Summary
Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.
Abstract
Genaue Augenbewegungen sind entscheidend für das Sehen, aber die Entwicklung des Okularmotoriksystems, insbesondere der molekularen Bahnen, die die Axonführung steuern, wurde noch nicht vollständig aufgeklärt. Dies ist zum Teil auf die technischen Einschränkungen traditioneller Axon-Leitfaden-Assays zurückzuführen. Um zusätzliche Axon-Leitlinien zu identifizieren, die den okulomotorischen Nerv beeinflussen, wurde ein ex vivo-Slice-Assay entwickelt, um den okulomotorischen Nerv in Echtzeit abzubilden, während er zum Auge heranwächst. E10.5 IslMN-GFP-Embryonen werden verwendet, um ex vivo Scheiben zu erzeugen, indem sie in Agarose eingebettet werden, auf ein Vibratome schneiden und sie dann in einem Mikroskop-Bühnen-Top-Inkubator mit Zeitraffer-Photomikroskopie für 24-72 h anbauen. das in vivo Timing des Auswachsens von Axonen vom Kern in die Umlaufbahn. Kleine Molekülinhibitoren oder rekombinante Proteine können den Kulturmedien hinzugefügt werden, um die Rolle verschiedener Axon-Führungswege zu bewerten. Diese Methode hat die Vorteile, mehr von der lokalen Mikroumgebung zu erhalten, durch die Axone durchqueren, nicht die wachsenden Axone axotomisieren und die Axone an mehreren Punkten entlang ihrer Flugbahn bewerten. Es kann auch Effekte auf bestimmte Teilmengen von Axonen identifizieren. Zum Beispiel führt die Hemmung von CXCR4 dazu, dass Axone, die sich noch innerhalb des Mittelhirns befinden, eher dorsal als ventral wachsen, aber Axone, die bereits ventral ausgetreten sind, sind nicht betroffen.
Introduction
Das Augenmotorsystem bietet ein elegantes System zur Untersuchung von Axon-Führungsmechanismen. Es ist relativ unkompliziert, bestehend aus drei Hirnnerven, die sechs extraokulare Muskeln (EOMs) innervieren, die das Auge bewegen, und dem Levator palpebrae superioris (LPS), der das Augenlid hebt. Der okulomotorische Nerv innerviert die LPS und vier EOMs - die unterlegene Schräglage und die mediale, minderwertige und überlegene Rectusmuskulatur. Die anderen beiden Nerven, die Trochlea und abducens, jeder nur innervate einen Muskel, die überlegene schräge und seitliche Rectus-Muskel, jeweils. Augenbewegungen bieten eine einfache Anzeige, zeigt, ob Innervation angemessen, fehlt oder abwegig war. Darüber hinaus gibt es menschliche Augenbewegungsstörungen, die aus Defiziten in der neuronalen Entwicklung oder Axonführung resultieren, kollektiv als die angeborenen Schädel-Disinnervationsstörungen (CCDDs)1bezeichnet.
Trotz dieser Vorteile wird das Augenmotorsystem selten in Axon-Leitstudien 2 ,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, aufgrund technischer Nachteile. In-vitro-Axon-Leitlinien-Assays haben viele Nachteile11. Co-Kultur-Assays, bei denen neuronale Explanten zusammen mit Explanten des Zielgewebes12 oder transfizierter Zellen13kultiviert werden, hängen sowohl von der Symmetrie des Explantations- als auch der präzisen Positionierung zwischen Explantation und Zielgewebe ab. Streifenassays14,15, in denen zwei Hinweise in abwechselnden Streifen und Axonen auf bevorzugtes Wachstum auf einem Streifen festgelegt sind, deuten nur darauf hin, dass ein Substrat dem anderen vorzuziehen ist, nicht, dass beide attraktiv sind. abstoßend oder physiologisch relevant. Mikrofluidikkammern können präzise chemische Gradienten bilden, aber wachsende Axone der Scherspannung16,17,18, unterziehen, die ihr Wachstum beeinflussen können. Darüber hinaus erfordert das Sammeln von Explanten oder dissoziierten Zellen bei jedem dieser Ansätze, dass auswachsende Axone axotomisiert werden, und daher untersuchen diese Assays tatsächlich die Axonregeneration und nicht das anfängliche Axonwachstum. Schließlich entfernen diese In-vitro-Ansätze die Mikroumgebung, die Axone und ihre Reaktionen auf Hinweise entlang verschiedener Punkte ihres Kurses beeinflusst, und testen traditionell nur einen Hinweis isoliert. Zusammen mit diesen Nachteilen stellt die geringe Größe jedes Kerns im Augenmotorsystem die Zerlegung für Explanten oder dissoziierte Kulturen technisch eine Herausforderung dar. Darüber hinaus sind Primärkulturen von okularen motorischen Neuronen in der Regel heterogen, haben einen signifikanten Zelltod und sind dichteabhängig, was eine Zusammenlegung von Zellen aus mehreren Embryonen erfordert (Ryosuki Fujiki, persönliche Kommunikation). In-vivo-Methoden, einschließlich Knockout-Maus-Modelle, sind jedoch angesichts der Zeit und des Erforderlichen für das Screening ungeeignet für das Screening.
Methoden, die entwickelt wurden, um ganze Embryonen zu kultivieren19 ermöglichen die Kennzeichnung von wandernden Zellen20 oder die Blockade bestimmter Moleküle21, aber ganze Embryokulturen erfordern eine Inkubation in Rollenflaschen, was eine Echtzeit-Bildgebung von markierten Strukturen. Chirurgische Techniken, die eine Manipulation des Embryos und anschließende Weiterentwicklung entweder in der Gebärmutter oder im Bauch der Mutter (Aufrechterhaltung der Plazentaverbindung)22 ermöglichen, erlauben aber auch keinen Zeitraffer Imaging.
Um die Hindernisse von In-vitro-Assays zu überwinden und ein schnelles Screening von Signalwegen zu ermöglichen, wurde eine ex vivo embryonale Scheibenkulturtechnik entwickelt23, angepasst an ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für peripheres Nervenwachstum24. Mit diesem Protokoll kann der sich entwickelnde okulomotorische Nerv im Laufe der Zeit in Gegenwart vieler der umgebenden Strukturen entlang seiner Flugbahn abgebildet werden, einschließlich EOM-Ziele. Durch Hinzufügen kleiner Molekülinhibitoren, Wachstumsfaktoren oder Leitfäden zu den Kulturmedien können wir Die Orientierungsstörungen an mehreren Punkten entlang des Axonverlaufs bewerten und so eine schnellere Bewertung potenzieller Wachstums- und Orientierungsfaktoren ermöglichen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen des Boston Children es Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt.
1. Zeitzeitliche Paarungen
- Platz ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stock Nr.: 017952) männliche und weibliche Mäuse über Nacht zusammen. Wiegen Sie die Weibchen und zeichnen Sie Gewichte vor der Paarung auf.
HINWEIS: ISLMN:GFP kenniert speziell motorische Neuronen mit einem farnesylierten GFP, das nicht zytotoxisch ist, lokalisiert sich auf die Zellmembran von motorischen Neuronen und ihren Axonen und ermöglicht es, die Nerven während der Entwicklung zu visualisieren25. Andere fluoreszierend markierte Linien könnten ebenfalls verwendet werden. - Überprüfen Sie, ob vaginale Stecker am frühen Morgen. Das Datum, an dem ein Stecker identifiziert wird, wird als E0.5 bezeichnet.
- Bestätigen Sie die Schwangerschaft mit Gewichtszunahme und/oder Ultraschall bei E10.5. Schwangere Muttern sollten mindestens 1 g gewonnen haben. Embryonen sind auf Ultraschall bei E10.5 zu sehen.
2. Herstellung von Reagenzien und Vibratom für die Scheibenkultur
- 500 ml Schneidpuffer vorbereiten: 5 ml HEPES und 5 ml Penicillin/Streptomycin auf 500 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca2+ und Mg2+hinzufügen. Auf 4 °C abkühlen lassen.
HINWEIS: Der zusätzliche Schneidpuffer sollte bei 4 °C gespeichert werden und kann für zukünftige Slice-Kulturexperimente verwendet werden. - 50 ml Kulturmedien vorbereiten: In einer sterilen Haube 12,5 ml HBSS, 12,5 ml Fetales Rinderserum, 250 l Glukose, 250 l L L L-Glutamin, 125 l HEPES zu 24,4 ml Fluorobright DMEM hinzufügen. (Endkonzentrationen: FlouroBright DMEM mit 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% Glukose, 1 mM Glutamin und 2,5 mM HEPES.). Erwärmen Sie die Kulturmedien in einem sterilen Wasserbad auf 37 °C.
HINWEIS: Kulturmedien können bis zu 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden.- In einer sterilen Kapuze, fügen Sie 1,5 ml Kulturmedien zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte. Fügen Sie jedem Brunnen eine Zellkultureinlage (Materialtabelle) hinzu. In einen sterilen 37 °C und 5% CO2-Inkubator geben.
- 4% Niedrigschmelztemperatur-Agarose vorbereiten: 2 g Niedrigschmelztemperatur-Agarose in 50 ml sterilem PBS auflösen. Mikrowelle in 30-60 s Intervallen bis vollständig gelöst. In ein 40 °C-Wasserbad geben, um Flüssigkeit aufzubewahren.
HINWEIS: Extra-Agarose kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert und für zukünftige Scheibenkulturexperimente geschmolzen werden. - Vibratom einrichten: Legen Sie eine neue Klinge auf Vibratom. Prüfeinstellungen: Dicke 400-450 m. Vorchillen der Vibratome-Stufe. Legen Sie etwas Eis in die äußere Kammer. Verwenden Sie eine Kammer und Bühne, die Live-Slices gewidmet sind. Verwenden Sie nicht die gleiche Vibramkammer für festes Gewebe als Restfixativ könnte für Scheiben schädlich sein.
- Bereiten Sie den Mikroskop-Bühnen-Inkubator auf 37 °C und 5%CO2vor.
- Vorbereiten der Zerlegung: Chirurgische Instrumente reinigen und mit 70% Ethanol besprühen. Füllen Sie zwei Petrischalen mit HBSS, auf Eis legen. Öffnen Sie eine 12 Brunnengewebe-Kulturplatte und legen Sie den Deckel auf Eis mit der Unterseite nach oben. Öffnen Sie eine 6 Well-Gewebe-Kulturplatte und platzieren Sie Zellkultur-Membraneinsätze und 1,5 ml Zellkulturmedien in jedem Brunnen. Die Platte in einem 37 °C und 5% CO2-Inkubator vorwärmen.
3. Ernte von E10.5-Embryonen und Scheibenaufbereitung
HINWEIS: Alle Schritte von diesem Punkt sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden. Halten Sie die Embryonen jederzeit auf Eis.
- Euthanisieren Sie die schwangere Mutter (E10.5) in einer CO2-Kammer. Führen Sie zervikale Dislokation durch.
- Den Bauch mit 70% Ethanol besprühen. Den Bauch mit einer Schere aufschneiden, die Gebärmutter entfernen und in eine Petrischale mit eiskaltem HBSS legen, um blutschnell wegzuwaschen. Bewegen Sie die gewaschene Gebärmutter zu einem zweiten Petri gefüllt mit Teller eiskalt HBSS.
- Entfernen Sie im Rahmen eines Sezierens die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und einzelnen Fruchtwassersäcken. Legen Sie die Embryonen auf die Unterseite des Deckels einer 12 Brunnenplatte. Auf Eis bleiben.
- Verwenden Sie unter einem Sezieren den Einzelnen, um alle Flüssigkeiten, die jeden Embryo umgeben, zu entfernen.
HINWEIS: Embryonen kleben am Filterpapier, wenn sie berührt werden. - Einbetten von Embryonen in Agarose. Gießen Sie geschmolzene Agarose über jeden Embryo, um es zu bedecken. Auf Eis bleiben. Sobald die Agarose verhärtet ist, kippen Sie jeden Embryo und gießen Sie zusätzliche Agarose auf der anderen Seite. Auf Eis bleiben.
- Mit einem fluoreszierenden Sezieren Bereich, trimmen Sie die Agarose um jeden Embryo, so dass es richtig ausgerichtet werden, wenn auf das Vibram-Stadium geklebt. Der okulomotorische Kern und das frühe Axonwachstum sind fluoreszierend. Richten Sie den Embryo so aus, dass der Kern, die auswachsenden Axone und das Auge eine Linie bilden, und trimmen Sie die Agarose mit einer Rasierklinge, die parallel zu dieser Linie geschnitten ist (dorsal zum Embryo, siehe Abbildung 1A).
HINWEIS: Dies wird die Seite sein, die an das Vibratomstadium geklebt wird (der Embryo wird auf seinem Rücken positioniert, der Kopf am nächsten an der Vibratomklinge). Eine Linie zwischen dem okulomotorischen Kern und dem Auge sollte parallel zur Vibratomklinge sein. - Füllen Sie die Vibratomekammer mit eiskaltem Scheibenpuffer. Den Embryo an das Vibratomstadium überlagern, so dass die Klinge parallel zum okulomotorischen Kern und den Augen ist. Sobald der Superkleber trocken ist, tauchen Sie das Vibratomstadium unter, so dass der Embryo nach weg von der Klinge ausgerichtet ist.
- In scheibenschneiden 400-450 m Scheiben. Sammeln Sie jede Scheibe mit einer sterilen Transferpipette. In kalten Schneidpuffer geben.
- Wählen Sie unter dem Sezieren die Scheibe aus, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthält. Mit einer sterilen Transferpipette auf den Zellkultureinsatz in die 6 Brunnenplatte legen. Geben Sie die Platte auf den 37 °C-Inkubator zurück. Alternativ können Sie eine Person schneiden und eine andere die Scheiben platzieren. Minimieren Sie die Zeit zwischen dem Schneiden und dem Platzieren in den Inkubator.
HINWEIS: Scheiben sollten so ausgerichtet sein, dass die maximale Fluoreszenz, die von den Kernen und Axonen emittiert wird, dem objektiven Mikroskop-Objektiv am nächsten kommt. Auf einem invertierten Mikroskop sollten die Scheiben auf die Membran mit den Kernen und Axonen gelegt werden, die dem Objektiv unter der Platte am nächsten sind. - Entfernen Sie die Rest-Agarose aus dem Vibratomstadium, überlagern Sie den nächsten Embryo auf die Stufe und wiederholen Sie die Schritte 3.7-3.9, bis alle Embryonen in Scheiben geschnitten und plattiert sind.
- Fügen Sie Inhibitor oder rekombinantes Molekül der Wahl zu Medien in jedem Brunnen hinzu, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen. In geeignetem Lösungsmittel verdünnen.
HINWEIS: Wenn Sie DMSO verwenden, verwenden Sie nur die Gewebekultur-Klasse DMSO. Alternativ können proteineverdünnende Perlen an bestimmten Stellen auf der Scheibe platziert werden. - In der 37 °C und 5% CO2-Kammer auf das Mikroskop stellen. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass alle 30 min (oder häufiger, falls gewünscht) Phasenkontrast- und Fluoreszenzfotos von jeder Scheibe aufnehmen. Scheiben können für 48-72 h gepflegt werden.
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Representative Results
Normale Ergebnisse: Abbildung 1 enthält einen Schaltplan des Experiments. Bereits ab E9.5 in der Maus beginnen die ersten Axone aus dem okulomotorischen Kern26hervorzugehen. Bei E10.5 ist im Mesenchym ein fascikulierter okulomotorischer Nerv zu sehen, der die frühen Pionierneuronen enthält. Es gibt erhebliche Variabilität zwischen Embryonen bei E10.5 (auch innerhalb desselben Wurfs), wie weit der Nerv in Richtung der Umlaufbahn fortgeschritten ist, wahrscheinlich aufgrund von Entwicklungsunterschieden von wenigen Stunden. Während der normalen Entwicklung der Utero erreichen die ersten GFP-positiven okulomotorischen Axone die Umlaufbahn/das Auge über die nächsten 18-24 h (durch E11.5) und beginnen dann, sich zu ihren Endzielen zu verzweigen27. In der Slice-Kultur wird dieses Timing rekapituliert (Abbildung 2,Video 1). Die Scheibe wächst und dehnt sich (in alle Richtungen) bis zu 72 h aus, und Axone sind vom Kern bis zum Auge zu sehen. Wir haben die ersten 36-48 h am nützlichsten für die Beurteilung des okulomotorischen Axonauswüchses gefunden. Motorneuronen können manchmal gesehen werden, wie sie sich innerhalb des Kerns bewegen (nicht gezeigt). In einigen Scheiben ist je nach Ausrichtung auch der Trochlea-Kern vorhanden. Trochlea-Axone dehnen sich seitlich innerhalb der Scheibe aus und bleiben oft stehen, weil ihr normaler Verlauf darin besteht, den Trochlea-Kern seitlich zu verlassen, bevor sie sich dorsal und kauarisch drehen, was aus der Scheibe heraus wäre. Gelegentlich scheinen sich die Trochlea-Axone mit den okulomotorischen Axonen zu verbinden und sich dem Auge zuzuwenden, was die Scheibe schwer zu interpretieren macht, da diese Axone einen sekundären Effekt auf die Führung der okulomotorischen Axone haben können.
Beispiel für die Hemmung eines wichtigen Axon-Führungsweges: Die Hemmung der CXCR4-Signalisierung verursacht eher ein dorsales als ein ventrales Wachstum von okulomotorischen Axonen. Wir bewerteten die Rolle der CXCR4-Signalisierung bei der okulomotorischen Entwicklung, indem wir AMD3100, einen wasserlöslichen kleinen Molekülinhibitor von CXCR428,direkt an die Kulturmedien anfügen, sobald die Slice-Kultur hergestellt ist. Die okulomotorischen Axone können dann gesehen werden, wie sie den okulomotorischen Kern dorsal verlassen und aus dem Orbit ("rückwärts") wachsen (Abbildung 2,Video 2). Die Axone, die das Mittelhirn bereits verlassen hatten und auf dem Weg zur Umlaufbahn bei E10.5 waren, setzen ihren Weg fort. Die Hemmung von CXCR4 wirkt sich auch auf das Gesamtwachstum der Scheibe aus.
Die Ausrichtung der Scheibe ist entscheidend. Slices sind nicht interpretierbar, wenn sie nicht richtig ausgerichtet sind. Einige Beispiele für falsch ausgerichtete Slices sind in Abbildung 3dargestellt. Wenn der Embryo zur Seite geneigt ist, befindet sich nur ein okulomotorischer Kern in der Scheibe (Abbildung 3A). Wenn der eingebettete Embryo zu weit nach hinten geneigt ist, sind die Augen nicht in der Scheibe, und stattdessen können sich die obere Extremität und das Hinterhirn oder das Rückenmark in der Scheibe befinden (Abbildung 3B). In diesem Fall ist die normale Flugbahn der okulomotorischen Axone nicht vorhanden, und sie neigen dazu, zufällig zu wachsen. Während der Platzierung der Scheibe auf der Kulturmembran kann sie gefaltet werden (Abbildung 3C).
Lösungsmittel können giftig sein. Bei der Auflösung von Inhibitoren oder Wachstumsfaktoren in organischen Lösungsmitteln ist Vorsicht geboten. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für eine Scheibe, die nach dem Zusatz von Ethanol in die Medien starb. 118 l wurden 1,5 ml Medien zugesetzt (Endkonzentration 7,8%), und diese hohe Konzentration erwies sich als toxisch. Um dies zu verhindern, lösen Sie die Gelösten in der minimalmöglichen Menge an Lösungsmittel (bis zur Grenze der Löslichkeit). Wenn möglich, in Wasser auflösen. Wenn DMSO verwendet wird, stellen Sie sicher, dass es steril ist, Gewebekultur Grade DMSO.
Abbildung 1 : Schematisch. E10.5 IslMN-GFP-Embryonen (A: Foto, B: schematisch)werden auf einem Vibramme (400-450 'm dick) in Scheiben geschnitten, so dass abschnitte sowohl den okulomotorischen Kern als auch die Umlaufbahn umfassen. Parallel gestrichelte Linien in A und B bezeichnen die Position der Vibratomeschnitte. Die untere gestrichelte Linie in A zeigt, wo die Agarose getrimmt und auf die Vibram-Bühne geklebt werden sollte. (C) Abschnitte werden flach auf eine Gewebekulturmembran gelegt, die den Austausch von Nährstoffen und Gasen ermöglicht, und in einem Bühnen-Inkubator für die Zeitraffermikroskopie platziert. In diesem Stadium können den Wachstumsmedien Inhibitoren hinzugefügt werden. (D) Kulturen können für 24-72 h gepflegt werden, und die okulomotorischen Axone können gesehen werden, wie sie auf das Auge wachsen. Angepasst mit Genehmigung von Whitman, et. al. 201823. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Die Hemmung von CXCR4 verursacht CN3-Fehlleitungen. Schnittkulturen aus E10.5 Isl-GFP-Embryonen, die in Kultur um 0, 12, 24 und 36 h abgebildet sind. Das obere Panel zeigt einen Wildtyp-Kontrollembryon und CN3 (grün) wächst im Laufe von 36 h ausgiebig zu den Augen und Zweigen. Siehe auch Video 1. Das untere Panel zeigt eine Scheibe mit 1 g/ml AMD3100 (spezifischer Inhibitor für CXCR4) hinzugefügt und Axone verlassen den okulomotorischen Nukleus dorsal. Diejenigen, die bereits ausgetreten waren, fahren weiter in Richtung Desauge. Siehe auch Video 2. D: dorsal, V: ventral, E: Auge, N: okulomotorischer Kern, SMN: spinale motorische Neuronen, Pfeile: okulomotorische Axone (weiß: Wildtypprojektion, gelb: abnorme Projektionen). Der Maßstabsbalken entspricht 200 m. Siehe auch Video 1 und Video 2. Eine ähnliche Zahl, die andere Beispiele zeigt, wurde in Whitman, et. al. 201823. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Die Ausrichtung der Scheiben ist entscheidend. Erste Bilder (Zeit 0 h) repräsentativer fehlorientierter Slices. A zeigt eine Scheibe, in der der Embryo zur Seite geneigt war, so dass projizierte CN3-Axone axotomisiert wurden. Projizierte Axone sind nur auf der rechten Seite der Scheibe (Pfeil) vorhanden. B zeigt eine Scheibe, in der der Embryo zurückgekippt wurde, so dass CN3-Kerne mit projizierten Axonen (Pfeil) bilateral sichtbar sind, aber die Augen sind nicht in der Scheibe vorhanden. Stattdessen sind spinale motorische Neuronen (SMN) und motorische Neuronenprojektionen auf die Gliedmaßen zu sehen. C zeigt eine Scheibe, die während der Platzierung auf der Membran gefaltet wurde. Slices, wie sie hier gezeigt werden, sollten verworfen werden. Skalenbalken stellen in jedem Panel 500 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Lösungsmittel können giftig sein. Zeitrafferbildgebung von Scheibenkulturen aus E10.5 Isl-GFP-Embryonen bei 0 und 12 h in kultur. Eine in Medien kultivierte Scheibe ohne Zusatzstoffe (A-B) wächst normalerweise für 12 h mit CN3-Axonen, die auf das Auge projiziert werden. Eine in Medien kultivierte Scheibe mit einer hohen Ethanolkonzentration (7,8%) (C-D) wächst nicht normal. Bei 12 h ist CN3 nicht gewachsen und ist kaum sichtbar, und das Gewebe hat begonnen, sich aufzulösen. Skalenbalken stellen in jedem Panel 500 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: CN3-Wachstum in der Slice-Kultur. Zeitrafferbildgebung einer Kontrollscheibenkultur aus einem E10.5 Isl-GFP-Embryo. Bilder, die alle 30 min über 18 h in Kultur aufgenommen wurden. CN3 (grün) wächst aus dem Kern (oben) zu den Augen und beginnt zu verzweigen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 2: Fehlausrichtung von CN3 mit Hemmung der CXCR4-Signalisierung. Zeitrafferbildgebung von Scheibenkulturen von E10.5 Isl-GFP-Embryonen über 48 h in der Kultur. Wenn 1 g/ml AMD3100 (spezifischer Inhibitor für CXCR4) direkt in die Medien aufgenommen wird, verlassen CN3-Axone, die sich noch nicht in der Peripherie befinden, den okulomotorischen Nukleus dorsal (links) anstatt ventral (rechts). Nachdruck mit Genehmigung von Whitman, et. al. 201823. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Dieses ex vivo Slice Culture-Protokoll bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Axon-Leitlinien-Assays23. Die Größe jedes Kranialmotorkerns ist kein begrenzender Faktor, und eine schwierige Zerlegung ist nicht erforderlich. Die endogene Mikroumgebung, durch die die Axone wandern, ermöglicht die Änderung eines Signalwegs unter Beibehaltung anderer Signalwege. Darüber hinaus können Effekte an verschiedenen Punkten entlang der Axonbahn bewertet werden. Da axon guidance mehrere Cues und Kombinationen von Cues erfordert, bietet dies entlang des Pfads29einen erheblichen Vorteil. Anders als in dissoziierten oder explantischen Kulturen werden wachsende Axone in dieser Zubereitung nicht geschnitten, so dass das anfängliche Axonwachstum beurteilt werden kann, anstatt axonregeneration. In den meisten anderen Beratungstests wird die Axonregeneration tatsächlich bewertet, anstatt das anfängliche Axonwachstum. Die Vermeidung von Axotomie vermeidet auch signifikante potenzielle Störfaktoren, weil die Neuronen nicht beschädigt sind oder unter Stress stehen.
Die beiden wichtigsten Schritte sind die Ausrichtung der Embryonen zum Schneiden und Minimieren der Zeit zwischen der Euthanasie der Mutter und der Platzierung der Scheiben im Brutkasten. Embryonen müssen jederzeit auf Eis gehalten werden. Zur Orientierung haben wir mehrere verschiedene Formen ausprobiert, aber aufgrund der Variabilität zwischen Embryonen in diesem Alter haben wir festgestellt, dass die Orientierung von Hand, basierend auf Fluoreszenz unter dem Sezierendes Mikroskop, am effektivsten ist. Die Orientierung per Hand begrenzt jedoch das embryonale Zeitfenster, das untersucht werden kann. Früher als E10.0 ist die richtige Ausrichtung der Scheibe eine Herausforderung, da das Auge schwer zu sehen ist und nur sehr wenige CN3-Axone zu sehen sind. Dies bedeutet jedoch, dass wir diese Methode nicht verwenden können, um das früheste Pionier-Axonwachstum zu untersuchen, da wir diesen Axonen erlauben müssen, teils herauszuwachsen, um die Scheibe orientieren zu können.
Es gibt mehrere Einschränkungen für die okulomotorische Scheibenkulturvorbereitung. Es ist am nützlichsten, um frühzeitige und mittlere Beratungsentscheidungen zu studieren, anstatt Entscheidungen über die Endverzweigung zu treffen. Bei E10.5 sind die EOMs nur als Muskelanlage vorhanden. Auch zu späteren Zeitpunkten, mit der aktuellen Bildgebungstechnologie, lassen sich einzelne Ziel-EOMs nicht innerhalb des Slices unterscheiden. Spezifische Terminalverzweigungsentscheidungen der Okulomotoraxone können daher nicht mit den aktuellen Bedingungen beurteilt werden. Da die Scheiben auf porösen Gewebekulturmembranen angebaut werden, ist die Trennung nach der Membran nach der Kultur schwierig und verursacht oft Gewebeschäden, wodurch Die Antikörperfärbung und Wiedermontage für zusätzliche Bildgebung erfolglos bleibt. Obwohl die Axone nicht geschnitten werden, wodurch neuronale Schäden minimiert werden, werden die umgebenden Gewebe geschnitten und daher beschädigt, was die Signalpunktexpression oder Freisetzung beeinflussen könnte. Das ideale Zeitfenster ist ebenfalls begrenzt. Wie bereits erwähnt, ist die Orientierung der Scheibe vor E10.0 schwierig, und nach E11.5 haben bereits viele Axone die Umlaufbahn erreicht, so dass bereits Zwischenführungsentscheidungen getroffen wurden.
Die Vorbereitung erfordert ein Mikroskop mit Bühnen-Top-Inkubator, automatischer Bühne und Zeitrafferfähigkeit. Die Objektive und die Kamera müssen für die Abbildung dicker Proben ohne Lichtung optimiert werden. Eine Auflösung auf der Ebene eines einzelnen Wachstumskegels, wie es bei einigen Kulturpräparaten möglich ist, ist mit dem aktuellen Bildaufbau nicht möglich. Die bildgebenden Parameter könnten jedoch möglicherweise angepasst werden, um eine höhere Auflösung zu ermöglichen, mit konfokaler oder 2-Photonen-Mikroskopie, die sich auf einen kleinen Bereich jeder Scheibe konzentriert (potenziell anpassen, wenn die Scheibe wächst). Mit dem aktuellen Epifluoreszenzmikroskop und der Bildgebung alle 30 min haben wir keine Photobleichung gesehen; Konfokalmikroskopie und häufigere Bildgebung könnten verwendet werden, aber Photobleichmittel würde ein potenzielles Problem werden.
Da kleine Molekülinhibitoren Off-Target-Effekte haben können, einschließlich auf das Gesamtwachstum und die Gesundheit der Scheibe, ist dieser Test am nützlichsten als Screening-Tool. Die Ergebnisse müssen mit anderen Methoden überprüft werden, z. B. mit K.o.-Mausmodellen. Bei der CXCR4-Hemmung beispielsweise ist das Gesamtwachstum der Scheibe leicht zurückgegangen (siehe Abbildung2), das mit den verschiedenen Funktionen von CXCR4 übereinstimmt. In Mausmodellen wurde jedoch der axon phänotyp, der in der Scheibe zu sehen war,23rekapituliert.
Dieses Protokoll könnte geändert werden, um andere Hirnnervenpopulationen zu untersuchen, obwohl für jede die richtige Ausrichtung der Scheiben und das Timing empirisch bestimmt werden müssten. Darüber hinaus könnten Mäuse mit unterschiedlichen fluoreszierenden Etiketten verwendet werden, die verschiedene Teilmengen von Neuronen markieren und/oder früher oder später embryonal enden.
Die Slice-Kultur kann auf verschiedene Weise manipuliert werden. Wir zeigen hier ein Beispiel für die Blockierung von Rezeptorsignalen mit einem kleinen Molekülinhibitor. Alternativ könnten den Medien Antikörper (entweder Rezeptorblocker oder Rezeptoraktivierung) oder rekombinante Proteine, wie Axon-Leitlinien oder Wachstumsfaktoren, zugesetzt werden. Um die Richtungseffekte auf die Axonführung zu bewerten, können Liganden-Sekretionsperlen an bestimmten Stellen auf die Scheibe gelegt werden. Mit einer dieser Methoden können viele andere Axon-Führungswege identifiziert und im Augenmotorsystem untersucht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Finanzierung durch das National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], die Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Stipendium] und die Children es Hospital Ophthalmology Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
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