Mikroskobun puan listesindeki bir noktaya yeniden odaklandığı her seferde bir değiştirme noktası nın seçilmesi gerekir. Bu, mikroskobu listedeki uygun noktaya odaklayarak ve daha sonra değiştir noktası düğmesini seçerek yapılabilir. Yeniden odaklama yaparken analog kaba/ince ayar tonuna dokunmamak önemlidir; odağı ayarlamak için yalnızca yazılımı kullanın. - Önce tasarım ve ardından deneme iletişim kutusundaki timelapse sekmesini seçerek zaman atlama parametrelerini ayarlayın. Zaman atlamalı onay kutusunu seçin. Zaman atlamalı görüntüler/toplam zaman açısından uygun zaman atlamalı parametreleri girin.
- Önce tasarımı seçerek puan listesinden görüntülenecek noktaları ve ardından tasarım/çalıştır deneme iletişim kutusundaki noktalar sekmesini ayarlayın. Ziyaret noktaları listesi seçeneğini seçin ve tam bir sıra ise virgül veya tire ile ayrılmış metin kutusuna görüntülenecek noktaları girin.
- Denemebaşlamadan önce, tasarım/çalıştır iletişim kutusundaki çalıştır sekmesini kullanarak dosya adlarını ve dosya konumlarını düzenleme. Dosya konumu ayarlar düğmesini seçerek, veri klasörünü seçerek ve daha sonra uygun klasörü seçerek veya yeni bir klasör oluşturarak değiştirilebilir. Resim dosyası adı metin kutusuna yeni dosya adını girerek dosya adlarını değiştirin.
- Denemeyi başlat iletişim kutusundaki oynat düğmesini seçerek denemeyi başlatın.
NOT: Timelapse için, DIC ayarını kullanarak (gereksiz fotobeyazrlamayı önlemek için) deneme boyunca her görüş alanında odağı sürekli olarak denetleyin ve hücreler zaman içinde odak dışına çıkma eğiliminde olduğu için puan listesindeki bilgileri yeniden odaklayıp güncelleyin.
4. Görüntü işleme
- Şekil oluşturma için istenilen ham (R3D) görüntü dosyalarını açın.
NOT: Son zamanlarda kaydedilen dosyalar, görüntüleme yazılımının başlangıç iletişim kutusundaki veri klasörü düğmesini kullanarak bulunabilir. - Deconvolution programı çalıştırın, bir deconvolved D3D görüntü dosyası üretmek için odak dışı floresan ışık kaldırmak için7,8, . Başlat iletişim kutusundaki işlem sekmesini seçin ve ardından deconvolve'useçin. Yeni bir iletişim kutusu deconvolvebaşlıklı görünecektir.
- Deconvolution parametrelerini, dekonvolution iletişim kutusundaki girişe uygun görüntü numarasını (her görüntü dosyasının sol üst köşesinde bulunan) sürükleyerek ayarlayın. Deconvolution iletişim kutusunda, daha fazla seçenek düğmesini seçin ve onay kutusunu işledikten sonra kırpma kenarlığı rolloff'unu seçin (aksi takdirde görüntüler ilgili DIC dosyasının üzerine eklenemez).
- Ham resim dosyasını deconvolve için deconvolution iletişim kutusunda yap düğmesini tıklatın.
NOT: Deconvolution parametreleri istenilen sonuçlar için yazılım üreticisinin kılavuz kılavuzunda belirtildiği şekilde ayarlanabilir.
- Gerekirse, herhangi bir veya tüm dalga boyu (renk) kanallarında manuel arka plan gürültüsü çıkarma ve parlaklık/kontrast ayarı gerçekleştirin. Deconvolved resim dosyasındaki kontrast ayarlama düğmesini seçerek bunu yapın.
- Önce D3D iletişim kutusunun üst kısmındaki dosya seçeneğini seçerek görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydedin. Ardından TIFF olarak kaydet'i seçin, uygun Z-yığınlarını (odak içinde olan), istenen filtre kümelerini seçin veya seçin.
- Üretici tarafından sağlanan herhangi bir yazılımı veya ImageJ5gibi serbestçe kullanılabilen programları kullanarak veri nicelleştirme gerçekleştirin.
- Hücre boyutu ölçümü için uygun D3D resim dosyasındaki araç sekmesine tıklayın ve ardından ölçü mesafeleri seçeneğini belirleyin. Sol tıklamalarla fareyi kullanarak istenilen resim dosyasındaki başlangıç ve bitiş noktalarını seçerek mesafeleri ölçün.
NOT: Hücre boyutu nicelemesi sırasında görüntüyü yakınlaştırmak en iyisidir. - Floresan sinyal nicelliği için, uygun D3D görüntü dosyasındaki araç sekmesinin altındaki veri denetçisi seçeneğini kullanın.
NOT: En iyisi görüntüyü yakınlaştırmak ve floresan sinyal miktarını tamamlarken yalnızca ilgili filtrelerin seçilmesidir. - Floresan sinyalini ölçmek için, belirli boyuta ayarlanmış sütun/satır seçeneğine sahip bir kutu çizin. Ölçülecek sinyaliçeren bir alan seçin ve değeri kaydedin. Hücrelerin hemen dışında bir alan seçmek için aynı boyut kutusunu kullanarak arka plan sinyalini ölçün. Hücre içinde elde edilen floresan sinyalinden kaydedilen değerden arka plan değerini çıkarın.
- Hücre boyutu ölçümü için uygun D3D resim dosyasındaki araç sekmesine tıklayın ve ardından ölçü mesafeleri seçeneğini belirleyin. Sol tıklamalarla fareyi kullanarak istenilen resim dosyasındaki başlangıç ve bitiş noktalarını seçerek mesafeleri ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GpsB fenotipleri
Daha önce sa-GpsB hücre lysis bir antisense RNA sonuçları kullanarak GpsB tükenmesi gibi önemli bir protein olduğunu göstermiştir9. Burada çeşitli hücre bölünmesi fenotiplerinin ortaya çıkışının ve protein lokalizasyonundaki değişikliklerin bu makalede açıklanan timelapse mikroskopi protokolü kullanılarak nasıl yakalanabileceği açıklanmaktadır. Bu amaçla, S. aureus suşları RB143 [SH1000 barındıran pEPSA5 (boş vektör)] ve GGS8 [SH1000 harboring pGG59 (Pxyl-gpsBantisenseblakedi)] daha önce bildirilen9, aşağıdaki gibi yetiştirilmiştir. RB143 ve GGS8 suşları 15 mL test tüpünde 5 μg/mL kloramfenikol (klor) ile takviye edilmiş 2 mL triptotik soya suyu (TSB) ile aşılanmış ve sallanırken 22 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırılmıştır. Gece kültürleri 10 mL taze TSB + klor 125 mL'lik bir şişede 1:20 seyreltilmiş ve 37 °C'de orta logaritmik faza kadar sallayarak (OD600 = 0,5) olarak yetiştirilmiştir. İndükleyici, %1 ksyoz, gpsB antisense RNA ifadesini tetiklemek için kültür ortamına eklendi ve kültür başka bir 3 h. Hücreler için yetiştirilen floresan boya FM4-64 (membran leke), gerektiğinde, 0.5 μL fm4-mL stok u eklenmesi ile doğrudan mikroskop çanak üzerinde kültürün 5 μL aliquot üzerine protokol de açıklandığı gibi. Şekil 1 ve Video 1'degösterildiği gibi, GGS8 türünü indüklemek için ksylose eklenmesidaha önce 9'da açıklandığı gibi "hasta" bir hücre fenotipine yol açmış, boş vektör kontrolü (RB143) ise indükleyici yokluğunda yetişen hücreler bizim kontrolümüzle benzer görünmiştir.
Grubumuz ayrıca S. aureus GpsB (Sa-GpsB) aşırı üretim B. subtilis9hücre bölünmesi bozan bildirdi. Burada açıklanan protokolü göstermek için bu aşırı ifade fenotipini örnek olarak kullanırız. Bu amaçla, bir B. subtilis zorlanma GG9 (amyE::Phyperspank-gpsBSaspc; ftsAZ::ftsAZ-gfpΩerm) 9 kullanıldı . Hücre bölünmesi bölgelerini işaretleyen anahtar hücre bölünmesi proteini10,11,hücre bölünmesi durumunu izlemek için floresan etiketli FtsZ'nin hücre altı lokalizasyonu kullanıldı. Mikroskopi örneği aşağıdaki gibi hazırlanmıştır. GG9 tek bir koloni 2 mL Luria-Bertani (LB) orta inotoulated ve bir kuvöz çalkalayıcı 22 °C gecede kuluçka. Gece kültürleri 10 mL taze LB 1:20 idi ve orta logaritmik faz (OD600 = 0,5) kadar sallayarak 37 °C'de büyüdü. Görüntülenecek GG9 hücreleri (5 μL aliquot) cam bir alt kültür çanak altına yerleştirildi ve 250 μM (son konsantrasyon) izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ile takviye LB ile yapılan% 1 agarose ped ile kaplı Sa-gpsB ifadesini ikna etmek için(Şekil 2 ve Video 2). Protokol bölümünde açıklandığı gibi timelapse mikroskopi ve hücre uzunluğu nicelemesi yapıldı.
FtsZ inhibisyonu
FtsZ, hücre bölünmesi için gerekli bir protein olmak, çekici bir ilaç hedefi olarak kabul edilir ve birden fazla grup yeni antibiyotikler geliştirmek için bir yol olarak FtsZ inhibitörleri geliştiriyoruz12. FtsZ'nin veya zapa gibi ilişkili proteinlerden birinin lokalizasyon paternleri, yeni antimikrobiyal bileşikleri incelemek ve/veya tanımlamak için muhabir olarak kullanılabilir. Biz s. aureus RB197 [SH1000 barındıran pRB42 ( PCd-zapASa-gfp bla erm]]9 ve B. subtilis PE92 (ftsAZ:ftsAZ:ftsAZ-gfpΩerm)13 suşlar kullanarak bu yaklaşımı göstermek için burada sağlanan protokolü kullanın. RB197 ve PE92 suşları yukarıda açıklandığı gibi TSB'de (zapA-gfpve LB ekspresyonunu indüklemek için 5 g/mL eritromisin içeren; ve 1.25 μM CdCl2 içeren) olarak yetiştirildi. Orta logaritmik fazda, iyi karakterize ftsz inhibitörü, PC19072314,15, 2 μg/mL son konsantrasyonda eklendi ve S. aureus ve B. subtilis hücreleri üzerindeki etkisi farklı zaman aralıklarında mikroskopi ile izlendi(Şekil 3 ve Şekil 4). Protokol bölümünde açıklandığı gibi S. aureus'un hücre çapı ve B. subtilis'in hücre uzunluğunun ölçülmesi yapıldı.
Şekil 1: Hasta fenotip gösteren S. aureus hücrelerinin yüksek çözünürlüklü mikrografı. S. aureus'un floresan mikrografları boş vektörü barındıran suşlar (solda; RB143) veya gpsBSa antisense RNA indükleyici bir kopyası (sağda; GGS8) varlığı ve yokluğunda 1% ksylose (indükleyici). Hücreler FM4-64 membran lekesi ile boyanmış (steril suda çözünmüş stoklar) ve TRITC filtre seti kullanılarak görüntülendi. Ölçek çubuğu: 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: B. subtilis'tehücre bölünmesi inhibisyonunu gösteren temsili veriler. (A) B. subtilis'in timelapse mikrografları, DIC/FITC kanallarını kullanarak 120 dk boyunca 20 dk aralıklarla elde edilen görüntülerle GG9'u zorlar. FtsZ-GFP (yeşil) floresan verileri gösterilir. Oklar deney boyunca bir hücreyi takip eder. Ölçek çubuğu: 1 μm. (B) Tüm zaman noktalarında hücre uzunluklarının ölçülmesi. Standart sapmayı (n = 50) gösteren hata çubuklarıile ortalama hücre uzunluğu gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: S. aureus'tahücre bölünmesi inhibisyonunun zaman dersi araştırması. (A) Zorlanma RB197 orta logaritmik faz hücreleri tedavi edilmemiş (üst) veya ftsZ inhibitörü ile tedavi (alt) (pc190723), 30 dakika büyüme sonrasında, büyüyen kültürlerin aliquots 90 dakika için her 10 dakika alınmıştır ve DIC ve FITC filtre setleri kullanılarak görüntülendi. ZapA-GFP floresan gösterilir. Ölçek çubuğu: 1 μm. (B) Mikroskopi verilerinin sayısallaştırılması. Standart sapmayı (n = 50) ve uygun ZapA-GFP yerelleştirmesini (orta hücre ve çevre) görüntüleyen hücrelerin yüzdesini (n = 50) gösteren hata çubuklarına sahip ortalama hücre genişliği gösterilir. Inhibitör le tedavi edilen hücrelerin veri noktaları kırmızı renkte gösterilir. Yeşil anahatlı şekiller doğru Y eksenine karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: B. subtilis'tesentetik inhibitör ile hücre bölünmesi inhibisyonunun araştırılması. B. subtilis strain PE92 orta logaritmik fazda ftsz inhibitörü (PC190723) ile tedavi edilmedi veya tedavi edildi ve sonraki 90 dk. büyüyen kültürlerin Aliquots mikroskopi için her 10 dakikada alındı ve görüntüler DIC / FITC kanalları kullanılarak elde edildi. FtsZ-GFP floresan gösterilir. Ölçek çubuğu: 1 μm. (B) Mikroskopi verilerinin sayısallaştırılması. Standart sapmayı (n = 50) ve uygun orta hücre FtsZ-GFP yerelleştirmesini görüntüleyen hücrelerin yüzdesini (n = 50) gösteren hata çubuklarına sahip ortalama hücre uzunluğu gösterilir. Inhibitör le tedavi edilen hücrelerin veri noktaları kırmızı renkte gösterilir. Yeşil anahatlı şekiller doğru Y eksenine karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Hasta fenotip geliştiren S. aureus hücrelerinin timelapse mikroskobu. Strain GGS8(gpsB antisense) % 1 ksisoz ile tedavi. Hücreler FM4-64 membran lekesi ile boyandı ve protokolde açıklandığı gibi TRITC kanalı kullanılarak 60 dk boyunca 10 dk aralıklarla görüntülendi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: Sa-gpsB aşırı ekspresyonu B. subtilishücre bölünmesi inhibisyonu yol açar. GG9'da FtsZ-GFP yerelleştirmesinde filamentasyon ve değişimi gösteren timelapse video. Görüntüler DIC ve FITC kanalları kullanılarak 120 dk için 20 dk aralıklarla alınmıştır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
| Tür | Zorlanma | Genotip | Başvuru | |
| S. aureus | RB143 | SH1000 pEPSA5, bla, kedi | Eswara ve ark, 2018 | |
| S. aureus | GGS8 | SH1000 pGG59 (pEPSA5 omurga) Pxyl-gpsBantisense, bla, kedi | Eswara ve ark, 2018 | |
| S. aureus | RB197 | SH1000 pRB42 (pJB67 omurga) PCd-zapASA-gfp, bla, kedi | Eswara ve ark, 2018 | |
| B. subtilis | GG9 | amyE::Phyperspank-gpsBSA spc; ftsAZΩftsAZ-gfp erm | Eswara ve ark, 2018 | |
| B. subtilis | PE92 | ftsAZ::ftsAZ-gfp Ωerm | Brzozowski ve ark, 2019 | |
Tablo 1: Suşlar kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi mikrobiyal organizmalarla ilgili çalışmalarda dayanak noktası olarak kalmıştır. Mikron ölçekli hücre büyüklükleri göz önüne alındığında, tek hücre düzeyinde çalışmalar geleneksel olarak elektron mikroskobu (EM) dayanıyordu. EM son yıllarda oldukça güçlü bir teknik haline gelmiş olsa da, sınırlı kullanıcı erişimi16ek olarak kendi içsel sınırlamaları vardır. Floresan mikroskobu tekniklerinde gelişmeler ve FDAA3gibi farklı floresan probların geliştirilmesi, canlı hücrelerde çeşitli hücresel süreçleri incelemek için çok çeşitli araçlar la mikrobiyal hücre biyologları sağlamıştır. Araştırmacılar da aktif değişiklikleri izlemek için floresan araçlar inşa ediyoruz, diğerleri arasında c-di-GMP gibi sinyal moleküllerinin düzeyinde örneğin, canlı hücrelerde17,18. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü timelapse floresan mikroskopi araştırmacılar değişiklikleri olduğu gibi izlemek ve ilgili fenotipler çalışma sağlar.
Yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile mikroskopi deneyleri yapmak için ayrıntılı protokoller sağladık (bkz. Malzeme Tablosu). Ancak, protokoldeki adımlar kullanıcının ve kullanılan mikroskobun ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Çeşitli hücre bölünmesi fenotiplerinin nasıl izlendiğini, protein lokalizasyonundaki değişiklikleri nasıl izleyip verileri ölçeceklerini göstermek için model organizmalarımız olarak S. aureus ve B. subtilis'i kullanırız. Buna ek olarak, zaman atlamalı elverişli olmayan durumlarda, bir FtsZ inhibitörü yardımıyla, nasıl bir zaman kursu deney kurmak için gösterir.
Floresan mikroskopisi ile doğal sınırlama kırınım sınırı tarafından belirlenen çözünürlük, hangi gelişmiş süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri19yardımı ile bir ölçüde aşılabilir 19,20. Fototoksisite ve fotobeyazlatma gibi diğer sorunlar daha az Z-yığınları toplayarak veya lazere maruz kalma süresini ve/veya sıklığını en aza indirerek atlatılabilir. Canlı hücre mikroskobuna özgü diğer kılavuz materyaller mevcuttur21. Gram-pozitif organizmalar B. subtilis ve S. aureusdışında , Bu kurmak kullanarak, biz başarıyla Gram-negatif bakteri Escherichia coli,maya Saccharomyces cerevisiae, ve nematode Caenorhabditis elegans görüntülenmiş.
Burada açıklanan deneylere ek olarak, benzer metodolojiler yüksek iş lenme tarzında belirli hücresel süreçleri hedefleyen bileşikleri tanımlamak için kullanılabilir. Niceleme işlemini otomatikleştiren algoritmalar da büyük veri kümeleri22,23için dahil edilebilir. Antibiyotik direnci krizini ele almak için farklı bakteri türlerinin incelenmesi ne kadar büyük bir ihtiyaç vardır ve temel biyolojik süreçlerin mekanizmalarını anlamak ve yeni terapötik bileşikleri belirlemek için daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Çeşitli floresan mikroskopi teknikleri diğerleri arasında bu sorunları ele araştırmacılara yardımcı olmak için güç ve ivme kazanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Laboratuvar üyelerimize bu yazıdaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Güney Florida Üniversitesi'nin (PE) başlangıç ödeneği ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
