Summary
Denne artikel indeholder et sæt af protokoller for udvikling af menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte cardiomyocyte (hiPSC-CM) netværk dyrket på multiwell MEA plader til reversibelt elektroporat cellemembranen for handling potentielle målinger. Optagelser med høj gennemløb hentes fra de samme celle steder gentagne gange i løbet af dage.
Abstract
Kardiel sikkerhed screening er af afgørende betydning for Drug Discovery og Therapeutics. Derfor er udviklingen af nye high-gennemløb elektrofysiologiske tilgange til hiPSC-afledte cardiomyocyte (hiPSC-CM) præparater er meget nødvendigt for effektiv Drug test. Selvom multielektrode matricer (MEAs) ofte anvendes til felt potentielle målinger af overgearet celler, beskrev og validerede en nylig publikation af Joshi-Mukherjee og kollegaer sin ansøgning om gentagne aktionspotentialer (AP) fra samme hiPSC-CM forberedelse over dage. Formålet er her at give detaljerede trin-for-trin metoder til såning CMs og til måling af AP bølgeformer via elektro portering med høj præcision og en tidsmæssig opløsning på 1 μs. Denne fremgangsmåde afhjælper manglen på brugervenlig metode til at opnå intracellulær adgang til målinger med høj gennemløb for pålidelige elektrofysiologiske undersøgelser. En detaljeret arbejdsstrøm og metoder til plating af hiPSC-CMs på multiwell MEA plader diskuteres kritiske trin, hvor det er relevant. Derudover rapporteres et specialbygget MATLAB-script til hurtig datahåndtering, udtræk og analyse for omfattende undersøgelse af bølgeform analysen for at kvantificere subtile forskelle i morfologi for forskellige AP-varigheds parametre, der er impliceret i arytmi og kardiotoksicitet.
Introduction
Human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (hipsc-CMS) er guldstandarden for et stigende antal laboratorier1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. At slå embryooide kroppe11,12,13 og enkeltlags3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 differentiering er de foretrukne metoder til produktion af kardiomyocytter, og multi elektrode systemet (MEA) er blevet en fælles modalitet til overvågning af elektro dynamikken i disse netværk18,19,20. Mens parametre, der kan udvindes fra felt potentialer (fps) såsom slaghastighed, amplitude, varighed og RR intervaller er baseline elektrofysiologisk respons af spontant slå monolag18,21, 22,23, er aktions potentiellet (AP), der underliggende disse ekstracellulære FP-signaler, svære at ekstrapolere24. Vores nylige publikation om opdagelsen af en anvendelse af mål for direkte tilbagevendende AP-målinger giver dokumentation for metodologien for eksemplariske intracellulære AP-udlæsninger med en omfattende bølgeform analyse ved forskellige repolariserings faser på tværs af flere partier af hiPSC-afledte kardiomyocyt-netværk3. I undersøgelsen viste vi, at leveringen af elektro porerende impulser til netværk af hiPSC-afledte kardiomyocytter muliggør intracellulær adgang til AP-optagelser. Disse forbigående AP-optagelser er afhængige af transmembran potentielle inddrivelser observeret gennem skades stedet3,25,26. Bølgeformer indspillet via MEA og patch-clamp i vores undersøgelse viste lignende AP morfologier således validere pålideligheden af tilgangen3.
Et par laboratorier har rapporteret måling ApS fra forskellige elektro gene celler ved hjælp af specialbyggede MEAs18,21,26,27,28,29, 30, men pålideligheden af at anvende mål for konsistente og gentagne AP-målinger blev ikke vurderet. I øjeblikket er den gyldne standard patch-clamp teknik begrænset til Terminal optagelser7,31 mens MEA-baserede AP målinger er forbigående og derfor kan udføres flere gange på samme celle. Vi viser også, at man nemt kan registrere høj kvalitet AP-signaler i millivolt-området, der kræver minimal filtrering. Forskerne kan derfor gennemføre ikke blot akutte, men også kroniske lægemiddel undersøgelser i de samme præparater ved hjælp af mål. Derudover tillader denne teknologi samtidige FP/AP-målinger, der genererer elektro-Biome-biblioteker i løbet af kort tid. I betragtning af den stigende vægt på arytmier forudsigelse og lægemiddel associeret kardiotoksicitet24,32,33,34,35, integration af AP måling tilgange vil forbedre narkotika sikkerhed og effektivitet vurderinger.
Her præsenterer vi protokoller for 1) forklækning af kryopræserverede hipsc-CMS til modning, 2) dissociering og plating af hipsc-CMS på multiwell MEAs, 3) optagelse af fps og ApS fra hipsc-cm netværk, 4) segmentering og udvinding af data til analyse, og 5) gendannelse af arrays for flere genbrug. Hvert trin er optimeret og understreger kritiske trin, hvor det er relevant. Krav til celle fastgørelse for at sikre en slå syncytial enkeltlags diskuteres og procedurer for multiwell MEA restaurering for gentagne elektrofysiologiske undersøgelser forklares. Endelig er en brugerdefineret GUI udviklet i laboratoriet præsenteret for AP signal udvinding, kvalitetssikring, og segmentering workflow at kvantificere og analysere AP parametre.
Protocol
1. fremstilling af opløsninger og materialer (se tabel over materialer)
-
6-brønd vævet-kultur plade substrat-belægning
- Tø belægnings substrat på is eller ved 4 °C.
- Forbered en 1:100 belægning substrat fortynding i koldt DMEM/F12 medium. Bland opløsningen ved langsom pipettering.
- 2 mL af belægnings substratopløsningen (trin 1.1.2) overføres pr. brønd af en 6-brønd vævskultur plade.
- Anbring straks den coatede vævskultur plade i celle kulturinkubatoren ved 37 °C og 5% CO2 i mindst 7 timer, og brug den inden for 7 dage.
-
hiPSC-CM kulturmedium
- Tilsæt 10 mL CM medie supplement optøet ved 4 °C til 500 mL CM base medium. Opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Aliquot nødvendig mængde af medier for dagen og bringe stuetemperatur før brug.
- hiPSC-CM optønings medium: Forbered dig frisk ved at blande hiPSC-CM-kulturmedium (trin 1,2) med 10% føtal bovint serum (FBS). Bring mediet til stuetemperatur før optøning af CMs til suspension.
- Fibronectin 1 mg/mL stamopløsning: aliquot 200 μL til 1,5 mL sterile mikrofuge rør og opbevares ved 4 °C til senere brug. Forbered arbejdsopløsning på 50 μg/mL koncentration frisk på is.
- Multiwell Cleaning Solution: Kombiner 0,5 g enzymatisk rengøringsmiddel med 50 mL sterilt, dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Vortex for at blande indholdet. Der filtreres og opbevares ved 4 °C i op til en uge.
2. forklækning af kryopræserverede hipsc-cm til modning (figur 1)
Bemærk: dette afsnit er beregnet til optøning og dyrkning af hipsc-CMS, der blev differentieret ved hjælp af feeder-fri enkeltlags metode3,16 og kryopræserverede i flydende nitrogen 10 dage efter differentiering på 1-2 million celler/hætteglas. Celler fra et hætteglas er belagt i to substrat belagte brønde af en 6-brønd vævskultur plade. Kardiomyocytter har tendens til at bosætte sig i bunden af røret, så blid blanding på tidspunktet for forklædning er vigtigt for at opnå lige celletæthed på tværs af brønde.
- Aliquot 2 mL FBS pr. hætteglas med hiPSC-CMs optøet i et 15 mL konisk rør og giver stuetemperatur.
- Tø hætteglas med kryopræserverede hipsc-CMS ved at placere dem i et 37 °c vandbad og hvirvle forsigtigt for selv optøning i højst 3 minutter.
- Overfør straks hætteglasindholdet til røret indeholdende FBS (Se trin 2,1), bland ved at hvirvlende og centrifugeres ved 200 x g i 5 min.
- Du aspirerer supernatanten og opslæmmes celle pellet i 1 mL hiPSC-CM optønings medium (Se trin 1,3) pr. hætteglas optøet. Brug en overførings pipette til at resuspendere pellet ved blid trituration. Vurdere cellernes levedygtighed.
- Tilsæt yderligere 3 mL optønings medium pr. hætteglas med hiPSC-CM optøet i trin 2,4 og Suspender forsigtigt med en overførings pipette for yderligere at adskille celle klumper.
- 2 mL cellesuspension dispenseres forsigtigt i hver brønd af substrat belagte 6-brønd plader (Se trin 1,1). Sted i cellekultur inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- Udskift med frisk hipsc-cm dyrkning medium efter 24 h og 3 gange ugentligt derefter i 20 dage.
Bemærk: cellerne skal holde sig til substrat belægningen med 24 timer og slå spontant ved 48 h efter belægning (Se video 1 og video 2).
3. multiwell MEA-plade sterilisering og belægning (figur 2 og figur 3)
Bemærk: den protokol, der er beskrevet her, er til klargøring af 24-brønd MEA-plader med 12 Micro Gold PEDOT-belagte elektroderne på glas til hiPSC-CM plating. Undgå at berøre bunden af pladen, da dette kan beskadige elektroderne.
- To dage før celle plating tilsættes 0,5 mL hiPSC-CM-kulturmedium (Se trin 1,2) til hver brønd og udfører en baseline-optagelse for at verificere signal-støj-forhold for kvalitetskontrol af måle resultaterne.
- Aspirer medierne, skyl med steril ddH2O og Steriliser under UV-lys inde i en laminar flow hætte natten over.
- Dagen før celle plating tilsættes 0,1 mL FBS til hver brønd for hydrofile behandling af MEA overflader. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Dette trin er nødvendigt for celle vedhæftning.
- Sug FBS og skyl med 0,5 mL steril ddH2O per brønd. Gentag endnu en gang.
- Lad pladen tørre i laminar flow hætten natten over.
- Der forberedes en arbejds fortynding på 50 μg/ml fibronektin i koldt DMEM/F12-medium fra bestanden (Se trin 1,4). Opbevar opløsningen på is.
- Afpipettér 5 μl af den arbejdende fibronektin fortynding (Se 3,6), og aflad forsigtigt dråbe til midten af hver brønd for at dække alle 12 elektroderne. Det er vigtigt at arbejde hurtigt på tværs af 24 brønde for at forhindre, at dråben fra tørring.
- Placer straks fibronectin-coated multiwell MEA-pladen på en hævet overflade i et befugtning kammer, der indeholder steril ddH2O til dækning af hele parabol overfladen. Placer kammeret med multiwell MEA-pladen i 3 timer i celle kulturinkubator.
Bemærk: det er vigtigt at anbringe 24-brønd pladen i et befugtning kammer for at forhindre, at fibronektin-dråber tørrer ud i inkubationsperioden.
4. hiPSC-CM dissociation og plating på Multiwell MEA plade (figur 3)
Bemærk: Start dette trin om 1 h før MEA fibronektin inkubation er færdig. Sørg for, at opløsningen til celle dissociation er på 37 °C, og at iPSC-CM optønings mediet er ved stuetemperatur. Dissociations metoder er blevet optimeret til 30 dage efter differentieret hiPSC-CMs dyrket på substrat belagte 6-brønd plader (Se trin 2) for at opnå ca. 90% levedygtigt CMs til behandling. Man bør være forsigtig med ikke at indføre luftbobler under formalings for at forhindre celledød.
- Aspirer kulturmediet fra hver brønd af 6-brønden vævskultur skål med 30 dages post-differentieret hiPSC-CM kultur (Se trin 2,7) og vask med 2 mL sterile D-PBS per brønd.
- Tilsæt 1 mL forvarmet celle dissociations opløsning (Se tabel over materialer) pr. brønd og Inkuber i 4 min ved 37 °c. Brug en overførings pipette til forsigtigt at triturere for at løsne cellerne for dissociation. Hvis de fleste af cellerne stadig er klæber, Inkuber i yderligere 3 min ved 37 °c og udriv igen. Denne yderligere inkubation bør hjælpe til maksimal celle genvinding. Må ikke inkubere i mere end 7 minutter, da dette kan resultere i lav cellelevedygtighed.
- Brug en overførings pipette til at samle alle de dissocierede celler i et konisk rør, der indeholder hiPSC-CM optønings medium (Se trin 1,3). Det anbefales at suspendere cellerne i mindst det dobbelte af mængden af medier (2 mL pr. brønd, der høstes) for at blokere aktiviteten af celle dissociations opløsningen.
- Centrifugeres ved 200 x g i 5 min.
- Opløsningen Aspirér forsigtigt, da pellet er løst fastgjort til overfladen og opslæmmes i 0,1 mL hiPSC-CM optønings medium. Brug en overførings pipette til at resuspendere pellet et par gange ved blid trituration.
- Aliquot 2 μL af dissocierede celler og fortyndes med 18 μL af mediet i et 1,5 mL mikrofuge-rør. Tilsæt 20 μL Trypan blå og bland for celletælling og rentabilitetsvurdering.
- Juster celletætheden til 6.000 celler/μL ved at tilføje den passende mængde hiPSC-CM optønings medium. Suspendere pellet ved blid svirpe et par gange. HiPSC-CMs løsnes nemt fra glas overfladerne, især når det er belagt med høje tætheer. Vi har optimeret såning tæthed og plating betingelser for at opnå 15 dage af elektriske optagelser.
- Når du er klar, bringes multiwell MEA-pladen ind i laminar flow hætten til celle såning. Det er afgørende at udføre de følgende to trin én brønd ad gangen for at forhindre fibronektin i at tørre.
- Fjern forsigtigt fibronektin-dråbe ved hjælp af en P10-pipette uden at røre elektroderne.
- Straks dispenserer en 5 μL celle dråbe (30.000 celler) til midten af brønden af MEA pladen, der dækker alle 12 elektroder. Gentag trinnet, indtil alle 24 brønde er belagt. Intermitterende blanding af cellesuspension ved svirpe anbefales.
- Sæt multiwell MEA-pladen tilbage i det løst overdækkede befugtning kammer og vend tilbage til celle kulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2 for 3 timer for celle fastgørelse.
- Tilsæt forsigtigt 200 μL hiPSC-CM optønings medium til hver brønd uden at forstyrre cellerne ved hjælp af en P200 pipette. Tilføj mediet dråbevis til siden af brønden.
- Sæt multiwell MEA-pladen tilbage i celle kulturinkubatoren.
- Udskift med frisk hiPSC-CM kulturmedium ved 24 h post plating. Spontane slag af kardiomyocytter kan observeres på dette tidspunkt (Se video 3).
- Skift medierne hver 2 dage indtil afslutningen af eksperimenter.
5. hiPSC-CM elektroporation og signal erhvervelse (figur 4 – 6)
Bemærk: denne protokol er til samtidig registrering af elektrode signaler med høj dataoverførselshastighed (12 steder for hver af de 24 brønde). 24-Well multiwell MEA-systemet bruges sammen med anskaffelsesoftwaren (Se tabel over materialer). Alle MEA-optagelser udføres ved 37 °C.
- Tænd for interface kortet og starte erhvervelse software. Der skal være tilstrækkelig tid til, at multiwell MEA-hovedstadiet kan nå 37 °C-temperaturen (Se pil 1 i figur 4).
- Indsæt multiwell MEA-pladen fra trin 4 i multiwell MEA-headstage ved at anbringe den over på optagelses platformen, og klik på knappen Indsæt (Se pil nr. 2 i figur 4). Lad temperaturen stabilisere, før optagelserne startes.
-
Juster indstillinger for anskaffelse og elektro portering
- Klik på ikonet Definer eksperimentel flow (Se pilen nr. 3 i figur 4), og Indstil optagelsestid til 2 min eller som ønsket.
- Klik på opsætnings ikonet for data opsamling (Se Arrow nr. 4 i figur 4) og Indstil samplingfrekvensen til 20 kHz, High-Pass Filter til 0,1 Hz og low-pass filter til 3500 Hz.
- Klik på ikonet stimulator Settings (Se figur 5). Under fanen stimulus definition skal du definere stimulering som bifasisk symmetrisk spændings pulser på 1 mv, 1 MS og 1 Hz. Under fanen stimulerings elektrode skal du vælge elektroporations steder ved at fremhæve alle relevante elektroer.
- Klik på knappen Udforsk for at visualisere signaler i alle brønde. Kontroller signalkvaliteten og Steady State-forhold. Tag noter om elektroderne med FP-signaler i mV-området. Klik på den samme knap for at stoppe efterforskningen. Der er ikke registreret nogen data indtil dette punkt.
- Start optagelsen ved at klikke på Go! -knappen. Elektroderne i hver brønd vil vise FP-signaler i RAW-data vinduet (figur 6). Efter 30 s optagelse, skal du klikke på knappen stimulere og tillade elektro poration til at finde sted på de udvalgte steder for 30 s; Klik derefter på den samme knap for at stoppe stimulation og fortsætte optagelsen for de resterende 60 s.
Bemærk: den optagede fil kan afspilles ved at skifte til ' Replayer mode ' i rullemenuen ' Application '.
6. multiwell MEA-plade rensning til genbrug
- Efter afsluttende eksperimenter rengøres alle brønde i multiwell-pladen ved at aspirere alt medieindhold fra hver brønd og forsigtigt undgå at røre elektrodeoverfladen.
- Tilsæt 1 mL steril ddH2O pr. brønd. Aspirer og Gentag én gang.
- Tilsæt 0,3 mL multiwell Cleaning Solution (Se trin 1,5) pr. brønd. Inkuber natten over ved stuetemperatur for at opløse celler og snavs.
- Den følgende morgen, Aspirér opløsningen og skyl med 1 mL steril ddH2O. inkuber i 5-7 min. og Aspirér. Gentag 5 gange.
- Tilsæt 0,5 mL steril ddH2O pr. brønd. Den rensede multiwell-pladens grundlinje registreres for kvalitetskontrol af de rensede mål (figur 7).
- Opbevares ved 4 °C, indtil det er klar til brug.
7. konvertering og eksport af data filer
Bemærk: der genereres fire datafiler for hver optagelse: MWR-, MWC-, MWD-og MWS-filer. Ved hjælp af konverterings softwaren kan MWD-filen konverteres til H5-fil til efterfølgende analyse ved hjælp af specialbygget script (Se supplerende fil 1).
- Initierer konverterings softwaren (Se tabel over materialer).
- Vælg Angiv input kurve i menuen filer . Vælg mappe, der indeholder datafiler af interesse.
- Vælg Angiv outputsti i menuen filer . Vælg mappe, hvor konverterede filer skal gemmes.
- Fremhæv MWD-fil af interesse.
- Klik på knappen Eksporter til HDF5 .
8. segmentering og analyse af data (figur 8-10)
Bemærk: MATLAB-baseret brugerdefineret software bruges til at segmentere og udtrække forskellige FP-og AP-data parametre. Software er tilgængelig på anmodning.
- Kør Waveform Analysis Code ved hjælp af MATLAB (Se figur 8 for en visning af GUI hovedvinduet).
- Klik på filer , og vælg proces. H5.
- Find og vælg filen MWD. H5, som er oprettet i henhold til trin 7 ovenfor.
- Klik på Gem mappe knappen for at ændre lagringsplaceringen af output-filer.
- Opret en signal behandlings kø ved at vælge elektrode/godt kombinationer af interesse og derefter klikke på knappen kø . Gentag dette trin for at tilføje flere elektrode/brønd kombinationer, der skal behandles i køen.
- Rediger køen ved at klikke direkte på med-navn/med-koncentration , hvis cellerne blev behandlet med lægemidler (figur 8).
- Når køen er færdig, klik på knappen Initialiser bølgeformer . Dette vil starte den indledende behandling, hvor signalerne er identificeret og ekstraheret til segmentering.
- Klik på knappen Zoom ind , og vælg den aktions potentielle interesseområde med markøren (figur 9).
- Klik på knappen Behold , og gennemse panelerne. Toppe (rødt ' x ') og trug (gule cirkler) detekteres for hver bølgeform, og de normaliserede aktionspotentialer er overlejret. Klik på knappen Behold , og gå videre til næste spor i køen (figur 10).
- Gentag trin 8.8-8,9 for resten af elektrode-/brøndens kombinations signaler i køen.
Bemærk: en . csv -fil vil blive genereret med APD-parametre målt for hver bølgeform. En . mat -fil for hver . H5 -fil gemmes også for at tillade yderligere behandling af segmenterede data.
Representative Results
Levedygtigheden og plating tætheden af post-optøede hiPSC-CMs er afgørende for multiwell MEA kultur. Forklædning af 1-2 millioner hipsc-CMS/hætteglas i to brønde af en 6-brønd vævskultur plade med 50% eller større levedygtighed vil producere en sund enkeltlags kultur med spontan slå på 48 h. dårlig levedygtighed af CMS vil resultere i kulturer med en høj procentdel af ikke-myocyt populationer. Disse monolag, når de adskilles for multiwell MEA plating generelt producere usammenhængende resultater og dårlig kvalitet signaler og derfor bør kasseres. Figur 1 viser eksempler på optimale vs. sub-optimale hipsc-CMS kulturer på 48 h post plating. Optøning CMs på substrat-coated vævskultur plader snarere end direkte på multiwell MEAs, giver mulighed for celle genvinding og modning3. Direkte plating af kryopræserverede CMS på array anbefales ikke, da det producerede usammenhængende resultater.
Ud over kvaliteten af den dissocierede CMS, er celle fastgørelse på multiwell MEA meget afhængig af celletæthed og fibronektin coating teknik. Fibronektin Dråbestørrelse er kritisk, da CMS vil overholde grænserne for fibronektin-belagt område. Af denne grund dispenserede kun 5 μl af fibronektin-opløsningen direkte over elektrode array området. For at sikre, at dråbe ikke spredes, skal brønd overfladen være helt tør på tidspunktet for belægningen. Figur 2 viser MULTIWELL MEA-pladens layout med skematiske trin-for-trin forbehandling for optimal tilberedning. For at forhindre, at fibronektin tørrer, skal multiwell MEA-pladerne anbringes i et befugtning kammer i inkubationsperioden, der ikke varer mere end 3 timer (Se trin 3,8). Når Inkubationstiden er færdig, er det vigtigt at fjerne fibronektin dråbe fra hver brønd lige før cm plating og først derefter gå videre til næste godt plating. Arbejde hurtigt og omhyggeligt dispensering af CMs er nøglen til en vellykket celle vedhæftet fil.
hiPSC-CM kulturer på 30 dage efter differentiering er dissocieret for multiwell MEA plating ved hjælp af enzymatiske celle dissociation metode (Se trin 4). CMS fastgøres til de fibronectin-belagte MEA-overflader med 3 timer, og en enkeltlags, der dækker matricer, vil være synlig efter 24 timers post plating (figur 3). Synkrone slå af enkeltlags vil blive observeret ved 24-48 h. celle dråbe dispersion vil påvirke kulturen tæthed eller endda føre til tørring og celledød. Præcis celleplacering direkte på arrayet er af allerstørste vigtighed, og derfor skal teknikken praktiseres for optimal plating. Celle vedhæftning til reference elektroden vil hæmme produktionen af elektrisk signal. Se figur 3 for billeder af optimal cm placering, og kultur efter 24 h.
CMs dyrket på multiwell MEAs er underkastet kvalitetskontrol for elektrisk aktivitet ved 48 h efter belægning. Typisk øges FP-signal amplitude fra μV-intervallet til mV i ca. 4 dage3. Hvis 50% af elektroderne i et netværk og 70% af de samlede net ikke producerer FP-signaler, er netværket eller kulturen ikke optimalt og bør kasseres. Kun kulturer, der passerer kvalitets tjekket, behandles for FP-og AP-analyse. Figur 6 viser eksempler på gode og sub-standard FP-signaler.
Elektroporation-mediated AP optagelser kan fås flere gange fra kulturer 48 h post-MEA plating. Ved at anvende elektro poration fik vi intracellulær adgang til at optage høj opløsning APs fra flere hiPSC-afledte cardiomyocyte netværk. Lavspændings pulser (1 V, 1 MS, 1 Hz) for 30 s blev leveret til forbigående, reversibel omdannelse af FP til AP. Elektro porationen giver mulighed for en vellykket intracellulær adgang til AP-måling i ca. 75% af elektroderne. Elektriske signaler optages i 2 min., som omfatter 30 s præ-elektroporation, 30 s under og 1 min post-elektro portering. Et tog på 10 s AP bølgeformer 10 s post-electroporation evalueres på tværs af alle steder for signalkvalitet og analyse. Ethvert spor, der ikke svarer til det rene AP-signal, kasseres. For at undersøge om AP amplituer korrelerer til FP signal vi elektroporated alle 288 sites til samtidig registrere bølgeformer. Repræsentative FP-og AP-signaler fra samme celle sted fra to forskellige elektroder er vist i figur 11a. Vi observerede ingen sammenhæng mellem FP amplituder og post elektroporation AP amplituder optaget fra samme celle site. Desuden havde flere elektro porationer af samme celle sted ved 0, 24, 48, 72 og 96 h ingen signifikant effekt på AP-figuren over tid (figur 11b).
I betragtning af systemets høje gennemløb er en manuel teknik til at udtrække og kvantificere parametre af interesse såsom RR-interval, øjeblikkelig frekvens og differentialaktions potentiel varighed ineffektiv og tidskrævende. En specialbygget MATLAB script til rådighed for forskersamfundet på anmodning er ansat til at udføre bølgeform målinger med 1 μs opløsning. Elektroporationstid punkter er overlagt med det ekstraherede signal til at identificere 10 s af AP post-elektro portering til at udføre signal udvinding, kvalitetssikring, og segmentering workflow (figur 8, figur 9, figur 10). brugergrænsefladen giver mulighed for udvælgelse af det ønskede segment ved hjælp af overlejret elektro poration indikatorer som en vejledning. Den segmenterede bølgeform behandles af subrutine for yderligere at identificere individuelle AP-bølgeformer. Dette er gennemført ved hjælp af peak Detection, hvor den højeste og laveste spænding er identificeret for hver cyklus. Når denne proces er afsluttet, er amplituderne normaliseret, og de tilknytter time vektorer skiftes til at definere tids nul til en spidsværdi på 1. Interpolation af skæringspunkter langs de individuelle cyklusser blev anvendt til at bestemme APD-målinger. Således, delvis automatisering workflow for AP bølgeform segmentering giver effektiv dataanalyse for forskellige APD parametre på tværs af flere partier af kulturer i en kort periode. Der arbejdes videre med automatisering af inklusions-og udelukkelseskriterier for FPs og APs for realtidsdata analyse.
En betydelig fordel ved multiwell MEA pladen er, at den kan genbruges flere gange. Denne restaurering muliggør gentagne elektrofysiologiske undersøgelser for omkostningseffektiv og konsistent dataindsamling. Optagelser af APs fra samme array efter 6 restaureringer er vist i figur 12. Signal-støj-forhold er ens på tværs af flere genanvendelser. For at demonstrere pålideligheden af array for gentagne elektrofysiologiske undersøgelser, i alt 3815 AP bølgeformer er samlet fra tre restaurering batches og AP varighed data udvindes for at undersøge repeterbarhed af resultaterne. Fordelings grunde for individuelle bølgeform APD30, apd80, triangulering (APD80— APD30) og fraktioneret forkortelse ((APD80— APD30)/(APD80)) vises (Figur 13).
Figur 1: forklædning af kryopræserverede hipsc-cm til modning. (A) cellebehandling til forklædning 1 hætteglas med 10 dage efter differentiering kryopræserverede hipsc-CMS. (B) fasekontrast billeder af vellykkede (venstre) og mislykket (højre) hipsc kulturer. Skala bjælke: 275 μm. Se video 1 og video 2 for vellykkede 14 og 24 dage efter differentiering kultur eksempler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Multiwell MEA Plate setup og klargøring. A) MULTIWELL MEA plade skemaer: pladen består af 24 brønde (a1 til D6), som hver indeholder 12 mikroelektrode systemer og 4 perifere reference elektroder. Elektrode diameter: 30 μm/Inter-elektrodeafstand: 300 μm. optagelser kan fås fra 288 elektroderne samtidigt. (B) sterilisering og hydrofile behandlingstrin, der skal udføres før hipsc-cm plating. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: hiPSC-cm dissociation og plating på Multiwell MEA pladen. (A) skematik af hipsc-cm MEA plating trin for hver brønd. B) mikroskopisk billede, som illustrerer den korrekte placering af celle dråber, som dækker alle 12 elektroder uden at sprede sig til 4 reference elektroderne. (C) fasekontrast mikroskopiske billeder af en eksemplarisk (venstre) og suboptimale (højre) hipsc-cm PLATTING på MEA ved 24 h efter plating. Scale bar = 275 μm. Se video 3 for at få succes med eksemplet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Multiwell-Screen erhvervelse software. Pilene angiver placeringen af de vigtigste funktioner og funktioner, der refereres til i teksten: temperaturkontrol (1) panelet giver mulighed for realtids temperaturovervågning i hele eksperimentet. Indsæt/skub ud (2) knappen engagere og frigive Multiwell MEA pladen. Definer eksperimentel flow (3) funktion giver brugeren mulighed for at indstille varigheden af optagelsen. Opsætning af data anskaffelse (4) gør det muligt for brugeren at angive indstillingerne for samplingsfrekvens og anskaffelses filter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Hipsc-cm elektroporation og signal erhvervelse . Stimulus definition fanebladet giver brugeren mulighed for at definere den elektro porerende puls parametre. Stimulering elektrode fanebladet giver brugeren mulighed for at vælge de elektroporerende elektroderne. Enhver kombination af 288 elektroder kan vælges. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: kvalitetskontrol af Multiwell-mål for elektrisk aktivitet. Multiwell-Screen erhvervelse software, der viser rå data vinduer med repræsentative eksempler på optimale (A) og sub-standard (B) FP-signaler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: FP-og AP-signaler fra det nye og gendannede array. Multiwell MEA enzymatiske rengøringstrin (A). Reference signalet for det nye array viser minimal signal-/støjforhold (B) og FP-signaler viser nettets elektriske aktivitet (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: data segmentering og analyse. Visning af GUI hovedvindue til bølgeform analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: data segmentering og analyse. Initialiser bølgeformer -knappen for at identificere og udtrække AP-bølgeformer til segmentering og for at starte den foreløbige behandling ved at zoome ind og vælge det potentielle interesseområde. Røde cirkler er elektro porationindikatorerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: data segmentering og analyse. Toppe (rødt ' x ') og trug (gule cirkler) detekteres for hver bølgeform, og de normaliserede APs er overlejret for en kvalitetskontrol af bølge formerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: AP amplitude afhængighed af FP signal for flere optagelser fra samme celle site. FP amplitude i μV intervaller (a, øverste venstre panel) eller mv intervaller (a, øverste højre panel) indspillet fra to uafhængige elektroder producere AP amplitude i mv-området (a, nederst til venstre og højre paneler) viser ingen sammenhæng mellem FP amplituder og post-elektroporation AP amplituden. De normaliserede AP-bølgeformer for hver optagelse er overlejret som vist for hver optagelse. Flere elektro porationer af samme celle sted ved 0 til 96 h producerede høj kvalitet AP bølgeformer tillader sporing af membran elektrodynamik (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: AP optagelser efter seks restaureringer. AP bølgeformer registreres samtidigt 10 s post-elektro portering på tværs af 12 elektroder fra samme brønd vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13: APD parameter histogrammer fra flere restaureringer. Fordelings grunde for individuelle bølgeform APD30 (A), APD80 (B), triangulering (APD80— APD30) (C) og fraktioneret forkortelse ((APD80— APD30)/(APD80)) (D) vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende filer. Videoer 1-3. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Gennem årene har anvendelsen af mål været begrænset til at gennemføre FP målinger af overgearet celler til at studere deres elektrofysiologiske egenskaber36,37,38,39. Kun få grupper har rapporteret AP spor fra elektro gene celler ved hjælp af Custom MEA baseret teknologi18,29,30. Men disse tilgange er ikke blevet undersøgt for gentagne optagelser fra de samme præparater. Vi udviklede en innovativ og præcis metode til at studere APs fra samme celle sted over dage i flere hiPSC-CM-netværk samtidigt3. I vores publicerede studie blev en multiwell Micro-Gold MEA-platform anvendt til at generere AP-bølgeform biblioteker fra flere partier af hiPSC-CM-kulturer med høj præcision og med en tidsmæssig opløsning på 1 μs. Den protokol, der er beskrevet her, forklarer såning af hiPSC-CMs på arrayet for effektiv udvikling af syncytial CM netværk til højt gennemløb AP optagelser. Flere kritiske trin i protokollen er: 1) produktion af flere høj renhed partier af kvalitetskontrolleret CMS for kryopræservering Banking, 2) meget levedygtige post-Thaw CMS til forklædning og modning, 3) behandling af multiwell MEA pladen til cm såning, 4) hiPSC-CM kultur dissociation ved 30 dage efter differentiering for belægning, og 5) genoprettelse af de multilaterale mål for multipel genbrug.
Det er vigtigt at bemærke, at batch-til-batch variation i hiPSC differentiering kan påvirke eksperimentelle resultater. Den enkeltlags metode til differentiering blev optimeret in-House for høj procent kardiomyocyte produktion3,40. FACS-analysen af MLC2v og TNNT2 markører i vores kulturer viser en ≥ 90% ventrikulær-lignende fænotype3. Disse kvalitets kontrollerede kulturer er kryopræserverede til eksperimentelle undersøgelser. De nuværende differentierings tilgange giver en heterogen blanding af nodal-, atrieflimle-og ventrikel lignende celler3,16,17,41. Derfor kan strategier anvendt til CM subtype population berigelse yderligere forbedre specificiteten af kulturerne. Derudover kan vævsteknik tilgange anvendes til at forbedre deres modning. De metoder, der foreslås her, kan nemt implementeres for andre CM-kilder.
De AP-bølgeformer, der blev registreret ved hjælp af MEA, var de samme som dem, som blev registreret fra netværk af kardiomyocytter ved optisk kortlægning42,43, komplementært metaloxid halvleder baseret MEA18,21og simuleret AP Brug af FP-optagelser20. For at adressere mekanismen for AP-målinger via MEA Hai og Spira25 viste det sig, at elektropore elektrode grænsefladen efterligner den etablerede skarpe glasmikroelektrode teknik. Dog kan muligheden for hvile membranen og de sande amplitude værdier i vores undersøgelse ikke fastslås, da elektropore elektroden i MEA-systemer ikke er kalibreret, og amplituden er en funktion af følsomheden og opløsningen af Teknik. Vores tilgang deler lignende begrænsninger for optisk kortlægning, når det kommer til AP amplitude.
De multiwell MEA-baserede FP/AP-udlæsninger, som er blevet omtalt her, åbner nye muligheder for lægemiddel sikkerhedsvurdering. Selvom spontane, disse hipsc-cm monolag slå med konstante satser. Analyse af APD parametre på tværs af flere netværk giver indsigt i elektrisk heterogenitet (Figur 13). Omfattende APD-restitutions analyser skal dog indeholde forudgående diastoliske intervaller. Desuden er høj kvalitet AP bølgeformer indspillet fra samme celle site over 96 h (figur 11b) er den første rapport til at spore membran elektrodynamik over tid, som vil være af værdi i udvikling og i sygdom.
Den her beskrevne protokol til kvantificering af AP-parametre kan bruges til at generere dosis-responskurver til test forbindelser. Som for nylig rapporteret af Edwards et al.3, dosisrespons af noradrenalin, izoproterenol og E 4031 er plottet for APD i forskellige repolariserings faser. Den offentliggjorte undersøgelse viste nøjagtigheden og pålideligheden af tilgangen til identifikation af de dosisafhængige subtile ændringer i AP-bølge formerne i realtid. Denne teknik kunne nemt udvides til andre forbindelser eller små molekyle biblioteker for at forstå forskellige elektrofysiologiske reaktioner.
Den MEA-baserede tilgang til AP-målinger, der præsenteres i denne undersøgelse, vil være af interesse ikke blot for elektro fysiologer, men også for celle biologer og in-silico- modellere. Endvidere, FP/AP optagelser fra samme celle site på hipsc-CMS vil gøre det muligt for forskere at generere bioelektriske data biblioteker af bred vifte af overgearet cellulære netværk inden for en kort periode. Tilgængeligheden af disse ressourcer vil være værdifuld for narkotika opdagelser og sygdoms modellering.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
| Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
| Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
| D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
| Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
| Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
| Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
| Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
| 6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |
References
- Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
- Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
- Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726 (2016).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
- Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
- Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
- Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
- Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
- Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
- Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
- Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100 (2015).
- Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110 (2016).
- Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206 (2014).
- Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
- Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
- Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
- Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
- Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
- Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
- Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
- Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
- Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
- Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
