Summary
Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISLMN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.
Abstract
Os movimentos de olho exatos são cruciais para a visão, mas o desenvolvimento do sistema do motor da ocular, especial as vias moleculars que controlam a orientação do AXON, não foi elucidado inteiramente. Isto é em parte devido às limitações técnicas de ensaios tradicionais da orientação do AXON. Para identificar indicações adicionais da orientação do AXON que influenciam o nervo oculomotor, um ensaio ex vivo da fatia à imagem o nervo oculomotor no tempo real enquanto cresce para o olho foi desenvolvido. E 10.5 ISLMN-os embriões de GFP são usados para gerar fatias ex vivo incorporando os no agarose, cortando em um vibratome, então crescendo os em uma incubadora do estágio-parte superior do microscópio com photomicroscopia do tempo-lapso para 24-72 h. fatias de controle recapitulam o tempo in vivo de crescimento de axônios do núcleo para a órbita. Os inibidores da molécula pequena ou as proteínas de recombinação podem ser adicionados aos meios de cultura para avaliar o papel de caminhos diferentes da orientação do AXON. Este método tem as vantagens de manter mais do microambiente local através do qual os axônios atravessam, não axotomizing os axônios crescentes, e avaliando os axônios em vários pontos ao longo de sua trajetória. Ele também pode identificar efeitos em subconjuntos específicos de axônios. Por exemplo, a inibição de CXCR4 provoca axônios ainda dentro do midbrain para crescer dorsalmente ao invés de ventralmente, mas axônios que já saíram ventralmente não são afetados.
Introduction
O sistema do motor da ocular fornece um sistema elegante para investigar mecanismos da orientação do AXON. É relativamente uncomplicated, consistindo em três nervos cranianos que inervam seis músculos extraocular (eoms) que movem o olho, e os da labii superioris do do levator (LPs) que levanta a pálpebra. O nervo oculomotor inerva os LPS e quatro EOMs-o oblíquo inferior e os músculos do músculo reto medial, inferior e superior. Os outros dois nervos, os troclear e os abducens, cada um somente inervam um músculo, o músculo oblíquo superior e lateral do reto, respectivamente. Os movimentos oculares proporcionam uma leitura fácil, mostrando se a inervação era apropriada, ausente ou aberrante. Adicionalmente, há uns distúrbios humanos do movimento do olho que resultam dos deficits no desenvolvimento neuronal ou na orientação do AXON, denominados coletivamente as desordens cranianas congênitas da disinervação (CCDDs)1.
Apesar destas vantagens, o sistema do motor da ocular é usado raramente em estudos2,3,4,5,6,7,8 da orientação do AXON, 9 anos de , 10, devido aos inconvenientes técnicos. Os ensaios de orientação de AXON in vitro têm muitas desvantagens11. Os ensaios da co-cultura, em que os explantes neuronal são cultivados junto com explantes do tecido do alvo12 ou as pilhas transfected13, dependem da simetria do explante e do posicionamento preciso entre o explante e o tecido do alvo. Ensaios de listra14,15, em que duas pistas são estabelecidas em listras alternadas e axônios são avaliados para o crescimento preferencial em uma listra, só indicam que um substrato é preferível ao outro, não que seja atraente ou repulsivo, ou fisiologicamente relevante. As câmaras de Microfluidics podem dar forma a Gradients químicos precisos, mas os axônios crescentes do assunto ao esforço de cisalhamento16,17,18, que podem afetar seu crescimento. Além disso, em cada uma dessas abordagens, a coleta de explantes ou células dissociadas requer que os axônios em crescimento sejam axotomizados e, portanto, esses ensaios realmente examinam a regeneração do AXON, em vez do crescimento inicial do AXON. Finalmente, essas abordagens in vitro removem o microambiente que influencia os axônios e suas respostas a pistas ao longo de diferentes pontos de seu curso, e tradicionalmente só testam uma sugestão isolada. Compondo estas desvantagens, o tamanho pequeno de cada núcleo no sistema do motor da ocular faz a dissecção que desafia tecnicamente para explantes ou culturas dissociada. Adicionalmente, as culturas preliminares de neurônios do motor da ocular são geralmente heterogêneas, têm a morte de pilha significativa, e são dependentes da densidade, exigindo o agrupamento das pilhas dos embriões múltiplos (Ryosuki Fujiki, uma comunicação pessoal). In vivo métodos, no entanto, incluindo modelos de mouse knockout, são inadequados para uso para triagem, dado o tempo e despesa necessária.
Métodos desenvolvidos para a cultura de embriões inteiros19 permitir a rotulagem de células migratórias20 ou bloqueio de moléculas específicas21, mas culturas embrionária inteiras exigem incubação em garrafas de rolos que impede a imagem em tempo real de rotulados Estruturas. Técnicas cirúrgicas que permitem a manipulação do embrião e, em seguida, subsequente desenvolvimento posterior quer no útero ou no abdômen da mãe (manutenção da conexão placentária)22 também são possíveis, mas estes também não permitem lapso de tempo Imaging.
Para superar os obstáculos de ensaios in vitro e permitir a rápida triagem de vias de sinalização, desenvolveu-se uma técnica de cultura de fatia embrionária ex vivo23, adaptada de um protocolo previamente publicado para o crescimento do nervo periférico24. Usando este protocolo, o nervo oculomotor de desenvolvimento pode ser imaged sobre o tempo na presença de muitas das estruturas circunvizinhas ao longo de sua trajetória, incluindo alvos de EOM. Ao adicionar inibidores de pequenas moléculas, fatores de crescimento ou indicações de orientação aos meios de cultura, podemos avaliar perturbações de orientação em vários pontos ao longo da trajetória do AXON, permitindo uma avaliação mais rápida dos potenciais fatores de crescimento e orientação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os trabalhos em animais aqui descritos foram aprovados e realizados em conformidade com os protocolos do Comitê de cuidados e uso de animais (IACUC) do Boston Children ' s hospital.
1. acasalamentos cronometrados
- Lugar ISLMN: GFP (proteína fluorescente verde do Neuron do motor de Islet; MGI: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J estoque: 017952) ratos masculinos e fêmeas junto durante a noite. Pesar as fêmeas e pesos recorde antes do acasalamento.
Nota: o ISLMN: GFP especificamente rotula os neurônios motores com um GFP farnesylated que não seja cytotoxic, localiza à membrana de pilha de neurônios de motor e de seus axônios, e permite que os nervos sejam visualizados durante o desenvolvimento25. Outras linhas com rótulo cDNAs também podem ser usadas. - Verifique se há plugues vaginais no início da manhã. A data em que um plugue é identificado é designado como E 0.5.
- Confirme a gravidez usando o ganho de peso e/ou ultra-som em E 10.5. As represas grávidas devem ter ganhado pelo menos 1 g. os embriões podem ser vistos no ultra-som em E 10.5.
2. preparação dos reagentes e do do para a cultura da fatia
- Prepare 500 mL de tampão de fatiamento: Adicione 5 mL de HEPES e 5 mL de penicilina/estreptomicina a 500 mL de solução de sal balanceada de Hank (HBSS) sem CA2 + e mg2 +. Chill a 4 ° c.
Nota: o tampão de fatiamento extra deve ser armazenado em 4 ° c e pode ser usado para experiências futuras da cultura da fatia. - Preparar 50 mL de meios de cultura: em um capuz estéril, adicione 12,5 mL de HBSS, 12,5 mL de soro bovino fetal, 250 μL de glicose, 250 μL de L-glutamina, 125 μL de HEPES para 24,4 mL de Fluorobright DMEM. (Concentrações finais: FlouroBright DMEM com 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% glicose, 1 milímetro glutamine, e 2,5 milímetros HEPES.). Aqueça os meios de cultura a 37 ° c em um banho de água estéril.
Nota: a mídia de cultura pode ser armazenada a 4 ° c por até 3 semanas.- Em uma capa estéril, adicione 1,5 mL de meios de cultura a cada poço de uma placa de 6 poços. Adicione uma inserção de cultura de célula (tabela de materiais) a cada poço. Coloc em um 37 ° c estéril e em uma incubadora de 5% CO2 .
- Prepare o agarose da temperatura do baixo-derretimento de 4%: Dissolva 2 g do agarose da temperatura do baixo-derretimento em 50 mL do PBS estéril. Microondas em intervalos de 30-60 s até totalmente dissolvido. Coloc em um banho de água do ° c 40 para manter o líquido.
Nota: o agarose extra pode ser conservado na temperatura ambiente (RT) e derretido para experiências futuras da cultura da fatia. - Configurar o vibratome: Coloque uma nova lâmina no vibratome. Verifique as configurações: espessura 400-450 μm. pré-Chill o estágio do. Coloque gelo na Câmara exterior. Use uma câmara e um estágio dedicados a fatias ao vivo. Não use a mesma Câmara do para o tecido fixo como o fixador residual poderia ser prejudicial às fatias.
- Prepare a incubadora superior do estágio do microscópio a 37 ° c e a 5% CO2.
- Prepare-se para dissecção: Limpe os instrumentos cirúrgicos e pulverize com 70% etanol. Encha dois pratos de Petri com HBSS, coloque no gelo. Abra uma placa da cultura do tecido de 12 poços e coloc a tampa no gelo com a parte inferior virada para cima. Abra uma placa da cultura do tecido de 6 poços e coloc inserções da membrana da cultura da pilha e 1,5 meios de cultura da pilha do mL em cada poço. Pré-aqueça a placa em uma incubadora de 37 ° c e de 5% CO2 .
3. colheita e 10,5 embriões e preparação de fatias
Nota: todas as etapas deste ponto devem ser feitas o mais rápido possível. Mantenha os embriões em gelo o tempo todo.
- Eutanizar a represa grávida (E 10.5) em uma câmara de CO2 . Realize luxação cervical.
- Pulverize o abdômen com 70% de etanol. Corte abrir o abdômen com tesoura, retire o útero e coloque-o em uma placa de Petri com gelo frio HBSS para lavar rapidamente afastado o sangue. Mova o útero lavado a um segundo Petri enchido com o gelo gelado HBSS do prato.
- um espaço de dissecação, remova os embriões do chifre uterine e dos sacos líquido amniótico individuais. Coloque os embriões na parte inferior da tampa de uma placa de 12 poços. Mantenha o gelo.
- um escopo de dissecação, use papel de filtro para remover qualquer líquido em torno de cada embrião.
Nota: os embriões vão ficar com o papel de filtro se tocado. - Incorporar embriões em agarose. Despeje o agarose derretido sobre cada embrião para cobri-lo. Mantenha o gelo. Assim que o agarose endureceu, vire cada embrião e despeje agarose adicional do outro lado. Mantenha o gelo.
- Usando um espaço de dissecação fluorescente, apare o agarose em torno de cada embrião assim que será orientado corretamente quando colado ao estágio do do. O núcleo oculomotor e o conseqüência adiantado do AXON são fluorescentes. Alinhe o embrião para que o núcleo, os axônios em crescimento e o olho formem uma linha, e corte o agarose com uma lâmina de barbear paralela a esta linha (dorsal ao embrião, ver Figura 1a).
Nota: este será o lado colado ao estágio do (o embrião será posicionado em suas costas, cabeça mais próxima da lâmina do). Uma linha entre o núcleo oculomotor e o olho deve ser paralela à lâmina do. - Encha a câmara do com o tampão gelo-frio da fatia. Supercole o embrião ao estágio do do de modo que a lâmina seja paralela com o núcleo e os olhos do oculomotor. Uma vez que o super cola está seco, submergir o estágio do assim que o embrião é orientado virado para longe da lâmina.
- Cortar fatias de 400-450 μm. Colete cada fatia com um Pipet de transferência estéril. Coloque em buffer de corte frio.
- o escopo de dissecação, escolha a fatia que contém os núcleos oculomotores e os olhos. Usando um Pipet de transferência estéril, coloc o na inserção da cultura da pilha na placa de 6 poços. Devolva a placa à incubadora de 37 ° c. Alternativamente, ter uma pessoa fatiando e outra colocando as fatias. Minimize o tempo entre fatiar e coloc na incubadora.
Nota: as fatias devem ser orientadas de forma que a fluorescência máxima emitida a partir dos núcleos e axônios seja mais próxima do objetivo do microscópio de imagem. Em um microscópio invertido, as fatias devem ser colocadas na membrana com os núcleos e axônios mais próximos ao objetivo embaixo da placa. - Retire o agarose residual do estágio do do, supercole o próximo embrião ao estágio e repita etapas 3.7-3.9 até que todos os embriões estejam cortados e chapeados.
- Adicione o inibidor ou a molécula de recombinação da escolha aos meios em cada poço para criar uma curva da dose-resposta. Diluir em solvente apropriado.
Nota: se utilizar DMSO, utilize apenas a classe de cultura de tecido DMSO. Alternativamente, as esferas da proteína-eluição podem ser coloc em posições específicas na fatia. - Coloc no microscópio no ° c 37 e na câmara de 5% CO2 . Ajuste o microscópio para tomar o contraste de fase e as fotografias fluorescentes de cada fatia cada 30 minutos (ou mais frequentemente se desejado). As fatias podem ser mantidas para 48-72 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultados normais: a Figura 1 fornece um esquema do experimento. Começando tão cedo quanto E 9.5 no rato, os primeiros axônios começam a emergir do núcleo oculomotor26. Por E 10.5, um nervo oculomotor fasciculado, que contenha os neurônios pioneiros adiantados, pode ser visto no mesenchyme. Há uma variabilidade significativa entre os embriões em E 10.5 (mesmo dentro da mesma maca) em como distante o nervo progrediu para a órbita, provável devido às diferenças desenvolventes de algumas horas. Durante o desenvolvimento normal no útero , os primeiros axônios oculomotores GFP-positivos atingem a órbita/olho nos próximos 18-24 h (por e 11.5) e, em seguida, começam a ramificar-se para seus alvos finais27. Na cultura da fatia, esse tempo é recapitulado (Figura 2, vídeo 1). A fatia cresce e se expande (em todas as direções) para até 72 h, e axônios podem ser vistos estendendo-se do núcleo para o olho. Nós encontramos o primeiro 36-48 h o mais útil para avaliar o outgrowth do AXON do oculomotor. Os neurônios motores às vezes podem ser vistos movendo-se dentro do núcleo (não mostrado). Em algumas fatias, dependendo da orientação, o núcleo troclear também está presente. Os axônios troclear estendem lateralmente dentro da fatia e frequentemente Stall, porque seu curso normal é sair do núcleo troclear lateralmente, antes de girar dorsalmente e caudally, que seria fora da fatia. Ocasionalmente, os axônios troclear parecem unir-se com os axônios oculomotores e girar para o olho, que faz a fatia difícil de interpretar, porque aqueles axônios podem ter um efeito secundário na orientação dos axônios oculomotor.
Exemplo de inibição de uma importante via de orientação do axão: a inibição da sinalização CXCR4 provoca o crescimento dorsal em vez de ventral de axônios oculomotores. Nós avaliamos o papel da sinalização CXCR4 no desenvolvimento oculomotor adicionando 1 μg/mL (1,26 μM) de AMD3100, um inibidor hidrossolúvel da molécula pequena de CXCR428, diretamente aos meios de cultura assim que a cultura da fatia for preparada. Os axônios oculomotores podem então ser vistos saindo do núcleo oculomotor dorsalmente e crescendo longe da órbita ("para trás") (Figura 2, vídeo 2). Aqueles axônios que já haviam deixado o midbrain e estavam a caminho da órbita em E 10.5 continuam em seu caminho. A inibição do CXCR4 também afeta o crescimento geral da fatia.
A orientação da fatia é crucial. As fatias não são interpretáveis se não estiverem orientadas corretamente. Alguns exemplos de fatias indevidamente orientadas são mostrados na Figura 3. Se o embrião é inclinado ao seu lado, apenas um núcleo oculomotor está na fatia (Figura 3a). Se o embrião incorporado é inclinado demasiado distante para suas costas, os olhos não estão na fatia, e preferivelmente o membro superior e o rombencéfalo ou a medula espinal podem estar na fatia (Figura 3B). Neste caso, a trajetória normal dos axônios oculomotores não está presente, e tendem a crescer aleatoriamente. Durante a colocação da fatia na membrana da cultura, pode tornar-se dobrado (Figura 3C).
Os solventes podem ser tóxicos. Deve-se tomar cuidado ao dissolver inibidores ou fatores de crescimento em solventes orgânicos. A Figura 4 mostra um exemplo de uma fatia que morreu após a adição de etanol à mídia. 118 μL foi adicionado a 1,5 mL dos meios (concentração final 7,8%), e esta concentração elevada provou tóxico. Para evitar isso, dissolver solutos na quantidade mínima de solvente possível (para o limite de solubilidade). Sempre que possível, dissolva-se na água. Se DMSO é usado, assegure-se de que esteja estéril, classe DMSO da cultura do tecido.
Figura 1 : Esquemático. E 10.5 ISLMN-embriões GFP (a: foto, B: esquemático) são cortados em um vibratoma (400-450 μm de espessura), de modo que as seções incluem tanto o núcleo oculomotor e a órbita. Linhas tracejadas paralelas em a e B denotam a localização dos cortes vibratoma. A linha tracejada mais baixa em a mostra onde o agarose deve ser cortado e colado ao estágio do do. (C) as seções são colocadas horizontalmente em uma membrana da tecido-cultura, permitindo a troca dos nutrientes e dos gases, e coloc em uma incubadora do fase-parte superior para a microscopia do lapso de tempo. Nesta fase, os inibidores podem ser adicionados à mídia de crescimento. (D) as culturas podem ser mantidas para 24-72 h, e os axônios oculomotores podem ser vistos crescendo ao olho. Adaptado com permissão de Whitman, et. Al. 201823. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Inibição de CXCR4 provoca CN3 misrouting. Culturas de fatia de embriões de E 10.5 ISL-GFP imaged em 0, 12, 24, e 36 h na cultura. O painel superior mostra um embrião de controle de tipo selvagem e CN3 (verde) cresce em direção aos olhos e ramos extensivamente ao longo de 36 h. Veja também vídeo 1. O painel inferior mostra uma fatia com 1 μg/mL AMD3100 (inibidor específico para CXCR4) adicionado e axônios sair do núcleo oculomotor dorsally. Aqueles que já haviam saído ventralmente continuam em direção ao olho. Veja também vídeo 2. D: dorsal, V: ventral, E: olho, N: núcleo oculomotor, SMN: neurônios motores espinhais, setas: axônios oculomotores (branco: projeção tipo selvagem, amarelo: projeções aberrantes). A barra de escala é igual a 200 μm. Veja também vídeo 1 e vídeo 2. Uma figura similar que mostra outros exemplos foi apresentada em Whitman, et. Al. 201823. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : A orientação das fatias é crucial. Imagens iniciais (tempo 0 h) de fatias desorientadas representativas. A mostra uma fatia em que o embrião foi inclinado para o lado tal que projetando AXÔNIOS CN3 foram axotomized. Projetando axônios só estão presentes no lado direito da fatia (seta). B mostra uma fatia em que o embrião foi inclinado para trás de modo CN3 núcleos com projeção axônios (seta) são visíveis bilateralmente, mas os olhos não estão presentes na fatia. Em vez disso, os neurônios motores da coluna vertebral (SMN) e as projeções do neurônio motor para os membros podem ser vistos. C mostra uma fatia que dobrou durante a colocação na membrana. Fatias como as mostradas aqui devem ser descartadas. As barras de escala representam 500 μm em cada painel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Os solventes podem ser tóxicos. Imagem latente do tempo-lapso de culturas da fatia de embriões do ISL-GFP de E 10.5 em 0 e em 12 h na cultura. Uma fatia cultivada nos meios sem aditivos (A-B) cresce normalmente para 12 h com os AXÔNIOS CN3 que projetam para o olho. Uma fatia cultivada em meios de comunicação com alta concentração de etanol (7,8%) (C-D) não cresce normalmente. Em 12 h, CN3 não cresceu e é mal visível, e o tecido começou a se desintegrar. As barras de escala representam 500 μm em cada painel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: CN3 conseqüência na cultura de fatia. Imagem latente do tempo-lapso de uma cultura da fatia do controle de um embrião de E 10.5 ISL-GFP. Imagens tiradas a cada 30 min sobre 18 h em cultura. CN3 (verde) cresce a partir do núcleo (superior) em direção aos olhos e começa a ramificando. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo 2: Mistargeting de CN3 com inibição da sinalização CXCR4. Imagem latente do tempo-lapso de culturas da fatia dos embriões de E 10.5 ISL-GFP sobre 48 h na cultura. Quando 1 μg/ml AMD3100 (inibidor específico para CXCR4) é adicionado diretamente à mídia, CN3 axônios que ainda não estão na periferia saem do núcleo oculomotor dorsalmente (esquerda) em vez de ventralmente (direita). Reimpresso com permissão de Whitman, et. Al. 201823. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo ex vivo da cultura da fatia fornece vantagens significativas sobre os ensaios tradicionais da orientação do AXON23. O tamanho de cada núcleo do motor craniano não é um fator limitante, e nenhuma dissecção difícil é necessária. O microambiente endógeno através do qual os axônios viajam são mantidos, permitindo a modificação de uma via de sinalização, mantendo outras vias de sinalização. Adicionalmente, os efeitos podem ser avaliados em diferentes pontos ao longo da trajetória do AXON. Uma vez que a orientação AXON requer várias pistas, e combinações de pistas, ao longo do caminho29, isso fornece uma vantagem significativa. Diferentemente de culturas dissociadas ou explantes, os axônios crescentes não são cortados nesta preparação, portanto, o crescimento inicial do axão pode ser avaliado, em vez de regeneração do axão. Na maioria dos outros ensaios de orientação, a regeneração de AXON está realmente sendo avaliada, em vez de crescimento inicial do AXON. Evitar a axotomia também evita fatores de confusão potenciais significativos porque os neurônios não estão danificados ou estresse.
As duas etapas mais críticas são a orientação dos embriões para fatiar e minimizar o tempo entre a eutanásia da mãe e a colocação das fatias na incubadora. Os embriões devem ser mantidos em gelo em todos os momentos. Para orientação, tentamos vários moldes diferentes, mas por causa da variabilidade entre os embriões nesta idade, descobrimos que a orientação à mão, com base na fluorescência o microscópio de dissecação, é mais eficaz. A orientação à mão limita a janela de tempo embrionária que pode ser estudada, no entanto. Mais cedo do que E 10.0, orientando a fatia corretamente é desafiador porque o olho é difícil de ver e muito poucos axônios CN3 podem ser vistos. Isso significa, no entanto, que não podemos usar este método para estudar o mais antigo pioneiro AXON outgrowth, como precisamos permitir que esses axônios para crescer parte maneira de ser capaz de orientar a fatia.
Há diversas limitações à preparação da cultura da fatia do oculomotor. É mais útil para estudar decisões de orientação iniciais e intermediárias, em vez de decisões de ramificação de terminais. Na E 10.5, as EOMs estão presentes apenas como uma Anlage muscular. Mesmo em pontos de tempo posteriores, com a tecnologia de imagem atual, EOMs de destino individual não podem ser distinguidos dentro da fatia. As decisões de ramificação terminais específicas dos axônios oculomotores, portanto, não podem ser avaliadas com as condições atuais. Porque as fatias são crescidas em membranas porosas da cultura do tecido, a separação da borne-cultura da membrana é difícil e causa frequentemente dano de tecido, fazendo a mancha do anticorpo e a remontagem para a imagem latente adicional mal sucedida. Embora os axônios não sejam cortados, minimizando assim os danos neuronais, os tecidos circundantes são cortados e, portanto, danificados, o que pode afetar a sinalização da expressão da sugestão ou liberação. A janela de tempo ideal também é limitada. Como observado acima, mais cedo do que a orientação E 10.0 da fatia é difícil, e depois de E 11.5, muitos axônios já atingiram a órbita, então decisões de orientação intermediárias já foram feitas.
A preparação exige um microscópio com incubadora do estágio-parte superior, estágio automático, e capacidade do Time-Lapse. Os objetivos e a câmera precisam ser otimizados para imagens de espécimes grossos sem compensação. A definição no nível de um único cone do crescimento, como é possível com algumas preparações da cultura, não é possível com a definição atual da imagem latente. Os parâmetros de imagem poderiam, no entanto, ser potencialmente adaptados para permitir maior resolução, com microscopia confocal ou 2 fóton, focando em uma pequena área de cada fatia (potencialmente ajustando como a fatia como axônios crescem). Usando o microscópio e a imagem latente epifluorescente atuais cada 30 minutos, nós não vimos photobranqueamento; a microscopia confocal e a imagem latente mais freqüente podiam ser usadas, mas photobranqueamento transformar-se-ia um problema potencial.
Como os inibidores de pequenas moléculas podem ter efeitos fora do alvo, incluindo o crescimento geral e a saúde da fatia, este ensaio é mais útil como uma ferramenta de triagem. Os resultados precisam ser verificados por outros métodos, como modelos de mouse knockout. Por exemplo, com a inibição de CXCR4, há um crescimento geral leve diminuído da fatia (veja a Figura 2), consistente com as múltiplas funções do CXCR4. Em modelos do rato, entretanto, o phenotype do AXON visto na fatia foi recapitulou23.
Este protocolo poderia ser modificado para estudar outras populações do nervo craniano, embora para cada um, a orientação apropriada das fatias e do sincronismo tivesse que ser determinada empiricamente. Adicionalmente, camundongos com diferentes rótulos fluorescentes podem ser usados que marcam diferentes subconjuntos de neurônios e/ou que se transformam em idades embrionárias anteriores ou posteriores.
A cultura de fatia pode ser manipulada de várias maneiras. Nós mostramos aqui um exemplo de obstruir a sinalização do receptor com um inibidor pequeno da molécula. Alternativamente, os anticorpos (bloqueio do receptor ou ativação do receptor) ou proteínas recombinantes, como pistas de orientação do AXON ou fatores de crescimento, podem ser adicionados à mídia. Para avaliar os efeitos direcionais na orientação do AXON, os grânulos de secreção de ligantes podem ser colocados na fatia em locais específicos. Usando algum destes métodos, muitos outros caminhos da orientação do AXON podem ser identificados e estudados no sistema do motor da ocular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Financiamento fornecido pelo National Eye Institute [5K08EY027850], Instituto Nacional de saúde da criança e desenvolvimento [U54HD090255], Harvard-Vision programa de desenvolvimento clínico cientista [5K12EY016335], os Cavaleiros Templários Eye Foundation [carreira Starter Grant], e a Children ' s Hospital ophthalmology Foundation [faculdade Discovery Award]. ECE é um investigador do Instituto médico Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
