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Bioengineering

बार-बार कार्रवाई की क्षमता वाली रिकॉर्डिंग के लिए मल्टीवेल माइक्रो-इलेक्ट्रोड ऐरे पर मानव iPSC-Derived Cardiomycye नेटवर्क

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59906
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3
1Aurora Research Institute, Advocate Aurora Health Care, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering and Applied Science, University of Wisconsin-Milwaukee, 3Department of Medicine-Cardiovascular, School of Medicine, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

इस लेख में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomycyte (HIPSC-CM) नेटवर्क के विकास के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट शामिल है बहुवेल MEA प्लेटों पर सुसंस्कृत कार्रवाई संभावित माप के लिए सेल झिल्ली reversibly electroporate करने के लिए. उच्च-थ्रूपुट रिकॉर्डिंग्स एक ही सेल साइटों से दिनों-बार प्राप्त की जाती हैं।

Abstract

कार्डिएक सुरक्षा स्क्रीनिंग दवा की खोज और चिकित्सकीय के लिए सर्वोपरि महत्व का है। इसलिए, HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट (HIPSC-सीएम) की तैयारी के लिए उपन्यास उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण का विकास कुशल दवा परीक्षण के लिए बहुत आवश्यक है। हालांकि multielectrode सरणियां (MEAs) अक्सर उत्तेजक कोशिकाओं के क्षेत्र संभावित माप के लिए कार्यरत हैं, जोशी-मुखर्जी और उनके सहयोगियों द्वारा हाल ही में एक प्रकाशन वर्णित है और आवर्तक कार्रवाई क्षमता (एपी) रिकॉर्डिंग के लिए अपने आवेदन मान्य एक ही hiPSC-सीएम की तैयारी से दिन में. यहाँ उद्देश्य के लिए मुख्य चिकित्सा बीज बोने के लिए विस्तृत कदम दर कदम तरीकों प्रदान करने के लिए और उच्च परिशुद्धता और 1 डिग्री के एक अस्थायी संकल्प के साथ इलेक्ट्रोपोट्रेशन के माध्यम से एपी waveforms को मापने के लिए है. यह दृष्टिकोण विश्वसनीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए उच्च-थ्रूपुट एपी माप के लिए इंट्रासेल्यूलर पहुँच प्राप्त करने के लिए उपयोग में आसान पद्धति की कमी को संबोधित करता है। मल्टीवेल एमईए प्लेटों पर HIPSC-सीएम के चढ़ाना के लिए एक विस्तृत कार्य प्रवाह और तरीकों पर चर्चा की जाती है जहां भी प्रासंगिक महत्वपूर्ण कदमों पर बल दिया जाता है। इसके अलावा, तेजी से डेटा हैंडलिंग, निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक कस्टम निर्मित MATLAB स्क्रिप्ट में फंसा विभिन्न एपी अवधि मानकों के लिए आकृति विज्ञान में सूक्ष्म अंतर की मात्रा निर्धारित करने के लिए तरंग विश्लेषण की व्यापक जांच के लिए रिपोर्ट की है अतालता और कार्डियोटॉक्सिसिटी।

Introduction

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (HIPSC-सीएम) प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या के लिए सोने के मानक हैं1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. भ्रूणीय शरीर11,12,13 और एकपरत3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 विभेदन कार्डियोमायोसाइट उत्पादन के लिए पसंदीदा तरीके हैं और बहुइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) एक आम मोडलिटी बन गई है इन नेटवर्कों की विद्युत गतिकी की निगरानी के लिए18,19,20. जबकि पैरामीटर है कि क्षेत्र क्षमता से निकाला जा सकता है (FPs) इस तरह की धड़कन दर के रूप में, आयाम, अवधि और आरआर अंतराल स्वतः पिटाई monolayers18,21की आधारभूत electrophysiological प्रतिक्रियाओं रहे हैं 22,23, इन extracellular FP संकेतों के अंतर्निहित कार्रवाई क्षमता (एपी) घटकों24extrapolate करने के लिए मुश्किल है . प्रत्यक्ष आवर्तक एपी माप के लिए MEAs के एक आवेदन की खोज पर हमारे हाल ही में प्रकाशन कई भर में विभिन्न repolarization चरणों में एक व्यापक तरंग विश्लेषण के साथ अनुकरणीय intracellular एपी readouts के लिए पद्धति का सबूत प्रदान करता है HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट नेटवर्क3के बैचों | अध्ययन में हमने दिखा दिया कि HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के नेटवर्क के लिए इलेक्ट्रोपोरेटिंग दालों की डिलीवरी एपी रिकॉर्डिंग के लिए इंट्रासेल्यूलर एक्सेस सक्षम बनाता है। येक्षणिक एपी रिकॉर्डिंग चोट स्थल3,25,26के माध्यम से देखी गई ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता वसूलियों पर निर्भर हैं . हमारे अध्ययन में विदेश भेजने और पैच-क्लैम्प के माध्यम से दर्ज वेवफॉर्म्स ने इसी प्रकार के एपी मॉर्फोलोजी को दिखाया जिससे दृष्टिकोण3की विश्वसनीयता मान्य होती है।

कुछ प्रयोगशालाओं ने कस्टम निर्मित एमईएएस18,21,26,27,28,29का उपयोग करके विभिन्न विद्युतजनित कोशिकाओं से ए पी को मापने की सूचना दी है, 30, लेकिन लगातार और आवर्तक एपी माप के लिए MEAs का उपयोग करने की विश्वसनीयता का मूल्यांकन नहीं किया गया था. वर्तमान में, सोने के मानक पैच-क्लैम्प तकनीक टर्मिनल रिकॉर्डिंग करने के लिए सीमित है7,31 जबकि, एमईए आधारित एपी माप क्षणिक हैं और इसलिए एक ही सेल पर कई बार आयोजित किया जा सकता है. हम यह भी बताते हैं कि एक आसानी से कम से कम फ़िल्टरिंग की आवश्यकता होती है millivolt रेंज में उच्च गुणवत्ता वाले एपी संकेतों को रिकॉर्ड कर सकते हैं. इसलिए शोधकर्ता एमईएएस का उपयोग करते हुए एक ही तैयारी में न केवल तीव्र बल्कि पुरानी दवा अध्ययन भी कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक कम समय में एक साथ एफपी/एपी माप उत्पन्न करने की अनुमति देती है। अतालता भविष्यवाणी और दवा संबद्ध कार्डियोटॉक्सिसिटी पर बढ़ते जोर को देखते हुए24,32,33,34,35, एपी माप के एकीकरण दृष्टिकोण दवा सुरक्षा और प्रभावकारिता आकलन में वृद्धि होगी.

यहाँ, हम 1) परिपक्वता के लिए cryopreserved HIPSC-सीएम के पूर्व चढ़ाना, 2) multiwell MEAs पर HIPSC-सीएम के विघटन और चढ़ाना, 3) HIPSC-CM नेटवर्क से FPs और APs की रिकॉर्डिंग, 4) विभाजन और विश्लेषण के लिए डेटा निकालने, और 5) एकाधिक पुन: उपयोग के लिए सरणियों को पुनर्स्थापित करना. हर कदम जहाँ भी प्रासंगिक महत्वपूर्ण कदम पर बल देने अनुकूलित किया गया है. सेल लगाव के लिए आवश्यकताओं को सुनिश्चित करने के लिए एक पिटाई syncytial monolayer चर्चा कर रहे हैं और दोहराव electrophysiological अध्ययन के लिए multiwell MEA बहाली के लिए प्रक्रियाओं की व्याख्या कर रहे हैं. अंत में, प्रयोगशाला में विकसित एक कस्टम जीयूआई एपी संकेत निष्कर्षण, गुणवत्ता आश्वासन, और विभाजन कार्यप्रवाह के लिए प्रस्तुत किया है परिमाण और एपी मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए.

Protocol

1. समाधान और सामग्री की तैयारी (सामग्री की तालिका देखें)

  1. 6-वेल ऊतक-संस्कृति प्लेट सब्सट्रेट-कोटिंग
    1. कोटिंग बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर सब्सट्रेट thaw.
    2. एक 1:100 कोटिंग सब्सट्रेट ठंड DMEM/F12 मध्यम में कमजोर पड़ने तैयार करें। धीमी पाइपिंग द्वारा समाधान मिक्स.
    3. एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के अच्छी तरह से प्रति कोटिंग सब्सट्रेट समाधान (चरण 1.1.2) के 2 एमएल स्थानांतरण।
    4. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में लेपित ऊतक कल्चर प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को कम से कम 7 घंटे के लिए रखें और 7 दिनों के भीतर उपयोग करें।
  2. HIPSC-सीएम संस्कृति माध्यम
    1. सीएम मीडिया पूरक के 10 एमएल जोड़ें सीएम आधार माध्यम के 500 एमएल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर thawed. अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. Alicot दिन के लिए मीडिया की राशि की आवश्यकता है और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान में लाने के लिए।
  3. HIPSC-CM thawing medium: HIPSC-CM संस्कृति माध्यम (चरण 1.2) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ मिश्रण करके ताजा तैयार करें। निलंबन के लिए सीएम के ठहरने से पहले मीडिया को कमरे के तापमान में लाें।
  4. फाइब्रोनेक्टिन 1 mg/mL स्टॉक समाधान: अलीकोट 200 डिग्री सेल्सियस 1.5 एमएल बाँझ माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में और बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। बर्फ पर नए सिरे से 50 ग्राम/एमएल सांद्रता का कार्य समाधान तैयार की जा रही है।
  5. मल्टीवेल सफाई समाधान: 50 एमएल बाँझ डबल आसुत पानी (डीडीएच2हे) के साथ एंजाइमी डिटर्जेंट के 0.5 ग्राम का मिश्रण। भंवर सामग्री मिश्रण करने के लिए. फ़िल्टर और एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. परिपक्वता के लिए क्रायोप्रीट HIPSC-CM की पूर्व-प्लेटिंग (चित्र 1)

नोट: यह खंड hiPSC-CMs कि फीडर मुक्त मोनोलेयर विधि3,16 और cryopreserved तरल नाइट्रोजन में 10 दिनों के बाद 1-2 लाख कोशिकाओं / एक शीशी से कोशिकाओं को एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के दो सब्सट्रेट लेपित कुओं में चढ़ाया जाता है। कार्डियोमायोसाइट्स ट्यूब के तल पर व्यवस्थित हो जाते हैं तो पूर्व चढ़ाना के समय कोमल मिश्रण कुओं में भी सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. HiPSC-सीएम की शीशी प्रति एफबीएस के 2 एमएल एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में फेंक दिया जा रहा है और कमरे के तापमान में लाने के लिए।
  2. क्रायोपर्ड हिपीएससी-सीएम की शीशियों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखकर और 3 मिनट से अधिक के लिए भी थिंग के लिए धीरे-धीरे घूमता है।
  3. तुरंत FBS युक्त ट्यूब के लिए शीशी सामग्री हस्तांतरण (चरण 2.1 देखें), घूमता और 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर centrifuge द्वारा मिश्रण.
  4. सुपरनेंट को प्रेरित करें और 1 एमएल में HIPSC-CM thawing माध्यम में सेल गोली को फिर से लागू करें (चरण 1.3 देखें) प्रति शीशी thawed. कोमल trituration द्वारा गोली resuspend करने के लिए एक हस्तांतरण pipette का प्रयोग करें. सेल व्यवहार्यता का आकलन करें।
  5. HIPSC-CM के प्रति शीशी thawing मध्यम के अतिरिक्त 3 एमएल जोड़ें चरण 2.4 में thawed और धीरे से सेल clumps को अलग करने के लिए एक हस्तांतरण pipette का उपयोग कर निलंबित.
  6. सब्सट्रेट लेपित 6-वेल प्लेट्स के प्रत्येक कुएं में धीरे से सेल निलंबन के 2 एमएल का वितरण करें (चरण 1-1 देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें।
  7. 24 एच और उसके बाद 20 दिनों के लिए 3 बार साप्ताहिक के बाद ताजा HIPSC-CM culturing माध्यम के साथ बदलें।
    नोट: कोशिकाओं 24 ज द्वारा सब्सट्रेट कोटिंग का पालन करें और 48 एच पोस्ट-प्लेटिंग पर सहज रूप से हरा चाहिए (देखें वीडियो 1 और वीडियो2)।

3. मल्टीवेल एमईए प्लेट नसबंदी और कोटिंग (चित्र 2 और चित्र 3)

नोट: यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल HIPSC-सीएम चढ़ाना के लिए कांच पर 12 माइक्रो सोने PEDOT लेपित इलेक्ट्रोड के साथ 24 अच्छी तरह से MEA प्लेटें तैयार करने के लिए है। प्लेट के नीचे को छूने से बचें क्योंकि इससे इलेक्ट्रोड को नुकसान हो सकता है।

  1. सेल चढ़ाना से दो दिन पहले, HIPSC-सीएम संस्कृति माध्यम के 0.5 एमएल जोड़ें (प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए कदम 1.2 देखें) और MEAs की गुणवत्ता की जांच के लिए संकेत-से-शोर अनुपात सत्यापित करने के लिए एक आधाररेखा रिकॉर्डिंग प्रदर्शन।
  2. मीडिया Aspirate, बाँझ डीडीएच2हे के साथ कुल्ला और एक laminar प्रवाह हुड रात भर के अंदर यूवी प्रकाश के तहत बाँझ.
  3. सेल चढ़ाना से पहले दिन, MEA सतहों के hydrophilic उपचार के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से FBS के 0.1 एमएल जोड़ें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। यह चरण कक्ष अनुलग्नक के लिए आवश्यक है.
  4. FBS को प्रेरित करें और 0.5 एमएल बाँझ डीडीएच2ओ प्रति अच्छी तरह से कुल्ला करें। एक और बार दोहराएँ.
  5. रात भर लेमिनर फ्लो हुड में सूखने के लिए प्लेट को छोड़ दें।
  6. स्टॉक से ठंडे DMEM/F12 माध्यम में 50 g/mL फाइब्रोनेक्टिन का कार्य कमजोर करना तैयार करें (चरण 1-4 देखें)। बर्फ पर समाधान रखें.
  7. पिपेट 5 कार्य फाइब्रोनेक्टिन कमजोर पड़ने के एल (देखें 3.6) और ध्यान से सभी 12 इलेक्ट्रोड को कवर करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से के केंद्र के लिए छोटी बूंद वितरित. बूंद को सुखाने से रोकने के लिए 24 कुओं में तेजी से काम करना महत्वपूर्ण है।
  8. तुरंत पूरे पकवान सतह को कवर करने के लिए बाँझ डीएच2ओ युक्त एक humidifying कक्ष के अंदर एक उठाया सतह पर फाइब्रोनेक्टिन लेपित multiwell एमईए प्लेट जगह है। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 3 एच के लिए मल्टीवेल एमई ए प्लेट के साथ कक्ष रखें।
    नोट: एक humidifying कक्ष में 24 अच्छी तरह से MEA प्लेट रखने से फाइब्रोनेक्टिन बूंदों ऊष्मायन अवधि के दौरान बाहर सुखाने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है.

4. HIPSC-CM वियोजन और मल्टीवेल एमईए प्लेट पर चढ़ाना (चित्र 3)

नोट: MEA fibronectin ऊष्मायन पूरा हो गया है करने के लिए पहले 1 ज के बारे में इस चरण को प्रारंभ करें। सुनिश्चित करें कि सेल वियोजन समाधान 37 डिग्री सेल्सियस पर है और iPSC-CM thawing माध्यम कमरे के तापमान पर है। वियोजन विधियों को 30 दिनों के लिए अनुकूलित किया गया है, जबकि अंतर-विभेदित HIPSC-CMs को सब्सट्रेट-कोट्ड 6-वेल प्लेट्स (चरण 2 देखें) पर सुसंस्कृत किया गया है ताकि एमईए चढ़ाना के लिए लगभग 90% व्यवहार्य सीएम प्राप्त किए जा सकें। सेल मौत को रोकने के लिए trituration जबकि हवा बुलबुले परिचय नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।

  1. 30 दिन के बाद अलग-अलग HIPSC-CM संस्कृति के साथ 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति पकवान के प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम aspirate (कदम 2.7 देखें) और बाँझ डी-पीबीएस प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल के साथ धो लें।
  2. पूर्व-गर्म सेल वियोजन विलयन का 1 एमएल जोड़ें (सामग्री की सारणीदेखें) प्रति अच्छी तरह से और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। वियोजन के लिए कोशिकाओं को ढीला करने के लिए धीरे triturate करने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें। यदि अधिकांश कोशिकाएं अभी भी अनुलग्न हैं, तो 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर से triturate करें। इस अतिरिक्त ऊष्मायन अधिकतम सेल वसूली के लिए मदद करनी चाहिए. 7 मिनट से अधिक के लिए इनक्यूबेट न करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कम सेल व्यवहार्यता हो सकती है।
  3. एक हस्तांतरण pipette का उपयोग करना, एक conical ट्यूब में सभी अलग कोशिकाओं पूल hiPSC-CM thawing माध्यम युक्त (चरण 1.3 देखें). सेल वियोजन समाधान की गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए कम से कम दो बार मीडिया की मात्रा (2 एमएल प्रति अच्छी तरह से काटा जा रहा है) में कोशिकाओं को निलंबित करने की सिफारिश की जाती है।
  4. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  5. समाधान को सावधानी से प्रेरित करें क्योंकि गोली सतह से शिथिल रूप से जुड़ी होती है और 0.1 एमएल HIPSC-CM thwing माध्यम में पुन: असाइन की जाती है। कोमल trituration द्वारा कई बार गोली resuspend करने के लिए एक हस्तांतरण pipette का प्रयोग करें.
  6. अलीकोट 2 र्ल् अलग-अलग कोशिकाओं का तथा 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में मीडिया के 18 डिग्री सेल्सियस के साथ पतला होता है। Trypan ब्लू के 20 $L जोड़ें और सेल गिनती और व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए मिश्रण.
  7. HIPSC-CM thawing माध्यम की उचित मात्रा जोड़कर 6,000 कोशिकाओं/ कोमल flicking द्वारा कुछ समय गोली निलंबित. HIPSC-सीएम आसानी से कांच की सतहों से अलग करते हैं, खासकर जब उच्च घनत्व पर चढ़ाया जाता है। हम बिजली रिकॉर्डिंग के 15 दिनों को प्राप्त करने के लिए बोने घनत्व और चढ़ाना शर्तों अनुकूलित किया है।
  8. जब तैयार हो, सेल बोने के लिए स्तरीय प्रवाह हुड में multiwell MEA प्लेट ले आओ. फाइब्रोनेक्टिन को सुखाने से रोकने के लिए एक समय में निम्नलिखित दो चरणों को अच्छी तरह से करना महत्वपूर्ण है।
    1. इलेक्ट्रोड को छूने के बिना एक P10 पिपेट का उपयोग कर के लिए फाइब्रोनेक्टिन छोटी बूंद को ध्यान से निकालें।
    2. तुरंत सभी 12 इलेक्ट्रोड को कवर MEA प्लेट के अच्छी तरह से केंद्र के लिए एक 5 डिग्री एल सेल छोटी बूंद (30,000 कोशिकाओं) वितरित. कदम दोहराएँ जब तक सभी 24 कुओं चढ़ाया जाता है. flicking द्वारा सेल निलंबन के विरामी मिश्रण की सिफारिश की है.
  9. मल्टीवेल एमईए प्लेट को शिथिल कवर humidifying कक्ष में वापस रखें और सेल लगाव के लिए 3 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर पर वापस जाएं।
  10. ध्यान से एक P200 पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को परेशान किए बिना प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें मध्यम. अच्छी तरह से पक्ष में मीडिया dropwise जोड़ें.
  11. मल्टीवेल एमई प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  12. 24 एच पोस्ट प्लेटिंग में ताजा HIPSC-सीएम संस्कृति माध्यम के साथ बदलें। कार्डियोमायोसाइट्स की सहज पिटाई इस बिंदु पर देखी जा सकती है (देखें वीडियो 3)।
  13. प्रयोगों के अंत तक हर 2 दिन में मीडिया बदलें.

5. HIPSC-CM विद्युत और संकेत अधिग्रहण (चित्र 4 - 6)

नोट: इस प्रोटोकॉल उच्च throughput इलेक्ट्रोड संकेतों के एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए है (12 साइटों में से प्रत्येक के लिए 24 कुओं). 24-वेल मल्टीवेल एमईए प्रणाली अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ प्रयोग किया जाता है (सामग्री की तालिकादेखें)। सभी एमई रिकॉर्डिंग 37 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित की जाती हैं।

  1. इंटरफ़ेस बोर्ड चालू करें और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर आरंभ करें. मल्टीवेल एमईए हेडस्टेज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तापमान तक पहुंचने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें (चित्र 4में तीर नं. 1 देखें)।
  2. मल्टीवेल एमईए प्लेट को रिकॉर्डिंग प्लेटफॉर्म पर कवर करके मल्टीवेल एमईए हेडस्टेज में चरण 4 से डालें और सम्मिलित करें बटन पर क्लिक करें (चित्र 4में तीर नंबर 2 देखें)। तापमान रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले स्थिर करने के लिए अनुमति दें।
  3. अधिग्रहण और इलेक्ट्रोपोट्रेशन सेटिंग्स समायोजित करें
    1. प्रायोगिक प्रवाह निर्धारित करें चिह्न पर क्लिक करें (चित्र 4में तीर नंबर 3 देखें) और रिकॉर्डिंग समय को 2 मिनट या वांछित के रूप में सेट करें.
    2. डेटा प्राप्ति सेटअप चिह्न पर क्लिक करें (चित्र 4में तीर नंबर 4 देखें) और नमूना दर 20 kHz करने के लिए सेट, उच्च पास फ़िल्टर करने के लिए 0.1 हर्ट्ज और कम पास फ़िल्टर करने के लिए 3500 हर्ट्ज.
    3. Stimulator सेटिंग्स आइकन पर क्लिक करें (चित्र 5) देखें . उत्तेजना परिभाषा टैब के अंतर्गत, उत्तेजना को 1 mV, 1 ms और 1 Hz की द्वि-जातीय सममित वोल्टता स्पंदों के रूप में परिभाषित करें। उत्तेजना इलेक्ट्रोड टैब के तहत, सभी प्रासंगिक इलेक्ट्रोड पर प्रकाश डाला द्वारा इलेक्ट्रोपोरोनेशन साइटों का चयन करें।
  4. सभी कुओं में संकेतों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए अन्वेषण बटन पर क्लिक करें. संकेत गुणवत्ता और स्थिर स्थिति की स्थिति की पुष्टि करें। एमवी रेंज में FP संकेतों के साथ इलेक्ट्रोड पर नोट्स ले लो. अन्वेषण को रोकने के लिए एक ही बटन क्लिक करें. इस बिंदु तक कोई डेटा रिकॉर्ड नहीं किया गया है.
  5. जाओ! बटन पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग शुरू करो. प्रत्येक कुएं में इलेक्ट्रोड कच्चे डेटा विंडो में FP संकेतों को दिखाएगा (चित्र 6) . रिकॉर्डिंग के 30 s के बाद, उत्तेजित बटन पर क्लिक करें और इलेक्ट्रोपोट्रेशन 30 s के लिए चयनित साइटों पर जगह लेने के लिए अनुमति देते हैं; फिर, उत्तेजना को रोकने और शेष 60 s के लिए रिकॉर्डिंग जारी रखने के लिए एक ही बटन पर क्लिक करें.
    नोट: दर्ज की गई फ़ाइल 'रेप्लेयर मोड' के लिए स्विचन द्वारा वापस खेला जा सकता है 'अनुप्रयोग' ड्रॉपडाउन मेनू में.

6. पुन: उपयोग के लिए मल्टीवेल एमई प्लेट सफाई

  1. अंतिम प्रयोगों के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से सभी मीडिया सामग्री aspirating और ध्यान से इलेक्ट्रोड सतह को छूने से बचने के द्वारा multiwell थाली में सभी कुओं को साफ.
  2. 1 एमएल बाँझ डीडीएच2ओ प्रति अच्छी तरह से जोड़ें। Aspirate और एक बार दोहराएँ.
  3. मल्टीवेल सफाई समाधान के 0.3 एमएल जोड़ें (कदम 1.5) प्रति अच्छी तरह से देखें. कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. अगले दिन सुबह, घोल को सहलाते हुए 1 एमएल बाँझ डीडीएच2ओ. 5 - 7 मिनट और एस्पायर के लिए इनक्यूबेट के साथ कुल्ला करें। 5 बार दोहराएँ.
  5. बाँझ डीडीएच2ओ प्रति अच्छी तरह से 0.5 एमएल जोड़ें। साफ किए गए MEAs की गुणवत्ता की जांच के लिए साफ मल्टीवेल प्लेट की आधार रेखा रिकॉर्ड करें (चित्र 7)।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक उपयोग करने के लिए तैयार है।

7. डेटा फ़ाइल रूपांतरण और निर्यात

नोट: चार डेटा फ़ाइलें हर रिकॉर्डिंग के लिए उत्पन्न किया जाएगा: MWR, MWC, MWD, और MWS फ़ाइलें. कनवर्टर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, MWD फ़ाइल कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग करके अनुवर्ती विश्लेषण के लिए H5 फ़ाइल में कनवर्ट की जा सकती है (पूरक फ़ाइल 1देखें).

  1. कनवर्टर सॉफ्टवेयर शुरू (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. फ़ाइल मेनू से इनपुट पथ सेट करें का चयन करें. ब्याज की डेटा फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर का चयन करें.
  3. फ़ाइल मेनू से आउटपुट पथ सेट करें का चयन करें. फ़ोल्डर का चयन करें जहाँ कनवर्ट की गई फ़ाइलें सहेजी जानी हैं.
  4. ब्याज की MWD फ़ाइल पर प्रकाश डाला.
  5. HDF5 के लिए निर्यात करें बटन क्लिक करें.

8. डेटा विभाजन और विश्लेषण (चित्र 8-10)

नोट: Matlab आधारित कस्टम सॉफ्टवेयर खंड और विभिन्न FP और एपी डेटा मापदंडों को निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है। सॉफ्टवेयर मांग पर उपलब्ध है.

  1. Matlab का उपयोग करके वेवफ़ॉर्म विश्लेषण कोड चलाएँ (GUI की मुख्य विंडो के दृश्य के लिए चित्र 8 देखें).
  2. फ़ाइल पर क्लिक करें और प्रक्रिया .h5का चयन करें.
  3. ढूँढें और ऊपर चरण 7 के अनुसार बनाई गई mwd.h5 फ़ाइल का चयन करें।
  4. आउटपुट फ़ाइलों का संग्रहण स्थान परिवर्तित करने के लिए निर्देशिका सहेजें बटन पर क्लिक करें.
  5. ब्याज के इलेक्ट्रोड/अच्छी तरह से संयोजन का चयन करके और फिर क्यू बटन पर क्लिक करके एक संकेत प्रसंस्करण कतार बनाएँ। क्यू करने के लिए संसाधित किया जा करने के लिए और अधिक इलेक्ट्रोड /अच्छी तरह से संयोजन संलग्न करने के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  6. यदि कोशिकाओं का औषधों के साथ उपचार किया गया तो मेड नेम / मेड एकाग्रता पर सीधे क्लिक करके कतार संपादित करें ( चित्र8) |
  7. एक बार कतार अंतिम है, प्रारंभ Waveforms बटन पर क्लिक करें. यह प्रारंभिक प्रसंस्करण जिसमें संकेतों की पहचान की जाती है और विभाजन के लिए निकाले जाते हैं, शुरू कर देंगे।
  8. ज़ूम इन बटन पर क्लिक करें और कर्सर के साथ रुचि के क्रिया संभावित क्षेत्र का चयन करें (चित्र 9) .
  9. रखें बटन क्लिक करें और पैनल की समीक्षा करें. चोटियों (लाल 'x') और troughs (पीले हलकों) हर तरंग के लिए पता चला रहे हैं और सामान्यीकृत कार्रवाई क्षमता आरोपित कर रहे हैं. रखें बटन क्लिक करें और कतार में अगले ट्रेस पर जाएँ (चित्र 10).
  10. कतार में शेष इलेक्ट्रोड/अच्छी संयोजन संकेतों के लिए चरण 8.8-8.9 दोहराएँ।
    नोट: एक .csv फ़ाइल APD हर तरंग के लिए मापा मानकों के साथ उत्पन्न किया जाएगा. विभाजित डेटा के अतिरिक्त संसाधन की अनुमति देने के लिए प्रत्येक .h5 फ़ाइल के लिए .mat फ़ाइल भी सहेजी जाती है.

Representative Results

बहु-कल्याण मंत्रालय की संस्कृति के लिए पोस्ट-थॉप्ड हिपीएससी-सीएम की व्यवहार्यता और चढ़ाना घनत्व महत्वपूर्ण है। 50% या अधिक व्यवहार्यता के साथ एक 6-वेल ऊतक संस्कृति प्लेट के दो कुओं में 1-2 लाख HIPSC-CMs/vial की प्री-प्लेटिंग 48 ज पर सहज पिटाई के साथ एक स्वस्थ मोनोलेयर संस्कृति का उत्पादन करेगा। सीएम की खराब व्यवहार्यता का परिणाम संस्कृतियों में होगा, जिसका प्रतिशत अधिक होगा। गैर-मायोसाइट आबादी. इन monolayers जब multiwell MEA चढ़ाना के लिए अलग आम तौर पर असंगत परिणाम और खराब गुणवत्ता संकेतों का उत्पादन और इसलिए खारिज कर दिया जाना चाहिए. चित्र 1 48 एच पोस्ट चढ़ाना पर इष्टतम बनाम उप इष्टतम hiPSC-CMs संस्कृतियों के उदाहरण से पता चलता है। multiwell MEAs पर सीधे के बजाय सब्सट्रेट लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटों पर मुख्यमंत्री thawing, सेल वसूली और परिपक्वता3के लिए अनुमति देता है. सरणी पर cryopreserved सीएम के प्रत्यक्ष चढ़ाना के रूप में यह असंगत परिणाम का उत्पादन अनुशंसित नहीं है.

अलग-अलग मुख्य ासान की गुणवत्ता के अतिरिक्त, बहुवेल एमईए पर सेल लगाव सेल घनत्व और फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग तकनीक पर अत्यधिक निर्भर है। फिब्रोनेक्टिन छोटी बूंद का आकार महत्वपूर्ण है क्योंकि मुख्य ांवथाय फाइब्रोनेक्टिन-कोट क्षेत्र की सीमाओं के अनुरूप होगा। इस कारण से, फाइब्रोनेक्टिन विलयन का केवल 5 डिग्री सेल्सियस विद्युत-क्षेत्र सरणी क्षेत्र पर सीधे वितरित किया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि छोटी बूंद तितर-बितर नहीं होती है, अच्छी सतह कोटिंग के समय पूरी तरह से सूखी होनी चाहिए। चित्रा 2 इष्टतम तैयारी के लिए कदम दर कदम pretreatment के schematics के साथ multiwell MEA प्लेट के लेआउट से पता चलता है. इसके अतिरिक्त, multiwell MEA प्लेटें सुखाने से फाइब्रोनेक्टिन को रोकने के लिए कोई अधिक से अधिक 3 ज स्थायी ऊष्मायन अवधि के दौरान एक humidifying कक्ष के अंदर रखा जाना चाहिए (चरण 3.8 देखें). एक बार ऊष्मायन अवधि पूरी हो जाने के बाद, सीएम चढ़ाना से ठीक पहले प्रत्येक कुएं से फाइब्रोनेक्टिन छोटी बूंद को हटाना महत्वपूर्ण है और उसके बाद ही अगले अच्छी तरह से चढ़ाना के लिए आगे बढ़ना महत्वपूर्ण है। तेजी से और सावधानी से काम कर रहे हैं सीएम के वितरण सफल सेल लगाव की कुंजी है.

HIPSC-सीएम संस्कृतियों पर 30 दिनों के बाद भेदभाव multiwell MEA चढ़ाना के लिए अलग कर रहे हैं एंजाइमी सेल वियोजन विधि का उपयोग कर (चरण 4 देखें). सीएम फाइब्रोनेक्टिन-कोट्ड एमईए सतहों को 3 एच से जोड़ेंगे और सरणियों को कवर करने वाला मोनोलेयर 24 ज पोस्ट-प्लेटिंग (चित्र 3) के बाद दिखाई देगा। मोनोलेयर की सिंक्रोनस पिटाई 24-48 ज पर देखी जाएगी। कोशिका छोटी बूंद फैलाव संस्कृति घनत्व को प्रभावित करेगी या यहां तक कि सुखाने और कोशिका मृत्यु का कारण बनेगी। सरणी पर सीधे सटीक सेल प्लेसमेंट अत्यंत महत्वपूर्ण है और इसलिए तकनीक इष्टतम चढ़ाना के लिए अभ्यास किया जाना चाहिए। संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए सेल आसंजन विद्युत संकेत उत्पादन में बाधा होगी। 24 h के बाद इष्टतम CM प्लेसमेंट की छवियों के लिए चित्र 3 और संस्कृति देखें.

मल्टीवेल एमईए पर सुसंस्कृत सीएम 48 एच पोस्ट-प्लेटिंग में विद्युत गतिविधि के लिए गुणवत्ता की जांच के अधीन हैं। आमतौर पर, FP संकेत आयाम लगभग 4 दिनों में $V रेंज से mV तक बढ़ जातीहै3. यदि एक नेटवर्क के भीतर इलेक्ट्रोड के 50% और कुल नेटवर्क का 70% FP संकेतों का उत्पादन नहीं करते, तो नेटवर्क या संस्कृति suboptimal हैं और खारिज कर दिया जाना चाहिए. केवल संस्कृतियों जो गुणवत्ता की जाँच पास FP और AP विश्लेषण के लिए संसाधित किए जाते हैं। चित्र 6 अच्छे और उप-मानक FP संकेतों के उदाहरण दिखाता है.

इलेक्ट्रोपोरेशन-मध्यस्थ एपी रिकॉर्डिंग संस्कृतियों से कई बार प्राप्त किया जा सकता है 48 एच पोस्ट-एमईए चढ़ाना। इलेक्ट्रोपोट्रेशन को रोजगार, हम कई HIPSC व्युत्पन्न cardiomycyte नेटवर्क से उच्च संकल्प APs रिकॉर्ड करने के लिए intracellular पहुँच प्राप्त की। कम वोल्टेज दालों (1 ट, 1 एमएस, 1 हर्ट्ज) के लिए 30 s क्षणिक, एपी के लिए FP के प्रतिवर्ती परिवर्तन के लिए दिया गया. इलेक्ट्रोपोट्रेशन इलेक्ट्रोड के लगभग 75% में एपी माप के लिए सफल intracellular पहुँच की अनुमति देता है. विद्युत संकेतों को 2 मिनट के लिए दर्ज किया गया है जिसमें 30 एस प्री-इलेक्ट्रोपोरेशन, 30 एस के दौरान और 1 मिनट के बाद विद्युत-उत्सर्जन शामिल हैं। 10 एस एपी waveforms 10 एस के बाद electroporation की एक ट्रेन संकेत गुणवत्ता और विश्लेषण के लिए सभी साइटों में मूल्यांकन कर रहे हैं. शुद्ध एपी संकेत के अनुरूप नहीं किसी भी निशान खारिज कर रहे हैं. जांच करने के लिए अगर एपी आयाम FP संकेत करने के लिए सहसंबंधित हम एक साथ waveforms रिकॉर्ड करने के लिए सभी 288 साइटों electroporated. प्रतिनिधि एफपी और एपी दो अलग इलेक्ट्रोड से एक ही सेल साइट से दर्ज संकेत चित्र 11Aमें दिखाए गए हैं. हमने एक ही सेल साइट से अभिलेखित एफपी आयाम और पश्च विद्युत-पोट्रेशन एपी आयाम के बीच कोई सहसंबंध नहीं देखा। इसके अतिरिक्त, 0, 24, 48, 72 और 96 h पर एक ही सेल साइट के एकाधिक electropores समय के साथ एपी आकार पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा (चित्र 11B).

प्रणाली के उच्च throughput प्रकृति को देखते हुए, एक मैनुअल तकनीक को निकालने और आरआर अंतराल के रूप में ब्याज के मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, तात्कालिक आवृत्ति और अंतर कार्रवाई संभावित अवधि अक्षम और समय लगता है. अनुरोध पर अनुसंधान समुदाय के लिए उपलब्ध एक कस्टम निर्मित MATLAB स्क्रिप्ट 1 $s संकल्प के साथ तरंग माप प्रदर्शन करने के लिए कार्यरत है। इलेक्ट्रोपोरेशन समय अंक निकाले गए संकेत के साथ मढ़ा जाता है, जो संकेत निष्कर्षण, गुणवत्ता आश्वासन, और विभाजन कार्यप्रवाह का संचालन करने के लिए एपी पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन के 10 s की पहचान करने के लिए तैयार किया जाता है (चित्र 8, चित्र 9, चित्र 10) यूजर इंटरफेस एक गाइड के रूप में मढ़ा विद्युत कथन संकेतकों का उपयोग कर वांछित खंड के चयन के लिए अनुमति देता है। खंडित तरंग आगे व्यक्तिगत एपी waveforms की पहचान करने के लिए subनेरूटी द्वारा संसाधित है. यह शिखर का पता लगाने के माध्यम से पूरा किया है, जहां उच्चतम और सबसे कम वोल्टेज प्रत्येक चक्र के लिए पहचान की है. एक बार जब यह प्रक्रिया पूरी हो जाती है, आयाम सामान्यीकृत हो जाते हैं, और संबद्ध समय सदिश1 के शिखर मान पर समय शून्य निर्धारित करने के लिए स्थानांतरित कर दिए जाते हैं। अलग-अलग चक्र के साथ चौराहे अंक के अंतर्वेशन APD माप निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस प्रकार, एपी तरंग विभाजन के लिए आंशिक स्वचालन कार्यप्रवाह समय की एक छोटी अवधि में संस्कृतियों के कई बैचों में विभिन्न APD मापदंडों के लिए कुशल डेटा विश्लेषण की अनुमति देता है. एफ पी एस और ए पी एस के लिए समावेशन और बहिष्करण मानदंड का और अधिक स्वचालन रीयल-टाइम डेटा विश्लेषण के लिए चल रहा है।

multiwell MEA प्लेट का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है. इस बहाली लागत प्रभावी और लगातार डेटा संग्रह के लिए दोहराव electrophysiological अध्ययन सक्षम बनाता है. 6 बहाली के बाद एक ही सरणी से ए पी की रिकॉर्डिंग चित्र 12में दिखाए गए हैं । सिग्नल-टू-शोर अनुपात कई पुन: उपयोग ों में समान है। दोहराव electrophysiological अध्ययन के लिए सरणी की विश्वसनीयता प्रदर्शित करने के लिए, 3815 एपी waveforms की कुल तीन बहाली बैचों से जमा कर रहे हैं और एपी अवधि डेटा परिणामों की repeatability की जांच करने के लिए निकाला जाता है. व्यक्तिगत तरंग APD30, APD80, त्रिकोणीयन (APD80] APD30) और आंशिक लघुकरण के लिएवितरण भूखंडों ( (एपीडी80[APD30)/

Figure 1
चित्र 1: परिपक्वता के लिए cryopreserved HIPSC-CM की पूर्व-प्लेटिंग। (क) 10 दिनों के बाद के 10 दिनों के बाद के 1 शीशी के लिए सेल प्रोसेसिंग, hiPSC-CMs. (B) सफल (बाएं) के चरण विपरीत छवियों और असफल (दाएं) hiPSC संस्कृतियों. स्केल बार: 275 डिग्री मी. सफल 14 और 24 दिनों के बाद भेदभाव संस्कृति उदाहरण के लिए वीडियो 1 और वीडियो 2 देखें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: Multiwell MEA प्लेट सेटअप और तैयारी. (ए) मल्टीवेल एमई प्लेट योजनाबद्ध: प्लेट में 24 कुओं (ए1 से डी6) प्रत्येक 12 माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों और 4 परिधीय संदर्भ इलेक्ट्रोड होते हैं। इलेक्ट्रोड व्यास: 30 डिग्री मी / अंतर-इलेक्ट्रोड दूरी: 300 डिग्री मी. रिकॉर्डिंग 288 इलेक्ट्रोड से एक साथ प्राप्त की जा सकती है। (बी) स्टरलाइजेशन और हाइड्रोफिलिक उपचार कदम HIPSC-सीएम चढ़ाना से पहले आयोजित किया जाएगा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: HIPSC-CM वियोजन और Multiwell MEA प्लेट पर चढ़ाना. (ए) प्रत्येक कुएं के लिए HIPSC-CM MEA चढ़ाना कदम के Schematics. (बी) सूक्ष्म प्रतिबिंब, जिसमें सही सेल ड्रॉलेट प्लेसमेंट का चित्रण किया गया है जिसमें 4 संदर्भ इलेक्ट्रोडों को फैलए बिना सभी 12 इलेक्ट्रोड शामिल हैं। (ग) चरण विपरीत सूक्ष्म चित्र एक अनुकरणीय (बाएं) और suboptimal (दाएं) hiPSC-CM 24 बजे के बाद प्लेटिंग पर MEA पर plating. स्केल बार$ 275 डिग्री मी. सफल MEA चढ़ाना उदाहरण के लिए वीडियो 3 देखें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Multiwell स्क्रीन अधिग्रहण सॉफ्टवेयर. तीर पाठ में संदर्भित प्रमुख विशेषताओं और कार्यों के स्थान का संकेत: तापमान नियंत्रण (1) पैनल प्रयोग भर में वास्तविक समय तापमान की निगरानी के लिए अनुमति देता है. सम्मिलित करें/Eect (2) बटन संलग्न हैं और Multiwell MEA प्लेट जारी. परिभाषित प्रायोगिक प्रवाह (3) समारोह रिकॉर्डिंग की अवधि निर्धारित करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है. डेटा अधिग्रहण सेटअप (4) समारोह नमूना दर और अधिग्रहण फिल्टर सेटिंग्स सेट करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: उच्च पीएससी-सीएम विद् युत्-पूजन और संकेत अर्जन . उत्तेजना परिभाषा टैब विद्युत पल्स पैरामीटर को परिभाषित करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है. उत्तेजना इलेक्ट्रोड टैब उपयोगकर्ता इलेक्ट्रोपोरेटिंग इलेक्ट्रोड का चयन करने के लिए अनुमति देता है. के किसी भी संयोजन का चयन किया जा सकता 288 इलेक्ट्रोड. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: विद्युत गतिविधि के लिए मल्टीवेल एमईएस की गुणवत्ता की जांच। Multiwell-स्क्रीन अधिग्रहण इष्टतम के प्रतिनिधि उदाहरण के साथ कच्चे डेटा खिड़कियों दिखा सॉफ्टवेयर (ए) और उप मानक (बी) FP संकेतों. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: नए और पुनर्स्थापित सरणी से FP और AP संकेत. मल्टीवेल एमईए एंजाइमी सफाई कदम (एक)। नई सरणी का आधारभूत संकेत शोर अनुपात के लिए न्यूनतम संकेत से पता चलता है (बी) और FP संकेत नेटवर्क की विद्युत गतिविधि दिखाने (सी) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: डेटा विभाजन और विश्लेषण. वेवफ़ॉर्म विश्लेषणके लिए जीयूआई के मुख्य विंडो का दृश्य | कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: डेटा विभाजन और विश्लेषण. की पहचान करने और विभाजन के लिए एपी waveforms निकालने के लिए और में zooming और ब्याज की कार्रवाई संभावित क्षेत्र का चयन करके प्रारंभिक प्रसंस्करण शुरू करने के लिए Waveforms बटन प्रारंभ. लाल वृत्त इलेक्ट्रोपोट्रेशन संकेतक हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: डेटा विभाजन और विश्लेषण. चोटियों (लाल 'x') और troughs (पीले हलकों) हर तरंग के लिए पता चला रहे हैं और सामान्यीकृत ए पी waveforms की एक गुणवत्ता की जांच के लिए आरोपित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्र 11: एक ही सेल साइट से कई रिकॉर्डिंग के लिए FP संकेत पर एपी आयाम निर्भरता. दो स्वतंत्र इलेक्ट्रोड से दर्ज की गई जेडवी श्रेणियों (ए , ऊपर बाएं पैनल) या एमवी पर्वतमाला (ए ,ऊपर बाएं पैनल) में एफपी आयाम ( ए , नीचे बाएं और दाएं पैनल) में एफपी आयाम और पश् च-इलेक्ट्रोपोरेशन एपी आयाम। प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए सामान्यीकृत एपी waveforms प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए दिखाया गया है के रूप में आरोपित कर रहे हैं. 0 से 96 ज पर एक ही सेल साइट के एकाधिक इलेक्ट्रोपोरेशन्स ने उच्च गुणवत्ता वाले एपी तरंगरूपों का उत्पादन किया जिससे झिल्ली इलेक्ट्रोडायनामिक्स (बी) की ट्रैकिंग की अनुमति दी जा सके। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्र 12: छह बहाली के बाद एपी रिकॉर्डिंग. एपी waveforms एक ही अच्छी तरह से से 12 इलेक्ट्रोड भर में एक साथ दर्ज की गई 10 s के बाद electroporation प्रदर्शित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्र 13: एकाधिक पुनर्स्थापनाओं से APD पैरामीटर हिस्टोग्राम. व्यक्तिगत तरंग APD30 (ए), APD80 (बी), त्रिकोणीयन (APD80] APD30) (सी) और आंशिक लघुकरण के लिए वितरण भूखंडों ( (एपीडी80$APD30) / (D) प्रदर्शित होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फाइलें. वीडियो 1-3. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इन वर्षों में एमईए का प्रयोग उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन करनेके लिए उत्तेजक कोशिकाओं के एफपी मापन को करने तक सीमित रहा है 36,37,38,39. केवल कुछ समूहों ने कस्टम एमईए आधारित प्रौद्योगिकी18,29,30का उपयोग करके इलेक्ट्रोजेनिक कोशिकाओं से एपी निशानों की सूचना दी है . तथापि, इन्हीं तैयारियों से बार-बार रिकॉर्डिंग करने के लिए इन तरीकों की जांच नहीं की गई है। हम एक साथ कई HIPSC-CM नेटवर्क में दिन में एक ही सेल साइट से एपीएस का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव और सटीक पद्धति विकसितकी 3. हमारे प्रकाशित अध्ययन में, एक multiwell सूक्ष्म सोने विदेश गया मंच उच्च परिशुद्धता के साथ hiPSC-सीएम संस्कृतियों के कई बैचों से एपी तरंग पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया था और 1 के एक अस्थायी संकल्प के साथ. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उच्च throughput एपी रिकॉर्डिंग के लिए syncytial मुख्यमंत्री नेटवर्क के कुशल विकास के लिए सरणी पर hiPSC-सीएम के बीज की व्याख्या करता है. प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) क्रायोप्रेक्षण बैंकिंग के लिए गुणवत्ता नियंत्रित मुख्यमंत्री के कई उच्च शुद्धता बैचों का उत्पादन, 2) पूर्व चढ़ाना और परिपक्वता के लिए अत्यधिक व्यवहार्य पोस्ट-थॉव सीएम, 3) मुख्यमंत्री के लिए multiwell MEA प्लेट के उपचार सीडिंग, 4) HIPSC-सीएम संस्कृति विभाजन 30 दिनों के बाद MEA चढ़ाना के लिए भेदभाव, और 5) कई पुन: उपयोग के लिए MEAs की बहाली.

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि HIPSC भेदभाव में बैच-टू-बैच भिन्नता प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकती है। विभेद की मोनोलेयर विधि को उच्च प्रतिशत कार्डियोमायोसाइट उत्पादन3,40के लिए घर में अनुकूलित किया गया था . हमारी संस्कृतियों के MLC2v और TNNT2 मार्करों के FACS विश्लेषण एक $90% वेंट्रिकुलर की तरह phenotype3प्रदर्शित करता है. इन गुणवत्ता नियंत्रित संस्कृतियों प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए cryopreserved हैं. वर्तमान विभेदन दृष्टिकोण नोडल के एक विषम मिश्रण उपज- एट्रियल - और निलय की तरह कोशिकाओं3,16,17,41. इसलिए, मुख्यमंत्री उपप्रकार जनसंख्या संवर्धन के लिए नियोजित रणनीतियों आगे संस्कृतियों की विशिष्टता में सुधार कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण उनकी परिपक्वता बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है. यहां प्रस्तावित तरीकों को अन्य मुख्यमंत्री स्रोतों के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।

एमई का उपयोग कर दर्ज की गई एपी waveforms ऑप्टिकल मानचित्रण42,43, पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक आधारित एमई 18,21, और नकली एपी द्वारा कार्डियोमायोसाइट्स के नेटवर्क से दर्ज उन लोगों के समान थे FP रिकॉर्डिंग20का उपयोग कर | MEA Hai और Spira25 के माध्यम से एपी माप के तंत्र को संबोधित करने के लिए प्रदर्शन किया है कि इलेक्ट्रोपोर-इलेक्ट्रोड इंटरफ़ेस स्थापित तेज ग्लास microelectrode तकनीक की नकल. हालांकि, हमारे अध्ययन में आराम झिल्ली क्षमता और सही आयाम मूल्यों को यह देखते हुए स्थापित नहीं किया जा सकता है कि विदेश में विद्युतमंडल-इलेक्ट्रोड इंटरफ़ेस calibrated नहीं है, और आयाम संवेदनशीलता और संकल्प का एक समारोह है तकनीक. हमारे दृष्टिकोण ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए इसी तरह की सीमाओं के शेयरों जब यह एपी आयाम की बात आती है.

मल्टीवेल एमईए-आधारित एफपी/एपी readouts यहाँ दवा सुरक्षा आकलन के लिए नई संभावनाएं खुली सूचना दी. हालांकि सहज, इन HIPSC-CM monolayers लगातार दरों पर हराया. एकाधिक नेटवर्कों में APD पैरामीटरों का विश्लेषण विद्युत विषमता पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है (चित्र 13)। तथापि, व्यापक एपीडी पुनरास्थापन विश्लेषणों में पूर्ववर्ती डायस्टोलिक अंतरालों को शामिल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, 96 एच से अधिक एक ही सेल साइट से दर्ज उच्च गुणवत्ता वाले एपी तरंग रूपों (चित्र 11ख) समय के साथ झिल्ली इलेक्ट्रोडायनामिक्स को ट्रैक करने के लिए पहली रिपोर्ट है जो विकास और रोग में मूल्य की होगी।

एपी पैरामीटर की मात्रा निर्धारित करने के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल यौगिकों का परीक्षण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में हालही में एडवर्ड्स एट अल 3 द्वारा रिपोर्ट, norepinephrine की खुराक प्रतिक्रिया, आइसोप्रोटेरेनॉल और ई 4031 विभिन्न पुनर्करण चरणों में APD के लिए साजिश रची हैं. प्रकाशित अध्ययन सटीकता और वास्तविक समय में एपी waveforms में खुराक पर निर्भर सूक्ष्म परिवर्तन की पहचान के लिए दृष्टिकोण की विश्वसनीयता का प्रदर्शन किया. इस तकनीक को आसानी से विभिन्न electrophysiological प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए अन्य यौगिकों या छोटे अणु पुस्तकालयों के लिए बढ़ाया जा सकता है.

इस अध्ययन में प्रस्तुत एपी माप के लिए विदेश राज्य अमेरिका आधारित दृष्टिकोण न केवल इलेक्ट्रोफिजियोलोजिस्ट के लिए बल्कि सेल जीवविज्ञानियों और इन-सिलिको मॉडलर्स के लिए भी ब्याज की होगी। इसके अलावा, HIPSC-सीएम पर एक ही सेल साइट से FP/AP रिकॉर्डिंग शोधकर्ताओं को समय की एक छोटी अवधि के भीतर उत्तेजक सेलुलर नेटवर्क की विस्तृत सरणी की bioelectric डेटा पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए सक्षम हो जाएगा. इन संसाधनों की उपलब्धता दवा खोजों और रोग मॉडलिंग के लिए मूल्यवान होगी।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

कोई नहीं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Sigma Aldrich A6964-100ML cell dissociation solution
Acquisition software Multichannel Systems Multiwell-Screen v 1.9.2.0
B27 Supplement ThermoFisher 17504-044 CM media supplement
Converter software Multichannel Systems MultiChannel DataManager
DMEM/F12 ThermoFisher 11330-032
D-PBS ThermoFisher 14190-250
FBS Fisher Scientific SH3007103HI
Fibronectin Sigma Aldrich F1141-5MG
Geltrex ThermoFisher A1413202 coating substrate
Interface board Multichannel Systems MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board
Multiwell MEA Plate Multichannel Systems 24W300/30G-288
RPMI 1640 ThermoFisher 11875-093 CM base medium
Terg-a-zyme Sigma Aldrich Z273287-1EA enzymatic detergent
Transfer pipettes, individually wrapped Fisher Scientific 1371148
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154-100ML
Ultrapure sterile water ThermoFisher 10977-023
6-well tissue-culture treated plates Fisher Scientific 08-772-1B

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References

  1. Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
  2. Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
  3. Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  4. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  5. Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726 (2016).
  6. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  7. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
  8. Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
  9. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  10. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  11. Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
  14. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  15. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  16. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  18. Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
  19. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
  20. Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
  21. Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
  22. Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
  23. Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
  24. Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
  25. Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
  26. Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
  27. Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
  28. Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100 (2015).
  29. Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110 (2016).
  30. Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206 (2014).
  31. Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
  32. Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
  33. Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
  34. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
  35. Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
  36. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  37. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
  38. Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
  39. Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
  40. Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
  41. Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
  42. Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
  43. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).

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बार-बार कार्रवाई की क्षमता वाली रिकॉर्डिंग के लिए मल्टीवेल माइक्रो-इलेक्ट्रोड ऐरे पर मानव iPSC-Derived Cardiomycye नेटवर्क
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Zlochiver, V., Kroboth, S. L., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings. J. Vis. Exp. (149), e59906, doi:10.3791/59906 (2019).

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