Summary
En ex vivo slice-analys kan ögonmuskelförlamningar nerv utväxt att avbildas i realtid. Skivor genereras genom att bädda in E 10.5 ISLmn: GFP embryon i aguppstod, skivning på en vibratome, och växer i en scen-Top inkubator. Rollen för Axon väglednings vägar bedöms genom att lägga till hämmare till kulturen media.
Abstract
Noggranna ögonrörelser är avgörande för synen, men utvecklingen av det okulära motorsystemet, särskilt de molekylära vägar som styr Axon-vägledningen, har inte helt klarlagts. Detta beror delvis på tekniska begränsningar av traditionella Axon väglednings analyser. För att identifiera ytterligare Axon vägledning signaler som påverkar ögon muskelmage, en ex vivo slice-analys för att avbilda den ögonmuskelförlamningar nerv i realtid som den växer mot ögat utvecklades. E 10.5 ISLmn-GFP embryon används för att generera ex vivo skivor genom att bädda in dem i aguppstod, skivning på en vibratome, sedan odla dem i ett Mikroskop skede-Top inkubator med tidsfördröjning photomicroscopy för 24-72 h. återför kontroll skivor recapitulate in vivo tidpunkten för utväxt av axoner från kärnan till omloppsbanan. Småmolekylära hämmare eller rekombinanta proteiner kan läggas till i kulturmedia för att bedöma vilken roll olika Axon väglednings vägar har. Denna metod har fördelarna med att upprätthålla mer av den lokala mikromiljön genom vilken axoner Traverse, inte axotomizing den växande axoner, och bedöma axonerna på flera punkter längs deras bana. Det kan också identifiera effekter på specifika undergrupper av axoner. Till exempel, hämning av CXCR4 orsakar axoner fortfarande inom mellanhjärnan att växa dorsalt snarare än ventralt, men axoner som redan har lämnat ventralt påverkas inte.
Introduction
Det okulära motorsystemet ger ett elegant system för att undersöka Axon vägledningssystem. Det är relativt okomplicerat, bestående av tre kraniala nerver innervating sex extraokulära muskler (EOMs) som flyttar ögat, och levator palpebraesuperior superioris (LPS) som lyfter ögonlocket. Den ögonmuskelförlamningar nerv innerverar LPS och fyra eoms-sämre sned och den mediala, sämre och överlägsen rectus muskler. De andra två nerver, den trochlear och abducens, var enda innerverar en muskel, den överlägsna sneda och laterala rectus muskler, respektive. Ögonrörelser ger en lätt avläsning, visar om innervation var lämpligt, saknas, eller avvikande. Dessutom, det finns mänskliga ögat rörelsestörningar som beror på underskott i neuronala utveckling eller Axon vägledning, kollektivt kallas den medfödda kraniala desinnervation störningar (CCDDs)1.
Trots dessa fördelar används okulärt motorsystem sällan i Axon väglednings studier2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, på grund av tekniska nackdelar. In vitro Axon väglednings analyser har många nackdelar11. Co-Culture analyser, där neuronala djur odlas tillsammans med djur av målvävnad12 eller transfekterade celler13, bero på både symmetri explantat och exakt positionering mellan explantat och målvävnad. Stripe-analyser14,15, där två ledtrådar är fastställda i alternerande ränder och axoner bedöms för preferens tillväxt på en rand, endast ange att ett substrat är att föredra framför den andra, inte att antingen är attraktiv eller repulsive, eller fysiologiskt relevanta. Mikrofluidik kammare kan bilda exakta kemiska gradienter, men ämne växande axoner till skjuvning stress16,17,18, vilket kan påverka deras tillväxt. Dessutom, i var och en av dessa metoder, samla in djur eller dissocierade celler kräver att outgrowing axoner vara axotomized och därmed dessa analyser faktiskt undersöka Axon förnyelse, snarare än initial Axon utväxt. Slutligen, dessa in vitro-metoder bort mikromiljön som påverkar axoner och deras svar på ledtrådar längs olika punkter i deras kurs, och traditionellt bara testa en cue i isolering. Compounding dessa nackdelar, gör den lilla storleken på varje kärna i den okulära motorsystemet dissektion tekniskt utmanande för antingen djur eller dissocierade kulturer. Dessutom, primära kulturer av okulära motoriska nervceller är vanligtvis heterogena, har betydande celldöd, och är densitet beroende, kräver sammanslagning av celler från flera embryon (Ryosuki Fujiki, personlig kommunikation). In vivo metoder, men inklusive knockout musmodeller, är olämpliga att använda för screening, med tanke på den tid och kostnader som krävs.
Metoder som utvecklats för att odla hela embryon19 Tillåt märkning av flyttande celler20 eller blockad av specifika molekyler21, men hela embryokulturer kräver inkubering i rullflaskor som utesluter realtids avbildning av märkta Strukturer. Kirurgiska tekniker som möjliggör manipulation av embryot och sedan senare vidareutveckling antingen i livmodern eller i buken av mamman (upprätthålla placenta anslutning)22 är också möjliga, men dessa inte heller tillåter tidsfördröjning Imaging.
För att övervinna hindren för in vitro-analyser och möjliggöra snabb screening av signalering vägar, en ex vivo embryonal slice kultur teknik utvecklades23, anpassad från ett tidigare publicerat protokoll för perifer nervutväxt24. Med hjälp av detta protokoll, utveckla ögon muskel nerven kan avbildas över tid i närvaro av många av de omgivande strukturerna längs dess bana, inklusive EOM mål. Genom att lägga till små molekyler hämmare, tillväxtfaktorer, eller vägledning signaler till kulturen media, kan vi bedöma vägledning störningar på flera punkter längs Axon bana, vilket möjliggör en snabbare bedömning av potentiella tillväxt och väglednings faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbete som beskrivs här godkändes och utfördes i enlighet med Boston Children ' s Hospital institutionella Animal Care och use Committee (IACUC) protokoll.
1. tidsinställda parningar
- Place ISLmn: GFP (Holmen motor neuron grönt fluorescerande protein; MGI: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J Stock nr: 017952) manliga och kvinnliga möss tillsammans över natten. Väg honor och rekord vikter före parning.
Obs: ISLmn: GFP specifikt etiketter motoriska neuroner med en farnesylated GFP som inte är cytotoxiska, lokaliserar till cellmembranet i motoriska nervceller och deras axoner, och gör att nerverna visualiseras under utveckling25. Andra Fluorescent-märkta linjer kan också användas. - Kontrollera om vaginala pluggar tidigt på morgonen. Det datum då en kontakt identifieras betecknas som E 0.5.
- Bekräfta graviditet med viktökning och/eller ultraljud vid E 10.5. Gravida dammar bör ha fått minst 1 g. embryon kan ses på ultraljud vid E 10.5.
2. beredning av reagenser och vibratome för slice kultur
- Förbered 500 mL av skivning buffert: Tillsätt 5 mL av HEPES och 5 mL av penicillin/streptomycin till 500 mL av Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) utan ca2 + och mg2 +. Kyla till 4 ° c.
Anmärkning: extra skivning buffert bör förvaras vid 4 ° c och kan användas för framtida segment kultur experiment. - Förbered 50 mL odlingsmedier: i en steril huva, tillsätt 12,5 mL HBSS, 12,5 mL fetalt bovint serum, 250 μL glukos, 250 μL L-glutamin, 125 μL av HEPES till 24,4 mL Fluorobright DMEM. (Slutliga koncentrationer: FlouroBright DMEM med 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% glukos, 1 mM glutamin, och 2,5 mM HEPES.). Värm odlingsmediet till 37 ° c i ett sterilt vattenbad.
Observera: odlingsmedier kan förvaras vid 4 ° c i upp till 3 veckor.- I en steril huva, tillsätt 1,5 mL kultur media till varje brunn av en 6-brunn tallrik. Lägg till en cellkultur Infoga (tabell över material) till varje brunn. Plats i en steril 37 ° c och 5% CO2 inkubator.
- Förbered 4% låg smälttemperatur aguppstod: Lös upp 2 g låg smälttemperatur aguppstod i 50 mL steril PBS. Mikrovågsugn i 30-60 s intervall tills den är helt upplöst. Placera i ett 40 ° c vattenbad för att hålla vätskan.
Obs: extra Agreste kan förvaras i rumstemperatur (RT) och smält för framtida segment kultur experiment. - Ställ in vibratome: placera ett nytt blad på vibratome. Kontrollera inställningar: tjocklek 400-450 μm. pre-Chill den vibratome skede. Placera en del is i ytterkammaren. Använd en kammare och en scen tillägnad levande skivor. Använd inte samma vibratome kammare för fast vävnad som restfixativ kan vara skadligt för skivor.
- Förbered mikroskopet skede övre inkubator till 37 ° c och 5% CO2.
- Förbered för dissektion: Rengör kirurgiska instrument och spraya med 70% etanol. Fyll två petriskålar med HBSS, plats på isen. Öppna en 12 brunn vävnad kultur tallrik och placera locket på isen med undersidan vänd uppåt. Öppna en 6 brunn vävnad kultur tallrik och placera cellkultur membran skär och 1,5 mL cellkultur media i varje brunn. Förvärm plattan i en 37 ° c och 5% CO2 inkubator.
3. upptagning av E 10.5 embryon och beredning av skivor
Anmärkning: alla steg från denna punkt bör göras så snabbt som möjligt. Håll embryona på is hela tiden.
- Euthanize den gravida dammen (E 10.5) i en CO2 kammare. Utför cervikal dislokation.
- Spraya buken med 70% etanol. Klipp öppna buken med sax, ta bort livmodern och placera den i en petriskål med iskallt HBSS att snabbt tvätta bort blod. Flytta den tvättade livmodern till en andra Petri fylld med skålen iskalla HBSS.
- Ta bort embryona från livmoder hornet och enskilda foster säckar under en dissekera omfattning. Placera embryona på undersidan av locket på en 12 bra tallrik. Håll på is.
- Använd filterpapper för att avlägsna eventuell vätska som omger varje embryo under en dissekera omfattning.
Anmärkning: embryon kommer att fastna på filterpapperet om det vidrörs. - Bädda in embryon i Agreste. Häll smält Agreste över varje embryo för att täcka det. Håll på is. Så snart aguppen har härdat, vänd varje embryo och häll ytterligare Agreste på andra sidan. Håll på is.
- Med hjälp av en fluorescerande dissekera omfattning, trimma aguppstod runt varje embryo så det kommer att orienteras ordentligt när limmas till vibratome skede. Den ögonmuskelförlamningar kärnan och tidig Axon utväxt är fluorescerande. Rikta embryot så att kärnan, utväxta axoner och öga bildar en linje, och trimma aguppstod med ett rakblad skära parallellt med denna linje (rygg till embryot, se figur 1a).
Obs: detta kommer att vara den sida limmade till vibratome skede (embryot kommer att placeras på ryggen, huvudet närmast vibratome bladet). En linje mellan den ögonmuskelförlamningar kärnan och ögat bör vara parallellt med vibratome bladet. - Fyll den vibratome kammaren med iskall slice buffert. Superlim embryot till vibratome skede så att bladet kommer att vara parallellt med ögonmuskelförlamningar kärna och ögon. När superlim är torrt, Sänk den vibratome skede så embryot är orienterad vänd bort från bladet.
- Skiva 400-450 μm skivor. Samla varje skiva med en steril överföring pipet. Placera i kall skivning buffert.
- Under den dissekera omfattningen, Välj det segment som innehåller den ögonmuskelförlamningar kärnor och ögon. Med hjälp av en steril överföring pipet, placera den på cellkultur infoga i 6 brunnen plattan. Returnera plattan till inkubatorn 37 ° c. Alternativt, har en person skivning och en annan placera skivorna. Minimera tiden mellan skivning och placering i inkubator.
Anm.: skivorna bör orienteras så att den maximala fluorescensen som avges från atomkärnor och axoner är närmast bild mikroskopens mål. På ett inverterat Mikroskop bör skivorna placeras på membranet med de kärnor och axoner som är närmast målet under plattan. - Ta bort resterande Agreste från vibratome skede, superlim nästa embryo till scenen och upprepa steg 3.7-3.9 tills alla embryon har skivade och pläterade.
- Lägg till inhibitor eller rekombinant molekyl val till media i varje brunn för att skapa en dos-responskurva. Späd i lämpligt lösningsmedel.
Anmärkning: om du använder DMSO, Använd endast vävnad kultur grade DMSO. Alternativt kan protein-eluting pärlor placeras på specifika platser på segmentet. - Placera på mikroskopet i 37 ° c och 5% CO2 kammare. Ställ in mikroskopet att ta faskontrast och fluorescerande fotografier av varje skiva var 30 min (eller oftare om så önskas). Skivor kan bibehållas för 48-72 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normala resultat: figur 1 ger ett schematiskt experiment. Börjar så tidigt som e 9.5 i mus, de första axonerna börjar dyka upp från ögonmuskelförlamningar Nucleus26. Genom e 10.5, en fasciokulerade ögonmuskelförlamningar nerv, som innehåller de tidiga pionjär nervceller, kan ses i Mesenchyme. Det finns betydande variation mellan embryon vid E 10.5 (även inom samma kull) i hur långt nerven har framskridit mot omloppsbana, sannolikt på grund av utvecklingsmässiga skillnader i några timmar. Under normala i Utero utveckling, den första GFP-positiva ögonmuskelförlamningar axoner nå omloppsbana/öga under nästa 18-24 h (genom e 11.5), och sedan börja förgrening till sina slutliga mål27. I slice-kulturen är den här tidpunkten rekapitulerad (bild 2, video 1). Segmentet växer och expanderar (i alla riktningar) för upp till 72 h, och axoner kan ses sträcker sig från kärnan mot ögat. Vi har hittat den första 36-48 h mest användbara för att bedöma ögonmuskelförlamningar Axon utväxt. Motoriska nervceller kan ibland ses flytta inom kärnan (visas inte). I vissa skivor, beroende på orientering, är trochlear kärnan också närvarande. Trochlear axoner sträcker sig i sidled inom segmentet och ofta stall, eftersom deras normala kurs är att lämna trochlear kärnan i sidled, innan du vrider dorsalt och caudally, som skulle vara ur segmentet. Ibland verkar trochlear axoner att gå med de ögonmuskelförlamningar axoner och vända sig mot ögat, vilket gör att segmentet svårt att tolka, eftersom dessa axoner kan ha en sekundär effekt på vägledningen av den ögonmuskelförlamningar axoner.
Exempel på att hämma en viktig Axon väglednings väg: hämmande CXCR4 signalering orsakar rygg snarare än ventrala tillväxt av ögonmuskelförlamningar axoner. Vi bedömde rollen som CXCR4 signalering på ögonmuskelförlamningar utveckling genom att tillsätta 1 μg/ml (1,26 μm) av AMD3100, en vattenlöslig liten molekyl hämmare av CXCR428, direkt till kulturen Media så snart segmentet kulturen är beredd. Den ögonmuskelförlamningar axoner kan sedan ses ut ur ögonmuskelförlamningar Nucleus dorsalt och växer bort från omloppsbana ("bakåt") (figur 2, video 2). De axoner som redan hade lämnat mellanhjärnan och var på väg till omloppsbana vid E 10.5 fortsätta på sin väg. Hämning av CXCR4 påverkar också den totala tillväxten av segmentet.
Orientering av segmentet är avgörande. Segment är inte tolkningsbara om de inte är korrekt orienterade. Några exempel på felaktigt orienterade skivor visas i figur 3. Om embryot lutas åt sidan är det bara en ögonmuskelförlamningar kärna i segmentet (figur 3a). Om det inbäddade embryot lutar för långt mot ryggen, är ögonen inte i segmentet, och i stället kan den övre extremiteten och bakhjärnan eller ryggmärgen vara i segmentet (figur 3B). I detta fall, den normala banan för de ögonmuskelförlamningar axoner är inte närvarande, och de tenderar att växa slumpmässigt. Under placeringen av slice på odlings membranet, kan det bli hopfälld (figur 3C).
Lösningsmedel kan vara giftiga. Försiktighet bör iakttas vid upplösning av hämmare eller tillväxtfaktorer i organiska lösningsmedel. Figur 4 visar ett exempel på ett segment som dött efter tillsats av etanol till mediet. 118 μL lades till 1,5 mL media (slutlig koncentration 7,8%), och denna höga koncentration visade sig vara giftig. För att förhindra detta, lös upp soluter i minsta möjliga lösningsmedel (till gränsen för löslighet). Lös upp i vatten när det är möjligt. Om DMSO används, se till att det är sterilt, vävnad kultur grade DMSO.
Figur 1 : Schematisk. E 10.5 ISLmn-GFP embryon (A: foto, B: schematiska) skivas på en vibratome (400-450 μm tjock) så att avsnitten omfatta både ögonmuskelförlamningar kärnan och omloppsbana. Parallella streckade linjer i A och B betecknar placeringen av vibratome-skären. Den undre streckade linjen i en show där Agam bör klippas och limmas till vibratome scenen. Cavsnitten läggs på ett vävnadskultur membran som möjliggör utbyte av näringsämnen och gaser, och placeras i en inkubator för tidsfördröjd mikroskopi. I detta skede, hämmare kan läggas till tillväxt medier. (D) kulturer kan bibehållas för 24-72 h, och de ögonmuskelförlamningar axoner kan ses växa till ögat. Anpassad med tillstånd från Whitman, et. Al. 201823. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Hämning av CXCR4 orsakar filen CN3 felaktig routing. Slice kulturer från E 10.5 ISL-GFP embryon avbildas vid 0, 12, 24, och 36 h i kulturen. Den övre panelen visar en vild-typkontroll embryo och filen CN3 (grön) växer mot ögonen och grenar omfattande under loppet av 36 h. Se även video 1. Den nedre panelen visar ett segment med 1 μg/ml AMD3100 (specifik hämmare för CXCR4) läggas och axoner ut ögonmuskelförlamningar Nucleus dorsally. De som redan hade lämnat ventralt fortsätta mot ögat. Se även video 2. D: dorsal, V: ventral, E: öga, N: ögonmuskelförlamningar Nucleus, SMN: spinal motoriska nervceller, pilar: ögonmuskelförlamningar axoner (vit: vildtyp projektion, gul: avvikande projektioner). Skalstapeln är lika med 200 μm. Se även video 1 och video 2. En liknande siffra som visar andra exempel presenterades i Whitman, et. Al. 201823. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Orientering av skivorna är avgörande. Initiala bilder (tid 0 h) representativa felorienterade skivor. A visar en skiva där embryot lutades åt sidan så att PROJICERING filen CN3 axoner var axotomized. Projicering av axoner finns endast på den högra sidan av segmentet (pil). B visar en skiva där embryot lutas tillbaka så filen CN3 kärnor med projicering av axoner (pil) är synliga bilateralt, men ögonen är inte närvarande i segmentet. Istället spinal motoriska neuroner (SMN) och motoriska neuron prognoser till armar och ben kan ses. C visar ett segment som viks under placeringen på membranet. Skivor som de som visas här ska kasseras. Skalstreck representerar 500 μm i varje panel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Lösningsmedel kan vara giftiga. Tidsförlopp avbildning av segment kulturer från E 10.5 ISL-GFP-embryon vid 0 och 12 h i kulturen. En skiva odlade i media utan tillsatser (a-B) växer normalt för 12 h med filen CN3 axoner projicering mot ögat. En skiva odlade i media med en hög koncentration av etanol (7,8%) (C-D) inte växer normalt. Vid 12 h, filen CN3 har inte vuxit och är knappt synlig, och vävnaden har börjat sönderfalla. Skalstreck representerar 500 μm i varje panel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: filen CN3 utväxt i slice kultur. Tidsfördröjning avbildning av en kontroll skiva kultur från ett E 10.5 ISL-GFP-embryo. Bilder tagna var 30 min över 18 h i kulturen. FILEN CN3 (grön) växer från kärnan (överst) mot ögonen och börjar förgrening. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video 2: Mistargeting av filen CN3 med hämning av CXCR4 signalering. Time-lapse Imaging av slice kulturer från E 10.5 ISL-GFP embryon över 48 h i kulturen. När 1 μg/ml AMD3100 (specifik hämmare för CXCR4) tillsätts direkt till medierna, filen CN3 axoner som ännu inte är i periferin lämna ögonmuskelförlamningar Nucleus dorsalt (vänster) snarare än ventralt (höger). Omtryckt med tillstånd från Whitman, et. Al. 201823. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta ex vivo slice kultur protokoll ger betydande fördelar jämfört med traditionella Axon väglednings analyser23. Storleken på varje kranialmotorisk kärna är inte en begränsande faktor, och ingen svår dissektion är nödvändig. Den endogena mikromiljön genom vilken axonerna färdas bibehålls, vilket möjliggör modifiering av en signalväg samtidigt som andra signaleringsvägar bibehålls. Dessutom kan effekter bedömas vid olika tidpunkter längs Axon-banan. Eftersom Axon vägledning kräver flera stack-ikoner och kombinationer av stack-ikoner, längs vägen29, ger detta en betydande fördel. Till skillnad från dissocierade eller explantat kulturer, växer axoner inte skärs i denna beredning, så initiala Axon utväxt kan bedömas, snarare än Axon förnyelse. I de flesta andra väglednings analyser, är Axon Regeneration faktiskt bedöms, snarare än initial Axon utväxt. Undvika axotomy också undviker betydande potentiella confounding faktorer eftersom nervceller inte är skadade eller under stress.
De två mest kritiska stegen är inriktningen av embryona för skivning och minimera tiden mellan eutanasi av mamman och placeringen av skivorna i inkubatorn. Embryon måste alltid förvaras på is. För orientering, vi har provat flera olika formar, men på grund av variationer mellan embryon i denna ålder, vi har funnit att orientering för hand, baserat på fluorescens under dissekera Mikroskop, är mest effektiva. Orientering för hand begränsar den embryonala tidsfönster som kan studeras, dock. Tidigare än E 10.0, orientera segmentet ordentligt är utmanande eftersom ögat är svårt att se och mycket få filen CN3 axoner kan ses. Detta innebär dock att vi inte kan använda denna metod för att studera den tidigaste pionjären Axon utväxt, eftersom vi måste låta dessa axoner att växa ut på ett sätt för att kunna orientera segmentet.
Det finns flera begränsningar för den ögonmuskelförlamningar slice kultur beredning. Det är mest användbart för att studera tidiga och mellanliggande väglednings beslut, snarare än terminalförgrenade beslut. Vid E 10.5 är EOMs närvarande endast som en muskel Anlage. Även vid senare tidpunkter, med den aktuella avbildnings tekniken, kan enskilda mål-EOMs inte särskiljas inom segmentet. Specifika terminalförgrenade beslut av ögonmuskelförlamningar axoner kan därför inte bedömas med nuvarande villkor. Eftersom skivorna odlas på porösa vävnad kultur membran, post-kultur separation från membranet är svårt och ofta orsakar vävnadsskada, vilket gör antikropp färgning och återmontering för ytterligare Imaging misslyckas. Även om axonerna inte skärs, vilket minimerar neuronala skador, de omgivande vävnaderna skärs och därför skadas, vilket kan påverka signalering Cue uttryck eller release. Det idealiska tidsfönstret är också begränsat. Som nämnts ovan, tidigare än E 10.0 orientering av segmentet är svårt, och efter E 11.5, många axoner har redan nått omloppsbana, så mellanliggande väglednings beslut har redan gjorts.
Preparatet kräver ett Mikroskop med scen-Top inkubator, automatisk fas, och Time-lapse kapacitet. Målen och kameran måste optimeras för avbildning av tjocka preparat utan clearing. Upplösning på nivån för en enda tillväxtkon, vilket är möjligt med vissa kultur preparat, är inte möjligt med den nuvarande Imaging set-up. Avbildnings parametrarna kan dock potentiellt anpassas för att möjliggöra högre upplösning, med konfokal eller 2-Photon-mikroskopi, med fokus på ett litet område av varje segment (potentiellt justera som segmentet som axoner växer). Med hjälp av den nuvarande epilys Mikroskop och avbildning var 30 min, vi har inte sett foto blekning; konfokal mikroskopi och mer frekvent avbildning kan användas, men foto blekning skulle bli ett potentiellt problem.
Eftersom små molekyler hämmare kan ha off-mål effekter, inklusive på den totala tillväxten och hälsan hos segmentet, denna analys är mest användbar som en screening verktyg. Resultaten måste verifieras med andra metoder, till exempel knockout Mouse-modeller. Till exempel, med CXCR4 hämning, det finns mild minskad total tillväxt av segmentet (se figur 2), i överensstämmelse med de flera funktionerna i CXCR4. I musmodeller var dock Axon fenotyp ses i segmentet återfått23.
Detta protokoll kan ändras för att studera andra kraniala nerv populationer, men för varje, rätt orientering av skivor och timing skulle behöva empiriskt bestämmas. Dessutom kan möss med olika fluorescerande etiketter användas som markerar olika undergrupper av nervceller och/eller som slås på till vid tidigare eller senare embryonala åldrar.
Segment kulturen kan manipuleras på flera sätt. Vi visar här ett exempel på blockering receptor signalering med en liten molekyl hämmare. Alternativt kan antikroppar (antingen receptor blockering eller receptor aktiverande) eller rekombinanta proteiner, såsom Axon vägledning eller tillväxtfaktorer, läggas till i medierna. För att utvärdera för riktade effekter på Axon vägledning, ligand-utsöndring pärlor kan placeras på segmentet på specifika platser. Med någon av dessa metoder, många andra Axon väglednings vägar kan identifieras och studeras i det okulära motorsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering som tillhandahålls av National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-vision klinisk vetenskapsman Development program [5K12EY016335], Tempelherreorden Eye Foundation [karriär starter Grant], och Children ' s Hospital oftalmologi Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE är Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
