Summary
Экзвио ломтик асссе позволяет oculomotor нервный рост, чтобы быть изображены в режиме реального времени. Фрагменты генерируются путем встраивания E10.5 IslMN:GFP эмбрионов в агарозе, нарезки на вибратом, и растет в стадии верхней инкубатора. Роль аксонов пути руководства оценивается путем добавления ингибиторов в культуре средств массовой информации.
Abstract
Точные движения глаз имеют решающее значение для зрения, но развитие глазной двигательной системы, особенно молекулярных путей контроля аксон руководства, не были полностью выяснены. Отчасти это связано с техническими ограничениями традиционных аксонов. Для выявления дополнительных аксонов наведения сигналы, влияющие на окуломоторный нерв, ex vivo ломтик асссе для изображения окуломоторного нерва в режиме реального времени, как он растет к глазу был разработан. E10.5 IslMN-GFP эмбрионы используются для создания ex vivo ломтики путем встраивания их в агарозу, нарезка на вибратом, а затем выращивать их в микроскоп этапе инкубатор с замедленной фотомикроскопии для 24-72 ч. Контроль ные части recapitulate in vivo синхронизации нарастания аксонов от ядра до орбиты. Небольшие молекулярные ингибиторы или рекомбинантные белки могут быть добавлены в культурные носители для оценки роли различных путей наведения аксона. Этот метод имеет преимущества поддержания большей части локальной микросреды, через которую пересекают аксоны, а не аксотомизации растущих аксонов, и оценки аксонов в нескольких точках по их траектории. Он также может определить влияние на конкретные подмножества аксонов. Например, ингибирование CXCR4 вызывает аксоны еще в середине мозга расти дорсально, а не венттально, но аксоны, которые уже вышли венттально не влияет.
Introduction
Глазная моторная система обеспечивает элегантную систему для исследования механизмов наведения аксона. Это относительно несложный, состоящий из трех черепных нервов, иннервирующих шесть экстраокулярных мышц (EOMs), которые двигают глаз, и леватор palpebrae superioris (LPS), который поднимает век. Окуломоторный нерв иннервирует LPS и четыре EOMs - нижние косые и медиальный, нижний, и превосходные мышцы прямой кишки. Два других нерва, trochlear и abducens, каждый только innervate одной мышцы, выше косой и боковой мышцы прямой кишки, соответственно. Движения глаз обеспечивают легкое считывание, показывая, если иннервация была уместной, отсутствует, или аномальные. Кроме того, Есть человеческие расстройства движения глаз, которые являются результатом дефицита в развитии нейронов или аксон руководства, коллективно называют врожденные расстройства дезиннервации черепа (CCDDs)1.
Несмотря на эти преимущества, глазная моторная системаредко используется в исследованиях аксона 2,3,4,5,6, 8, 9 До 9 , 10, из-за технических недостатков. In vitro axon руководство анализы имеют много недостатков11. Анализы сокультуры, в которых нейрональные экспланты культивируются вместе с высадками целевой ткани12 или транс-инфицированных клеток13,зависят как от симметрии экспланта, так и от точного позиционирования между эксплантировой и целевой тканью. Полоса анализы14,15, в котором два сигнала изложены в чередующихся полос и аксонов оцениваются для преференциального роста на одной полосе, только указывают, что один субстрат предпочтительнее другого, не то, что либо является привлекательным или отталкивающим, или физиологически актуальным. Microfluidics камеры могут образовывать точные химические градиенты, но при условии выращивания аксонов сдвига стресс16,17,18, которые могут повлиять на их рост. Кроме того, в каждом из этих подходов, сбор explants или диссоциированных клеток требует, чтобы перерастания аксонов быть акотомизированы и, таким образом, эти анализы на самом деле изучить аксон регенерации, а не первоначальный аксон рост. Наконец, эти подходы in vitro удаляют микросреду, которая влияет на аксоны и их реакцию на сигналы по разным точкам их курса, и традиционно тестируют только один сигнал в изоляции. Усугубляя эти недостатки, небольшой размер каждого ядра в глазной двигательной системе делает вскрытие технически сложным для эксплантированных или диссоциированных культур. Кроме того, первичные культуры глазных моторных нейронов, как правило, неоднородны, имеют значительную гибель клеток, и зависят от плотности, требуя объединения клеток из нескольких эмбрионов (Ryosuki Fujiki, личное общение). In vivo методы, однако, в том числе нокаут мыши модели, не уместны для использования для скрининга, учитывая время и расходы, необходимые.
Методы, разработанные для культуры целых эмбрионов19 позволяют маркировки мигрирующих клеток20 или блокады конкретных молекул21, но целые культуры эмбриона требуют инкубации в роликовых бутылках, что исключает в режиме реального времени изображения помечены Структуры. Хирургические методы, которые позволяют манипуляции эмбриона, а затем последующее дальнейшее развитие либо в матке или в брюшной полости матери (поддержание плацентарной связи)22 также возможны, но они также не позволяют промежуток времени Изображений.
Чтобы преодолеть препятствия in vitro анализы и позволяют быстрый скрининг сигнальных путей, ex vivo эмбриональных срез культуры техника была разработана23, адаптированы из ранее опубликованного протокола для периферических нервных нарастания24. Используя этот протокол, развивающийся окуломоторный нерв может быть изображен с течением времени в присутствии многих окружающих структур по его траектории, включая цели EOM. Добавляя небольшие молекулярные ингибиторы, факторы роста или сигналы руководства к культурным носителям, мы можем оценить возмущения руководства в нескольких точках вдоль траектории аксона, что позволяет более быстро оценивать потенциальные факторы роста и руководства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все работы по уходу за животными, описанные здесь, были утверждены и выполнены в соответствии с протоколами Бостонской детской больницы по уходу за животными и использованию (IACUC).
1. Приуроченные спаривания
- Место ISLMN:GFP (Islet Motor Нейрон Зеленый флуоресцентный белок; MGI: J:132726; Jax Tg (Isl-EGFP)1Slp/J Stock No: 017952) мужские и женские мыши вместе на ночь. Взвешивание самок и рекордные веса до спаривания.
ПРИМЕЧАНИЕ: ISLMN:GFP специально этикетки моторных нейронов с фарнезилатной GFP, который не является цитотоксическим, локализуется в клеточной мембране моторных нейронов и их аксонов, и позволяет нервы быть визуализированы во время развития25. Другие флуоресцентно помеченные линии также могут быть использованы. - Проверьте наличие вагинальных пробок ранним утром. Дата идентификации штепсельной вилки обозначена как E0.5.
- Подтвердите беременность с помощью увеличения веса и/или ультразвука при Е10.5. Беременные плотины должны были получить по крайней мере 1 г. Эмбрионы можно увидеть на УЗИ на E10.5.
2. Подготовка реагентов и вибратом для среза культуры
- Подготовка 500 мл нарезки буфера: добавить 5 мл HEPES и 5 мл пенициллина / стрептомицина до 500 мл цистерны Хэнка сбалансированного соляного раствора (HBSS) без Ca2 "и Mg2". Охладите до 4 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный буфер нарезки должен храниться при 4 градусах Цельсия и может использоваться для будущих экспериментов по культуре срезов. - Подготовка 50 мл культурных носителей: В стерильный капюшон добавьте 12,5 мл HBSS, 12,5 мл сыворотки плода крупного рогатого скота, 250 л глюкозы, 250 л L L-глютамина, 125 л HEPES до 24,4 мл Фторобрайт ДМЭм. (Окончательные концентрации: FlouroBright DMEM с 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% глюкозы, 1 мМ глутамин, и 2,5 мм HEPES.). Разогрейте культурные носители до 37 градусов по Цельсию в стерильной водяной бане.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культура носителя может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 3 недель.- В стерильных капюшонах добавьте 1,5 мл культурных носителей к каждому колодцу 6-колодца. Добавьте вставку культуры ячейки(Таблица материалов) к каждому колодцу. Поместите в стерильный инкубатор 37 градусов по Цельсию и 5% CO 2.
- Приготовьте 4% низкоплавительной температуры агарозы: растворите 2 г низкоплавивой температуры агарозы в 50 мл стерильной PBS. Микроволновая печь в 30-60 с интервалами до полного растворения. Поместите в водяную ванну 40 градусов, чтобы сохранить жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные агарозы могут храниться при комнатной температуре (RT) и расплавленного для будущих экспериментов культуры ломтик. - Настройка вибратом: Поместите новое лезвие на вибратом. Настройки проверки: толщина 400-450 мкм. Предварительно охладить стадию вибратом. Поместите немного льда во внешнюю камеру. Используйте камеру и сцену, посвященную живым срезам. Не используйте ту же камеру вибратом для фиксированной ткани, как остаточный фиксатор может нанести ущерб ломтикам.
- Подготовка микроскопа стадии верхней инкубатора до 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
- Подготовка к вскрытию: Чистые хирургические инструменты и спрей с 70% этанола. Заполните две блюда Петри hBSS, поместите на лед. Откройте 12 хорошо ткани культуры пластины и поместите крышку на лед с нижней вверх. Откройте 6 хорошо ткани культуры пластины и место клеточной культуры мембраны вставки и 1,5 мл клеточной культуры средств массовой информации в каждом колодце. Предварительно разогреть тарелку в инкубаторе 37 градусов по Цельсию и 5% CO 2.
3. Сбор эмбрионов E10.5 и приготовление ломтиков
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги с этой точки должно быть сделано как можно быстрее. Держите эмбрионы на льду в любое время.
- Эвтаназия беременной плотины (E10.5) в камере CO2. Выполните вывих шейки матки.
- Спрей живота с 70% этанола. Разрежьте живот ножницами, удалите матку и поместите ее в чашку Петри с ледяным HBSS, чтобы быстро смыть кровь. Переместите промытую матку ко второму Петри, наполненного ледорубом HBSS.
- Под вслековкающим прицелом, извлеките зародыши от утробного рожочка и индивидуальных амниотических мешков. Поместите эмбрионы на нижней стороне крышки 12 хорошо пластины. Продолжайте на льду.
- Под областью вскрытия используйте фильтровальную бумагу для удаления любой жидкости, окружающей каждый эмбрион.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы будут придерживаться фильтровальной бумаги, если коснулся. - Встраиваем эмбрионы в агарозу. Налейте расплавленной агарозы над каждым эмбрионом, чтобы покрыть его. Продолжайте на льду. Как только агароз затвердевает, переверните каждый эмбрион и вылейте дополнительные агарозы на другую сторону. Продолжайте на льду.
- Используя флуоресцентный расчленяющий область, обрезать агарозу вокруг каждого эмбриона, чтобы он был правильно ориентирован при приклеении к стадии вибратом. Ядро окуломоторного ядра и ранний аксон ный рост флуоресцентные. Выровнять эмбрион так, чтобы ядро, перерастая аксоны, и глаз образуют линию, и обрезать агарозу с лезвием бритвы, вырезанным параллельно этой линии (дорсаль к эмбриону, см. Рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет сторона приклеенные к стадии вибратом (эмбрион будет расположен на спине, голова ближе к лезвию вибратом). Линия между окуломоторным ядром и глазом должна быть параллельно лезвию вибратом. - Заполните вибратомкамеры ледяным буфером ломтик. Суперклей эмбриона на стадии вибратом так, что лезвие будет параллельно окуломоторного ядра и глаз. Как только суперклей высохнет, погрузите стадию вибратом, чтобы эмбрион ориентировался лицом к лицу с лезвием.
- Нарежьте 400-450 мкм ломтиками. Соберите каждый ломтик с стерильной трубкой передачи. Поместите в холодный буфер нарезки.
- Под рассекающим сярприсом выберите срез, содержащий окуломоторные ядра и глаза. Используя стерильный трубопровод, поместите его на вставить в 6 скважинную пластину. Верните тарелку в инкубатор 37 градусов по Цельсию. Кроме того, есть один человек нарезки, а другой размещения ломтиков. Свести к минимуму время между нарезки и размещением в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты должны быть ориентированы таким образом, что максимальная флуоресценция, излучаемых ядрами и аксонами, ближе всего к цели микроскопа изображения. На перевернутом микроскопе ломтики должны быть помещены на мембрану с ядрами и аксонами, наиболее близкими к цели под пластиной. - Удалить остаточный агароз с стадии вибратом, суперклей следующего эмбриона на сцену и повторить шаги 3,7-3,9, пока все эмбрионы были нарезана и покрыта.
- Добавить ингибитор или рекомбинантную молекулу выбора для средств массовой информации в каждой скважине, чтобы создать кривую дозы-реакции. Разбавить соответствующим растворителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании DMSO, используйте только ткани культуры класса DMSO. Кроме того, белок-eluting шарики могут быть размещены в определенных местах на ломтик. - Поместите на микроскоп в камере 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Установите микроскоп, чтобы принять фазовый контраст и флуоресцентные фотографии каждого ломтика каждые 30 минут (или чаще по желанию). Фрагменты могут быть сохранены для 48-72 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Нормальные результаты: Рисунок 1 обеспечивает схему эксперимента. Начиная с E9.5 в мыши, первые аксоны начинают выходить из окуломоторного ядра26. По E10.5, фасцилуляционный окуломоторный нерв, который содержит ранние пионерские нейроны, можно увидеть в мезенхиме. Существует значительная изменчивость между эмбрионами на E10.5 (даже в том же помете) в том, как далеко нерв продвинулся к орбите, вероятно, из-за различий в развитии в несколько часов. Во время нормального развития матки первые GFP-позитивные окуломоторные аксоны достигают орбиты/глаза в течение следующих 18-24 ч (по E11.5), а затем начинают разветвляться до своих конечных целей27. В срез нойкультуры, это время резюмируется(Рисунок 2, Видео 1). Срез растет и расширяется (во всех направлениях) до 72 ч, и аксоны можно увидеть простирается от ядра к глазу. Мы нашли первые 36-48 ч наиболее полезным для оценки аксона окуломоторного аксона. Моторные нейроны иногда можно увидеть движущихся в ядре (не показано). В некоторых ломтиках, в зависимости от ориентации, трохлеевое ядро также присутствует. Trochlear аксоны распространяются боково в пределах ломтика и часто стойло, потому что их нормальный курс заключается в выходе из трохлеера ядро боковой, прежде чем превратить дорсально и caudally, который будет из ломтика. Иногда трохлеера аксоны, кажется, соединяются с окуломоторными аксонами и поворачиваются к глазу, что затрудняет интерпретацию среза, так как эти аксоны могут иметь вторичное влияние на наведение окуломоторных аксонов.
Пример ингибирования важного пути наведения аксона: Ингибирование CXCR4 сигнализации вызывает дорсальный, а не брюшной рост окуломоторных аксонов. Мы оценили роль CXCR4 сигнализации на развитие окуломоторного, добавив 1 мкг/мл (1,26 мЛ) AMD3100, водорастворимый небольшой молекулы ингибитор CXCR428, непосредственно в культурном сми, как только срез культуры подготовлен. Окуломоторные аксоны можно увидеть выходя из окуломоторного ядра дорсально и растет от орбиты ("назад")(Рисунок 2, Видео 2). Те аксоны, которые уже покинули средний мозг и направлялись на орбиту на E10.5, продолжают свой путь. Ингибиция CXCR4 также влияет на общий рост среза.
Ориентация ломтика имеет решающее значение. Фрагменты не интерпретируются, если они не ориентированы должным образом. Некоторые примеры неправильно ориентированных срезов показаны на рисунке 3. Если эмбрион наклонен в сторону, в срезе находится только одно окуломоторное ядро(рисунок 3А). Если встроенный эмбрион наклонен слишком далеко к спине, глаза не в ломтик, и вместо этого верхняя конечность и задний мозг или спинной мозг может быть в ломтик (Рисунок 3B). При этом нормальной траектории окуломоторных аксонов нет, и они, как правило, растут случайным образом. Во время размещения ломтика на культурной мембране, он может стать сложенным(рисунок 3C).
Растворы могут быть токсичными. Следует принимать меры при растворении ингибиторов или факторов роста органических растворителей. На рисунке 4 показан пример ломтика, который умер после добавления этанола в сми. К 1,5 мл носителей было добавлено 118 мл (окончательная концентрация 7,8%), и эта высокая концентрация оказалась токсичной. Чтобы предотвратить это, растворить растворы в минимальновозможном количестве растворителя (до предела растворимости). Когда это возможно, растворить в воде. Если DMSO используется, убедитесь, что это стерильный, ткани культуры класса DMSO.
Рисунок 1 : Схема. E10.5 IslMN-GFP эмбрионы (A: фото, B: схематичный) нарезаны на вибратом (400-450 мкм толщиной), так что разделы включают как окуломоторное ядро и орбиту. Параллельные линии в A и B обозначают расположение разрезов вибратом. Нижняя линия в A показывает, где агароза должна быть обрезана и приклеена к стадии вибратом. (C) Разделы укладываются на ткань-культурную мембрану, что позволяет обмениваться питательными веществами и газами, и помещаются в инкубатор для замедленной микроскопии. На этом этапе ингибиторы могут быть добавлены к средствам роста. (D) Культуры могут быть сохранены для 24-72 h, и аксоны oculomotor можно увидеть растущие к глазу. Адаптировано с разрешения Уитмена и т.д. al. 201823. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Ингибиция CXCR4 вызывает неправильное понимание CN3. Нарезка культур из эмбрионов E10.5 Isl-GFP, изображенных на 0, 12, 24 и 36 ч в культуре. Верхняя панель показывает эмбрион управления дикого типа и CN3 (зеленый) растет к глазам и ветвям широко в течение 36 ч. Также смотрите видео 1. Нижняя панель показывает ломтик с 1 мкг/мЛ AMD3100 (специфический ингибитор для CXCR4) добавления и аксоны выхода окуломоторного ядра дорсально. Те, которые уже вышли вентилально продолжают сярлицать в сторону глаз. Также смотрите видео 2. D: спинной, V: вентраль, E: глаз, N: окуломоторное ядро, SMN: спинномозговые моторные нейроны, стрелки: окуломоторные аксоны (белые: проекция дикого типа, желтый: аномальные проекции). Шкала бар равна 200 мкм. Также смотрите видео 1 и видео 2. Аналогичная цифра, показывающая другие примеры, была представлена в Уитмене и т.д. al. 201823. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Ориентация ломтиков имеет решающее значение. Первоначальные изображения (время 0 ч) репрезентативных неправильно ориентированных ломтиков. А показывает кусочек, в котором эмбрион был наклонен в сторону таким образом, что проектирование CN3 аксоны были акотомизированы. Проектирование аксонов присутствуют только на правой стороне среза (стрелка). B показывает ломтик, в котором эмбрион был наклонен назад, так что ядра CN3 с проецированием аксонов (стрелка) видны на двусторонней основе, но глаза не присутствуют в ломтике. Вместо спинномозговой моторных нейронов (SMN) и моторных нейронов прогнозы на конечности можно увидеть. C показывает срез, сложенный во время размещения на мембране. Фрагменты, подобные тем, которые показаны здесь, должны быть отброшены. Шкала баров представляют 500 мкм в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Растворители могут быть токсичными. Time-lapse изображение культур ломтика от e10.5 Эмбрионы Isl-GFP на 0 и 12 h в культуре. Срез, культивированный в носителях без добавок (A-B), обычно растет в течение 12 ч с CN3 аксоны проектирование к глазу. Кусочек, культивированный в средствах массовой информации с высокой концентрацией этанола (7,8%) (C-D) не растет нормально. В 12 ч CN3 не вырос и едва виден, и ткань начала распадаться. Шкала баров представляют 500 мкм в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: CN3 рост в срез культуры. Time-lapse изображение культуры контрольного среза из эмбриона E10.5 Isl-GFP. Изображения, сделанные каждые 30 минут более 18 ч в культуре. CN3 (зеленый) растет из ядра (вверху) к глазам и начинает ветвления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Видео 2: Mistargeting CN3 с ингибированием CXCR4 сигнализации. Time-lapse изображение культур ломтика от E10.5 Эмбрионы Isl-GFP над 48 h в культуре. Когда 1 мкг/мл AMD3100 (специфический ингибитор для CXCR4) добавляется непосредственно в носитель, cn3 аксоны, которые еще не находятся на периферии, выходят из окуломоторного ядра dorsally (слева), а не вентройно (справа). Перепечатано с разрешения Уитмена и т.д. al. 201823. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол культуры культуры ex vivo обеспечивает значительные преимущества по сравнению с традиционными аксоновыми инструкциями23. Размер каждого черепного опрокидного ядра не является ограничивающим фактором, и никакого сложного вскрытия не требуется. Эндогенная микросреда, через которую проезжают аксоны, поддерживается, что позволяет изменять один сигнальный путь, сохраняя при этом другие сигнальные пути. Кроме того, эффекты могут быть оценены в различных точках вдоль траектории аксона. Поскольку аксон руководство требует нескольких сигналов, и комбинации сигналов, по пути29, это обеспечивает значительное преимущество. В отличие от разъединенных или explant культур, растущие аксоны не вырезать в этом препарате, так что первоначальный аксон нарост может быть оценен, а не аксон регенерации. В большинстве других инструкций, аксон регенерации на самом деле оценивается, а не первоначальный аксон рост. Избегая акотомии также позволяет избежать значительных потенциальных смешанных факторов, потому что нейроны не повреждены или под стрессом.
Двумя наиболее важными шагами являются ориентация эмбрионов на нарезку и минимизацию времени между эвтаназии матери и размещением ломтиков в инкубаторе. Эмбрионы должны постоянно находиться на льду. Для ориентации, мы пробовали несколько различных форм, но из-за изменчивости между эмбрионами в этом возрасте, мы обнаружили, что ориентация вручную, на основе флуоресценции под рассекающим микроскопом, является наиболее эффективным. Ориентация вручную ограничивает эмбриональное времяокно, которое может быть изучено, однако. Ранее, чем E10.0, ориентация ломтик правильно является сложной задачей, потому что глаз трудно увидеть, и очень мало CN3 аксоны можно увидеть. Это означает, однако, что мы не можем использовать этот метод для изучения раннего роста аксона пионера, так как мы должны позволить этим аксонам вырасти из части пути, чтобы иметь возможность сориентировать ся.
Есть несколько ограничений на окуломоторную подготовку культуры ломтик. Это наиболее полезно для изучения ранних и промежуточных решений руководства, а не терминальных решений о ветвящемся. На E10.5, EOMs присутствуют только как мышцы anlage. Даже в более поздние моменты времени, с помощью современной технологии визуализации, отдельные целевые EOMs не могут быть различимы в пределах среза. Специфически терминальные ветвления решения окуломоторных аксонов поэтому не могут быть оценены с текущими условиями. Поскольку ломтики выращиваются на пористой ткани культуры мембран, пост-культуры отделение от мембраны трудно и часто вызывает повреждение тканей, что делает антитела окрашивания и монтажа для дополнительной визуализации неудачно. Хотя аксоны не разрезаны, тем самым минимизируя повреждение нейронов, окружающие ткани разрезаются и, следовательно, повреждены, что может повлиять на выражение сигнала или выделение. Идеальное временное окно также ограничено. Как отмечалось выше, раньше, чем E10.0 ориентация ломтика трудно, и после E11.5, многие аксоны уже достигли орбиты, так что промежуточные решения руководства уже были приняты.
Препарат требует микроскопа с инкубатором, автоматической стадией и возможностью замедленного действия. Цели и камера должны быть оптимизированы для визуализации толстых образцов без очистки. Разрешение на уровне одного конуса роста, как это возможно при некоторых культурных приготовлениях, невозможно при нынешней настройке изображения. Параметры изображения, однако, потенциально могут быть адаптированы, чтобы позволить более высокое разрешение, с конфокальной или 2-фотонной микроскопии, сосредоточив внимание на небольшой площади каждого ломтика (потенциально корректировки, как ломтик, как аксоны расти). Используя текущий эпифлуоресцентный микроскоп и изображения каждые 30 минут, мы не видели фотоотбеления; конфокальная микроскопия и более частые изображения могут быть использованы, но фотоотбеление станет потенциальной проблемой.
Поскольку мелкие молекулярные ингибиторы могут иметь нецелевое воздействие, в том числе на общий рост и здоровье среза, этот анализ наиболее полезен в качестве инструмента скрининга. Результаты должны быть проверены другими методами, такими как модели вымысла мыши. Например, при торможении CXCR4 наблюдается умеренный общий рост среза (см. рисунок2), согласующихся с несколькими функциями CXCR4. В моделях мыши, однако, фенотип аксона, замеченный в срезе, был повторена23.
Этот протокол может быть изменен для изучения других популяций черепных нервов, хотя для каждого из них должна быть эмпирически определена надлежащая ориентация ломтиков и сроки. Кроме того, мыши с различными флуоресцентными этикетками могут быть использованы, которые отмечают различные подмножества нейронов и / или которые повернуть на более ранний или более поздний эмбриональный возраст.
Культурой срезов можно манипулировать несколькими способами. Мы показываем здесь пример блокирования рецепторов сигнализации с небольшой ингибитор молекулы. Кроме того, антитела (блокирование рецепторов или активация рецепторов) или рекомбинантные белки, такие как аксонные сигналы руководства или факторы роста, могут быть добавлены в средствах массовой информации. Для оценки направленного воздействия на аксон руководство, лиганд-секретирования шарики могут быть размещены на ломтик в конкретных местах. Используя любой из этих методов, многие другие аксон пути руководства могут быть определены и изучены в глазной двигательной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование, предоставляемое Национальным институтом глаз (5K08EY027850), Национальным институтом детского здоровья и развития (U54HD090255), Гарвардской клинической научной программой развития (5K12EY016335), Фондом тамплиеров «Карьера Стартера» Гранта, и Детский больничный офтальмология Фонда «Факультет Открытие премии». ECE является Говард Хьюз медицинский институт следователя.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
