Summary
Denna artikel innehåller en uppsättning protokoll för utveckling av Human inducerad pluripotenta stamcells-derived cellen (hipsc-cm) nätverk odlade på multispot MEA plattor för att reversibelt elektroporate cellmembranet för åtgärder potentiella mätningar. Inspelningar med hög kapacitet erhålls från samma cell platser upprepade gånger under dagar.
Abstract
Hjärt säkerhets screening är av största vikt för läkemedels upptäckt och Therapeutics. Därför är utvecklingen av nya hög genomströmning elektrofysiologiska metoder för hipsc-derived cellen (hipsc-cm) preparat välbehövligt för effektiv drogtester. Även om multielektrod matriser (MEAS) används ofta för fält potentiella mätningar av retbara celler, en nyligen publikation av Joshi-Mukherjee och kollegor beskrev och validerade sin ansökan om återkommande åtgärder potentiella (AP) inspelningar från samma hiPSC-CM förberedelse över dagar. Syftet är att tillhandahålla detaljerade steg-för-steg-metoder för seedning av CMs och för mätning av AP-vågformer via elektroporation med hög precision och en temporala upplösning på 1 μs. Denna metod tar upp bristen på lättanvända metoder för att få intracellulär åtkomst för hög genomströmning AP mätningar för tillförlitlig elektrofysiologiska undersökningar. Ett detaljerat arbetsflöde och metoder för plätering av hipsc-CMS på multispot MEA plattor diskuteras betona kritiska steg där det är relevant. Dessutom rapporteras ett specialbyggt MATLAB-skript för snabb datahantering, extraktion och analys för omfattande utredning av våg Forms analysen för att kvantifiera subtila skillnader i morfologi för olika AP-varaktighets parametrar som är inblandade i arytmi och kardiotoxicitet.
Introduction
Humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (hipsc-CMS) är den gyllene standarden för ett ökande antal laboratorier1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Att slå embryoida kroppar11,12,13 och enskiktslager3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 differentiering är de föredragna metoderna för kardiomyocyte produktion och multielektrod array (MEA) har blivit en gemensam modalitet för övervakning av elektrodynamiken i dessa nät18,19,20. Medan parametrar som kan extraheras från fältpotentialer (FPS) såsom svävningshastighet, amplitud, varaktighet och RR intervall är baslinjen elektrofysiologiska svar på spontant slå enskiktslager18,21, 22,23, de åtgärder potentiella (AP) komponenter bakom dessa extracellulära FP-signaler är svåra att extraräkna24. Vår senaste publikation om upptäckten av en tillämpning av MEAS för direkta återkommande AP mätningar ger bevis på metodik för exemplariska intracellulära AP avläsning med en omfattande vågform analys vid olika repolarisering faser över flera partier av hiPSC-härledda kardiomyocyte nätverk3. I studien visade vi att leveransen av elektroporerande pulser till nätverk av hiPSC-härledda kardiomyocyter möjliggör intracellulär åtkomst för AP-inspelningar. Dessa transienta AP-inspelningar är beroende av transmembranpotentiella återvinningar som observerats genom skadestället3,25,26. Vågformer inspelade via MEA och patch-klämma i vår studie visade liknande AP morfologier därmed validera tillförlitligheten i metoden3.
Några laboratorier har rapporterat Mät APS från olika elektrogena celler med hjälp av specialbyggda MEAS18,21,26,27,28,29, 30, men tillförlitligheten i att använda MEAs för konsekventa och återkommande AP-mätningar bedömdes inte. För närvarande är Gold Standard patch-Clamp teknik begränsad till Terminal Recordings7,31 medan MEA-baserade AP-mätningar är övergående och kan därför utföras flera gånger i samma cell. Vi visar också att man enkelt kan spela in högkvalitativa AP-signaler i millivolt-området som kräver minimal filtrering. Forskarna kan därför inte bara genomföra akuta men också kroniska läkemedels studier i samma preparat med hjälp av MEAs. Dessutom tillåter denna teknik samtidig FP/AP-mätning genererar Electro-Biome bibliotek på kort tid. Med tanke på den ökande betoningen på arytmi prediktion och läkemedelsrelaterade kardiotoxicitet24,32,33,34,35, integration av AP-mätning strategier för att förbättra läkemedelssäkerheten och effektivitets bedömningarna.
Här presenterar vi protokoll för 1) förplätering av nedfrysta hipsc-CMS för mognad, 2) Dissocierande och plätering av hipsc-CMS på multispot MEAS, 3) inspelning av fps och APS från hipsc-cm nätverk, 4) segmentera och extrahera data för analys, och 5) återställa matriser för flera återanvändning. Varje steg har optimerats med betoning på kritiska steg där det är relevant. Krav för cell fäste för att säkerställa en stryk syncytial enskiktslager diskuteras och förfaranden för multispot MEA restaurering för repetitiva elektrofysiologiska studier förklaras. Slutligen, ett anpassat GUI som utvecklats i laboratoriet presenteras för AP signal utvinning, kvalitetssäkring, och segmentering arbetsflöde för att kvantifiera och analysera AP parametrar.
Protocol
1. beredning av lösningar och material (se tabell över material)
-
6-väl vävnad-kultur plattan substrat-beläggning
- Tina beläggnings underlaget på is eller vid 4 ° c.
- Förbered ett 1:100 beläggnings substrat utspädning i kallt DMEM/F12 medium. Blanda lösningen genom långsam pipettering.
- Överför 2 mL av beläggnings substratlösningen (steg 1.1.2) per brunn på en 6-och vävnads odlings platta.
- Placera omedelbart den belagda vävnads odlingsplattan i cellkulturens inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 i minst 7 timmar och Använd inom 7 dagar.
-
hiPSC-CM odlingssubstrat
- Tillsätt 10 mL CM Media tillägg tinat vid 4 ° c till 500 mL CM bas medium. Förvaras vid 4 ° c i upp till 2 veckor.
- Alikvot erforderlig mängd media för dagen och tillföra rumstemperatur före användning.
- hiPSC-CM upptinning medium: Förbered färskt genom att blanda hiPSC-CM odlingssubstrat (steg 1,2) med 10% foster bovint serum (FBS). Ta mediet till rumstemperatur före upptining av CMs för upphängning.
- Fibronectin 1 mg/mL stamlösning: alikvot 200 μL i 1,5 mL sterila mikrofugerör och förvaras vid 4 ° c för senare användning. Förbered arbetslösning av 50 μg/mL koncentration nyligen på is.
- Multiwell rengöringslösning: kombinera 0,5 g enzymatisk tvättmedel med 50 mL sterilt dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Virvel för att blanda innehållet. Filtrera och förvara vid 4 ° c i upp till en vecka.
2. förplätering av kryopreserverad hiPSC-CM för mogning (figur 1)
Anmärkning: detta avsnitt är avsett för upptining och odling av hipsc-CMS som differentierades med hjälp av den matar fria enskiktslager-metoden3,16 och nedfrysta i flytande kväve 10 dagar efter differentiering på 1-2 miljoner celler/injektionsflaska. Celler från en injektionsflaska är pläterade i två substrat-belagda brunnar av en 6-well vävnadsodling plattan. Kardiomyocyter tenderar att bosätta sig på botten av röret så mild blandning vid tidpunkten för förplätering är viktigt för att uppnå även celltäthet över brunnar.
- Alikvot 2 mL FBS per injektionsflaska med hiPSC-CMs tinats i ett 15 mL koniskt rör och tillföra rumstemperatur.
- Tina injektionsflaskor med nedfrysta hipsc-CMS genom att placera dem i en 37 ° c vattenbad och snurra försiktigt för även upptining för inte mer än 3 min.
- Överför omedelbart innehållet i injektionsflaskan till röret som innehåller FBS (se steg 2,1), blanda genom att snurra och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 mL hiPSC-CM upptinande medium (se steg 1,3) per injektionsflaska upptinad. Använd en överföringspipett för att Omsuspendera pelleten genom skonsam triturering. Bedöma cellernas lönsamhet.
- Tillsätt ytterligare 3 mL upptining medium per injektionsflaska med hiPSC-CM tinat i steg 2,4 och suspendera försiktigt med en överföringspipett för att ytterligare separera cell klumpar.
- Fördela 2 mL av cellsuspensionen försiktigt i varje brunn av substrat-belagda 6-well plattor (se steg 1,1). Plats i cellkulturens inkubator vid 37 ° c och 5% CO2.
- Ersätt med färskt hiPSC-CM odlingssubstrat efter 24 h och 3 gånger i veckan därefter i 20 dagar.
Obs: celler ska följa substrat beläggningen med 24 h och slå spontant vid 48 h efterplätering (se video 1 och video 2).
3. sterilisering och beläggning av Multiwell-MEA-plattor (figur 2 och figur 3)
Anmärkning: det protokoll som beskrivs här är för att förbereda 24-well MEA plattor med 12 Micro Gold PEDOT-belagda elektroder på glas för hiPSC-CM plätering. Undvik att vidröra bottenplattan eftersom det kan skada elektroderna.
- Två dagar före cellplätering, tillsätt 0,5 mL hiPSC-CM odlingssubstrat (se steg 1,2) till varje brunn och utföra en baslinje inspelning för att kontrollera signal-brus-förhållande för kvalitetskontroll av MEAs.
- Aspirera på mediet, skölj med sterilt ddH2O och sterilisera i UV-ljus inuti en laminärt flödeshuv över natten.
- Dagen före cellplätering, tillsätt 0,1 mL FBS till varje brunn för hydrofila behandling av MEA ytor. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Det här steget är nödvändigt för cell bilaga.
- Aspirera FBS och skölj med 0,5 mL sterilt ddH2O per brunn. Upprepa en gång till.
- Låt plattan torka i laminärt flödeshuv över natten.
- Bered en arbetsutspädning på 50 μg/ml Fibronektin i kallt DMEM/F12-medium från lagret (se steg 1,4). Håll lösningen på is.
- Pipettera över 5 μl av den arbetande Fibronektin-spädningen (se 3,6) och fördela försiktigt droppet till mitten av varje brunn för att täcka alla 12 elektroder. Det är viktigt att arbeta snabbt över de 24 brunnarna för att förhindra att droppet torkar.
- Placera omedelbart den fibronectin-belagda multispot MEA-plattan på en upphöjd yta inuti en fuktande kammare som innehåller steril DDH2O för att täcka hela disk ytan. Placera kammaren med multispot MEA-plattan i 3 timmar i cellkulturens inkubator.
Anmärkning: att placera 24-brunnen MEA-plattan i en fuktande kammare är avgörande för att förhindra att Fibronektin droppar torkar ut under inkubationstiden.
4. hiPSC-CM dissociation och plätering på Multiwell MEA plattan (figur 3)
Anmärkning: starta detta steg om 1 h innan MEA Fibronektin inkubering är klar. Se till att cell dissociation Solution är vid 37 ° c och iPSC-CM upptining mediet är i rumstemperatur. Dissociation metoder har optimerats för 30 dagar efter differentierade hiPSC-CMs odlade på substrat-belagda 6-well plattor (se steg 2) för att få cirka 90% livskraftig CMs för MONOPLÄTERING. Försiktighet bör iakttas inte för att införa luftbubblor medan sönderdelning för att förhindra celldöd.
- Aspirera kultur mediet från varje brunn av 6-och vävnadskultur skålen med 30 dag efter differentierade hiPSC-CM kultur (se steg 2,7) och tvätta med 2 mL steril D-PBS per brunn.
- Tillsätt 1 mL förvärmda cell dissociationslösning (se tabell över material) per brunn och inkubera i 4 min vid 37 ° c. Använd en överföringspipett för att försiktigt triturera för att lossa celler för dissociation. Om de flesta av cellerna är fortfarande anhängare, inkubera i ytterligare 3 min vid 37 ° c och hackad igen. Denna ytterligare inkubering bör bidra till maximal cell återhämtning. Inkubera inte i mer än 7 minuter eftersom detta kan resultera i låg cellviabilitet.
- Använd en överföringspipett och koppla alla separerade celler till ett koniskt rör som innehåller hiPSC-CM upptinande medium (se steg 1,3). Det rekommenderas att avbryta cellerna i minst dubbelt så mycket media (2 mL per brunn som skördats) för att blockera aktiviteten av cell dissociation lösning.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min.
- Aspirera lösningen noggrant eftersom pelleten är löst knuten till ytan och omsuspenderas i 0,1 mL hiPSC-CM upptinande medium. Använd en överföringspipett för att Omsuspendera pelleten några gånger genom skonsam trituration.
- Alikvot 2 μl separerade celler och späd med 18 μl media i en 1,5 ml mikrofugrör tub. Tillsätt 20 μL Trypan Blue och blanda för cellräkning och lönsamhetsbedömning.
- Justera CELLTÄTHETEN till 6 000 celler/μL genom att tillsätta lämplig volym hiPSC-CM upptinande medium. Suspendera pelleten genom att mjuka snärta några gånger. Den hiPSC-CMs lätt lossnar från glasytor speciellt vid pläterad vid höga densiteter. Vi har optimerat sådd densitet och plätering villkor för att uppnå 15 dagar av elektriska inspelningar.
- När du är klar, ta med multispot MEA plattan i laminärt Flow Hood för cell sådd. Det är viktigt att utföra följande två steg en väl i taget för att förhindra Fibronektin från torkning.
- Ta försiktigt bort Fibronektin-droppet med en P10-pipett utan att vidröra elektroderna.
- Dispensera omedelbart en 5 μL cell droppe (30 000 celler) till mitten av brunnen på MEA-plattan som täcker alla 12 elektroder. Upprepa steget tills alla 24 brunnar är pläterade. Intermittent blandning av cellsuspension genom snärta rekommenderas.
- Placera multispot MEA plattan i den löst täckta befuktnings kammaren och återvänd till cellkulturens inkubator vid 37 ° c och 5% Co2 för 3 h för cell infästning.
- Tillsätt försiktigt 200 μL hiPSC-CM upptinande medium till varje brunn utan att störa cellerna med en P200-pipett. Lägg till media droppvis på sidan av brunnen.
- Sätt tillbaka multispot MEA-plattan i cellkulturens inkubator.
- Ersätt med färska hiPSC-CM kultur medium vid 24 h efter plätering. Spontan misshandel av kardiomyocyter kan observeras vid denna punkt (se video 3).
- Ändra Media varje 2 dagar till slutet av experiment.
5. hipsc-cm elektroporation och signal förvärv (figurerna 4 – 6)
Anmärkning: detta protokoll är för samtidig inspelning av hög genomströmning elektrod signaler (12 platser för var och en av de 24 brunnar). Det 24-och multispot MEA-systemet används med förvärvs programvaran (se tabell över material). Alla MEA inspelningar utförs vid 37 ° c.
- Slå på gränssnittskortet och initiera förvärvs programvaran. Låt multispot MEA-headstage ha tillräckligt med tid för att nå 37 ° c-temperaturen (se pil nr 1 i figur 4).
- Sätt in multispot MEA-plattan från steg 4 i multispot MEA-headstage genom att placera den täckt över inspelnings plattformen och klicka på knappen Infoga (se pil nr 2 i figur 4). Låt temperaturen stabiliseras innan inspelningen påbörjas.
-
Justera inställningar för förvärv och elektroporation
- Klicka på ikonen definiera experiment flöde (se pil 3 i figur 4) och Ställ in inspelningstiden på 2 min eller efter önskemål.
- Klicka på ikonen data insamlings inställning (se pil nr 4 i figur 4) och Ställ in samplingsfrekvens på 20 kHz, högpassfilter till 0,1 Hz och lågpassfilter till 3500 Hz.
- Klicka på ikonen för stimulator-inställningar (se figur 5). Under fliken stimulus definition definierar du stimulering som bifasisk symmetrisk spännings pulser på 1 MV, 1 MS och 1 Hz. Under fliken stimuleringelektroder , Välj elektroporationssajter genom att markera alla relevanta elektroder.
- Klicka på knappen utforska för att visualisera signaler i alla brunnar. Kontrollera signalkvalitet och steady state-förhållanden. Anteckna på elektroder med FP-signaler i mV-intervallet. Klicka på samma knapp för att stoppa utforskandet. Inga data har registrerats fram till denna punkt.
- Starta inspelningen genom att klicka på knappen gå! . Elektroderna i varje brunn kommer att Visa FP-signaler i RAW data-fönstret (figur 6). Efter 30 s av inspelningen, klick på det stimulera knapp och tillåta elektroporation till äga rum på det valde tomten för 30 s; Klicka sedan på samma knapp för att stoppa stimulering och fortsätta inspelningen för de återstående 60 s.
Obs: den inspelade filen kan spelas upp genom att byta till "Replayer mode" i "ansökan" rullgardinsmenyn.
6. Multiwell MEA tallrik rengöring för återanvändning
- Efter slutliga experiment, rengör alla brunnar i multispot plattan av aspirera alla mediainnehåll från varje brunn och försiktigt undvika att vidröra elektrod ytan.
- Tillsätt 1 mL sterilt ddH2O per brunn. Aspirera och upprepa en gång.
- Tillsätt 0,3 ml multispot rengöringslösning (se steg 1,5) per brunn. Inkubera över natten vid rumstemperatur för att få bort celler och skräp.
- Följande morgon, aspirera på lösningen och skölj med 1 mL sterilt ddH2O. inkubera i 5-7 min och aspirera. Upprepa 5 gånger.
- Tillsätt 0,5 mL sterilt ddH2O per brunn. Anteckna baslinjen för den rengjorda multispot-plattan för kvalitetskontroll av de rengjorda MEAS (figur 7).
- Förvaras vid 4 ° c tills det är färdigt att användas.
7. konvertering och export av data fil
Obs: fyra datafiler kommer att genereras för varje inspelning: MWR, MWC, MWD och MWS filer. Med hjälp av konverteringsprogramvaran kan MWD-filen konverteras till H5-fil för efterföljande analys med hjälp av specialbyggda skript (se kompletterande fil 1).
- Initiera omvandlarens programvara (se tabell över material).
- Välj Ange inmatnings Sök väg på Arkiv -menyn. Välj mapp som innehåller datafiler av intresse.
- Välj Ange utmatnings Sök väg på Arkiv -menyn. Välj mapp där konverterade filer ska sparas.
- Markera MWD-fil av intresse.
- Klicka på knappen Exportera till hdf5 .
8. segmentering och analys av data (diagram 8-10)
MATLAB-baserade anpassade program används för att segmentera och extrahera olika FP och AP data parametrar. Programvara finns tillgänglig på begäran.
- Kör våg Forms analys koden med MATLAB (se figur 8 för en vy av GUI: s huvudfönster).
- Klicka på Arkiv och välj process. H5.
- Hitta och välj filen MWD. H5 som skapats enligt steg 7 ovan.
- Klicka på knappen Spara katalog för att ändra lagringsplatsen för utdatafilerna.
- Skapa en signalbearbetning kö genom att välja elektrod/väl kombinationer av intresse och sedan klicka på knappen kö . Upprepa det här steget om du vill lägga till fler elektrod-/bra kombinationer som ska bearbetas till kön.
- Redigera kön genom att klicka direkt på med-namn/med-koncentration om celler behandlades med läkemedel (figur 8).
- När kön är slutgiltig klickar du på knappen initiera vågformer . Detta kommer att starta den preliminära bearbetningen i vilken signaler identifieras och extraheras för segmentering.
- Klicka på knappen Zooma in och välj den åtgärdspotentiella intresseområdet med markören (bild 9).
- Klicka på knappen Behåll och granska panelerna. Toppar (röda "x") och tråg (gula cirklar) upptäcks för varje vågform och normaliserade åtgärder potentialer överlagras. Klicka på knappen Behåll och gå vidare till nästa spår i kön (Bild 10).
- Upprepa steg 8.8 till 8,9 för resten av elektrod-/väl kombinations signalerna i kön.
Obs: en CSV -fil kommer att genereras med APD parametrar mätt för varje vågform. En . mat -fil för varje . H5 -fil sparas också för att tillåta ytterligare bearbetning av segmenterade data.
Representative Results
Livsdugligheten och pläteringen tätheten av post-Thawed hipsc-CMS är kritisk för multispot MEA kultur. Förplätering av 1-2 miljoner hipsc-CMS/flaska i två brunnar i en 6-well vävnad kultur tallrik med 50% eller större lönsamhet kommer att producera en hälsosam enskiktslager kultur med spontan slog på 48 h. dålig lönsamhet för CMS kommer att resultera i kulturer med en hög andel icke-myocyte populationer. Dessa enskiktslager när dissocieras för multispot MEA plätering i allmänhet ger inkonsekventa resultat och dålig kvalitet signaler och därför bör kasseras. Figur 1 visar exempel på optimala vs. suboptimala Hipsc-CMS kulturer på 48 h postplätering. Upptinning CMS på substrat-belagda vävnad kultur plattor snarare än direkt på multispot MEAS, möjliggör cell återhämtning och mognad3. Direkt plätering av nedfrysta CMS på matrisen rekommenderas inte eftersom det producerade inkonsekventa resultat.
Förutom kvaliteten på den separerade CMS, är cell Attachment på multispot MEA mycket beroende av celltäthet och Fibronektin beläggningsteknik. Storleken på Fibronektin-dropleten är kritisk eftersom CMS kommer att överensstämma med gränserna för det Fibronektin-belagda området. Av denna anledning dispenseras endast 5 μl av Fibronektin-lösningen direkt över elektrod området. För att säkerställa att dropp inte skingras, måste brunnen ytan vara helt torr vid tidpunkten för beläggningen. Figur 2 visar layouten för multispot MEA plattan med schematiska steg-för-steg förbehandling för optimal beredning. För att förhindra att Fibronektin torkar ska multispot MEA-plattorna placeras inuti en fuktande kammare under inkubationstiden som inte varar mer än 3 timmar (se steg 3,8). När inkubationstiden är klar, är det viktigt att ta bort Fibronektin DROPP från varje brunn strax före cm plätering och först därefter gå vidare till nästa brunn plätering. Att arbeta snabbt och försiktigt dispensering av CMs är nyckeln till framgångsrik cell attachment.
hipsc-cm kulturer vid 30 dagar efter differentiering dissocieras för multispot MEA plätering med hjälp av enzymatisk cell dissociation metod (se steg 4). CMS kommer att fästas på de fibronectin-belagda MEA-ytorna med 3 h och en enskiktslager som täcker matriserna kommer att vara synlig efter 24 h efterplätering (figur 3). Synkron svävning av enskiktslager kommer att observeras vid 24-48 h. cell dropp spridning kommer att påverka kulturen densitet eller ens leda till torkning och celldöd. Exakt cell placering direkt på matrisen är av yttersta vikt och därför tekniken måste praktiseras för optimal plätering. Cellernas vidhäftning till referenselektroden kommer att hindra elektrisk signal produktion. Se figur 3 för bilder av optimal cm placering, och kultur efter 24 h.
CMS odlade på multispot MEAS utsätts för kvalitetskontroll för elektrisk aktivitet på 48 h efterplätering. Typiskt, FP signal amplitud ökar från μV intervallet till mV i cirka 4 dagar3. Om 50% av elektroderna inom ett nätverk och 70% av de totala näten inte producerar FP-signaler, är nätverket eller kulturen suboptimala och bör kasseras. Endast kulturer som klarar kvalitetskontrollen behandlas för FP-och AP-analys. Figur 6 visar exempel på bra och UNDERMÅLIGA FP-signaler.
Electroporation-medierad AP inspelningar kan erhållas flera gånger från kulturer 48 h post-MEA plätering. Anställa Electroporation, vi fick intracellulära tillgång till rekordhög upplöst APs från flera hiPSC-derived kardiomyocyte nätverk. Lågspännings pulser (1 V, 1 MS, 1 Hz) för 30 s levererades för övergående, reversibel omvandling av FP till AP. Den elektroporation Tillåt framgångsrik intracellulär tillträde för AP mättning i ca 75% om elektroderna. Elektriska signaler registreras för 2 min som inkluderar 30 s pre-elektroporation, 30 s under och 1 min post-elektroporation. Ett tåg med 10 s AP vågformer 10 s post-elektroporation utvärderas på alla platser för signalkvalitet och analys. Alla spår som inte överensstämmer med ren AP-signal kasseras. För att undersöka om AP amplituder korrelerar till FP signal vi electroporated alla 288 platser att samtidigt spela vågformer. Representativa FP-och AP-signaler som spelats in från samma cell plats från två olika elektroder visas i figur 11a. Vi observerade ingen korrelation mellan FP amplituder och post elektroporation AP amplituder inspelade från samma cell plats. Dessutom hade flera elektroporeringar av samma cellsajt vid 0, 24, 48, 72 och 96 h ingen signifikant effekt på AP-formen över tid (figur 11B).
Med tanke på systemets höga genomflödande karaktär är en manuell teknik för att extrahera och kvantifiera parametrar av intresse såsom RR-intervall, momentan frekvens och differentiell åtgärd potentiell varaktighet ineffektiv och tidskrävande. Ett specialbyggt MATLAB-skript som är tillgängligt för forskarsamfundet på begäran används för att utföra våg Forms mätningar med 1 μs upplösning. Electroporation tid punkter överlagras med den extraherade signalen för att identifiera 10 s AP post-elektroporation att bedriva signal utvinning, kvalitetssäkring och segmentering arbetsflöde (figur 8, figur 9, figur 10). användargränssnittet tillåter val av önskat segment med hjälp av överlagda elektroporation indikatorer som en guide. Den segmenterade vågformen bearbetas av subrutiner för att ytterligare identifiera individuella AP-vågformer. Detta slutförs genom Peak Detection, där den högsta och lägsta spänningen identifieras för varje cykel. När den här processen är slutförd normaliseras amplituderna och associera tids vektorer flyttas för att definiera tids nollpunkt värdet 1. Interpolering av skärningspunkter längs de enskilda cyklerna användes för att bestämma APD-mätningar. Således, partiell automatisering arbetsflöde för AP vågform segmentering möjliggör effektiv dataanalys för olika APD parametrar över flera partier av kulturer i en kort tidsperiod. Ytterligare automatisering av inkludering och uteslutningskriterier för FPs och APs pågår för dataanalys i realtid.
En stor fördel med multispot MEA-plattan är att den kan återanvändas flera gånger. Denna restaurering möjliggör repetitiva elektrofysiologiska studier för kostnadseffektiv och konsekvent datainsamling. Inspelningar av APs från samma matris efter 6 restaureringar visas i figur 12. Signal-brus-förhållandet liknar över flera återanvändningar. För att påvisa tillförlitligheten av matrisen för repetitiva elektrofysiologiska studier, sammanlagt 3815 AP vågformer slås samman från tre restaurering partier och AP varaktighet data extraheras för att undersöka repeterbarheten av resultaten. Distributionsområden för individuell vågform APD30, APD80, triangulering (APD80-APD30) och fraktionerad förkortning ((APD80— APD30)/(APD80)) visas (figur 13).
Figur 1: förbordning av kryopreserverad hiPSC-cm för mognad. (A) cell bearbetning för förplätering 1 injektionsflaska med 10 dagar efter differentiering nedfrysta hipsc-CMS. (B) faskontrast bilder av framgångsrika (vänster) och misslyckade (höger) hipsc kulturer. Skalbar: 275 μm. Se video 1 och video 2 för framgångsrika 14 och 24 dagar efter differentiering kultur exempel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: installation och förberedelse av Multiwell-MEA-plattan. A) Multiwell-plattans schematik: plattan består av 24 brunnar (a1 till D6) vardera innehållande 12 mikroelektrodmatriser och 4 perifera referenselektroder. Elektrod diameter: 30 μm/Inter-elektrodavstånd: 300 μm. inspelningar kan erhållas från 288-elektroderna samtidigt. B) steriliserings-och hydrofila behandlingssteg som ska utföras före hipsc-cm-plätering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: hiPSC-cm dissociation och plätering på Multiwell MEA plattan. (A) Schematics av hipsc-cm MEA plating steg för varje brunn. B) mikroskopisk bild som illustrerar korrekt placering av cell droppar som täcker alla 12 elektroder utan att spridas till de 4 referens elektroderna. Cfaskontrast mikroskopiska bilder av en exemplarisk (vänster) och suboptimala (höger) hipsc-cm PLATTING på MEA vid 24 h efterplätering. Skalstapel = 275 μm. Se video 3 för lyckade monoplätering exempel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: programvara för att förvärva Multiwell-Screen. Pilar anger placeringen av viktiga funktioner och funktioner som refereras i texten: temperaturkontroll (1) panelen möjliggör realtids temperaturövervakning hela experimentet. Knappen Infoga/mata ut (2) aktivera och släpp Multiwell MEA-plattan. Define experimental Flow (3) funktionen tillåter användaren att ställa in varaktigheten av inspelningen. Med funktionen data insamlings inställning (4) kan användaren ange inställningarna för samplingsfrekvens och anskaffnings filter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Hipsc-cm elektroporation och signal anskaffning . Fliken stimulus definition gör det möjligt för användaren att definiera de elektroporerande puls parametrarna. Stimulering elektroder fliken tillåter användaren att välja elektroporating elektroder. Alla kombinationer av 288-elektroderna kan väljas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: kvalitetskontroll av Multiwell MEAs för elektrisk aktivitet. Multiwell-Screen förvärv programvara som visar rådata fönster med representativa exempel på optimala (a) och sub-standard (B) FP-signaler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: fp-och AP-signaler från den nya och återställda matrisen. Multiwell MEA enzymatiska rengöringssteg (a). Baslinjen signalen för den nya matrisen visar minimal signal-brus-förhållande (B) och fp-signaler visar den elektriska aktiviteten i nätverket (C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: segmentering och analys av data. Vy över GUI: s huvudfönster för vågform analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: segmentering och analys av data. Initiera våg Forms knappen för att identifiera och EXTRAHERA AP-vågformer för segmentering och för att starta den preliminära bearbetningen genom att zooma in och välja åtgärden potentiella område av intresse. Röda cirklar är de elektroporation indikatorerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: segmentering och analys av data. Toppar (röda "x") och tråg (gula cirklar) upptäcks för varje vågform och normaliserade APs överlagras för en kvalitetskontroll av vågformerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: AP-amplitud beroende av FP-signalen för flera inspelningar från samma cellplats. FP amplitud i μV intervall (a, övre vänstra panelen) eller MV intervall (a, övre högra panelen) inspelad från två oberoende elektroder producera AP amplitud i MV Range (a, nedre vänstra och högra paneler) visar ingen korrelation mellan FP amplituder och efter elektroporation AP amplituder. De normaliserade AP-vågformerna för varje inspelning läggs ovanpå som visas för varje inspelning. Flera electroporations av samma cell plats vid 0 till 96 h producerade högkvalitativa AP vågformer möjliggör spårning av membran elektrodynamik (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: AP-inspelningar efter sex restaureringar. AP-vågformer inspelade samtidigt 10 s post-elektroporation över 12 elektroder från samma brunn visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13: APD-parametern histogram från flera restaureringar. Distributionsområden för individuell vågform APD30 (A), APD80 (B), triangulering (APD 80— APD30) (C) och fraktionerad förkortning ((APD80— APD30)/(APD80)) (D) visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande filer. Videor 1-3. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Under årens lopp har tillämpningen av MEAS begränsats till att utföra FP-mätningar av retbara celler för att studera deras elektrofysiologiska egenskaper36,37,38,39. Endast ett fåtal grupper har rapporterat AP-spår från elektrogena celler med hjälp av anpassad MEA-baserad teknik18,29,30. Dessa metoder har dock inte undersökts för upprepade inspelningar från samma preparat. Vi utvecklade en innovativ och exakt metod för att studera APs från samma cell plats över dagar i flera hiPSC-CM nätverk samtidigt3. I vår publicerade studie, en multispot Micro-Gold MEA plattform var anställd för att generera AP vågform bibliotek från flera partier av hipsc-cm kulturer med hög precision och med en temporal upplösning på 1 μs. Det protokoll som beskrivs här förklarar seedning av hiPSC-CMs på matrisen för effektiv utveckling av syncytial CM nätverk för hög genomströmning AP inspelningar. Flera kritiska steg i protokollet är: 1) produktion av flera hög-renhet partier av kvalitetskontrollerat CMS för frysförvaring Banking, 2) mycket livskraftigt post-Tina CMS för förbordning och mognad, 3) behandling av multispot MEA plattan för cm seedning, 4) hiPSC-CM kultur dissociation vid 30 dagar efter differentiering för MONOPLÄTERING, och 5) restaurering av MEAs för flera återanvändning.
Det är viktigt att notera att variation av sats-till-sats i hiPSC differentiering kan påverka experimentella resultat. Den enskiktslager differentierings metoden var optimerad in-House för hög procent kardiomyocyte produktion3,40. FACS analys av MLC2v och TNNT2 markörer av våra kulturer visar en ≥ 90% ventrikulär-liknande fenotyp3. Dessa kvalitetskontrollerade kulturer är kryopreserverade för experimentella studier. Den nuvarande differentierings metoder ger en heterogen blandning av nodal-, förmaks-och ventrikel-liknande celler3,16,17,41. Därför, strategier som används för CM subtyp befolkning berikning kan ytterligare förbättra specificiteten av kulturerna. Dessutom kan vävnadstekniska metoder användas för att förbättra deras mognad. De metoder som föreslås här kan enkelt implementeras för andra CM källor.
De AP-vågformer som registrerats med hjälp av MEA liknade dem som registrerats från nätverk av kardiomyocyter genom optisk mappning42,43, kompletterande metalloxid halvledare-baserad MEA18,21och simulerad AP använda FP Recordings20. För att ta itu med mekanismen för AP-mätningar via MEA Hai och spira25 visade det att elektroporelektrod gränssnitt härma den etablerade skarpa glas mikroelektrod tekniken. Det går dock inte att fastställa vilmembranpotentialen och de sanna amplitudvärdena i vår studie med tanke på att elektroporelektrodgränssnittet i MEA-system inte är kalibrerat och att amplituden är en funktion av känsligheten och upplösningen hos Teknik. Vår strategi delar liknande begränsningar för optisk mappning när det gäller AP-amplitud.
De multispot MEA-baserade FP/AP-utläsningar rapporterade här öppna nya möjligheter för läkemedels säkerhetsbedömning. Även spontant, dessa hipsc-cm enskiktslager Beat i konstant takt. Analys av APD parametrar i flera nätverk ger insikt om elektrisk heterogenitet (figur 13). Omfattande APD-restitutionanalyser måste dock innefatta föregående diastoliska intervaller. Dessutom är högkvalitativa AP-vågformer inspelade från samma cell plats över 96 h (figur 11B) den första rapporten för att spåra membran elektrodynamik över tid som kommer att vara av värde i utveckling och sjukdom.
Det protokoll som beskrivs här för kvantifiering av AP-parametrar kan användas för att generera dos-responskurvor för att testa föreningar. Som nyligen rapporterats av Edwards et al.3, dos svar av noradrenalin, isoproterenol och E 4031 ritas för APD på olika repolarisering faser. Den publicerade studien visade på noggrannheten och tillförlitligheten i tillvägagångssättet för identifiering av de dosberoende subtila förändringarna i AP-vågformerna i realtid. Denna teknik kan lätt förlängas för andra föreningar eller små molekyl bibliotek för att förstå olika elektrofysiologiska svar.
Det MEA-baserade tillvägagångssättet för AP-mätningar som presenteras i denna studie kommer att vara av intresse inte bara för Elektrofysiologer utan även för cellbiologer och in-silico- Modellerare. Vidare, FP/AP inspelningar från samma cell plats på hipsc-CMS gör det möjligt för forskare att generera bioelektriska Databibliotek av brett spektrum av retbara cellulära nätverk inom en kort tidsperiod. Tillgängligheten av dessa resurser kommer att vara värdefullt för läkemedels upptäckter och sjukdomsmodellering.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
| Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
| Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
| D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
| Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
| Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
| Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
| Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
| 6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |
References
- Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
- Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
- Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726 (2016).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
- Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
- Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
- Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
- Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
- Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
- Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
- Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100 (2015).
- Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110 (2016).
- Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206 (2014).
- Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
- Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
- Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
- Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
- Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
- Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
- Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
- Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
- Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
- Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
