Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/59914
Automatic Translation
1, 1,2
1Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, 2Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية استخدام المجهر ورقة الضوء شعرية لأربعة الأبعاد تصور ديناميات مستقبلات السطح في الخلايا الحية. هنا يتم عرض مستقبلات الخلايا التائية على CD4+ الخلايا التائية الأولية.

Abstract

يتم إملاء الإشارات ووظيفة الخلية من خلال الهياكل الديناميكية والتفاعلات لمستقبلات سطحها. لفهم العلاقة بين الهيكل والوظيفة لهذه المستقبلات في الموقع ، نحتاج إلى تصوروتتبعها على سطح الخلية الحية بدقة زمنية مكانية كافية. هنا نعرض كيفية استخدام التي تم تطويرها مؤخرا Lattice ضوء ورقة المجهر (LLSM) لصورة مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) رباعية الأبعاد (4D، والمكان والزمان) في غشاء الخلية الحية. الخلايا التائية هي واحدة من الخلايا الفعالة الرئيسية في الجهاز المناعي التكيفي ، وهنا استخدمنا الخلايا التائية كمثال لإظهار أن إشارات ووظيفة هذه الخلايا مدفوعة بديناميكيات وتفاعلاتTCRs. LLSM يسمح للتصوير 4D مع قرار الزمانية المكانية لم يسبق لها مثيل. وبالتالي يمكن تطبيق هذه التقنية المجهرية عموما على مجموعة واسعة من الجزيئات السطحية أو داخل الخلايا من خلايا مختلفة في علم الأحياء.

Introduction

كانت الديناميكيات الدقيقة لتهريب الجزيئات ونشرها على سطح الخلية ثلاثية الأبعاد في الوقت الحقيقي لغزًا يجب حله. كان المجهر دائما ً توازناً بين السرعة والحساسية والدقة. إذا تم تكبير أي واحد أو اثنين، يتم تصغير الثالث. ولذلك، ونظرا لصغر الحجم والسرعة الهائلة التي تتحرك بها مستقبلات السطح، ظل تتبع دينامياتها يشكل تحديا تكنولوجيا رئيسيا في مجال بيولوجيا الخلايا. على سبيل المثال ، تم إجراء العديد من الدراسات باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) المجهر1،2،3، الذي له دقة زمنية عالية ، ولكن يمكن أن صورة فقط شريحة رقيقة جدا من غشاء الخلية التائية (~ 100 نانومتر) ، وبالتالي يخطئ الأحداث التي تحدث بعيدا في الخلية. هذه الصور TIRF أيضا عرض فقط قسم ثنائي الأبعاد من الخلية. وعلى النقيض من ذلك، فإن تقنيات الدقة الفائقة، مثل المجهر المجهري لإعادة الإعمار البصري العشوائي (STORM)4،والمجهر المجهري للتعريب المُفعَّل ضوئيًا (PALM)5،والمجهر المنفّز لاستنفاد الانبعاثات (STED)6،يمكنها التغلب على حد حيود Abbe للضوء. هذه التقنيات لديها دقة مكانية عالية (~ 20 نانومتر القرار)4،5،6،7، لكنها غالبا ما تستغرق عدة دقائق للحصول على كامل ثنائي الأبعاد (2D) أو ثلاثي الأبعاد (3D) صورة ، وبالتالي يتم فقدان القرار الزمني. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون تقنيات مثل STORM و PALM التي تعتمد على إشارات وامضة غير دقيقة في عد8،9. المجهر الإلكتروني لديه حتى الآن أعلى دقة (تصل إلى 50 مساء القرار)10; حتى أنه يمكن إجراء ثلاثي الأبعاد مع شعاع أيون مركزة المسح المجهري الإلكترون (FIB-SEM)، مما أدى إلى ما يصل إلى 3 نانومتر XY و 500 نانومتر Z القرار11. ومع ذلك ، فإن أي شكل من أشكال المجهر الإلكتروني يتطلب إعداد عينة قاسية ولا يمكن إجراؤه إلا مع خلايا أو أنسجة ثابتة ، مما يلغي إمكانية تصوير العينات الحية بمرور الوقت.

تقنيات للحصول على دقة الزهوية الزمنية العالية المطلوبة لتحديد ديناميات الجزيئات السطحية وداخل الخلايا في الخلايا الحية في طبيعتها الفسيولوجية الحقيقية 3D يجري تطويرها مؤخرا. واحدة من هذه التقنيات هي Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12، والتي تستخدم ورقة ضوء منظمة لخفض التبييض الضوئي بشكل كبير. وضعت في عام 2014 من قبل الحائز على جائزة نوبل اريك Betzig، ودقة محورية عالية، انخفاض photobleaching والضوضاء الخلفية، والقدرة على صورة في وقت واحد مئات من الطائرات لكل مجال من مجالات الرؤية جعل المجاهر LLS متفوقة على widefield، TIRF والمجاهر كونكترسي12،13،14،15،16،17،19. هذه التقنية التصوير رباعية الأبعاد (س، ذ، ض والوقت)، في حين لا يزال الحيود محدودة (~ 200 نانومتر XYZ القرار)، لديه قرار زمني لا يصدق (حققنا معدل الإطار من حوالي 100 إطارا في الثانية، مما أدى إلى صورة خلية 3D أعيد بناؤها مع 0.85 ثانية لكل إطار) للحصول على المكانية 3D.

يمكن استخدام LLSM بشكل عام لتتبع ديناميكيات الوقت الحقيقي لأي جزيئات داخل أي خلية على مستوى الجزيء الواحد والخلية الواحدة ، خاصة تلك الموجودة في الخلايا عالية التفحص مثل الخلايا المناعية. على سبيل المثال، نعرض هنا كيفية استخدام LLSM لتصور ديناميات مستقبلات الخلايا التائية (TCR). الخلايا التائية هي الخلايا الفعالة في الجهاز المناعي التكيفي. TCRs هي المسؤولة عن الاعتراف ligands الببتيد-MHC (pMHC) المعروضة على سطح الخلايا المضادة (APC)، الذي يحدد اختيار، والتنمية، والتمايز، ومصير، وظيفة خلية T. يحدث هذا الاعتراف في الواجهة بين الخلايا التائية وAPCs ، مما يؤدي إلى تجميع مستقبلات موضعية لتشكيل ما يسمى المشبك المناعي. في حين أنه من المعروف أن TCRs في المشبك المناعي ضرورية لوظيفة المؤثرات الخلايا التائية، لا تزال غير معروفة هي الآليات الأساسية للاتجار TCR في الوقت الحقيقي إلى المشبك. وقد سمحت لنا LLSM لتصور في الوقت الحقيقي ديناميات TCRs قبل وبعد الاتجار إلى المشبك مع التفاعل pMHC-TCR الناتجة(الشكل 1). ولذلك يمكن استخدام LLSM لحل الأسئلة الحالية للديناميات التكوينية لـ TCRs وتوفير رؤى لفهم كيفية تميز الخلية بين المستضدات الذاتية والأجنبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

5C. C7 TCR المعدلة وراثيا RAG2 بالضربة القاضية الفئران في B10. تم استخدام خلفية في هذه الدراسة وفقًا لبروتوكول وافقت عليه لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة شيكاغو.

1. حصاد وتنشيط الخلايا التائية

ملاحظة: يستند هذا الجزء من البروتوكول إلى بروتوكولات سابقة. انظر الاستشهادات لمزيد من التفاصيل20،21.

  1. القتل الرحيم 10-12 أسبوع 5C. C7 الماوس المعدلة وراثيا من أي من الجنسين (~ 20-25 غرام) وفقا لبروتوكول IACUC المعتمدة (أي، CO2 الغرفة تليها خلع عنق الرحم).
  2. رش الذبيحة الماوس جيدا مع الإيثانول 70٪ لنقع أسفل الفراء وتقديمهم إلى خزانة السلامة BSL-2.
  3. بدوره الماوس على الجانب الأيمن وجعل شق صغير في تجويف الجسم مع مقص الجراحية. إزالة الطحال باستخدام ملقط الجراحية. قطع النسيج الضام بعيدا حسب الحاجة مع مقص الجراحية.
  4. وضع الطحال في 70 ميكروم المسام شبكة مصفاة الخلية والهريس مع الجزء الخلفي من 1 مل حقنة المكبس. غسل من خلال مصفاة جيدا مع RPMI كاملة (RPMI مع 10٪ مصل الأبقار الجنين [FBS]، 2 MM L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / ستربتومسين، 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol).
  5. الطرد المركزي تعليق خلية واحدة من الطحال في 300 × ز لمدة 5 دقيقة. تجاهل supernatant.
    ملاحظة: بيليه في هذه المرحلة سوف تكون حمراء.
  6. إعادة تعليق الطحال في 5 مل RBC العازلة الليسي. احتضان لمدة 5 دقيقة، ثم إخماد مع 5 مل من RPMI كاملة.
  7. الطرد المركزي تعليق خلية واحدة من الطحال في 300 × ز لمدة 5 دقيقة. تجاهل supernatant.
    ملاحظة: يجب أن تكون بيليه في هذه المرحلة بيضاء، وليس حمراء.
  8. إعادة تعليق بيليه في 5 مل من RPMI كاملة.
  9. نقل إلى قارورة T-25 وإضافة 10 ميكرومتر فراشة السيتوكروم-C (MCC، تسلسل ANERADLIAYLKQATK). وضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  10. في اليوم التالي، أضف الماوس المؤتلف IL-2 إلى تركيز نهائي يبلغ 100 U/mL.
  11. مراقبة للأيام التالية، إضافة وسائط جديدة كما وسائل الإعلام الحالية يتحول الأصفر. سوف تموت الخلايا التائية إذا تركت في وسائل الإعلام الصفراء دون مراقبة لأكثر من 48 ساعة.

2. إعداد الخلايا

  1. احتضان 5 مم التغطيات المستديرة مع 0.1٪ بولي-L-ليسين لمدة 10 دقيقة. تستنشق قبالة والسماح الجافة بشكل طبيعي.
  2. استخدام كاشف التدرج الكثافة (انظر جدول المواد)لفصل الخلايا الميتة والحصول على 1 × 106 خلايا T و 1 × 106 APCs (CH27 الخلايا21،22 نقلها مع mCherry الخلايا الخلايا) بشكل منفصل.
    ملاحظة: يتم حساب الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
    1. أضف 3 مل من كاشف تدرج الكثافة إلى أنبوب مخروطي 15 مل وإضافة خلايا مُنخفضة إلى حافة الأنبوب بعناية. لا تخلط. الطرد المركزي عند 930 × ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية؛ استخدام التسارع / التباطؤ: بطيء / بطيء. قم بإزالة الطبقة الوسطى الرقيقة من الخلايا بين الوسائط الكاملة وكاشف تدرج الكثافة بعناية، مع وضع كل نوع خلية في أنابيب مخروطية منفصلة.
      ملاحظة: من الضروري إعداد خلايا أكثر من اللازم للتصوير، حيث نجد أن 50٪ يتم فقدانها في المتوسط أثناء العملية. كلما زاد عدد الخلايا المستخدمة في العملية ، كلما كان من الأسهل حصادها من تدرج الكثافة. نحن نستخدم 4-8 مل من كلا النوعين من الخلايا لضمان الخلايا الزائدة. إذا رغبت في ذلك، يمكن حساب الخلايا قبل هذه الخطوة لضمان حجم المطلوبة. يتم وضع أي خلايا إضافية مرة أخرى في قوارير كل منها.
    2. غسل كل من أنابيب الخلايا التائية وخلايا CH27 ثلاث مرات مع 5 مل دورة في الدقيقة كاملة (300 × ز لمدة 5 دقيقة). تجاهل supernatant في كل مرة أثناء الغسيل. إعادة تعليق كل أنبوب في 1 مل كاملة RPMI وعدد الخلايا عن طريق مقياس الهيوكتومتر.
  3. إعادة تعليق 1 × 106 APCs في 500 ميكرولتر دورة في الدقيقة كاملة وإضافة 10 μM MCC. احتضان لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. غسل الخلايا ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر دورة في الدقيقة كاملة (300 × ز لمدة 5 دقيقة). تجاهل supernatants.
  4. إعادة تعليق 1 × 106 خلايا T في 500 ميكرولتر دورة في الدقيقة كاملة. أضف 2 ميكروغرام من الخلايا المضادة لـ TCRα Alexa488 المسماة (استنساخ H57) إلى 500 ميكرولتر من الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. غسل الخلايا ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من RPMI كاملة (300 × ز لمدة 5 دقيقة). تجاهل supernatant بعد كل غسل.
    ملاحظة: تم قطع الأجسام المضادة المضادة لTCR المغنية في فاب أحادية التكافؤ باستخدام مجموعة إعداد فاب (انظر جدول المواد)لتجنب ربط مستقبلات الخلايا التائية بواسطة الأجسام المضادة المغنية (هذه الخطوة اختيارية).
  5. إعادة تعليق كلا النوعين من الخلايا في 500 ميكرولتر من وسائط التصوير (فينول الأحمر الخالي من Leibovitz L-15 المتوسطة مع 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / ستربتومسين، 2 م م L-الجلوتامين).

3. إجراء المحاذاة اليومية LLSM

ملاحظة: (هام) يستند بروتوكول المحاذاة هذا إلى أداة LLSM المستخدمة (انظر جدول المواد). قد يكون كل LLSM مختلفة وتتطلب استراتيجيات محاذاة مختلفة، وخاصة تلك التي هي بنيت في المنزل. تنفيذ المحاذاة الروتينية المناسبة والاستمرار في القسم 4.

  1. أضف 10 مل من الماء بالإضافة إلى 30 ميكروريسسين ميكروريسين (1 ملغم/مل من المخزون) إلى حمام LLSM (~ 10 مل)، اضغط على الصورة (الصفحة الرئيسية) لنقل الهدف إلى موضع الصورة، وإلقاء نظرة على نمط شعاع ليزر واحد من Bessel. قم بمحاذاة شعاع الليزر باستخدام الأدلة ومنطقة الاهتمام المحددة مسبقًا (ROI) لجعل الشعاع نمطًا رفيعًا متوازنًا في جميع الاتجاهات.
    1. يجب أن يظهر الشعاع أيضًا مركزًا في كاميرا الباحث. استخدام اثنين من أجهزة ضبط إمالة المرآة، والميكرومتر العلوي، والتركيز، وطوق هدف الانبعاثات لضبط. انظر الشكل 2A, B للحصول على شعاع محاذاة بشكل صحيح.
  2. غسل الحمام والأهداف مع ما لا يقل عن 200 مل من الماء لإزالة الفلورسين تماما.
  3. صور معيار الفلورسنت الخرز في وسائل الإعلام التصوير (التي أعدتها الخرز التمسك 5 mm coverslip مع بولي L-ليسين، انظر جدول المواد؛وهذا يمكن أن تكون معدة مسبقا وإعادة استخدامها) لوظيفة انتشار نقطة المادية (PSF) في وسائط التصوير.
    ملاحظة: يمكن أن يكون هناك واحد فقط في عرض من أجل تجهيز في وقت لاحق، وذلك في محاولة للعثور على قطعة من ذلك في حد ذاته في المشاهد أو يمكن اقتصاص بسهولة للحصول على واحد من قطعة.
    1. قم بتشغيل التضاهر عن طريق الإعداد إلى 3 في مربع "نطاق X Galvo". اضغط على Live لعرض الحقل الحالي. تحرك على طول اتجاه Z للعثور على زلة الغطاء والخرز. العثور على مركز من المنزّه عن طريق التحرك على طول Z، اضغط على إيقاف لإيقاف الليزر. تحقق من 3D، مركز الصحافة ثم اضغط على تنفيذ. سيؤدي ذلك إلى جمع البيانات.
    2. ضبط مرآة الميل يدويًا ، وطوق الهدف ، وميكرومتر التركيز لأعلى القيم الرمادية ، ثم ضبط حسب الضرورة للحصول على أنماط مناسبة للمسح الموضوعي ، z galvo ، z + الهدف (totPSF) ، وأوضاع التقاط عينات (samplePSF). انظر الشكل 2C-F للاطلاع على إسقاطات الكثافة القصوى المعدلة بشكل صحيح.
      ملاحظة: أوضاع التقاط المختلفة (مسح الهدف، z galvo، z+objective، ومسح العينة) تغيير كيفية تحرك ورقة الضوء من خلال العينة. يجب استخدام كافة أوضاع الفحص للمحاذاة.
    3. يوضح مسح العينة كيفية جمع البيانات أثناء التجربة. جمع عينة PSF عن طريق الضغط على تنفيذ في وضع مسح العينة لdeskewing وdeconvolution (انظر القسم 5). تغيير الليزر إلى ثلاثة وضع اللون (488، 560، 647) واضغط على تنفيذ مرة أخرى.
      ملاحظة: منذ الصور LLSM بزاوية (57.2 درجة)، يتم جمع الصور التي تم التقاطها في وضع "مسح العينة" في هذه الزاوية، وبالتالي يتم "انحراف". إزالة الانحراف هو عملية تصحيح لهذه الزاوية و "إعادة محاذاة" الصورة إلى كومة z صحيح. يجب جمع هذه البيانات في وسائط التصوير وفي جميع القنوات التي سيتم تصويرها أثناء التجربة. إذا لم يتم تجميع هذا بشكل صحيح، لن يتم إزالة انحراف البيانات بشكل صحيح. وبالمثل، تأكد من أن الوسائط قد تم تسخينها إلى 37 درجة مئوية (أو درجة الحرارة التجريبية المطلوبة).

4. إعداد الخلايا مع LLSM

  1. أضف 100,000 من الناقلات المضادة للمقاومة (50 ميكرولتر) من الخطوة 2.5 إلى قسيمة تغطية دائرية قطرها 5 مم من الخطوة 2.1 والسماح لها بالاستقرار لمدة 10 دقيقة.
  2. الشحوم حامل العينة ثم إضافة غطاء خلية الجانب المتابعة لذلك. إضافة قطرة من وسائل الإعلام التصوير إلى الجزء الخلفي من غطاء لتجنب فقاعات قبل وضع في الحمام. المسمار حامل العينة على بيزو، واضغط على صورة (الصفحة الرئيسية).
  3. العثور على APC إلى صورة للتأكد من أن LLSM وبرامج التصوير (انظر جدول المواد)تعمل بشكل صحيح.
    ملاحظة: نحن صورة في حجم خطوة 0.4 ميكرومتر مع 60 z-الخطوات والتعرض 10 مللي ثانية للونين مع مجموعة dither إلى 3، مما يؤدي إلى 1.54 ثانية لكل إطار من صورة 3D مع ~ 200 نانومتر XY و 400 نانومتر Z القرار. قد تحتاج هذه الإعدادات إلى تعديل على أساس حجم الخلية، والمطلوب z-القرار، وقوة إشارة من تقنية وضع العلامات الفلورية المستخدمة. استخدام الطاقة الليزر أيضا تختلف على أساس تقنية وضع العلامات الفلورية المستخدمة.
    1. اضغط على Live لعرض الصورة الحالية. التحرك على طول Z للعثور على زلة الغطاء والخلايا.
    2. العثور على مركز APC عن طريق التحرك في الاتجاه Z، ثم اضغط على إيقاف لوقف الليزر. تحقق من 3D وأدخل الإعدادات المطلوبة (انظر الخطوة 4.3.1) ، اضغط على المركز ثم اضغط على تنفيذ. سيؤدي ذلك إلى جمع البيانات.
  4. خفض المرحلة لتحميل الموقف وإضافة 50 ميكرولتر من الخلايا التائية في وسائط التصوير (100،000 الخلايا، من الخطوة 2.5) دروبwise مباشرة على قسيمة الغطاء. فمن الأفضل للسماح نموذج قطرة على نهاية تلميح ماصة ومن ثم لمس تلميح إلى السائل حمام. رفع مرحلة العودة عن طريق النقر على"صورة (العودة)".
  5. بدء التصوير. تأكد من تعيين حجم المكدس المطلوب وطول الفاصل الزمني. على سبيل المثال، صورة 60 z-مكدسات في حجم خطوة 0.4 ميكرومتر وإدخال 500 الأطر الزمنية. (عادة) إيقاف التسجيل قبل الوصول إلى 500 إطار لتجنب التبييض الضوئي. استخدم الوضع المباشر للبحث عن أزواج الخلايا، وعند إدخال الإعدادات الجاهزة والمرغوبة، اضغط على تنفيذ لجمع البيانات. راجع الفيلم 1 والشكل 1 للحصول على مثال.

5. تتبع ديناميات السطح

  1. تصدير البيانات من برنامج التصوير (انظر جدول المواد). سيؤدي ذلك إلى إنشاء ملفات TIF كومة z لكل نقطة وقت في كل لون.
  2. أولا deskew وdeconvolve البيانات.
    ملاحظة: نحن نستخدم خط أنابيب LLSpy بموجب ترخيص من قبل حرم أبحاث Janelia18من HHMI ، ولكن deskewing وdeconvolution متوفرة أيضًا داخل برامج تصوير متعددة (انظر جدول المواد).
  3. إزالة التبييض البيانات.
    ملاحظة: نحن نستخدم ميزة إزالة التبييض فيجي مع مطابقة الرسم البياني (مسار فيجي: صورة | ضبط | تصحيح التبييض | مطابقة الرسم البياني | موافق).
  4. الاستيراد إلى برنامج التتبع (انظر جدول المواد). تتبع المجموعات وفقًا لمواصفات البرامج. راجع الفيلم 2 للحصول على مثال.
    ملاحظة: ستعتمد نتائج التتبع على برنامج التتبع المستخدم، والخوارزمية المختارة، ومعلمات الإخراج المطلوبة المحددة، وما إلى ذلك. على سبيل المثال ، في برنامج التتبع الذي نستخدمه (انظر جدول المواد)، اخترنا السماح للبرنامج بتتبع الأشكال غير المنتظمة ، بدلاً من تعيين كل ميزة بقعة واحدة ، حيث لا يتم تنظيم مجموعات TCR في مجالات مثالية. بالإضافة إلى ذلك ، اخترنا جمع 35 معلمة ، بما في ذلك السرعة والاتجاه والحجم والكثافة والمنطقة والموقع ومعلومات مدة المسار. ومع ذلك، فإن أساليب أو معلمات مختلفة تكون مفيدة للإجابة على أسئلة مختلفة.
    1. إذا لم يكن التتبع مرغوبًا فيه، فاستخدم البرنامج المساعد ClearVolume لفيجي لتصور وإنشاء الأفلام من بيانات hyperstack.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا ، ونحن نصف العزلة ، وإعداد ، والتصوير من الماوس الأساسي 5C. C7 الخلايا T باستخدام مجهر ورقة الضوء شعرية. خلال القسم 3 ، لا بد من محاذاة المجهر بشكل صحيح ، وجمع PSF يوميًا يتم معه تخفيض البيانات بعد جمعها. في الشكل 2، نعرض صور المحاذاة الصحيحة التي سيتم رؤيتها عند محاذاة المجهر. الشكل 2A والشكل 2B إظهار مسار شعاع الصحيح ومحاذاة شعاع، على التوالي، عند الصورة في الفلورسين. يجب أن يظهر الفحص الموضوعي شكل X كبير في إسقاطات XZ و YZ متناظرة قدر الإمكان؛ وينبغي أيضا أن يتم تعديل هذا ليكون صغير من X ممكن(الشكل 2C). ويتحقق ذلك أساسا عن طريق ضبط طوق هدف الانبعاثات. يجب أن يظهر مسح z galvo بيضاويًا في XZ و XY مع نقطة واحدة على كلا الجانبين (أعلى وأسفل لـ XZ وإلى اليسار واليمين لـ YZ)(الشكل 2D). ويتحقق ذلك بشكل رئيسي عن طريق ضبط الميل مرآة جالنيو، إما يدويا أو مع التعديل الآلي في البرنامج. وأخيراً، يجب أن يظهر كل من المسح الضوئي للهدف z+والمسح الضوئي للعينة النقاط التي تبدو مستديرة قدر الإمكان(الشكل 2E والشكل 2F،على التوالي). قد يكون هذه X صغيرة، ولكن هذا ينبغي أن يكون باهتة قدر الإمكان. وينبغي أن تكون هذه الانحياز بشكل جيد إذا تم تعيين المسح الموضوعي وz جالفو بشكل جيد، ولكن إذا كانت التعديلات ضرورية، سيتم إجراؤها في الغالب مع مرآة غالفو. ومن المهم ملاحظة أنه خلال هذه المحاذاة، وفي أي وقت يتم فيه تعديل الطوق والجلفو، سيلزم أيضاً تعديل التركيز (الميكرومتر فوق هدف الانبعاثات).

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا أن نرى ديناميات رباعية الأبعاد من TCRs على سطح الخلية T(الشكل 1، الفيلم 1). الميزة الرئيسية لهذا المجهر تكمن في القدرة على تتبع وحدات السطح المتخيلة من TCRs ، والحصول على بيانات كمية من حجمها ، والحركة ، وكثافة الإشارة ، وما إلى ذلك (انظر جدول المواد). يعرض الفيلم 2 مثالًا على المسارات التي تم الحصول عليها.

Figure 1
الشكل 1: 4-الأبعاد التصوير من T خلية-APC Synapse. (أ)مثال تمثيلي 3D الوقت الفاصل LLSM الصور التي تظهر خلية T التفاعل مع APC. تظهر ديناميات TCR (أخضر ، المسمى من قبل مكافحة TCR-AF488) في التعرف على المستضدات المعروضة على سطح APC (أحمر ، ملشيري دوري). مقياس شريط = 5 ميكرون. انظر أيضا الفيلم 1. (ب)شريحة XY متعامدة من (A). Inset هو إطار مرجعي لخلية كاملة. مقياس شريط = 5 ميكرون. (C)شريحة YZ متعامدة من (A). Inset هو إطار مرجعي لخلية كاملة. مقياس شريط = 5 ميكرون. (D)شريحة مزدوجة متعامدة من (A). Inset هو إطار مرجعي للخلية بأكملها. مقياس شريط = 5 ميكرون. انظر أيضا الفيلم 3. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: محاذاة LLSM. (أ)نمط شعاع المطلوب لتجربة التصوير LLSM. (ب)لقطة شاشة لعملية محاذاة الحزمة؛ على اليسار هو نافذة التركيز تظهر ضيق، شعاع مركزة؛ في أعلى اليمين يوجد رسم بياني يوضح أن الشعاع يتمركز داخل النافذة. في أسفل اليمين هو مكتشف الكاميرا ، والتي ينبغي أيضا أن تكون رقيقة ، شعاع مركزة. (C)إسقاطات الكثافة القصوى (MIPs) للمسح الموضوعي للمسح الموضوعي. (D)إسقاطات الكثافة القصوى (MIPs) للمسح الضوئي للزي-غالفو. (E)إسقاطات الكثافة القصوى (MIPs) للمسح الضوئي للمسح الضوئي للهدف z+. (F)إسقاطات الكثافة القصوى (MIPs) للمسح الضوئي للعينات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Movie 1
الفيلم 1: تشكيل المشبك الخلية T. تقديم حجم لونين من التفاعل من خلية T المسمى مع αTCR-AF488 (الأخضر) مع APC الهدف التعبير عن mCherry الخلوية (الأحمر) أكثر من 70 نقطة زمنية في 1.54 ق الفاصل الزمني. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Movie 2
الفيلم 2: تتبع الحركة الديناميكية TCR. مقارنة مع الفيلم 1. تم تتبع التجمعات المقابلة لهياكل TCR المرئية في 3D مع مرور الوقت مع برامج التصوير. ذيول التنين تظهر مواقع الكتلة على الإطارات الأربعة السابقة هي اللون مرمزة من قبل طول التشريد. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Movie 3
الفيلم 3: شرائح متعامدة من المشبك الخلية T. مقارنة مع الفيلم 1 والشكل 1B-D. شريحة مزدوجة متعامدة من الفيلم 1، تبين أن αTCRа-AF488 فاب هو في الواقع تسمية TCRs سطح الخلية. مقياس شريط = 5 ميكرون. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تحسين البروتوكول المقدم لاستخدام خلايا CD4+ T المعزولة من 5C. C7 الفئران المعدلة وراثيا على أداة LLSM المستخدمة، وبالتالي أنظمة الخلايا الأخرى وLLSMs قد تحتاج إلى تحسين بشكل مختلف. ومع ذلك ، يظهر هذا البروتوكول قوة التصوير 4D ، حيث يمكن استخدامه لقياس ديناميات مستقبلات السطح على خلية كاملة بأقل تشويه في الظروف الفسيولوجية. لذلك، هناك العديد من التطبيقات المستقبلية المحتملة لهذه التقنية.

خطوة حاسمة هي السماح للخلايا بالاستقرار عند تركيز مناسب. إذا كان عدد كبير جداً من APCs تسوية على غطاء وتصبح كثيفة جداً، فمن الصعب العثور على خلية T التي تتفاعل مع APC واحد فقط. عندما خلية T لديه نقاط الاشتباك العصبي متعددة، تتبع وتفسير البيانات يمكن أن تصبح معقدة للغاية. وبالمثل ، إذا كان عدد قليل جدا من APCs موجودة ، وإيجاد خلية T تشكيل المشبك هو أيضا من الصعب. في أيدينا، والسماح لخلايا 50،000 لتسوية لمدة 10 دقيقة يحقق كثافة الأمثل. ومع ذلك، يمكن تجنب هذه المشكلة إذا كان استخدام نظام مع الخلايا المنضمة. يمكن أن تزرع الخلايا في الحاضنة مع القسائم إلى التقاء المطلوب.

وبالمثل، يعتمد عدد الخلايا التائية التي تم إسقاطها في النظام على حجم الحمام والمسافة التي يمكن أن تفرقها. في نظام LLSM المستخدمة هنا، هناك حمام 12 مل وحمام 2.5 مل، على عكس الإصدار السابق من النظام الذي كان فقط حمام 10 مل المتاحة. نحن نستخدم حمام 12 مل لتصوير الفلورسين الأصلي ثم التبديل إلى حمام 2.5 مل لتصوير الخلايا. وهذا يسمح لغسل أقل شمولا من الحمام بعد خطوة التصور شعاع، ويخفض أيضا عدد الخلايا التائية اللازمة لكل جلسة التصوير. وهذا بدوره سيسمح للمستخدمين باستخدام عدد أقل من الخلايا.

العثور على الخلايا في النقطة الصحيحة للتفاعل هو أيضا تحديا. في أيدينا، الخلايا التائية يستغرق حوالي 2 دقيقة ليستقر إلى APCs على قسيمة الغطاء، لذلك من المهم أن تبدأ في البحث في قسيمة الغطاء عن الخلايا التائية الديناميكية قريبة من APCs. وكان التحسن الرئيسي في هذا هو إضافة ضوء LED في كاميرا الباحث. إذا كنت تستخدم نظامًا منزليًا ، فإننا نوصي بشدة بإدراج هذه الميزة في التصميم.

وأخيراً، فإن استراتيجيات وضع العلامات الفلورية هي اعتبار هام آخر. كل بروتين الفلورسنت أو صبغة له غلة كمية مختلفة ومعدل من التبييض الضوئي. الأصباغ الفلورية عادة ما تكون أكثر إشراقا، ولكن إذا تم نقل الخلايا بشكل ثابت مع جزيء البروتين الفلوري المسمى، يتم تجديد التسمية كما تستمر الخلية في إنتاج الجزيء. لذلك ، فإن استراتيجية وضع العلامات هي عامل مهم يجب مراعاته عند تصميم التجارب.

ونود أن نختتم بمناقشة بشأن الاتجاهات المستقبلية للتكنولوجيا. LLSM هو أيضا قادرة على المجهر الإضاءة منظم (SIM)، والذي يؤدي إلى دقة 150 نانومتر XY و 280 نانومتر Z القرار، وعلى الأقل 10 مرات أسرع من SIM widefield12. لذلك ، في حين أن LLSM يوفر سرعة غير مسبوقة للتصوير 4D ، فإنه لا يمكن تحقيق الدقة المكانية لتقنيات الدقة الفائقة الحالية4،5،6. ومع ذلك، يمكن تحسين هذا القرار إذا كان يمكن إنشاء STED LLSM. وقد استخدمت ورقة ضوء STED واستنفاد الانبعاثات حفز مع المجهرية انتقائية إضاءة الطائرة (STED-SPIM) ، ولكن تفتقر إلى القرار الزمني من LLSM21،22،23،24. إذا تم تكييف STED-SPIM لدمج شعرية، يمكننا الحصول على دقة محورية 50 نانومتر مع أقل بكثير photobleaching، وصورة أسرع من التقنيات المتاحة حاليا. ومع ذلك ، مع التكنولوجيات الحالية المتاحة ، LLSM يعطينا أسرع قرار زمني مع دقة محورية عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نود أن ننوه بالمشورة والتوجيه من الدكتور فيتاس بيندوكاس في جامعة شيكاغو. نشكر المرفق الأساسي للمجهر الضوئي المتكامل في جامعة شيكاغو لدعمه والحفاظ على مجهر ورقة الضوء الشبكية. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعاهد القومية للصحة الجديدة للمبتكر1DP2AI144245 وجائزة NSF المهنية 1653782 (إلى J.H.). يتم دعم J.R. من قبل برنامج زمالات أبحاث الدراسات العليا NSF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309659 For T cell harvest
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-25ML For T cell culture
5 mm round coverslips World Precision Instruments 502040 For Imaging
70um Sterile Cell Strainer Corning 7201431 For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody BioLegend 109215 For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) X&Y Cell Culture FBS-500 For T cell culture
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02 Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F6377 For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres Thermo Fisher Scientific F8810 For microscope alignment
Imaris Bitplane N/A Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope 3i N/A Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 21083027 For Imaging
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-081 For T cell culture
LLSpy Janelia Research Campus N/A LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK Elimbio Custom Synthesis For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin Life Technologies 15140122_3683884612 For T cell culture
Poly-L-Lysine Phenix Research Products P8920-100ML For Imaging
RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4300-54 For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2 Sigma-Aldrich I0523 For T cell culture
RPMI 1640 Medium Corning MT10040CV For T cell culture
Slidebook 3i N/A LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools Nova-Tech International DSET10 For T cell harvest
T-25 Flasks Eppendorf 2231710126 For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits Thermo Fisher Scientific 44685 For preparing Fab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
  3. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  5. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
  7. Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
  8. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  9. Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
  10. Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
  11. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  12. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
  13. Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
  14. Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
  15. Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
  16. Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
  17. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
  18. Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
  19. Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
  20. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
  21. Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
  22. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
  23. Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
  24. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 155، المجهر ورقة الضوء شعرية، علم المناعة، مستقبلات الخلايا التائية، التصوير، تتبع، ديناميات
تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing … More

Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e59914, doi:10.3791/59914 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter