Summary
Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo's in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.
Abstract
Nauwkeurige oogbewegingen zijn cruciaal voor het gezichtsvermogen, maar de ontwikkeling van het oculair motorsysteem, met name de moleculaire trajecten die de axon-geleiding beheersen, is niet volledig opgehelderd. Dit is deels te wijten aan technische beperkingen van traditionele axon guidance testen. Om aanvullende axon geleidings signalen te identificeren die de Oculomotor zenuw beïnvloeden, een ex vivo slice assay om de Oculomotor zenuw in real-time te afbeelden naarmate deze in de richting van het oog groeit, werd ontwikkeld. E 10.5 ISLMN-GFP- embryo's worden gebruikt om ex vivo-segmenten te genereren door ze in agarose in te sluiten, te snijden op een vibratome en ze vervolgens te kweken in een Microscoop-topincubator met timelapse-photomicroscopie voor 24-72 h. regel segmenten even de in vivo timing van de uitgroei van axonen van de Nucleus naar de baan. Kleine molecuul remmers of recombinant proteïnen kunnen aan de kweekmedia worden toegevoegd om de rol van verschillende axon geleidings trajecten te beoordelen. Deze methode heeft de voordelen van het handhaven van meer van de lokale micro omgeving waardoor axonen doorkruisen, niet axotomiseren van de groeiende axonen, en het beoordelen van de axonen op meerdere punten langs hun traject. Het kan ook effecten op specifieke subsets van axonen identificeren. Bijvoorbeeld, remming van CXCR4 zorgt ervoor dat axonen nog steeds binnen de middenhersenen groeien schrapen in plaats van ventraal, maar axonen die al hebben verlaten ventraal zijn niet aangetast.
Introduction
Het oculair motorsysteem biedt een elegant systeem voor het onderzoeken van Axon geleidings mechanismen. Het is relatief ongecompliceerd, bestaande uit drie craniale zenuwen innervating zes extraocular spieren (EOMs) die het oog bewegen, en de levator palpebrae superioris (LPS) die het ooglid liften. De Oculomotor zenuw innert de lp's en vier eoms-de minderwaardige schuine en de mediale, inferieure en superieure rectus spieren. De andere twee zenuwen, de trochlear en kidnens, elk slechts innervate één spier, de superieure schuine en laterale rectus spier, respectievelijk. Oogbewegingen zorgen voor een gemakkelijke uitlezen, wat aangeeft of innervatie gepast, vermist of afwijkend is. Bovendien, er zijn menselijke oog bewegingsstoornissen die voortvloeien uit tekorten in neuronale ontwikkeling of Axon begeleiding, gezamenlijk aangeduid als de aangeboren craniale desinnervatie stoornissen (Cdd's)1.
Ondanks deze voordelen wordt het oculair motorsysteem zelden gebruikt in axon guidance studies2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, vanwege technische nadelen. In vitro axon begeleiding assays hebben vele nadelen11. Co-cultuur assays, waarin neuronale explanten worden gekweekt samen met explantaten van doelweefsel12 of getranssinfecteerde cellen13, afhankelijk van beide symmetrie van de explant en precieze positionering tussen de explant en het doelweefsel. Stripe assays14,15, waarin twee signalen zijn vastgelegd in afwisselende strepen en axonen worden beoordeeld op preferentiële groei op één streep, geven alleen aan dat één substraat beter is dan de andere, niet dat het aantrekkelijk is of weerzinwekkend, of fysiologisch relevant. Microfluïdica kamers kunnen precieze chemische gradiënten vormen, maar het onderwerp groeit axonen om stress16,17,18te afschuiven, wat hun groei kan beïnvloeden. Bovendien, in elk van deze benaderingen, het verzamelen van explanten of gezien cellen vereist dat de uitgroeiende axonen worden axotomized en dus deze tests onderzoeken axon regeneratie, in plaats van initiële axon uitgroei. Tot slot, deze in vitro benaderingen verwijderen van de micro-omgeving die invloed op axonen en hun reacties op hints langs verschillende punten van hun cursus, en traditioneel slechts één hint in isolatie te testen. Door deze nadelen te comperen, maakt de geringe omvang van elke Nucleus in het oculaire motorsysteem de dissectie technisch uitdagend voor zowel explantaten als gedisiteerde culturen. Bovendien zijn primaire culturen van oculaire motorneuronen meestal heterogeen, hebben significante celdood, en zijn dichtheids afhankelijke, waarbij het groeperen van cellen uit meerdere embryo's vereist is (Ryosuki Fujiki, persoonlijke communicatie). In vivo methoden, met inbegrip van Knockout muismodellen, zijn echter ongeschikt om te gebruiken voor screening, gezien de tijd en kosten die nodig zijn.
Methoden die zijn ontwikkeld voor het kweken van hele embryo's19 het labelen van cellen20 of blokkade van specifieke moleculen21toestaan, maar hele embryo culturen vereisen incubatie in roller flessen die real-time beeldvorming van gelabelde Structuren. Chirurgische technieken die manipulatie van het embryo mogelijk maken en vervolgens verdere ontwikkeling in de baarmoeder of in de buik van de moeder (het handhaven van de placentaire verbinding)22 kunnen ook worden uitgevoerd, maar deze laten ook geen time-lapse Imaging.
Om de obstakels van in vitro testen te overwinnen en een snelle screening van signalerings trajecten mogelijk te maken, werd een ex vivo embryonale segment kweek techniek ontwikkeld23, aangepast van een eerder gepubliceerd protocol voor perifere zenuw groei24. Met behulp van dit protocol, de ontwikkelende Oculomotor zenuw kan worden afgebeeld in de tijd in de aanwezigheid van veel van de omringende structuren langs haar traject, met inbegrip van EOM targets. Door kleine molecuul remmers, groeifactoren of geleidings signalen aan de cultuur media toe te voegen, kunnen we geleidings verstoringen op meerdere punten langs het axon-traject beoordelen, waardoor een snellere beoordeling van potentiële groei-en geleidings factoren mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven dier werkzaamheden zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen van het Boston Children's Hospital institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).
1. getimede paringen
- Plaats ISLMN: GFP (eilandje motor neuron groen fluorescerende eiwitten; MGI: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J Stock No: 017952) mannelijke en vrouwelijke muizen 's nachts samen. Weeg de vrouwtjes en het record gewicht vóór de paring.
Opmerking: ISLMN: GFP categoriseerde motorneuronen specifiek met een door farnesylated GFP dat niet cytotoxisch is, lokaliseert naar de celmembraan van motorneuronen en hun axonen, en laat de zenuwen visualiseren tijdens ontwikkeling25. Andere fluorescently gelabelde lijnen kunnen ook worden gebruikt. - Controleer in de vroege ochtend op vaginale stekkers. De datum waarop een stekker wordt geïdentificeerd, wordt aangeduid als E 0.5.
- Bevestig de zwangerschap met gewichtstoename en/of echografie bij E 10.5. Zwangere Dammen moeten ten minste 1 g hebben opgedaan. embryo's zijn te zien op echografie bij E 10.5.
2. bereiding van reagentia en vibratome voor segment cultuur
- Bereid 500 ml snijden buffer: Voeg 5 ml Hepes en 5 ml penicillaire/streptomycine toe aan 500 ml van de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS) zonder CA2 + en mg2 +. Chill tot 4 °C.
Opmerking: extra snijden buffer moet worden bewaard bij 4 °c en kan worden gebruikt voor toekomstige slice cultuur experimenten. - Bereid 50 mL kweekmedia voor: Voeg in een steriele kap 12,5 mL HBSS, 12,5 mL foetaal runderserum, 250 μL glucose, 250 μL L-glutamine, 125 μL HEPES toe aan 24,4 mL Fluorobright DMEM. (Eindconcentraties: FlouroBright DMEM met 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% glucose, 1 mM glutamine en 2,5 mM HEPES.). Verwarm de kweekmedia tot 37 °C in een steriel waterbad.
Let op: kweekmedia kunnen maximaal 3 weken bij 4 °C bewaard worden.- Voeg in een steriele motorkap 1,5 mL kweekmedia toe aan elk goed van een 6-put plaat. Voeg een celkweek insert (Inhoudsopgave) toe aan elke put. Plaats in een steriele 37 °C en 5% CO2 incubator.
- Bereid 4% laag smeltende temperatuur agarose: los 2 g van lage smelttemperatuur agarose op in 50 mL steriele PBS. Magnetron in 30-60 s intervallen tot volledig opgelost. Plaats in een waterbad van 40 °C om de vloeistof te bewaren.
Opmerking: extra agarose kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur (RT) en gesmolten voor toekomstige segment cultuur experimenten. - Vibratome instellen: plaats een nieuwe blade op vibratome. Controleer instellingen: dikte 400-450 μm. pre-Chill de vibratome fase. Plaats wat ijs in de buiten kamer. Gebruik een kamer en podium gewijd aan Live Slices. Gebruik niet dezelfde vibratome kamer voor vast weefsel als residuele fixatief kan schadelijk zijn voor plakjes.
- Bereid de topincubator van de Microscoop-fase tot 37 °C en 5% CO2.
- Voorbereiden op dissectie: schone chirurgische instrumenten en spray met 70% ethanol. Vul twee Petri schaaltjes met HBSS, plaats op ijs. Open een 12 goed weefselkweek plaat en leg het deksel op ijs met de onderzijde naar boven gericht. Open een 6 goed weefselcultuur plaat en plaats celkweek membraan inserts en 1,5 mL celkweek media in elke put. Verwarm de plaat voor op een incubator van 37 °C en 5% CO2 .
3. E 10.5 embryo's oogsten en plakken voorbereiden
Opmerking: alle stappen vanaf dit punt moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Houd de embryo's te allen tijde op ijs.
- Euthanaseer de drachtige Dam (E 10.5) in een CO2 kamer. Uitvoeren van cervicale dislocatie.
- Spray de buik met 70% ethanol. Snijd de buik met een schaar open, verwijder de baarmoeder en plaats deze in een Petri schaaltje met ijskoude HBSS om het bloed snel weg te spoelen. Verplaats de gewassen baarmoeder naar een tweede Petri gevuld met schotel ijskoude HBSS.
- Verwijder de embryo's uit de baarmoeder hoorn en individuele amniotische zakjes onder een ontleed bereik. Plaats de embryo's op de onderzijde van de deksel van een 12-put. Blijf op ijs.
- Gebruik, onder een ontleed bereik, filterpapier om elke vloeistof rondom elk embryo te verwijderen.
Opmerking: embryo's blijven bij aanraking aan het filtreerpapier plakken. - Embryo's insluiten in agarose. Giet gesmolten agarose over elk embryo om het te bedekken. Blijf op ijs. Zodra de agarose is gehard, Flip elk embryo en giet extra agarose aan de andere kant. Blijf op ijs.
- Trim de agarose rond elk embryo met behulp van een fluorescerende ontleden Scope, zodat deze op de juiste manier wordt georiënteerd wanneer deze aan de tril fase wordt vastgelijmd. De Nucleus Oculomotor en de vroege axon-uitgroei zijn fluorescerend. Lijn het embryo uit zodat de Nucleus, de uitgroei van de axonen en het oog een lijn vormen, en snijd de agarose met een scheermesje parallel aan deze lijn (Zie Figuur 1a).
Let op: dit wordt de zijkant gelijmd aan de vibratome fase (het embryo zal worden gepositioneerd op zijn rug, hoofd dichtst bij de vibratome Blade). Een lijn tussen de kern van de Oculomotor en het oog moet evenwijdig zijn aan de vibratome Blade. - Vul de vibratome kamer met ijskoude segmentbuffer. Overlijm het embryo met de vibratome fase, zodat het mes evenwijdig is met de kern en de ogen van de Oculomotor. Als de superlijm droog is, Dompel je de vibratome stage onder, zodat het embryo naar de weg van het blad gericht is.
- Snijd de schijfjes 400-450 μm. Verzamel elk segment met een steriele transferpipet. Plaats in de koude snijden buffer.
- Kies onder het ontleed bereik het segment dat de Oculomotor-kernen en-ogen bevat. Gebruik een steriele Transfer pipet en plaats deze op de celkweek insert in de 6-plaat. Keer de plaat terug naar de incubator van 37 °C. U ook één persoon slicen en een andere de segmenten plaatsen. Minimaliseer de tijd tussen snijden en plaatsen in een incubator.
Opmerking: segmenten moeten zodanig worden georiënteerd dat de maximale fluorescentie die uit de kernen en axonen wordt uitgestoten, het dichtst bij de doelstelling van de Imaging Microscoop ligt. Op een omgekeerde Microscoop moeten de plakjes op het membraan worden geplaatst met de kernen en axonen die het dichtst bij het doel onder de plaat liggen. - Verwijder de resterende agarose uit de vibratome fase, superlijm het volgende embryo op het podium en herhaal stappen 3.7-3.9 totdat alle embryo's zijn gesneden en geplateerd.
- Voeg een remmer of recombinant molecuul naar keuze toe aan media in elk goed om een dosis-responscurve te creëren. Verdun in een geschikt oplosmiddel.
Opmerking: als u DMSO gebruikt, gebruik dan alleen de DMSO van het weefselkweek niveau. Als alternatief kunnen eiwit-eluting-kralen op specifieke locaties op het segment worden geplaatst. - Plaats op de Microscoop in de 37 °C en 5% CO2 kamer. Stel de Microscoop in om elke 30 minuten fase contrast en fluorescerende foto's van elke slice te nemen (of vaker indien gewenst). Segmenten kunnen worden gehandhaafd voor 48-72 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normale resultaten: Figuur 1 geeft een schematische voorstelling van het experiment. Beginnend met E 9.5 in muis, beginnen de eerste axonen uit de Oculomotor Nucleus26te ontstaan. Door E 10.5, een fascicgeënt Oculomotor zenuw, die de vroege Pioneer neuronen bevat, kan worden gezien in de Mesenchyme. Er is een significante variabiliteit tussen embryo's op E 10.5 (zelfs binnen hetzelfde nest) in hoever de zenuw is gevorderd naar de baan, waarschijnlijk als gevolg van ontwikkelingsverschillen van enkele uren. Bij normaal in utero ontwikkeling bereiken de eerste GFP-positieve Oculomotor axonen de baan/het oog over de volgende 18-24 h (door e 11.5), en beginnen ze te vertakken naar hun einddoelen27. In de segment cultuur wordt deze timing geherculeerd (Figuur 2, video 1). Het segment groeit en breidt uit (in alle richtingen) tot 72 uur, en axonen kunnen worden gezien vanaf de Nucleus naar het oog. We hebben de eerste 36-48 h meest bruikbaar gevonden voor het beoordelen van de uitgroei van Oculomotor axon. Motorische neuronen kunnen soms worden gezien bewegen binnen de Nucleus (niet weergegeven). In sommige plakjes, afhankelijk van de oriëntatie, is de trochlear Nucleus ook aanwezig. Trochlear axonen strekken zich lateraal uit binnen het segment en vaak kraam, omdat hun normale cursus is om de trochlear Nucleus lateraal af te sluiten, alvorens schrapen en caudally te draaien, wat buiten het segment zou zijn. Af en toe lijken de trochlear axonen samen te komen met de Oculomotor axonen en zich naar het oog te wenden, waardoor het segment moeilijk te interpreteren is, omdat die axonen een secundair effect kunnen hebben op de geleiding van de Oculomotor axonen.
Voorbeeld van remming van een belangrijke axon guidance route: remming van CXCR4 signalering veroorzaakt dorsale in plaats van ventrale groei van Oculomotor axonen. We beoordeelden de rol van CXCR4 signalering op de ontwikkeling van Oculomotor door toevoeging van 1 μg/mL (1,26 μM) AMD3100, een in water oplosbare, kleine molecuul remmer van CXCR428, direct aan de cultuur media zodra de segment cultuur is voorbereid. De Oculomotor axonen kunnen dan worden gezien bij het verlaten van de Oculomotor Nucleus schrapen en groeien weg van de baan ("achteruit") (Figuur 2, video 2). Die axonen die de veroorzaakt al hadden verlaten en onderweg waren naar de baan bij e 10.5, gaan verder op hun pad. Remming van CXCR4 beïnvloedt ook de algehele groei van het segment.
De oriëntatie van het segment is cruciaal. Segmenten zijn niet interpreteerbaar als ze niet goed zijn georiënteerd. In afbeelding 3worden enkele voorbeelden van onjuist georiënteerde segmenten weergegeven. Als het embryo aan zijn zijde wordt gekanteld, bevindt zich slechts één Oculomotor-kern in het segment (Figuur 3A). Als het ingesloten embryo te ver naar achteren wordt gekanteld, zijn de ogen niet in het segment, en in plaats daarvan kunnen de bovenste ledematen en de achterhersenen of het ruggenmerg in het segment zitten (Figuur 3B). In dit geval is het normale traject van de Oculomotor axonen niet aanwezig en hebben ze de neiging om willekeurig te groeien. Tijdens het plaatsen van het segment op het cultuur membraan kan het worden gevouwen (Figuur 3C).
Oplosmiddelen kunnen giftig zijn. Voorzichtigheid moet worden begrepen bij het oplossen van remmers of groeifactoren in organische oplosmiddelen. Figuur 4 toont een voorbeeld van een segment dat stierf na toevoeging van ethanol aan de media. 118 μL werd toegevoegd aan 1,5 mL media (eindconcentratie 7,8%), en deze hoge concentratie bleek giftig. Om dit te voorkomen, lost u opgeloste stoffen op in de minimale hoeveelheid oplosmiddel (tot de oplosbaarheidsgrens). Indien mogelijk oplossen in water. Als DMSO wordt gebruikt, ervoor te zorgen dat het is steriel, weefselcultuur kwaliteit DMSO.
Figuur 1 : Schematisch. E 10.5 ISLMN-GFP embryo's (A: foto, B: schematisch) worden gesneden op een vibratome (400-450 μm dik), zodat secties zowel de Oculomotor Nucleus als de baan omvatten. Parallelle onderbroken lijnen in A en B duiden op de locatie van de vibratome sneden. De onderste onderbroken lijn in een toont waar de agarose moet worden bijgesneden en gelijmd aan de vibratome fase. C) secties worden plat gelegd op een weefsel-cultuur membraan, waardoor de uitwisseling van voedingsstoffen en gassen, en geplaatst in een podium-top incubator voor time-lapse microscopie. In dit stadium kunnen remmers aan de groeimedia worden toegevoegd. (D) culturen kunnen worden gehandhaafd voor 24-72 h, en de Oculomotor axonen kunnen worden gezien groeien naar het oog. Aangepast met toestemming van Whitman, et. al. 201823. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Remming van CXCR4 veroorzaakt CN3 misrouting. Segment culturen van E 10.5 ISL-GFP embryo's, afgebeeld op 0, 12, 24 en 36 h in cultuur. Het bovenste paneel toont een wild-type controle embryo en CN3 (groen) groeit in de richting van de ogen en takken uitgebreid in de loop van 36 h. Zie ook video 1. Het onderste paneel toont een segment met 1 μg/mL AMD3100 (specifieke remmer voor CXCR4) toegevoegd en axonen verlaten de Oculomotor Nucleus dorsally. Zij die al ventraal waren uitgeleverd, blijven naar het oog. Zie ook video 2. D: dorsal, V: ventrale, E: oog, N: Oculomotor Nucleus, SMN: ruggenmerg motorneuronen, pijlen: Oculomotor axonen (wit: wild type projectie, geel: afwijkende projecties). Schaalbalk is gelijk aan 200 μm. Zie ook video 1 en video 2. Een vergelijkbare figuur met andere voorbeelden werd gepresenteerd in Whitman, et. al. 201823. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : De oriëntatie van de sneetjes is cruciaal. Initiële beelden (tijd 0 h) van representatieve verkeerd georiënteerde segmenten. A toont een segment waarin het embryo aan de zijkant werd gekanteld, zodat het PROJECTEREN van CN3 axonen axotomized was. Projecterende axonen zijn alleen aan de rechterkant van het segment (pijl) aanwezig. B toont een segment waarin het embryo terug werd gekanteld, zodat CN3 kernen met projecterende axonen (Arrow) bilateraal zichtbaar zijn, maar de ogen niet in het segment aanwezig zijn. In plaats daarvan kunnen ruggengraat motorneuronen (SMN) en motorische neuron projecties naar de ledematen worden gezien. C toont een segment dat is gevouwen tijdens plaatsing op het membraan. Segmenten zoals die hier worden weergegeven, moeten worden weggegooid. Schaal staven vertegenwoordigen 500 μm in elk paneel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Oplosmiddelen kunnen giftig zijn. Timelapse-beeldvorming van segment culturen van E 10.5 ISL-GFP-embryo's op 0 en 12 uur in cultuur. Een segment gekweekt in media zonder additieven (A-B) groeit normaal voor 12 h met CN3 axonen naar het oog projecteren. Een segment gekweekt in media met een hoge concentratie van ethanol (7,8%) (C-D) groeit niet normaal. Om 12 uur, CN3 is niet gegroeid en is nauwelijks zichtbaar, en het weefsel is begonnen te desindiveren. Schaal staven vertegenwoordigen 500 μm in elk paneel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: CN3 uitgroei in segment cultuur. Timelapse-beeldvorming van een controle segment cultuur uit een E 10.5 ISL-GFP embryo. Beelden genomen elke 30 min over 18 h in cultuur. CN3 (groen) groeit van de Nucleus (boven) naar de ogen en begint te vertakken. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: mistargeting van CN3 met remming van CXCR4 signalering. Timelapse-beeldvorming van segment culturen uit E 10.5 ISL-GFP-embryo's van meer dan 48 uur in cultuur. Wanneer 1 μg/ml AMD3100 (specifieke remmer voor CXCR4) rechtstreeks aan de media wordt toegevoegd, kunnen CN3 axonen die nog niet in de periferie zijn, de Oculomotor Nucleus schrapen (links) in plaats van ventraal (rechts) verlaten. Herdrukt met toestemming van Whitman, et. al. 201823. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit ex vivo segment cultuur protocol biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele axon guidance-testen23. De grootte van elke craniale motor kern is geen beperkende factor, en geen moeilijke dissectie is noodzakelijk. De endogene micro omgeving waardoor de axonen reizen wordt gehandhaafd, waardoor wijziging van een signalering traject met behoud van andere signalering trajecten. Bovendien kunnen effecten worden beoordeeld op verschillende punten langs het axon-traject. Aangezien axon guidance meerdere hints en combinaties van hints vereist, biedt het pad29een aanzienlijk voordeel. In tegenstelling tot in gezien of explant culturen worden groeiende axonen niet in dit preparaat gesneden, dus initiële axon-uitgroei kan worden beoordeeld, in plaats van Axon-regeneratie. In de meeste andere leidraden wordt axon-regeneratie eigenlijk beoordeeld, in plaats van initiële axon-uitgroei. Het vermijden van axotomie vermijdt ook belangrijke potentiële verstorende factoren omdat de neuronen niet beschadigd zijn of onder stress.
De twee meest kritische stappen zijn de oriëntatie van de embryo's voor het snijden en minimaliseren van de tijd tussen euthanasie van de moeder en het plaatsen van de plakjes in de incubator. Embryo's moeten te allen tijde op ijs worden gehouden. Voor oriëntatie, we hebben geprobeerd verschillende mallen, maar vanwege de variabiliteit tussen embryo's op deze leeftijd, we hebben gevonden die oriëntatie met de hand, op basis van fluorescentie onder de ontleed Microscoop, is het meest effectief. Oriëntatie met de hand beperkt het embryonale tijdvenster dat kan worden bestudeerd, echter. Eerder dan E 10.0, is het een uitdaging om het segment goed te oriënteren, omdat het oog moeilijk te zien is en er maar heel weinig CN3 axonen kunnen worden gezien. Dit betekent echter dat we deze methode niet kunnen gebruiken om de vroegste Pioneer axon-uitgroei te bestuderen, omdat we die axonen op een deel manier moeten laten groeien om het segment te kunnen oriënteren.
Er zijn verschillende beperkingen voor de voorbereiding van de segment cultuur van Oculomotor. Het is vooral nuttig voor het bestuderen van vroege en tussentijdse oriëntatie beslissingen, in plaats van beslissingen over terminale vertakkingen. Bij E 10.5 zijn de EOMs alleen aanwezig als een spier-Anlage. Zelfs op latere tijdstippen, met de huidige beeldvormingstechnologie, kunnen afzonderlijke doel-EOMs niet binnen het segment worden onderscheiden. Specifieke terminale vertakkings beslissingen van de Oculomotor axonen kunnen daarom niet worden beoordeeld aan de huidige voorwaarden. Omdat de plakjes worden geteeld op poreuze weefselkweek membranen, post-cultuur scheiding van het membraan is moeilijk en vaak veroorzaakt weefselschade, waardoor antilichamen kleuring en HERMONTAGE voor extra beeldvorming mislukt. Hoewel de axonen niet worden gesneden, waardoor neuronale schade wordt geminimaliseerd, worden de omringende weefsels gesneden en daarom beschadigd, wat de signalering van de Cue-expressie of de vrijgave kan beïnvloeden. Het ideale tijdvenster is ook beperkt. Zoals hierboven vermeld, eerder dan E 10.0 oriëntatie van het segment is moeilijk, en na E 11.5, hebben veel axonen al de baan bereikt, dus tussentijdse oriëntatie beslissingen zijn al gemaakt.
Het preparaat vereist een microscoop met stage-top incubator, automatische fase, en time-lapse-capaciteit. De doelstellingen en de camera moeten worden geoptimaliseerd voorbeeld vorming van dikke specimens zonder clearing. Resolutie op het niveau van een enkele groei kegel, zoals mogelijk is met een aantal cultuur preparaten, is niet mogelijk met de huidige Imaging-opstelling. De beeldvormings parameters kunnen echter mogelijk worden aangepast om een hogere resolutie mogelijk te maken, met confocale of 2-fotonen microscopie, gericht op een klein gebied van elk segment (mogelijk aanpassen als het segment als axonen groeien). Met behulp van de huidige epifluorescerende Microscoop en beeldvorming elke 30 min, we hebben niet gezien photobleaching; confocale microscopie en frequentere beeldvorming kunnen worden gebruikt, maar fotobleaching zou een potentieel probleem worden.
Omdat kleine molecuul remmers kunnen hebben off-target effecten, met inbegrip van de algehele groei en de gezondheid van het segment, deze assay is het nuttigst als een screening-instrument. De resultaten moeten worden geverifieerd door andere methoden, zoals afdek Muismodellen. Bijvoorbeeld, met CXCR4 remming is er een milde verminderde totale groei van het segment (Zie Figuur 2), consistent met de meerdere functies van CXCR4. In muismodellen werd echter het in het segment vertoonde axon-fenotype23gerecapitculeerd.
Dit protocol kan worden aangepast om andere craniale zenuw populaties te bestuderen, hoewel voor elk ervan de juiste oriëntatie van de plakjes en de timing empirisch moet worden bepaald. Daarnaast kunnen muizen met verschillende fluorescerende etiketten worden gebruikt die verschillende subgroepen van neuronen markeren en/of die aanzetten tot eerdere of latere embryonale leeftijden.
De segment cultuur kan op verschillende manieren worden gemanipuleerd. We tonen hier een voorbeeld van het blokkeren van receptor signalering met een kleine molecuul remmer. Als alternatief kunnen antilichamen (ofwel receptor blokkerende of receptor activerende) of recombinante eiwitten, zoals axon geleidings signalen of groeifactoren, aan de media worden toegevoegd. Om te evalueren voor directionele effecten op axon-geleiding, kunnen ligand-afscheidende parels op specifieke locaties op het segment worden geplaatst. Met behulp van een van deze methoden kunnen vele andere axon-geleidings trajecten worden geïdentificeerd en bestudeerd in het oculaire motorsysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering door het National Eye Institute [5K08EY027850], Nationaal Instituut voor kindgezondheid en ontwikkeling [U54HD090255], Harvard-Vision Development Program [5K12EY016335], de Knights Templar Eye Foundation [carrière starter Grant], en de Children's Hospital Ophthalmologie Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
