Summary

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo

Published: July 16, 2019
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Summary

Un présagéex-invivo permet d’imaginer l’excroissance du nerf oculomoteur en temps réel. Les tranches sont générées par l’intégration d’embryons E10.5 IslMN:GFP dans l’agarose, en coupant sur un vibratome et en grandissant dans un incubateur de toit de scène. Le rôle des voies de guidage d’axone est évalué en ajoutant des inhibiteurs aux médias de culture.

Abstract

Les mouvements précis des yeux sont cruciaux pour la vision, mais le développement du système moteur oculaire, en particulier les voies moléculaires contrôlant le guidage des axones, n’a pas été entièrement élucidé. Cela est dû en partie aux limitations techniques des essais traditionnels de guidage d’axone. Pour identifier les indices additionnels de guidage d’axone influençant le nerf oculomoteur, un assay de tranche ex vivo pour imager le nerf oculomoteur en temps réel pendant qu’il se développe vers l’oeil a été développé. E10.5 Les embryons Isl MN-GFP sont utilisés pour générer des tranches ex vivo en les incorporant dans l’agarose, en les coupant sur un vibratome, puis en les cultivant dans un incubateur au microscope avec photomicroscopie en accéléré de 24 à 72 h. Les tranches de contrôle récapitulent le moment in vivo de la croissance des axones du noyau à l’orbite. Des inhibiteurs de petites molécules ou des protéines recombinantes peuvent être ajoutés au support culturel pour évaluer le rôle de différentes voies de guidage des axones. Cette méthode a l’avantage de maintenir une plus grande partie du microenvironnement local par lequel les axones traversent, et non pas d’axotomiser les axones en croissance, et d’évaluer les axones à plusieurs points le long de leur trajectoire. Il peut également identifier des effets sur des sous-ensembles spécifiques d’axones. Par exemple, l’inhibition du CXCR4 provoque une croissance dorale des axones dans le cerveau moyen plutôt que ventrale, mais les axones qui sont déjà sortis ventrales ne sont pas affectés.

Introduction

Le système moteur oculaire fournit un système élégant pour étudier les mécanismes de guidage des axones. Il est relativement simple, composé de trois nerfs crâniens intériorisant six muscles extraoculaires (EOM) qui déplacent l’œil, et le levator palpebrae superioris (LPS) qui soulève la paupière. Le nerf oculomoteur intémine les LPS et quatre EOM – les muscles inférieurs obliques et les muscles rectus médiaux, inférieurs et supérieurs. Les deux autres nerfs, le trochlear et les abducens, chacun seulement innervate un muscle, le muscle supérieur oblique et latéral de rectus, respectivement. Les mouvements des yeux fournissent une lecture facile, montrant si l’innervation était appropriée, manquante ou aberrante. En outre, il y a des désordres humains de mouvement d’oeil qui résultent des déficits dans le développement neuronal ou le guidage d’axone, collectivement appelé les désordres crâniens congénitaux de disinnervation (CCDDs)1.

Malgré ces avantages, le système moteur oculaire est rarement utilisé dans les études de guidage d’axone2,3,4,5,6,7,8, 9 (en) , 10, en raison d’inconvénients techniques. Les tests de guidage d’axone in vitro ont beaucoup d’inconvénients11. Les essais de co-culture, dans lesquels les explants neuronaux sont cultivés ensemble avec des explants de tissu cible12 ou des cellules transfectées13,dépendent à la fois de la symétrie de l’explantation et du positionnement précis entre l’explante et le tissu cible. Les essais à rayures14,15, dans lesquels deux indices sont posés en rayures alternées et les axones sont évalués pour une croissance préférentielle sur une bande, indiquent seulement qu’un substrat est préférable à l’autre, non pas que l’un ou l’autre est attrayant répugnant, ou physiologiquement pertinent. Les chambres microfluidiques peuvent former des gradients chimiques précis, mais les axones de plus en plus de sujet pour cisailler le stress16,17,18, qui peuvent affecter leur croissance. En outre, dans chacune de ces approches, la collecte d’explants ou de cellules dissociées exige que les axones de croissance soient axotomisés et donc ces essais examinent réellement la régénération d’axone, plutôt que la croissance initiale d’axone. Enfin, ces approches in vitro éliminent le microenvironnement qui influence les axones et leurs réponses aux indices le long de différents points de leur cours, et traditionnellement seulement tester un signal dans l’isolement. En plus de ces inconvénients, la petite taille de chaque noyau dans le système moteur oculaire rend la dissection techniquement difficile pour les explantations ou les cultures dissociées. En outre, les cultures primaires des neurones moteurs oculaires sont habituellement hétérogènes, ont la mort cellulaire significative, et sont dépendantes de densité, exigeant la mise en commun des cellules des embryons multiples (Ryosuki Fujiki, communication personnelle). Les méthodes in vivo, cependant, y compris les modèles de souris knock-out, sont inappropriés à utiliser pour le dépistage, compte tenu du temps et des dépenses requises.

Les méthodes développées pour la culture d’embryons entiers19 permettent l’étiquetage des cellules migratrices20 ou le blocus de molécules spécifiques21, mais les cultures d’embryons entiers nécessitent l’incubation dans des bouteilles à rouleaux, ce qui empêche l’imagerie en temps réel de l’étiquetage Structures. Les techniques chirurgicales qui permettent la manipulation de l’embryon, puis le développement ultérieur soit dans l’utérus ou dans l’abdomen de la mère (maintien de la connexion placentaire)22 sont également possibles, mais ceux-ci ne permettent pas non plus time-lapse Imagerie.

Pour surmonter les obstacles des essais in vitro et permettre un dépistage rapide des voies de signalisation, une technique de culture de tranches embryonnaires ex vivo a été développée23, adaptée d’un protocole précédemment publié pour la croissance nerveuse périphérique24. Grâce à ce protocole, le nerf oculomoteur en développement peut être représenté au fil du temps en présence de nombreuses structures environnantes le long de sa trajectoire, y compris les cibles de l’OME. En ajoutant des inhibiteurs de petites molécules, des facteurs de croissance ou des indices de guidage aux médias de culture, nous pouvons évaluer les perturbations de guidage à plusieurs points le long de la trajectoire d’axone, permettant une évaluation plus rapide des facteurs de croissance et d’orientation potentiels.

Protocol

Tous les travaux sur les animaux décrits ici ont été approuvés et exécutés conformément aux protocoles du Boston Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Accouplements chronométrés Placez ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg (Isl-EGFP)1Slp/J Stock No: 017952) souris mâles et femelles ensemble pendant la nuit. Peser les femelles et enregistrer le…

Representative Results

Résultats normaux : La figure 1 fournit un schéma de l’expérience. Commençant dès E9.5 dans la souris, les premiers axones commencent à émerger du noyau oculomoteur26. Par E10.5, un nerf oculomoteur fasculé, qui contient les premiers neurones pionniers, peut être vu dans le mésenchyme. Il existe une variabilité significative entre les embryons à E10.5 (même dans la même portée) dans la mesure dans laquelle le nerf a progressé vers l’orbite, probablemen…

Discussion

Ce protocole de culture de tranche ex vivo fournit des avantages significatifs au-dessus des essais traditionnels de guidage d’axone23. La taille de chaque noyau moteur crânien n’est pas un facteur limitant, et aucune dissection difficile n’est nécessaire. Le microenvironnement endogène à travers lequel les axones voyagent est maintenu, permettant la modification d’une voie de signalisation tout en maintenant d’autres voies de signalisation. En outre, les effets peuvent être évalués à diff…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financement fourni par le National Eye Institute [5K08EY027850], le National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Le Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], la Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], et la Children’s Hospital Ophthalmology Foundation [Prix de découverte de la Faculté]. ECE est un chercheur de l’Institut médical Howard Hughes.

Materials

24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors – Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

References

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Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

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