Summary
Denne artikkelen inneholder et sett med protokoller for utvikling av humant indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocyte (hiPSC CM) nettverk kultivert på multiwell MEA plater til reverserbart electroporate cellemembranen for handling potensielle målinger. Opptak med høy gjennomstrømming hentes fra de samme celleområdene gjentatte ganger over dager.
Abstract
Hjerte sikkerhet screening er av overordnet betydning for stoffet oppdagelse og legemiddel selskap. Derfor er utviklingen av romanen høy gjennomstrømming elektrofysiologisk tilnærminger for hiPSC-avledet cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparater mye nødvendig for effektiv narkotika testing. Selv om multielectrode matriser (tiltak) ofte brukes til felt potensielle målinger av nervøs celler, har en nylig publikasjon av Joshi-Mukherjee og kollegaer beskrevet og validert sin søknad om tilbakevendende handlinger (AP)-innspillinger fra samme hiPSC-CM forberedelse over dager. Målet her er å gi detaljerte trinn-for-trinn metoder for seeding CMs og for å måle AP bølgeformer via electroporation med høy presisjon og en temporal oppløsning på 1 μs. Denne tilnærmingen tar for seg mangelen på brukervennlige metoder for å få intracellulære tilgang til AP-målinger med høy gjennomstrømning for pålitelige elektrofysiologisk undersøkelser. En detaljert arbeidsflyt og metoder for plating av hiPSC-CMs på multiwell MEA platene er diskutert understreker kritiske skritt der det er relevant. I tillegg er en spesialbygd MATLAB script for rask datahåndtering, utvinning og analyse rapporteres for omfattende undersøkelse av bølgeform analyse for å kvantifisere subtile forskjeller i morfologi for ulike AP varighet parametre innblandet i arytmi og Kardiotoksisitet.
Introduction
Humant indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMs) er gullstandarden for et økende antall laboratorier1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Juling embryoid organer11,12,13 og monolag3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 differensiering er de foretrukne metodene for cardiomyocyte produksjon og multielectrode array (Mea) har blitt en felles modalitet for overvåking av elektrodynamikk av disse nettverkene18,19,20. Mens parametere som kan trekkes ut fra feltet potensialer (FPS) som juling rate, amplitude, varighet og RR intervaller er Baseline elektrofysiologisk svar av spontant juling monolagere18,21, 22,23: handlings potensialet (AP)-komponentene som er underliggende for disse ekstracellulære FP-signalene, er vanskelige å ekstrapolere24. Vår siste utgivelse på oppdagelsen av en anvendelse av tiltak for direkte tilbakevendende AP målinger gir bevis på metodikk for eksemplarisk intracellulære AP readouts med en omfattende bølgeform analyse på ulike repolarisasjon faser på tvers av flere grupper av hiPSC-avledet cardiomyocyte nettverk3. I studien viste vi at levering av electroporating pulser til nettverk av hiPSC-avledet cardiomyocytes muliggjør intracellulære tilgang for AP innspillinger. Disse transient Ap-opptakene er avhengig av transmembrane potensielle gjenoppretting observert gjennom skaden nettstedet3,25,26. Bølgeformer innspilt via MEA og patch-Clamp i vår studie viste lignende AP morfologier dermed validere påliteligheten av tilnærmingen3.
Noen laboratorier har rapportert måle APS fra ulike electrogenic celler ved hjelp av spesialbygde tiltak18,21,26,27,28,29, 30, men påliteligheten til å bruke tiltak for konsistente og tilbakevendende Ap-målinger ble ikke vurdert. For tiden er gull standard patch-Clamp teknikk begrenset til Terminal innspillinger7,31 mens, Mea-baserte Ap målinger er forbigående og derfor kan gjennomføres flere ganger på samme celle. Vi viser også at man enkelt kan ta opp høykvalitets AP-signaler i millivolt området som krever minimalt med filtrering. Forskerne kan derfor ikke bare utføre akutte, men også kroniske legemiddelstudier i de samme forberedelsene som bruker tiltak. i tillegg tillater denne teknologien samtidig FP/AP-måling som genererer elektro-biome biblioteker i løpet av kort tid. Gitt den økende vekt på arytmi prediksjon og narkotika forbundet Kardiotoksisitet24,32,33,34,35, integrering av AP måling tilnærminger vil forbedre narkotika sikkerhet og effekt vurderinger.
Her presenterer vi protokoller for 1) pre-plating av embryo hiPSC-CMs for modning, 2) dissociating og plating av hiPSC-CMs på multiwell tiltak, 3) innspilling av FPs og APs fra hiPSC-CM nettverk, 4) segmentere og utpakking av data for analyse, og 5) gjenopprette matriser for flere gjenbruk. Hvert trinn er optimalisert med vekt på kritiske trinn der det er relevant. Krav til celle vedlegg for å sikre en vibrerende syncytial monolag diskuteres og prosedyrer for multiwell MEA restaurering for repeterende elektrofysiologisk studier er forklart. Endelig er en tilpasset GUI utviklet i laboratoriet presentert for AP signal utvinning, kvalitetssikring, og segmentering arbeidsflyt å kvantifisere og analysere AP parametere.
Protocol
1. utarbeidelse av løsninger og materialer (se tabell over materialer)
-
6-brønn vev-kultur plate substrat-belegg
- Tin belegg underlaget på is eller ved 4 ° c.
- Forbered en 1:100 belegg substrat fortynning i kaldt DMEM/F12 medium. Bland løsningen ved langsom pipettering.
- Overføring 2 mL av belegget substrat løsning (trinn 1.1.2) per brønn av en 6-brønn vev kultur plate.
- Umiddelbart plassere belagt vev kultur plate i cellen kultur inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 i minst 7 h og bruk innen 7 dager.
-
hiPSC-CM kultur medium
- Tilsett 10 mL CM medie supplement tint ved 4 ° c til 500 mL CM sokkel medium. Oppbevares ved 4 ° c i opptil 2 uker.
- Alikvot nødvendige mengden av media for dagen og bringe til romtemperatur før bruk.
- hiPSC-CM tine medium: Forbered friskt ved å blande hiPSC-CM kultur medium (trinn 1,2) med 10% fosterets storfe serum (FBS). Bring mediene til romtemperatur før tine av CMs for suspensjon.
- Fibronektin 1 mg/mL lagerløsning: Alikvot 200 μL i 1,5 mL sterile microfuge rør og oppbevares ved 4 ° c for senere bruk. Forbered arbeids løsning på 50 μg/mL konsentrasjon fersk på isen.
- Multiwell rengjøringsløsning: Kombiner 0,5 g med enzymatisk vaskemiddel med 50 mL sterilt dobbelt destillert vann (ddH2O). Vortex å blande innholdet. Filtrer og oppbevar ved 4 ° c i opptil en uke.
2. pre-plating av embryo hiPSC-CM for modning (figur 1)
Merk: denne delen er ment for tine og dyrking hiPSC-CMs som ble differensiert ved hjelp av mater-fri monolag metode3,16 og embryo i flytende nitrogen 10 dager etter differensiering på 1-2 millioner celler/hetteglass. Celler fra ett hetteglass er belagt i to substrat-belagte brønner av en 6-brønn vev kultur plate. Cardiomyocytes tendens til å bosette seg på bunnen av røret så skånsom blanding på tidspunktet for pre-plating er viktig for å oppnå jevn celle tetthet på tvers av brønner.
- Alikvot 2 mL FBS per hetteglass med hiPSC-CMs blir tint inn i en 15 mL konisk rør og bringe til romtemperatur.
- Tine hetteglass med embryo hiPSC-CMs ved å plassere dem i en 37 ° c vannbad og virvel forsiktig for enda tine for ikke mer enn 3 min.
- Overfør umiddelbart innholdet i hetteglasset til røret som inneholder FBS (se trinn 2,1), bland med virvlende og sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspend celle pellet i 1 mL hiPSC-CM tine medium (se trinn 1,3) per hetteglass tint. Bruk en overførings pipette for å resuspend pellet ved milde trituration. Analysere celle levedyktighet.
- Legg ytterligere 3 mL tine medium per hetteglass med hiPSC CM tint i trinn 2,4 og suspendere forsiktig ved hjelp av en overførings pipette til ytterligere distansere celle klumper.
- Dispensere 2 mL celle fjæring forsiktig inn i hver brønn av substrat-belagt 6-brønn plater (se trinn 1,1). Plasser i cellekultur inkubator ved 37 ° c og 5% CO2.
- Erstatt med friskt hiPSC-CM dyrking medium etter 24 timer og 3 ganger ukentlig i 20 dager.
Merk: cellene skal følge underlaget belegget med 24 h og slo spontant på 48 h post-plating (se Video 1 og video 2).
3. Multiwell MEA plate sterilisering og belegg (figur 2 og figur 3)
Merk: protokollen beskrevet her er for å forberede 24-brønn MEA plater med 12 Micro gull PEDOT-belagt elektroder på glass for hiPSC-CM plating. Unngå å berøre bunnen av platen, da dette kan skade elektrodene.
- To dager før celle plating, tilsett 0,5 mL hiPSC-CM kultur medium (se trinn 1,2) til hver brønn og utføre en Baseline opptak for å verifisere signal-til-støy-forhold for kvalitetskontroll av tiltak.
- Aspirer mediene, skyll med steril ddH2O og STERILISERE under UV-lys inne i en laminær Flow Hood over natten.
- Dagen før celle plating, tilsett 0,1 mL FBS til hver brønn for hydrofile behandling av MEA overflater. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur. Dette trinnet er nødvendig for celle vedlegg.
- Aspirer FBS og skyll med 0,5 mL sterilt ddH2O per brønn. Gjenta en gang til.
- La platen tørke i den laminær strømnings panseret over natten.
- Forbered en fungerende fortynning av 50 μg/mL fibronektin i kaldt DMEM/F12 medium fra bestanden (se trinn 1,4). Hold løsningen på isen.
- Pipetter 5 μL av arbeids fibronektin fortynning (se 3,6) og trekk dråpetelleren forsiktig til midten av hver brønn for å dekke alle 12 elektroder. Det er viktig å arbeide raskt på tvers av de 24 brønnene for å hindre at dråpe tørking.
- Plasser umiddelbart den fibronektin multiwell MEA-platen på en hevet overflate i et fukte kammer som inneholder steril ddH2O for å dekke hele oppvask flaten. Plasser kammeret med multiwell MEA plate for 3 t i cellen kultur inkubator.
Merk: plassering av 24 godt MEA plate i et fukte kammer er avgjørende for å hindre fibronektin dråper tørker ut i løpet av inkubasjonsperioden.
4. hiPSC-CM dissosiasjon og plating på Multiwell MEA plate (figur 3)
Merk: Start dette trinnet ca 1 time før MEA fibronektin inkubasjons er fullført. Sørg for at celle dissosiasjon oppløsning er på 37 ° c og at iPSC-CM tine medium er i romtemperatur. Dissosiasjon metoder har blitt optimalisert for 30 dager etter differensiert hiPSC-CMs kultivert på substrat-belagt 6-brønn plater (se trinn 2) for å få ca 90% levedyktig CMs for MEA plating. Forsiktighet bør utvises for ikke å innføre luftbobler mens trituration å hindre celle død.
- Aspirer kulturen medium fra hver brønn av 6-brønn vev kultur parabolen med 30 dagers post-differensiert hiPSC-CM kultur (se trinn 2,7) og vask med 2 mL steril D-PBS per brønn.
- Tilsett 1 mL pre-varmet celle dissosiasjon løsning (se tabell over materialer) per brønn og ruge for 4 min ved 37 ° c. Bruk en overførings pipette for å forsiktig triturate å løsne celler for dissosiasjon. Hvis de fleste av cellene er fortsatt tilhenger, ruge for en annen 3 min ved 37 ° c og triturate igjen. Denne ekstra inkubasjons skal bidra til maksimal celle utvinning. Ikke ruge i mer enn 7 minutter da dette kan føre til lav celle levedyktighet.
- Ved hjelp av en overføring pipette, basseng alle dissosiert cellene i et konisk rør som inneholder hiPSC-CM tine medium (se trinn 1,3). Det anbefales å suspendere cellene i minst to ganger volumet av Media (2 mL per velvære høstes) for å blokkere aktiviteten av cellen dissosiasjon løsning.
- Sentrifuger på 200 x g i 5 min.
- Aspirer løsningen nøye når pellet er løst festet til overflaten og resuspend i 0,1 mL hiPSC-CM tine medium. Bruk en overføring pipette å resuspend pellet et par ganger av milde trituration.
- Alikvot 2 μL av dissosiert celler og fortynnet med 18 μL av medier i et 1,5 mL microfuge rør. Tilsett 20 μL av Trypan blå og bland for celle telling og levedyktighet vurdering.
- Juster celle tettheten til 6 000 celler/μL ved å legge til riktig volum av hiPSC-CM tine medium. Suspendere pellet ved milde bla et par ganger. Den hiPSC-CMs lett løsne fra glassflater spesielt når belagt ved høy tetthet. Vi har optimalisert seeding tetthet og plating forhold for å oppnå 15 dager med elektriske innspillinger.
- Når du er klar, ta med multiwell MEA plate i laminær Flow panseret for celle seeding. Det er viktig å utføre følgende to trinn en brønn om gangen for å hindre at fibronektin tørker.
- Forsiktig fjerne fibronektin dråpe ved hjelp av en P10 pipette uten å berøre elektrodene.
- Umiddelbart dispensere en 5 μL celle dråpe (30 000 celler) til midten av brønnen på MEA plate som dekker alle 12 elektroder. Gjenta trinnet til alle de 24 brønnene er belagt. Periodisk blanding av celle suspensjon ved å bla anbefales.
- Plasser multiwell MEA platen tilbake i løst dekket fukte kammer og gå tilbake til cellen kultur inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for 3 h for celle vedlegg.
- Legg forsiktig til 200 μL av hiPSC-CM tine medium til hver brønn uten å forstyrre cellene ved hjelp av en P200 pipette. Legg til medie dråpevis på siden av brønnen.
- Plasser multiwell MEA platen tilbake i cellen kultur inkubator.
- Erstatt med friskt hiPSC-CM kultur medium ved 24 h post plating. Spontane cardiomyocytes kan observeres på dette punktet (se video 3).
- Endre Media hver 2 dager til slutten av eksperimenter.
5. hiPSC-CM electroporation og signal oppkjøp (figur 4 – 6)
Merk: denne protokollen er for samtidig opptak av høy gjennomstrømming elektrode signaler (12 nettsteder for hver av de 24 brønnene). Den 24-godt multiwell MEA systemet brukes med oppkjøpet programvare (se tabell over materialer). Alle MEA opptakene er utført ved 37 ° c.
- Slå på grensesnittet styret og starte oppkjøpet programvare. La det multiwell MEA-headstage få nok tid til å nå temperaturen på 37 ° c (se pil nummer 1 i Figur 4).
- Sett inn multiwell MEA-plate fra trinn 4 i multiwell MEA-headstage ved å plassere den dekket over opptaks plattformen og klikk på Sett inn -knappen (se pil nr 2 i Figur 4). La det stabilisere temperaturen før opptak starter.
-
Juster innstillinger for anskaffelse og electroporation
- Klikk på Definer eksperimentell flyt -ikonet (se pil nummer 3 i Figur 4) og sett opptakstiden til 2 min eller etter ønske.
- Klikk på ikonet for Oppsett av data innsamling (se pilen nr. 4 i Figur 4) og angi samplingsfrekvens til 20 kHz, høypassfilter til 0,1 Hz og low-pass filter til 3500 Hz.
- Klikk på ikonet for stimulator-innstillinger (se figur 5). Under kategorien Stimulus Definition definerer du stimulering som bifasisk symmetriske spennings pulser på 1 mv, 1 MS og 1 Hz. Under fanen for stimulering av elektroder velger du electroporation IDer ved å fremheve alle relevante elektroder.
- Klikk på Utforsk -knappen for å visualisere signaler i alle brønner. Kontroller signalkvaliteten og de stadige tilstands forholdene. Ta notater på elektroder med FP-signaler i mV-serien. Klikk den samme knappen for å stoppe utforskningen. Ingen data er registrert frem til dette punktet.
- Start innspillingen ved å klikke på Go! -knappen. Elektrodene i hver brønn vil vise FP-signaler i rå data vinduet (figur 6). Etter 30 s med opptak, klikk på stimulere knappen og la electroporation finne sted på de valgte nettstedene for 30 s; deretter klikker du på den samme knappen for å stoppe stimulering og fortsette innspillingen for de resterende 60 s.
Merk: den innspilte filen kan spilles av ved å bytte til "Replayer Mode" i "Application" dropdown menyen.
6. Multiwell MEA plate rengjøring for gjenbruk
- Etter siste eksperimenter, Rengjør alle brønnene i multiwell plate ved aspirating alle medieinnhold fra hver brønn og forsiktig unngå å berøre elektroden overflaten.
- Tilsett 1 mL sterilt ddH2O per brønn. Aspirer og gjenta en gang.
- Tilsett 0,3 mL multiwell rengjøringsmiddel (se trinn 1,5) per brønn. Ruge overnatter ved romtemperatur for å løsne celler og rusk.
- Neste morgen aspirer oppløsningen og skyll med 1 mL sterilt ddH2O. ruge for 5-7 min og aspirer. Gjenta 5 ganger.
- Tilsett 0,5 mL sterilt ddH2O per brønn. Registrer Baseline på rengjort multiwell plate for kvalitetskontroll av rengjort tiltak (figur 7).
- Oppbevares ved 4 ° c til den er klar til bruk.
7. data filkonvertering og eksport
Merk: fire datafiler vil bli generert for hver innspilling: MWR, MWC, MWD, og MWS filer. Ved hjelp av omformer programvaren kan MWD-filen konverteres til H5-fil for påfølgende analyse ved hjelp av spesialbygde skript (se tilleggsfil 1).
- Start omformer programvaren (se tabell over materialer).
- Velg Angi inn data bane fra fil- menyen. Velg mappen som inneholder datafiler av interesse.
- Velg Angi utgangs bane på fil- menyen. Velg mappen der konverterte filer skal lagres.
- Uthev MWD fil av interesse.
- Klikk Eksporter til HDF5 -knappen.
8. data segmentering og analyse (figur 8-10)
Merk: MATLAB-basert tilpasset programvare brukes til å segmentere og trekke ut ulike FP og AP data parametere. Programvare er tilgjengelig på forespørsel.
- Kjør bølgeform analyse koden ved hjelp av MATLAB (se Figur 8 for en visning av det grafiske hoved vinduet).
- Klikk på fil og velg Process. H5.
- Finn og velg MWD. H5-filen som er opprettet i henhold til trinn 7 ovenfor.
- Falle i staver på bevare adresseliste knapp å endre lagringen plasseringen av det produksjon fil-størrelse.
- Opprett en signalbehandling kø ved å velge elektrode/vel kombinasjoner av interesse og deretter klikke på kø -knappen. Gjenta dette trinnet for å tilføye flere elektrode-/brønn kombinasjoner som skal behandles i køen.
- Rediger køen ved å klikke direkte på med navn/med konsentrasjon Hvis celler ble behandlet med narkotika (Figur 8).
- Når køen er endelig, klikker du på Initial bølgeformer knappen. Dette vil starte den foreløpige behandlingen der signalene identifiseres og trekkes ut for segmentering.
- Klikk på Zoom inn -knappen og velg det potensielle interesseområdet med markøren (figur 9).
- Klikk på Behold -knappen og se gjennom panelene. Peaks (rød ' x ') og trau (gule sirkler) oppdages for hver bølgeform og normalisert handling potensialer legges oppå. Klikk på Behold -knappen og gå videre til neste spor i køen (Figur 10).
- Gjenta trinn 8.8 – 8.9 for resten av signalene med elektrode/brønn kombinasjon i køen.
Merk: en CSV -fil vil bli generert med APD-parametere målt for hver bølgeform. En . mat -fil for hver . H5 -fil lagres også for å muliggjøre ytterligere behandling av segmentert data.
Representative Results
Levedyktigheten og plating tetthet av post-tint hiPSC-CMs er avgjørende for multiwell MEA kultur. Pre-plating av 1-2 millioner hiPSC-CMs/hetteglass i to brønner av en 6-brønn vev kultur plate med 50% eller større levedyktighet vil produsere en sunn monolag kultur med spontan juling på 48 h. dårlig levedyktighet av CMs vil resultere i kulturer med en høy andel av ikke-myocyte populasjoner. Disse monolagere når dissosiert for multiwell MEA plating generelt produsere inkonsekvente resultater og dårlig kvalitet signaler og derfor bør kastes. Figur 1 viser eksempler på optimale kontra sub-optimale HiPSC-CMs kulturer på 48 h post plating. Tine CMs på substrat-belagt vev kultur plater i stedet for direkte på multiwell, gjør det mulig for celle utvinning og modning3. Direkte plating av embryo CMs på Array er ikke anbefalt som det produserte inkonsekvente resultater.
I tillegg til kvaliteten på dissosiert CMs, celle vedlegg på multiwell MEA er svært avhengig av celle tetthet og fibronektin belegg teknikk. Den fibronektin dråpestørrelse er avgjørende som CMs vil samsvare med grensene for fibronektin-belagt område. Av denne grunn føres bare 5 μL av den fibronektin oppløsningen direkte over elektrode området. For å sikre at dråpe ikke sprer seg, må brønnen overflaten være helt tørr på tidspunktet for belegget. Figur 2 viser oppsettet til multiwell Mea-plate med skjematisk trinn-for-trinn-forbehandling for optimal forberedelse. I tillegg, for å hindre fibronektin fra tørking av multiwell MEA platene må plasseres inne i et fukte kammer i løpet av inkubasjonsperioden varer ikke mer enn 3 h (se trinn 3,8). Når inkubasjonsperioden er fullført, er det viktig å fjerne fibronektin dråpe fra hver brønn like før CM plating og bare deretter gå videre til neste brønn plating. Arbeide raskt og nøye utlevering av CMs er nøkkelen til vellykket celle vedlegg.
hiPSC-CM kulturer på 30 dager etter differensiering er dissosiert for multiwell MEA plating bruke enzymatisk celle dissosiasjon metoden (se trinn 4). CMs vil feste til fibronektin-belagt MEA flater med 3 h og en monolag dekker arrays vil være synlig etter 24 h post-plating (Figur 3). Synkron juling av monolag vil bli observert ved 24-48 h. spredning av celle dråpe vil påvirke kultur tettheten eller til og med føre til tørking og celle død. Presis celleplassering direkte på matrisen er av største betydning og derfor teknikken må praktiseres for optimal plating. Celle vedheft til referanse elektroden vil hindre elektrisk signal produksjon. Se Figur 3 for bilder av optimale cm plassering, og kultur etter 24 h.
Den CMs kultivert på multiwell tiltak er utsatt for kvalitetskontroll for elektrisk aktivitet på 48 h post-plating. Vanligvis øker FP signal amplitude fra μV rekkevidde til mV i ca 4 dager3. Hvis 50% av elektrodene i et nettverk og 70% av de totale nettverkene ikke produserer FP-signaler, er nettverket eller kulturen suboptimal og bør kastes. Bare kulturer som består kvalitets sjekken, behandles for FP-og AP-analyse. Figur 6 viser eksempler på gode og sub-standard FP-signaler.
Electroporation-mediert AP innspillinger kan fås flere ganger fra kulturer 48 h post-MEA plating. Ved å ansette electroporation fikk vi intracellulære tilgang til å ta opp høyoppløselige APs fra flere hiPSC-avledede cardiomyocyte-nettverk. Lavspennings pulser (1 V, 1 MS, 1 Hz) for 30 s ble levert for forbigående, reversibel transformasjon av FP til AP. Electroporation gir vellykket intracellulære tilgang for AP-måling i ca. 75% av elektrodene. Elektriske signaler registreres i 2 minutter, som inkluderer 30 s electroporation, 30 s under og 1 min post-electroporation. Et tog på 10 s AP bølgeformer 10 s post-electroporation er evaluert på tvers av alle områder for signalkvalitet og analyse. Alle spor som ikke samsvarer med rent AP-signal, forkastes. For å undersøke om AP amplituder relatere til FP signal vi electroporated alle 288 nettsteder for å samtidig spille inn bølgeformer. Representative FP-og AP-signaler som er tatt opp fra samme celleområde fra to forskjellige elektroder, vises i figur 11a. Vi observerte ingen sammenheng mellom FP-amplituder og post electroporation AP-amplituder som er registrert fra samme celleområde. I tillegg hadde flere electroporations av samme celleområde ved 0, 24, 48, 72 og 96 h ingen signifikant effekt på AP-formen over tid (figur 11b).
Gitt høy gjennomstrømming natur systemet, en manuell teknikk for å trekke ut og kvantifisere parametre av interesse som RR intervall, momentant frekvens og differensial handling potensiell varighet er ineffektiv og tidkrevende. En spesialbygd MATLAB script tilgjengelig for forskning samfunnet på forespørsel er ansatt for å utføre bølgeform målinger med 1 μs oppløsning. Electroporation tid punkter er overlappet med det utpakkede signalet for å identifisere 10 s av AP post-electroporation for å gjennomføre signal Extraction, kvalitetssikring, og segmentering arbeidsflyt (Figur 8, figur 9, figur 10). brukergrensesnittet gjør det mulig å velge ønsket segment ved hjelp av de kledde electroporation indikatorene som en veiledning. Den segmentert bølgeformen behandles av subrutiner for å ytterligere identifisere individuelle AP-bølgeformer. Dette er fullført gjennom topp deteksjon, hvor den høyeste og laveste spenning er identifisert for hver syklus. Når denne prosessen er fullført, amplituder er normalisert, og knytte tid vektorer er forskjøvet til å definere tid null på en topp verdi på 1. Interpolering av skjæringspunkter langs de enkelte syklusene ble brukt til å bestemme APD målinger. Dermed delvis automatisering arbeidsflyt for AP bølgeform segmentering tillater effektiv dataanalyse for ulike APD parametere på tvers av flere grupper av kulturer i en kort periode. Videre automatisering av kriteriene for inkludering og ekskludering for FPs og APs pågår for sanntidsdata analyse.
En betydelig fordel med multiwell MEA plate er at den kan gjenbrukes flere ganger. Denne restaureringen muliggjør repeterende elektrofysiologisk studier for kostnadseffektiv og konsistent datainnsamling. Innspillinger av APs fra samme array etter 6 restaurering er vist i Figur 12. Signal-til-støy-forhold er likt på tvers av flere reuses. For å demonstrere påliteligheten til matrisen for repeterende elektrofysiologisk studier, totalt 3815 AP bølgeformer er gruppert fra tre restaurering batcher og AP varighets data er hentet for å undersøke repeterbarhet av resultatene. Fordelings tomter for individuell bølgeform APD30,APD 80, triangulering (APD80-APD30) og brøk forkortelse ((APD80-APD30)/(APD80)) vises (figur 13).
Figur 1: pre-plating av embryo hiPSC-cm for modning. (A) celle prosessering for pre-plating 1 hetteglass med 10 dager etter differensiering embryo HiPSC-CMs. (B) fase kontrast bilder av vellykket (venstre) og mislykket (høyre) hiPSC kulturer. Scale bar: 275 μm. Se Video 1 og video 2 for vellykket 14 og 24 dager etter differensiering kultur eksempler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: MULTIWELL Mea plate oppsett og forberedelser. (A) Multiwell Mea plate skjematisk: platen består av 24 brønner (a1 til D6) hver inneholder 12 microelectrode arrays og 4 perifere referanseelektroder. Elektrode diameter: 30 μm/Inter-elektrode avstand: 300 μm. opptak kan fås fra 288 elektroder samtidig. (B) sterilisering og hydrofile behandlingstrinn som skal utføres før HIPSC-cm plating. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: hiPSC-cm dissosiasjon og plating på MULTIWELL Mea plate. (A) skjematisk av HIPSC-cm Mea plating skritt for hver brønn. (B) mikroskopisk bilde som illustrerer riktig plassering av celle dråpe som dekker alle 12 elektroder uten å spre seg til de 4 referanse elektrodene. (C) fase kontrast mikroskopiske bilder av en eksemplarisk (venstre) og suboptimal (høyre) HIPSC-cm PLATTING på Mea ved 24 h post-plating. Scale bar = 275 μm. Se video 3 for eksempel på et vellykket Mea-plating. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Multiwell programvare for skjerm anskaffelse. Pilene angir plasseringen av viktige funksjoner og funksjoner som det refereres til i teksten: temperaturkontroll (1) panel gjør det mulig for sanntids temperatur overvåking gjennom hele eksperimentet. Sett inn/løs ut (2)-knappen for å engasjere og løsne Multiwell MEA plate. Definer eksperimentell Flow (3) funksjonen lar brukeren angi varigheten av opptaket. Med funksjonen for data innsamlings oppsett (4) kan brukeren angi samplingsfrekvensen og innstillingene for anskaffelses filteret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: hiPSC-cm electroporation og signal oppkjøp . Stimulus Definition tab lar brukeren definere electroporating puls parametere. Kategorien stimulering av elektroder gjør det mulig for brukeren å velge electroporating elektroder. Enhver kombinasjon av 288-elektrodene kan velges. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: kvalitetskontroll av Multiwell tiltak for elektrisk aktivitet. Multiwell-skjermen oppkjøpet programvare som viser rå data Vinduer med representative eksempler på optimal (A) og sub-standard (B) FP signaler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: FP-og Ap-signaler fra den nye og gjenopprettede matrisen. Multiwell MEA enzymatisk rengjøring trinn (A). Det opprinnelige signalet for den nye matrisen viser minimalt signal til støyforhold (B) og FP-signaler viser den elektriske aktiviteten i nettverket (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: data segmentering og analyse. Visning av GUI viktigste vindu for bølgeform analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: data segmentering og analyse. Initialisere bølgeformer knappen for å identifisere og trekke ut Ap bølgeformer for segmentering og for å starte den foreløpige behandlingen ved å zoome inn og velge handlingen potensielle området av interesse. Røde sirkler er electroporation indikatorer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: data segmentering og analyse. Topper (rød ' x ') og trau (gule sirkler) oppdages for hver bølgeform og normalisert APs legges oppå for en kvalitetskontroll av bølgeformene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: Ap amplitude avhengighet av FP signal for flere innspillinger fra samme celleområdet. FP-amplitude i μV-områder (a, øvre venstre panel) eller mv-områder (a, øverst til høyre) innspilt fra to uavhengige elektroder produserer Ap-amplitude i mv-rekkevidde (a, nedre venstre og høyre panel) som ikke viser noen korrelasjon mellom FP-amplituder og post-electroporation AP amplituder. Normalisert AP bølgeformer for hver innspilling er lagt som vist for hver innspilling. Flere electroporations av samme celleområdet på 0 til 96 h produsert høy kvalitet AP bølgeformer tillater sporing av membran elektrodynamikk (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12: Ap innspillinger etter seks restaurering. AP bølgeformer registrert samtidig 10 s post-electroporation over 12 elektroder fra samme brønn vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13: APD-parameteren histogrammer fra flere restaurering. Fordelings tomter for individuell bølgeformAPD 30 (A), APD80 (B), triangulering (APD80-APD30) (C) og brøk forkortelse ((APD80-APD30)/(APD80)) (D) vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfiler. Videoer 1-3. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Gjennom årene har tiltak vært begrenset til å utføre FP målinger av nervøs celler for å studere deres elektrofysiologisk egenskaper36,37,38,39. Bare noen få grupper har rapportert Ap spor fra electrogenic celler ved hjelp av tilpassede Mea teknologi18,29,30. Imidlertid har disse tilnærmingene ikke blitt undersøkt for gjentatte innspillinger fra de samme forberedelsene. Vi utviklet en innovativ og nøyaktig metode for å studere APs fra samme celleområde over dager i flere hiPSC-CM-nettverk samtidig3. I vår publiserte studie, en multiwell mikro-gull MEA-plattformen ble brukt til å generere AP bølgeform biblioteker fra flere grupper av hiPSC-CM kulturer med høy presisjon og med en temporal oppløsning på 1 μs. Protokollen beskrevet her forklarer seeding av hiPSC-CMs på array for effektiv utvikling av syncytial CM nettverk for høy gjennomstrømming AP innspillinger. Flere kritiske trinn i protokollen er: 1) produksjon av flere høy renhet partier av kvalitets-kontrollerte CMs for kryonisk bevaring bank, 2) svært levedyktig post-tine CMs for pre-plating og modning, 3) behandling av multiwell MEA plate for CM seeding, 4) hiPSC-CM kultur dissosiasjon på 30 dager etter differensiering for MEA plating, og 5) restaurering av tiltak for flere gjenbruk.
Det er viktig å merke seg at batch-til-batch variasjon i hiPSC differensiering kan påvirke eksperimentelle utfall. Den monolag metoden for differensiering ble optimalisert i huset for høy prosent cardiomyocyte produksjon3,40. FACS-analysen av MLC2v og TNNT2 markører i våre kulturer viser en ≥ 90% ventrikkel-lignende fenotype3. Disse kvalitets kontrollerte kulturene er embryo for eksperimentelle studier. Den nåværende differensiering tilnærminger gir en heterogen blanding av Nodal-, atrieflimmer-og ventrikkel-lignende celler3,16,17,41. Derfor strategier ansatt for CM under type befolkning berikelse kan ytterligere forbedre spesifisitet av kulturer. I tillegg kan vevs tekniske tilnærminger anvendes for å forbedre deres modning. Metodene som foreslås her kan enkelt implementeres for andre CM kilder.
Ap bølgeformer innspilt med Mea var lik de som er registrert fra nettverk av cardiomyocytes ved optisk kartlegging42,43, komplementære metalloksid Semiconductor-basert Mea18,21, og simulert Ap med FP-innspillinger20. For å møte mekanismen av AP målinger via MEA hai og Spira25 demonstrert at electropore-elektrode grensesnitt etterligne den etablerte skarp glass microelectrode teknikk. Imidlertid kan ikke hvile membran potensialet og de sanne amplitude verdiene i vår studie etableres, gitt at electropore-grensesnittet i MEA-systemer ikke kalibreres, og at amplituden er en funksjon av følsomheten og oppløsningen til Teknikk. Vår tilnærming aksjer lignende begrensninger til optisk kartlegging når det gjelder AP amplitude.
Den multiwell MEA-baserte FP/AP-readouts som rapporteres her, åpner nye muligheter for vurdering av narkotika sikkerhet. Selv om spontane, disse hiPSC-CM monolagere beat på konstant hastighet. Analyse av APD-parametere på tvers av flere nettverk gir innsikt i elektriske heterogenitet (figur 13). Imidlertid må omfattende APD restitusjon analyser innlemme foregående diastolisk intervaller. Videre høy kvalitet AP bølgeformer registrert fra samme celleområdet over 96 h (figur 11b) er den første rapporten til å spore membran elektrodynamikk over tid som vil være av verdi i utvikling og sykdom.
Protokollen som beskrives her for kvantifisere AP-parametre kan brukes til å generere dose reaksjons kurver for å teste forbindelser. Som nylig rapportert av Edwards et al.3, dose respons av noradrenalin, Isoproterenol og E 4031 er PLOTTET for APD på ulike repolarisasjon faser. Den publiserte studien viste nøyaktigheten og påliteligheten til tilnærmingen for identifisering av dose avhengige subtile endringer i AP bølgeformer i sanntid. Denne teknikken kan lett utvides for andre forbindelser eller små molekyl biblioteker for å forstå ulike elektrofysiologisk svar.
Den MEA-baserte tilnærmingen for AP-målinger presentert i denne studien vil være av interesse ikke bare å electrophysiologists, men også til celle biologer og in-silisiummangan modelers. Videre, FP/AP registreringene fra det likt cellen sted opp på hiPSC-CMs ville sette i stand forskning å utvikle bioelectric data biblioteker av bred oppstille av nervøs cellular nettverk innen en kort perioden. Tilgjengeligheten av disse ressursene vil være verdifullt for narkotika funn og sykdoms modellering.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
| Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
| Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
| D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
| Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
| Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
| Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
| Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
| 6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |
References
- Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
- Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
- Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726 (2016).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
- Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
- Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
- Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
- Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
- Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
- Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
- Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100 (2015).
- Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110 (2016).
- Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206 (2014).
- Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
- Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
- Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
- Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
- Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
- Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
- Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
- Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
- Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
- Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
