Summary
En ex vivo skive analyse tillader oculomotoriske nerve udvækst at blive afbildet i realtid. Udsnit genereres ved at indlejre E 10.5 ISLMN: gfp -embryoner i agopstået, udskæring på en vibratome og vokser i en scene-top inkubator. Axon-vejlednings forløbene vurderes ved at tilføje inhibitorer til kultur medierne.
Abstract
Nøjagtige øjenbevægelser er afgørende for synet, men udviklingen af det okulære motorsystem, især de molekylære veje, der styrer Axon-vejledningen, er ikke fuldt belyst. Dette skyldes til dels de tekniske begrænsninger i de traditionelle Axon-vejlednings assays. For at identificere yderligere Axon-vejlednings signaler, der påvirker oculomotoriske-nerven, er en ex vivo-skive analyse til at afbilde okulomotor nerven i realtid, da den vokser mod øjet, udviklet. E 10.5 ISLMN-gfp- embryoner bruges til at generere ex vivo-skiver ved at indlejre dem i agopstået, udskæring på en vibratome og derefter dyrke dem i en mikroskop fase-top inkubator med tidsforskudt photomicroskopi for 24-72 h. kontroludsnit rekapitulere den in vivo timing af udvækst af axoner fra kernen til kredsløb. Små molekyle hæmmere eller rekombinante proteiner kan tilsættes til kultur medierne for at vurdere de forskellige Axon-vejlednings forløses rolle. Denne metode har fordelene ved at opretholde mere af det lokale mikromiljø, hvorigennem axoner Traverse, ikke axotomizing de voksende axoner, og vurdere axoner på flere punkter langs deres bane. Den kan også identificere effekter på bestemte undergrupper af axoner. For eksempel, hæmning af CXCR4 forårsager axoner stadig inden for midthjernen til at vokse dorsalt snarere end Ventrally, men axoner, der allerede har forladt ventrally påvirkes ikke.
Introduction
Det okulære motorsystem giver et elegant system til undersøgelse af Axon-vejlednings mekanismerne. Det er relativt ukompliceret, bestående af tre kranielle nerver endelser seks ekstrokulære muskler (eoms) som bevæger øjet, og levator palpebrae superioris (LPS), som løfter øjenlåget. Den oculomotoriske nerve innervates LPS og fire EOMs-den ringere skrå og den mediale, ringere, og overlegne rectus femoris muskler. De to andre nerver, trochlear og bortførelser, hver eneste inderverer en muskel, den overlegne skrå og laterale rectus femoris muskel, hhv. Øjenbevægelser giver en nem aflæsning, viser, om innervation var passende, manglende eller afvigende. Derudover, der er menneskelige øjenbevægelser lidelser, der skyldes underskud i neuronal udvikling eller Axon vejledning, kollektivt betegnet de medfødte kranielle disinnervation lidelser (CCDDs)1.
På trods af disse fordele anvendes det okulære motorsystem sjældent i Axon-vejlednings studierne2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10på grund af tekniske ulemper. In vitro Axon vejlednings analyser har mange ulemper11. Co-Culture assays, hvor neuronal bruskeksplantater dyrkes sammen med bruskeksplantater af målvæv12 eller transficeret celler13, afhænger af både symmetri af forklarelsen og præcis positionering mellem forklaren og målvæv. Stripe assays14,15, hvor to stikord er fastlagt i vekslende striber og axoner vurderes for præference vækst på en stribe, kun indikerer, at et substrat er at foretrække frem for den anden, ikke at enten er attraktiv eller repulsiv, eller fysiologisk relevant. Microfluidics kamre kan danne præcise kemiske gradienter, men underkastes voksende axoner til at forskyde stress16,17,18, som kan påvirke deres vækst. Desuden kræver indsamling af bruskeksplantater eller dissocierede celler i hver af disse tilgange, at udvoksede axoner skal axotomiseret, og disse undersøgelser undersøger således faktisk Axon-regenerering i stedet for Initial Axon-udvækst. Endelig, disse in vitro tilgange fjerne det mikromiljø, der påvirker axoner og deres svar på signaler langs forskellige punkter i deres kursus, og traditionelt kun teste en cue i isolation. Sammenblanding af disse ulemper, den lille størrelse af hver kerne i det okulære motorsystem gør dissektion teknisk udfordrende for enten bruskeksplantater eller dissocierede kulturer. Desuden primære kulturer af okulære motoriske neuroner er normalt heterogene, har betydelig celledød, og er tæthed afhængige, der kræver pooling af celler fra flere embryoner (Ryosuki Fujiki, personlig kommunikation). In vivo metoder, dog, herunder knockout musemodeller, er upassende at bruge til screening, i betragtning af den tid og udgifter, der kræves.
Metoder udviklet til kultur hele embryoner19 tillade mærkning af migrerende celler20 eller blokade af specifikke molekyler21, men hele embryo kulturer kræver inkubation i rulle flasker, som udelukker real-time billeddannelse af mærkede Strukturer. Kirurgiske teknikker, der tillader manipulation af embryonet og derefter efterfølgende videre udvikling enten i livmoderen eller i maven af moderen (opretholdelse af placenta forbindelsen)22 er også muligt, men disse giver heller ikke tid-lapse Imaging.
For at overvinde hindringerne for in vitro-assays og muliggøre hurtig screening af signalerings veje blev der udviklet en ex vivo-kultur teknik for embryonale skiver23, der er tilpasset fra en tidligere offentliggjort protokol for perifere nerve udvækst24. Ved hjælp af denne protokol, kan udvikle oculomotoriske nerve blive afbildet over tid i nærværelse af mange af de omgivende strukturer langs dens bane, herunder EOM mål. Ved at tilføje små molekyle hæmmere, vækstfaktorer eller vejlednings signaler til kultur medierne kan vi vurdere vejlednings forstyrrelser på flere punkter langs Axon-forløbet, hvilket giver mulighed for en hurtigere vurdering af potentielle vækst-og vejlednings faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyre arbejde, der er beskrevet her, blev godkendt og udført i overensstemmelse med Boston children's Hospital institutionelle dyrepleje og brug Komité (IACUC) protokoller.
1. tidsindstillede parringer
- Placer ISLMN: gfp (Islet motor neuron grøn fluorescerende protein; MGI: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J Stock No: 017952) mandlige og hunmus sammen natten over. Vejning af hunnerne og plade Lodderne før parring.
Bemærk: ISLMN: gfp specifikt etiketter motor neuroner med en FARNESYLATED gfp, der ikke er cytotoksisk, lokaliserer til cellemembranen af motoriske neuroner og deres axons, og tillader nerver til at blive visualiseret under udvikling25. Andre fluorescently mærkede linjer kan også anvendes. - Check for vaginal stik tidligt om morgenen. Den dato, hvor et stik identificeres, betegnes som E 0.5.
- Bekræft graviditet ved hjælp af vægtøgning og/eller ultralyd ved E 10.5. Gravide dæmninger skulle have fået mindst 1 g. embryoner kan ses på ultralyd på E 10.5.
2. klargøring af reagenser og vibratome til skive kultur
- Forbered 500 mL skære buffer: Tilsæt 5 mL HEPES og 5 mL penicillin/streptomycin til 500 mL af Hank's afbalancerede salt opløsning (HBSS) uden ca2 + og mg2 +. Afkøer til 4 °C.
Bemærk: ekstra skære buffer skal opbevares ved 4 °C og kan bruges til fremtidige udsnit kultur eksperimenter. - Forbered 50 mL dyrkningsmedier: i en steril hætte tilsættes 12,5 mL HBSS, 12,5 mL føtal bovint serum, 250 μL glucose, 250 μL L-glutamin, 125 μL HEPES til 24,4 mL Fluorobright DMEM. (Afsluttende koncentrationer: FlouroBright DMEM med 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% glucose, 1 mM glutamin og 2,5 mM HEPES.). Opvarmer kulturmediet til 37 °C i et sterilt vandbad.
Bemærk: kultur medier kan opbevares ved 4 °C i op til 3 uger.- I en steril hætte tilsættes 1,5 mL kultur medier til hver brønd af en 6-brønd plade. Tilføj en cellekultur Indsæt (tabel over materialer) til hver brønd. Steril 37 °C og 5% CO2 -inkubator.
- Forbered 4% lavsmeltnings temperatur agopstået: 2 g lavsmeltnings temperaturer opløses i 50 mL steril PBS. Mikrobølgeovnen i 30-60 s intervaller, indtil den er helt opløst. Placer i et 40 °C vandbad for at holde væsken.
Bemærk: ekstra agopstået kan opbevares ved stuetemperatur (RT) og smeltes til fremtidige udsnit kultur eksperimenter. - Indstil vibratome: Placer en ny kniv på vibratome. Kontroller indstillinger: tykkelse 400-450 μm. pre-chill vibratome scenen. Anbring lidt is i yder kammeret. Brug et kammer og en scene dedikeret til levende skiver. Brug ikke det samme vibratome kammer til fast væv, da rest fikseringsmiddel kan beskadige skiver.
- Forbered mikroskop Stage topinkubator til 37 °C og 5% CO2.
- Forbered dissektion: Rengør kirurgiske instrumenter og spray med 70% ethanol. Fyld to Petri skåle med HBSS, Placer på is. Åbn en 12 brønd vævskultur plade og Anbring låget på isen med undersiden opad. Åbn en 6 brønd vævskultur plade og Placer cellekultur membran skær og 1,5 mL cellekultur medier i hver brønd. Forvarm pladen i en 37 °C og 5% CO2 inkubator.
3. høst E 10.5 embryoner og klargøring af skiver
Bemærk: alle trin fra dette punkt skal gøres så hurtigt som muligt. Opbevar embryonerne på is til enhver tid.
- Euthanize den gravide dæmning (E 10.5) i et CO2 kammer. Udfør livmoderhals dislokation.
- Spray maven med 70% ethanol. Skær åbne maven med en saks, fjerne livmoderen og placere den i en Petri skål med iskold HBSS til hurtigt at vaske væk blod. Flyt den vaskede livmoder til en anden Petri fyldt med parabol iskold HBSS.
- Under en dissekere anvendelsesområde, fjerne embryoner fra livmoder horn og individuelle amniotiske SACs. Placer embryonerne på undersiden af låget på en 12-brønd plade. Hold på is.
- Brug filtrerpapir under et dissekting-område for at fjerne enhver væske, der omgiver hvert embryo.
Bemærk: embryonerne vil holde sig til filter papiret, hvis de berøres. - Integrer embryoner i agopstået. Hæld smeltet agopstået over hvert embryo til at dække det. Hold på is. Så snart aghas er hærdet, flip hvert embryo og hæld yderligere agopstået på den anden side. Hold på is.
- Ved hjælp af et fluorescerende dissekere område, trim agopstået omkring hvert embryo, så det vil blive orienteret korrekt, når limet til vibratome scenen. Den oculomotoriske kerne og tidlig Axon udvækst er fluorescerende. Ret embryonet ind, så kernen, de udvoksende axoner og øjet danner en linje, og trim agopstod med en kniv skåret parallelt med denne linje (dorsal til embryonet, se figur 1a).
Bemærk: Dette vil være den side limet til vibratome scenen (embryonet vil blive placeret på ryggen, hovedet tættest på vibratome bladet). En linje mellem okulomotor kernen og øjet skal være parallel med vibratome bladet. - Fyld vibratome kammeret med iskold skive buffer. Superlim embryonet til vibratome scenen, så klingen vil være parallel med oculomotoriske kernen og øjnene. Når superlim er tør, nedsænkes vibratome scenen, så embryonet vender væk fra bladet.
- Skær 400-450 μm skiver. Saml hver skive med et sterilt overførings pipet. Placer i kold skære buffer.
- Under den dissekere anvendelsesområde, skal du vælge den skive, der indeholder den okulomotor kerner og øjne. Ved hjælp af en steril overførsel pipet, placere det på cellen kultur Indsæt i 6 brønd pladen. Returner pladen til 37 °C-inkubator. Alternativt har en person udskæring og en anden placering af skiver. Minimer tiden mellem udskæring og placering i inkubator.
Bemærk: skiver skal orienteres på en sådan måde, at den maksimale fluorescens, der udsendes fra kerner og axoner, er tættest på målet for billedbehandlings mikroskopet. På et inverteret mikroskop skal skiverne placeres på membranen med kerner og axoner tættest på målet under pladen. - Fjern den resterende agopstået fra vibratome scenen, superlim det næste embryo til scenen og Gentag trin 3.7-3.9, indtil alle embryoner er skåret og belagt.
- Tilføj inhibitor eller rekombinant molekyle af valg til medier i hver brønd for at skabe en dosis-respons kurve. Fortyndes i passende opløsningsmiddel.
Bemærk: Brug kun DMSO i vævskultur kvalitet, hvis du bruger DMSO. Alternativt kan protein-elueringsperler placeres på bestemte steder på skiven. - Mikroskop i 37 °C og 5% CO2 kammer. Indstil mikroskopet til at tage fasekontrast og fluorescerende fotografier af hver skive hver 30 min (eller oftere, hvis det ønskes). Skiver kan vedligeholdes for 48-72 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normale resultater: figur 1 giver en skematisk af eksperimentet. Begyndende så tidligt som E 9.5 i mus begynder de første axoner at dukke op fra oculomotoriske Nucleus26. Ved E 10.5, en fasciculated oculomotoriske nerve, som indeholder de tidlige Pioneer neuroner, kan ses i mesenchyme. Der er betydelig variation mellem embryoner på E 10.5 (selv inden for samme kuld) i hvor langt nerven er skredet mod kredsløb, sandsynligvis på grund af udviklingsmæssige forskelle på et par timer. Under normal i utero udvikling, de første gfp-positive oculomotoriske axoner nå kredsløb/øje over den næste 18-24 h (ved e 11.5), og derefter begynde forgrening til deres endelige mål27. I Skive kultur gentages denne timing (figur 2, video 1). Udsnittet vokser og udvides (i alle retninger) for op til 72 h, og axoner kan ses strækker sig fra kernen mod øjet. Vi har fundet den første 36-48 h mest nyttige til vurdering af oculomotoriske Axon outgrowth. Motor neuroner kan undertiden ses bevæger sig i kernen (ikke vist). I nogle skiver, afhængigt af orienteringen, er trochlear-kernen også til stede. Trochlear axoner strækker sig sideværts i Skive og ofte stall, fordi deres normale kurs er at forlade trochlear Nucleus sideværts, før du tænder dorsalt og caudally, som ville være ude af skiven. Lejlighedsvis, trochlear axoner synes at slutte sig til oculomotoriske axoner og drej mod øjet, hvilket gør skiven svær at fortolke, da disse axoner kan have en sekundær effekt på vejledning af oculomotoriske axoner.
Eksempel på at hæmme en vigtig Axon Guidance pathway: Inhibe ring CXCR4 signalering forårsager dorsale i stedet for ventrale vækst af oculomotoriske axons. Vi vurderede rollen af CXCR4 signalering på oculomotoriske udvikling ved at tilføje 1 μg/mL (1,26 μM) af AMD3100, en vandopløselig lille molekyle hæmmer af CXCR428, direkte til kultur medierne, så snart udsnitskulturen er forberedt. Den oculomotoriske axoner kan derefter ses forlader oculomotoriske Nucleus dorsalt og vokser væk fra kredsløb ("baglæns") (figur 2, video 2). De axoner, der allerede havde forladt midthjernen og var på vej til bane ved E 10.5 fortsætte på deres vej. Hæmning af CXCR4 påvirker også den samlede vækst af skive.
Orientering af skive er afgørende. Udsnit kan ikke fortolkes, hvis de ikke er korrekt orienteret. Nogle eksempler på forkert orienterede udsnit er vist i figur 3. Hvis embryonet er vippes til sin side, er der kun én oculomotoriske-kerne i Skive (figur 3A). Hvis det indlejrede embryo er vippes for langt mod ryggen, er øjnene ikke i skiven, og i stedet kan den øvre lemmer og baghjerne eller rygmarv være i Skive (figur 3B). I dette tilfælde er den normale bane af oculomotoriske axoner ikke til stede, og de har tendens til at vokse tilfældigt. Under placering af skive på kultur membranen, kan det blive foldet (figur 3C).
Opløsningsmidler kan være giftige. Der skal udvises forsigtighed ved opløsning af inhibitorer eller vækstfaktorer i organiske opløsningsmidler. Figur 4 viser et eksempel på en skive, der døde efter tilsætning af ethanol til medierne. 118 μL blev tilsat 1,5 mL af mediet (endelig koncentration 7,8%), og denne høje koncentration viste sig giftig. For at forhindre dette, opløse opløselig i den mindste mængde af opløsningsmiddel muligt (til grænsen for opløselighed). Når det er muligt, opløses i vand. Hvis DMSO anvendes, sikre, at det er steril, væv kultur klasse DMSO.
Figur 1 : Skematisk. E 10.5 ISLMN-Gfp embryoner (A: foto, B: skematisk) er skåret på en vibratome (400-450 μm tyk), således at sektioner omfatter både oculomotoriske kerne og kredsløb. Parallelle stiplede linjer i A og B angiver placeringen af vibratome-udskæringerne. Den nedre stiplede linje i en viser, hvor den agerede skal beskæres og limes til vibratome scenen. (C) sektioner er lagt fladt på en vævs-kultur membran, tillader udveksling af næringsstoffer og gasser, og placeres i en Stage-top inkubator for tidsforskudt mikroskopi. På dette stadium kan inhibitorer tilsættes til vækstmediet. (D) kulturer kan opretholdes for 24-72 h, og oculomotoriske axoner kan ses vokser til øjet. Tilpasset med tilladelse fra Whitman, et. al. 201823. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Hæmning af CXCR4 forårsager CN3 forkert routing. Skær kulturer fra e 10.5 ISL-gfp embryoner afbildet på 0, 12, 24 og 36 h i kulturen. Det øverste panel viser en vild-type kontrol embryo og CN3 (grøn) vokser mod øjnene og grene udførligt i løbet af 36 h. Se også video 1. Det nederste panel viser et udsnit med 1 μg/ml AMD3100 (specifik inhibitor til CXCR4) tilsat og axoner udgang oculomotoriske Nucleus dorsally. Dem, der allerede havde forladt ventrally fortsætte mod øjet. Se også video 2. D: dorsal, V: ventral, E: Eye, N: oculomotoriske Nucleus, SMN: spinal motor neuroner, pile: oculomotoriske axoner (hvid: dværg projektion, gul: afvigende projektioner). Skalalinjen er lig med 200 μm. Se også video 1 og video 2. Et lignende tal, der viser andre eksempler, blev præsenteret i Whitman, et. al. 201823. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Retningen af skiverne er afgørende. Indledende billeder (tid 0 h) af repræsentative fejl orienterede udsnit. A viser en skive, hvor embryonet blev vippes til siden sådan, at projicere CN3 axoner blev axotomized. Projicering af axoner er kun til stede i højre side af udsnittet (pil). B viser en skive, hvor embryonet blev vippes tilbage, så CN3 kerner med projicering af axoner (pil) er synlige bilateralt, men øjnene er ikke til stede i Skive. I stedet spinal motor neuroner (SMN) og motor neuron fremskrivninger til lemmer kan ses. C viser et udsnit, der foldes under placeringen på membranen. Skiver som dem, der er vist her, skal kasseres. Skala søjler repræsenterer 500 μm i hvert panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Opløsningsmidler kan være giftige. Tidsforskudt billeddannelse af skive kulturer fra E 10.5 ISL-GFP-embryoner ved 0 og 12 timer i kulturen. En skive, der dyrkes i medier uden tilsætningsstoffer (A-B) , vokser normalt i 12 timer med CN3 axoner, der projicerer mod øjet. En skive, der dyrkes i medier med en høj koncentration af ethanol (7,8%) (C-D) vokser ikke normalt. Ved 12 h, CN3 er ikke vokset og er næppe synlig, og vævet er begyndt at disintegrér. Skala søjler repræsenterer 500 μm i hvert panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: CN3 udvækst i Skive kultur. Tidsforskudt billeddannelse af en kontrol skive kultur fra et E 10.5 ISL-GFP-embryo. Billeder taget hver 30 min over 18 h i kulturen. CN3 (grøn) vokser fra kernen (top) mod øjnene og begynder forgrening. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 2: Mistargeting af CN3 med hæmning af CXCR4 signalering. Tidsforskudt billeddannelse af skive kulturer fra E 10.5 ISL-GFP-embryoner over 48 h i kulturen. Når 1 μg/ml AMD3100 (specifik inhibitor til CXCR4) tilsættes direkte til medierne, CN3 axoner, der endnu ikke er i periferien, udgang oculomotoriske Nucleus dorsalt (venstre) i stedet for ventrally (højre). Genoptrykt med tilladelse fra Whitman, et. al. 201823. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne ex vivo Slice-kultur protokol giver betydelige fordele i forhold til traditionelle Axon-vejlednings assays23. Størrelsen af hver kranie motor kerne er ikke en begrænsende faktor, og ingen vanskelig dissektion er nødvendig. Den endogene mikromiljø, hvorigennem axoner rejse vedligeholdes, tillader ændring af en signalering pathway samtidig bevare andre signalering veje. Derudover kan virkningerne vurderes på forskellige punkter langs Axon-forløbet. Da Axon vejledning kræver flere signaler, og kombinationer af cues, langs stien29, dette giver en betydelig fordel. I modsætning til dissocierede eller forklarende kulturer, er voksende axoner ikke skæres i denne forberedelse, så indledende Axon udvækst kan vurderes, snarere end Axon regenerering. I de fleste andre vejlednings undersøgelser er Axon regenerering faktisk ved at blive vurderet, snarere end Initial Axon outgrowth. Undgå axotomi undgår også betydelige potentielle forstyrrende faktorer, fordi neuronerne ikke er beskadiget eller under stress.
De to mest kritiske trin er orienteringen af embryonerne til udskæring og minimering af tiden mellem eutanasi af moderen og placeringen af skiverne i inkubator. Embryonerne skal til enhver tid holdes på is. Til orientering har vi prøvet flere forskellige forme, men på grund af variabilitet mellem embryoner i denne alder, har vi konstateret, at orienteringen i hånden, baseret på fluorescens under den dissekere mikroskop, er mest effektiv. Orientering i hånden begrænser den embryonale tidsvindue, der kan undersøgt, dog. Tidligere end e 10.0, orientering skiven ordentligt er udfordrende, fordi øjet er svært at se, og meget få CN3 axoner kan ses. Dette betyder dog, at vi ikke kan bruge denne metode til at studere den tidligste pioner Axon outgrowth, som vi har brug for at tillade disse axoner til at vokse ud del måde at være i stand til at orientere skive.
Der er flere begrænsninger for oculomotoriske skive kultur forberedelse. Det er mest nyttigt til at studere tidlige og mellemliggende vejlednings beslutninger, snarere end Terminal forgreningsbeslutninger. På E 10.5 er EOMs kun til stede som en muskel Anlage. Selv på senere tidspunkter, med den nuværende billedteknologi, kan individuelle måleoms ikke skelnes i Skive. Specifikke Terminal forgreningsbeslutninger i oculomotoriske-axonerne kan derfor ikke vurderes med de aktuelle forhold. Fordi skiver dyrkes på porøse vævskultur membraner, er post-kultur adskillelse fra membranen vanskelig og ofte forårsager vævsskader, hvilket gør antistof farvning og genmontering for yderligere billeddannelse mislykket. Selvom axonerne ikke skæres, og derved minimerer neuronal skade, skæres de omgivende væv og derfor beskadiget, hvilket kan påvirke signalering cue udtryk eller frigivelse. Det ideelle tidsvindue er også begrænset. Som nævnt ovenfor, tidligere end e 10.0 orientering af skive er vanskelig, og efter e 11.5, mange axoner har allerede nået kredsløb, så mellemliggende vejlednings beslutninger er allerede blevet truffet.
Præparatet kræver et mikroskop med Stage-top inkubator, automatisk fase, og time-lapse kapacitet. Målsætningerne og kameraet skal optimeres til billeddannelse af tykke prøver uden clearing. Resolution på niveau med en enkelt vækst kegle, som det er muligt med nogle kultur præparater, er ikke muligt med den nuværende Imaging set-up. Billedbehandlings parametrene kan dog muligvis tilpasses, så de giver en højere opløsning, med konfokale-eller 2-photon-mikroskopi, med fokus på et lille område af hver skive (eventuelt justeret som skive som axoner vokser). Ved hjælp af den nuværende epifluorescerende mikroskop og Imaging hver 30 min, har vi ikke set foto blegning; der kunne anvendes Konfokal mikroskopi og hyppigere billeddannelse, men foto blegning ville blive et potentielt problem.
Fordi små molekyle hæmmere kan have off-Target effekter, herunder på den samlede vækst og sundhed af skive, denne analyse er mest nyttig som et screeningsværktøj. Resultaterne skal verificeres ved andre metoder, såsom knockout-musemodeller. For eksempel, med CXCR4 hæmning, der er mild nedsat samlede vækst af skive (Se figur 2), i overensstemmelse med de mange funktioner i CXCR4. I musemodeller blev Axon-Fænotypen, som blev set i udsnittet, imidlertid opsummeret23.
Denne protokol kan ændres for at studere andre kranielle nerve populationer, selv om den korrekte orientering af skiver og timing skal fastsættes empirisk. Derudover kan mus med forskellige fluorescerende etiketter anvendes, der markerer forskellige undergrupper af neuroner og/eller som tænder på tidligere eller senere embryonale aldre.
Udsnitskulturen kan manipuleres på flere måder. Vi viser her et eksempel på blokering receptor signalering med en lille molekyle inhibitor. Alternativt, antistoffer (enten receptor blokering eller receptor aktivering) eller rekombinante proteiner, såsom Axon vejledning signaler eller vækstfaktorer, kunne tilsættes til medierne. For at evaluere retningsbestemte effekter på Axon-vejledning kan der anbringes ligand-secerende perler på udsnittet på bestemte steder. Ved hjælp af en af disse metoder kan mange andre Axon-vejledningsforløb identificeres og undersøgt i det okulære motorsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansiering fra National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute for Child sundhed and Development [U54HD090255], Harvard-vision klinisk videnskabsmand udviklings program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [Career starter Og børnehospitalet oftalmologi Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE er et Howard Hughes Medical Institute investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
