Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.
Abstract
Die Signalisierung und Funktion einer Zelle wird durch die dynamischen Strukturen und Wechselwirkungen ihrer Oberflächenrezeptoren diktiert. Um die Struktur-Funktions-Beziehung dieser Rezeptoren vor Ort wirklich zu verstehen, müssen wir sie auf der Oberfläche der lebenden Zelle mit genügend raumzeitlicher Auflösung visualisieren und verfolgen. Hier zeigen wir, wie sie die kürzlich entwickelte Lattice Light-Sheet-Mikroskopie (LLSM) verwenden, um T-Zellrezeptoren (TCRs) vierdimensional (4D, Raum und Zeit) an der lebenden Zellmembran abzubilden. T-Zellen sind eine der Haupteffektorzellen des adaptiven Immunsystems, und hier haben wir T-Zellen als Beispiel verwendet, um zu zeigen, dass die Signalisierung und Funktion dieser Zellen durch die Dynamik und Wechselwirkungen der TCRs angetriebenwerden. LLSM ermöglicht 4D-Bildgebung mit beispielloser Raumzeitauflösung. Diese Mikroskopietechnik kann daher in der Biologie allgemein auf eine Vielzahl von Oberflächen- oder intrazellulären Molekülen verschiedener Zellen angewendet werden.
Introduction
Die genaue Dynamik des Molekülhandels und der Streuung auf der dreidimensionalen Zelloberfläche in Echtzeit war ein Rätsel, das es zu lösen gilt. Mikroskopie war schon immer ein Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Auflösung; Wenn ein oder zwei Maximierungen, wird die dritte minimiert. Aufgrund der geringen Größe und der immensen Geschwindigkeit, mit der sich Oberflächenrezeptoren bewegen, ist die Verfolgung ihrer Dynamik eine große technologische Herausforderung für den Bereich der Zellbiologie geblieben. Zum Beispiel wurden viele Studien mit der totalen inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) Mikroskopie1,2,3durchgeführt, die eine hohe zeitliche Auflösung hat, aber nur ein sehr dünnes Stück der T-Zell-Membran (ca. 100 nm) abbilden kann und daher Ereignisse vermisst, die weiter entfernt in der Zelle geschehen. Diese TIRF-Bilder zeigen auch nur einen zweidimensionalen Abschnitt der Zelle. Im Gegensatz dazu können superhochauflösende Techniken wie die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM)4, die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)5und die stimulierte Emissionserschöpfungsmikroskopie (STED)6die Abbe-Beugungsgrenze des Lichts überwinden. Diese Techniken haben eine hohe räumliche Auflösung (20 nm Auflösung)4,5,6,7, aber sie dauern oft viele Minuten, um ein vollständiges zweidimensionales (2D) oder dreidimensionales (3D) Bild zu erhalten, und daher geht die zeitliche Auflösung verloren. Darüber hinaus können Techniken wie STORM und PALM, die auf blinkenden Signalen basieren, Ungenauigkeiten bei der Zählungvon 8,9haben. Elektronenmikroskopie hat bei weitem die höchste Auflösung (bis 50 pm Auflösung)10; es kann sogar dreidimensional mit fokussierter Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) durchgeführt werden, was zu bis zu 3 nm XY und 500 nm Z Auflösung11führt. Jede Form der Elektronenmikroskopie erfordert jedoch eine harte Probenvorbereitung und kann nur mit festen Zellen oder Geweben durchgeführt werden, wodurch die Möglichkeit einer Bildgebung von Lebendenproben im Laufe der Zeit ausgeschlossen wird.
Techniken zur Erzielung der hohen raumzeitlichen Auflösung, die erforderlich ist, um die Dynamik von Oberflächen- und intrazellulären Molekülen in lebenden Zellen in ihrer wahren physiologischen 3D-Natur zu identifizieren, werden erst vor kurzem entwickelt. Eine dieser Techniken ist Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, die eine strukturierte Lichtplatte verwendet, um photobleaching drastisch zu senken. Entwickelt im Jahr 2014 von Nobelpreisträger Eric Betzig, die hohe axiale Auflösung, geringe Photobleaching und Hintergrundgeräusche, und die Fähigkeit, gleichzeitig Hunderte von Ebenen pro Sichtfeld bilden LLS Mikroskope überlegen Widefield, TIRF und konfokale Mikroskope12,13,14,15,16,17,18,19. Diese vierdimensionale (x, y, z und zeit) Bildgebungstechnik, die zwar noch beugungsbegrenzt ist (200 nm XYZ-Auflösung), hat eine unglaubliche zeitliche Auflösung (wir haben eine Bildrate von etwa 100 fps erreicht, was zu einem 3D-rekonstruierten Zellbild mit 0,85 Sekunden pro Frame führt) für die 3D-Raumerfassung.
LLSM kann im Allgemeinen verwendet werden, um die Echtzeitdynamik von Molekülen innerhalb einer Zelle auf Einzelmolekül- und Einzelzellebene zu verfolgen, insbesondere in stark motilen Zellen wie Immunzellen. Zum Beispiel zeigen wir hier, wie man LLSM verwendet, um die T-Zell-Rezeptor-Dynamik (TCR) zu visualisieren. T-Zellen sind die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems. TCRs sind verantwortlich für die Erkennung von Peptid-MHC (pMHC) Liganden, die auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen (APC) angezeigt werden, die die Auswahl, Entwicklung, Differenzierung, Dasschicksal und Funktion einer T-Zelle bestimmen. Diese Erkennung tritt an der Schnittstelle zwischen T-Zellen und APCs auf, was zu lokalisierten Rezeptorclustern führt, um die so genannte immunologische Synapse zu bilden. Während bekannt ist, dass TCRs an der immunologischen Synapse für die T-Zell-Effektorfunktion unerlässlich sind, sind noch unbekannt die zugrunde liegenden Mechanismen des Echtzeit-TCR-Handels zur Synapse. LLSM hat es uns ermöglicht, die Dynamik von TCRs vor und nach dem Handel mit der resultierenden pMHC-TCR-Interaktion in Echtzeit zu visualisieren (Abbildung 1). LLSM kann daher verwendet werden, um aktuelle Fragen der prägenden Dynamik von TCRs zu lösen und Erkenntnisse zu liefern, um zu verstehen, wie eine Zelle zwischen selbst- und fremder Antigene unterscheidet.
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Protocol
5C. C7 TCR-transgene RAG2 Knockout-Mäuse in B10. Ein Hintergrund wurde in dieser Studie gemäß einem Protokoll verwendet, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Chicago genehmigt wurde.
1. Ernte und Aktivierung von T-Zellen
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls basiert auf früheren Protokollen. Siehe Zitate für weitere Details20,21.
- Euthanisieren Sie ein 10-12 Wochen altes 5C. C7 transgene Maus beiderlei Geschlechts (20-25 g) nach dem zugelassenen IACUC-Protokoll (d. h.CO2-Kammer gefolgt von zervikaler Dislokation).
- Mauskarkasse gründlich mit 70% Ethanol besprühen, um das Fell einzuweichen und in einen BSL-2 Sicherheitsschrank zu bringen.
- Drehen Sie die Maus auf die rechte Seite und machen Sie einen kleinen Schnitt in der Körperhöhle mit chirurgischer Schere. Entfernen Sie die Milz mit chirurgischen Zangen. Mit einer chirurgischen Schere das Bindegewebe nach Bedarf abschneiden.
- Legen Sie die Milz in ein 70-m-Pore-Mesh-Zellsieb und zerkleinern Sie mit der Rückseite eines 1 ml Spritzenkolbens. Waschen Sie das Sieb gründlich mit komplettem RPMI (RPMI mit 10% fetalem Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 50 m 2-Mercaptoethanol).
- Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension von Splenozyten bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
HINWEIS: Das Pellet an dieser Stelle wird rot sein. - Setzen Sie die Splenozyten in 5 ml RBC-Lysepuffer aus. 5 min inkubieren, dann mit 5 ml komplettem RPMI löschen.
- Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension von Splenozyten bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
HINWEIS: Das Pellet sollte an dieser Stelle weiß und nicht rot sein. - Setzen Sie das Pellet in 5 ml vollständigem RPMI wieder aus.
- In einen T-25-Kolben übertragen und 10 M Mottencytochrom-C (MCC, Sequenz ANERADLIAYLKQATK) hinzufügen. Legen Sie die Zellen in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht.
- Am nächsten Tag, fügen Sie rekombinante Maus IL-2 zu einer endgültigen Konzentration von 100 U/ml.
- Beobachten Sie für die folgenden Tage, fügen Sie frische Medien hinzu, wenn die aktuellen Medien gelb werden. T-Zellen sterben ab, wenn sie in gelben Medien über 48 h unbeaufsichtigt bleiben. Zellen sind bereit, 6-10 Tage nach der Ernte zu verwenden.
2. Vorbereiten von Zellen
- 5 mm runde Deckelscheiben mit 0,1% Poly-L-Lysin für 10 min inkubieren. Absaugen und natürlich trocknen lassen.
- Verwenden Sie ein Dichtegradientenreagenz (siehe Materialtabelle), um abgestorbene Zellen zu trennen und 1 x 106 T-Zellen und 1 x 106 APCs (CH27-Zellen21,22 mit zytosolischem mCherry) separat zu erhalten.
HINWEIS: Zellen werden mit einem Hämozytometer gezählt.- Fügen Sie 3 ml Dichtegradientenreagenz zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu und fügen Sie Zellen tropfenweise an den Rand des Rohres hinzu. Nicht mischen. Zentrifuge bei 930 x g für 10 min bei 4 °C; Beschleunigung/Verzögerung verwenden: SLOW/SLOW. Entfernen Sie die dünne mittlere Zellschicht zwischen dem gesamten Medium und dem Dichtegradientenreagenz sorgfältig, indem Sie jeden Zelltyp in separate konische Röhren setzen.
HINWEIS: Es ist notwendig, mehr Zellen vorzubereiten, als für die Bildgebung benötigt werden, da wir feststellen, dass 50% im Durchschnitt während des Prozesses verloren gehen. Je mehr Zellen für den Prozess verwendet werden, desto einfacher ist es, sie aus dem Dichtegradienten zu ernten. Wir verwenden 4-8 ml beider Zelltypen, um überschüssige Zellen zu gewährleisten. Falls gewünscht, können Zellen vor diesem Schritt gezählt werden, um das benötigte Volumen sicherzustellen. Alle zusätzlichen Zellen werden wieder in ihre jeweiligen Kolben gesteckt. - Waschen Sie beide Röhren von T-Zellen und CH27-Zellen dreimal mit 5 ml komplettem RPMI (300 x g für 5 min). Entsorgen Sie den Überstand jedes Mal während der Wäsche. Setzen Sie jede Röhre in 1 ml kompletten RPMI aus und zählen Sie zellen durch ein Hämozytometer.
- Fügen Sie 3 ml Dichtegradientenreagenz zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu und fügen Sie Zellen tropfenweise an den Rand des Rohres hinzu. Nicht mischen. Zentrifuge bei 930 x g für 10 min bei 4 °C; Beschleunigung/Verzögerung verwenden: SLOW/SLOW. Entfernen Sie die dünne mittlere Zellschicht zwischen dem gesamten Medium und dem Dichtegradientenreagenz sorgfältig, indem Sie jeden Zelltyp in separate konische Röhren setzen.
- Resuspend 1 x 106 APCs in 500 l komplette RPMI und fügen Sie 10 M MCC. Inkubieren für 3 h bei 37 °C, 5%CO2. Waschen Sie Zellen dreimal mit 500 l komplettem RPMI (300 x g für 5 min). Entsorgen Sie die Überräube.
- Resuspend 1 x 106 T-Zellen in 500 l komplettem RPMI. Fügen Sie 2 g Anti-TCR-Alexa488-markierte Fab (Klon H57) zu 500 l Zellen hinzu. 30 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Waschen Sie Zellen dreimal mit 500 l vollständigem RPMI (300 x g für 5 min). Überstand nach jeder Wäsche entsorgen.
HINWEIS: Der divalente Anti-TCR-Antikörper wurde mit einem Fab-Präparat-Kit (siehe Materialtabelle) in monovalente Fab geschnitten, um eine Vernetzung der T-Zellrezeptoren durch den divalenten Antikörper zu vermeiden (dieser Schritt ist optional). - Setzen Sie beide Zelltypen in 500 l bildgebenden Medien (phenolrotfreies Leibovitz-Medium L-15 mit 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin) aus.
3. Durchführung der LLSM-Tagesausrichtung
ANMERKUNG: (Wichtig) Dieses Ausrichtungsprotokoll basiert auf dem verwendeten LLSM-Instrument (siehe Tabelle der Materialien). Jedes LLSM kann unterschiedlich sein und unterschiedliche Ausrichtungsstrategien erfordern, insbesondere solche, die selbst erstellt wurden. Führen Sie die entsprechende Routineausrichtung durch und fahren Sie mit Abschnitt 4 fort.
- Fügen Sie dem LLSM-Bad 10 ml Wasser plus 30 l Fluorescein (1 mg/ml)-Gehalt hinzu (ca. 10 ml Volumen), drücken Sie Bild (Home), um das Objektiv in die Bildposition zu verschieben, und betrachten Sie ein einzelnes Bessel-Laserstrahlmuster. Richten Sie den Laserstrahl mithilfe der Führungen und des voreingestellten Interessenbereichs (ROI) aus, um den Strahl zu einem dünnen Muster in alle Richtungen zu gestalten.
- Der Strahl sollte auch in der Finderkamera fokussiert erscheinen. Verwenden Sie zwei Spiegelneigungsregler, Top-Mikrometer, Fokus und Emissionsobjektivkragen, um sich anzupassen. Siehe Abbildung 2A,B für korrekt ausgerichteten Balken.
- Waschen Sie das Bad und Ziele mit mindestens 200 ml Wasser, um Fluorescein vollständig zu entfernen.
- Bildstandard-Fluoreszenzperlen in den bildgebenden Medien (vorbereitet durch Anhaften von Perlen an einem 5 mm-Coverslip mit Poly-L-Lysin, siehe Tabelle der Materialien;dies kann vorbereitet und wiederverwendet werden) für physikalische Punktausbreitungsfunktion (PSF) in bildgebenden Medien.
HINWEIS: Es kann nur eine Perle für die spätere Verarbeitung in Sicht sein, also versuchen Sie, eine Perle zu finden, die sich selbst im Betrachter befindet oder leicht abgeschnitten werden kann, um eine einzelne Perle zu erhalten.- Schalten Sie dither ein, indem Sie in der Box "X Galvo" auf 3 setzen. Drücken Sie Live, um das aktuelle Feld anzuzeigen. Bewegen Sie sich entlang der Z-Richtung, um den Deckelzettel und die Perlen zu finden. Finden Sie die Mitte einer Perle, indem Sie sich entlang Z bewegen, drücken Sie Stopp, um den Laser anzuhalten. Überprüfen Sie 3D, drücken Sie Center und drücken Sie dann Execute. Dadurch werden die Daten erfasst.
- Passen Sie den Neigungsspiegel, den Objektivkragen und das Fokusmikrometer manuell für höchste Grauwerte an, und passen Sie sie dann bei Bedarf an, um die richtigen Muster für objektive Scan-, z-Galvo-, z+objektive (totPSF) und Sample-Scan-Erfassungsmodi (samplePSF) zu erhalten. Siehe Abbildung 2C-F für richtig eingestellte Projektionen der maximalen Intensität (MEP).
HINWEIS: Die verschiedenen Aufnahmemodi (Objektivscan, z galvo, z+objektiv und Sample-Scan) ändern die Art und Weise, wie sich das Lichtblatt durch die Probe bewegt. Alle Scan-Modi sollten für die Ausrichtung verwendet werden. - Der Beispielscan zeigt, wie Daten während des Experiments gesammelt werden. Sammeln Sie die Probe PSF, indem Sie Execute im Sample-Scan-Modus für Dekewing und Dekonvolution drücken (siehe Abschnitt 5). Wechseln Sie die Laser in den Dreifarbenmodus (488, 560, 647) und drücken Sie erneut ausführen.
HINWEIS: Da die LLSM-Bilder in einem Winkel (57,2°) aufgenommen wurden, werden im "Sample Scan"-Modus aufgenommene Bilder in diesem Winkel gesammelt und daher "verzerrt". De-Skewing ist der Prozess der Korrektur für diesen Winkel und "Neuausrichtung" des Bildes auf einen echten Z-Stack. Diese Daten müssen in bildgebenden Medien und in allen Kanälen gesammelt werden, die während des Experiments abgebildet werden. Wenn dies nicht ordnungsgemäß gesammelt wird, werden die Daten nicht ordnungsgemäß entstellt. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Medien auf 37 °C (oder die gewünschte Versuchstemperatur) erwärmt wurden.
4. Einrichten von Zellen mit LLSM
- Fügen Sie 100.000 APCs (50 l) von Schritt 2,5 bis zu einem kreisförmigen Abdeckungsrutsch mit 5 mm Durchmesser ab Schritt 2.1 hinzu und lassen Sie sie sich für 10 min begleichen.
- Fetten Sie den Probenhalter und fügen Sie dann die coverslip-Zellseite dazu. Fügen Sie einen Tropfen Bildmedien auf der Rückseite des Coverslip hinzu, um Blasen zu vermeiden, bevor Sie sie in das Bad legen. Schrauben Sie den Probenhalter auf den Piezo, und drücken Sie Bild (Home).
- Suchen Sie einen Abbild-APC, um sicherzustellen, dass die LLSM- und Bildverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien)ordnungsgemäß funktioniert.
ANMERKUNG: Wir stellen uns bei einer Schrittgröße von 0,4 m mit 60 Z-Schritten und einer Belichtung von 10 ms für zwei Farben mit dither auf 3, was zu 1,54 s pro Bildbild mit einer Auflösung von 200 nm XY und 400 nm Z führt. Diese Einstellungen müssen möglicherweise basierend auf der Zellgröße, der gewünschten Z-Auflösung und der Signalstärke der verwendeten fluoreszierenden Etikettierungstechnik angepasst werden. Der Laserstromverbrauch variiert auch je nach verwendeter fluoreszierender Etikettierungstechnik.- Drücken Sie Live, um das aktuelle Bild anzuzeigen. Bewegen Sie sich entlang Z, um den Deckbedeckungsschlupf und die Zellen zu finden.
- Suchen Sie die Mitte eines APC, indem Sie sich in Z-Richtung bewegen, und drücken Sie dann Stopp, um den Laser anzuhalten. Überprüfen Sie 3D und geben Sie die gewünschten Einstellungen ein (siehe Schritt 4.3.1), drücken Sie Center und drücken Sie dann Execute. Dadurch werden die Daten erfasst.
- Senken Sie die Stufe, um die Position zu laden, und fügen Sie 50 L T-Zellen in bildgebenden Medien (100.000 Zellen, ab Schritt 2.5) tropfenweise direkt über den Deckelschlupf hinzu. Am besten lassen Sie einen Tropfen am Ende der Pipettenspitze bilden und berühren Sie dann die Spitze an der Badeflüssigkeit. Erhöhen Sie die Bühne zurück, indem Sie auf "Bild (Return)" klicken.
- Beginnen Sie mit der Bildgebung. Stellen Sie sicher, dass Sie die gewünschte Stapelgröße und Zeitrafferlänge festlegen. Zum Beispiel, Bild 60 z-Stacks bei einer Schrittgröße von 0,4 m und Eingabe 500 Zeitrahmen. (Typischerweise) stoppen Sie die Aufnahme, bevor 500 Frames erreicht werden, um Photobleichungen zu vermeiden. Verwenden Sie den Live-Modus, um nach Zellpaaren zu suchen, und wenn bereite und gewünschte Einstellungen eingegeben wurden, drücken Sie Ausführen, um Daten zu sammeln. Siehe Film 1 und Abbildung 1 für ein Beispiel.
5. SpurOberflächendynamik
- Exportieren Sie die Daten aus der Imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien). Dadurch werden Z-Stack-TIF-Dateien für jeden Zeitpunkt in jeder Farbe erstellt.
- Zuerst die Daten deskew und dekonvolvenieren.
HINWEIS: Wir verwenden die LLSpy-Pipeline unter Lizenz von HHMI Janelia Research Campus18, aber Dekewing und Dekonvolution sind auch in mehreren Bildverarbeitungssoftwares verfügbar (siehe Tabelle der Materialien). - Entbleichen Sie die Daten.
HINWEIS: Wir verwenden Fidschis Bleichmittel-Funktion mit Histogramm-Matching (Fidschi-Pfad: Bild | Anpassen | Bleichkorrektur | Histogramm Matching | OK). - Importieren in die Tracking-Software (siehe Materialtabelle). Verfolgen Sie Cluster gemäß Denksoftware-Spezifikationen. Siehe Film 2 für ein Beispiel.
HINWEIS: Die Tracking-Ergebnisse hängen von der verwendeten Tracking-Software, dem gewählten Algorithmus, den ausgewählten gewünschten Ausgabeparametern usw. ab. In der von uns verwendeten Tracking-Software (siehe Tabelle der Materialien) haben wir uns beispielsweise dafür entschieden, der Software zu erlauben, unregelmäßige Formen zu verfolgen, anstatt jedem Feature einen einzelnen Punkt zuzuweisen, da TCR-Cluster nicht in perfekte Sphären organisiert sind. Darüber hinaus haben wir 35 Parameter gesammelt, einschließlich Geschwindigkeit, Richtung, Lautstärke, Intensität, Fläche, Standort und Spurdauerinformationen. Unterschiedliche Methoden oder Parameter sind jedoch von Vorteil, um verschiedene Fragen zu beantworten.- Wenn Tracking nicht gewünscht ist, verwenden Sie das ClearVolume-Plugin für Fidschi zum Visualisieren und Erstellen von Filmen aus Hyperstack-Daten.
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Representative Results
Hier beschreiben wir die Isolierung, Vorbereitung und Abbildung der primären Maus 5C. C7 T-Zellen mit einem Gitter-Lichtbogenmikroskop. In Abschnitt 3 ist es zwingend erforderlich, das Mikroskop richtig auszurichten und täglich PSF zu sammeln, mit dem die Daten nach der Erfassung dekonvolvenieren können. In Abbildung 2zeigen wir die richtigen Ausrichtungsbilder, die beim Ausrichten des Mikroskops zu sehen sind. Abbildung 2A und Abbildung 2B zeigen den richtigen Strahlweg bzw. die Ausrichtung des Strahls, wenn sie in Fluorescein abgebildet sind. Der Objektivscan sollte eine große X-Form in den XZ- und YZ-Projektionen zeigen, die so symmetrisch wie möglich ist; dies sollte auch so klein wie möglich von einem X angepasst werden (Abbildung 2C). Dies wird vor allem durch die Anpassung des Emissionszielkragens erreicht. Der z galvo scan sollte ein Oval in XZ und XY mit einem einzigen Punkt auf beiden Seiten (oben und unten für XZ und links und rechts für YZ) zeigen (Abbildung 2D). Dies wird vor allem durch die Einstellung der Galvo-Spiegelneigung erreicht, entweder manuell oder mit der motorisierten Einstellung in der Software. Schließlich sollten sowohl der z+objektive Scan als auch der Stichprobenscan Punkte anzeigen, die so rund wie möglich aussehen(Abbildung 2E bzw. Abbildung 2F). Diese können ein kleines X haben, aber dies sollte so abgeflacht wie möglich sein. Diese sollten gut ausgerichtet sein, wenn der Objektivscan und z galvo gut eingestellt wurden, aber wenn Anpassungen notwendig sind, werden sie meist mit dem Galvospiegel durchgeführt. Es ist wichtig zu beachten, dass bei dieser Ausrichtung, jedes Mal, wenn der Kragen und das Galvo eingestellt werden, der Fokus (Mikrometer über dem Emissionsziel) ebenfalls angepasst werden muss.
Mit diesem Protokoll können wir die vierdimensionale Dynamik der TCRs auf einer T-Zellen-Oberfläche sehen (Abbildung 1, Film 1). Der Hauptvorteil dieses Mikroskops liegt in der Fähigkeit, die visualisierten Oberflächeneinheiten der TCRs zu verfolgen und quantifizierte Daten aus ihrer Größe, Bewegung, Signalintensität usw. zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien). Film 2 zeigt ein Beispiel für die erhaltenen Spuren.
Abbildung 1: 4-dimensionale Abbildung von T-Zelle-APC-Synapse. (A) Ein repräsentatives Beispiel für 3D-Zeitraffer-LLSM-Bilder, die eine T-Zelle zeigen, die mit einem APC interagiert. Gezeigt werden die TCR-Dynamik (grün, beschriftet durch Anti-TCR-AF488) bei der Erkennung von Antigenen, die auf der Oberfläche eines APC (rot, zytosolisch mCherry) präsentiert werden. Skalenbalken = 5 m. Siehe auch Film 1. (B) Orthogonales XY-Stück (A). Inset ist ein Referenzrahmen einer ganzen Zelle. Skalenbalken = 5 m. (C) Orthogonaly YZ Scheibe von (A). Inset ist ein Referenzrahmen einer ganzen Zelle. Skalenbalken = 5 m. (D) Dual-orthogonales Stück (A). Inset ist der Referenzrahmen der ganzen Zelle. Skalenbalken = 5 m. Siehe auch Film 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: LLSM-Ausrichtung. (A) Gewünschtes Strahlmuster für LLSM-Bildgebungsexperimente. (B) Screenshot des Strahlausrichtungsprozesses; auf der linken Seite ist das Fokusfenster, das den verengten, fokussierten Strahl zeigt; oben rechts ist ein Diagramm, das zeigt, dass der Strahl innerhalb des Fensters zentriert ist; unten rechts befindet sich die Finderkamera, die auch ein dünner, fokussierter Strahl sein sollte. (C) Projektionen mit maximaler Intensität (MEP) einer Perle durch Objektivscan. (D) Maximale Intensitätsprojektionen (MIPs) einer Perle durch z-galvo scan. (E) Maximale Intensitätsprojektionen (MEP) einer Perle durch z+objektiven Scan. (F) Projektionen mit maximaler Intensität (MEP) einer Perle durch Stichprobenscan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 1: T-Zell-Synapse-Bildung. Zweifarbiges Volumen-Rendering der Interaktion einer T-Zelle, die mit dem Wert "TCR-AF488" (grün) beschriftet ist, mit einem Ziel-APC, der zytosolisches mCherry (rot) über 70 Zeitpunkte im Intervall von 1,54 s ausdrückt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Film 2: Verfolgen der dynamischen TCR-Bewegung. Vergleichen Sie mit Film 1. Cluster, die sichtbaren TCR-Strukturen entsprechen, wurden im Laufe der Zeit in 3D mit Bildverarbeitungssoftware nachverfolgt. Drachenschwänze, die Clusterpositionen gegenüber den vorherigen vier Frames anzeigen, sind farblich nach Verschiebungslänge codiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Film 3: Orthogonale Scheiben der T-Zell-Synapse. Vergleichen Sie mit Film 1 und Abbildung 1B-D. Dual-orthogonale Scheibe von Film 1, die zeigt, dass die Zelle Oberfläche TCRs tatsächlich mit dem "TCR"-AF488 Fab beschriftet. Inset ist ein Referenzrahmen ganzer Zelle. Skalenbalken = 5 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Das vorgestellte Protokoll wurde für die Verwendung von CD4+ T-Zellen optimiert, die von 5C isoliert wurden. C7-Transgenmäuse auf dem verwendeten LLSM-Instrument und daher andere Zellsysteme und LLSMs müssen möglicherweise unterschiedlich optimiert werden. Dieses Protokoll zeigt jedoch die Kraft der 4D-Bildgebung, da es verwendet werden kann, um die Dynamik eines Oberflächenrezeptors auf einer ganzen Zelle mit der geringsten Verzerrung unter physiologischen Bedingungen zu quantifizieren. Daher gibt es viele mögliche zukünftige Anwendungen dieser Technik.
Ein kritischer Schritt besteht darin, die Zellen in einer angemessenen Konzentration absetzen zu lassen. Wenn sich zu viele APCs auf dem Coverslip absetzen und zu dicht werden, ist es schwierig, eine T-Zelle zu finden, die nur mit einem einzelnen APC interagiert. Wenn eine T-Zelle mehrere Synapsen hat, kann das Verfolgen und Interpretieren von Daten sehr kompliziert werden. Wenn zu wenige APCs vorhanden sind, ist es ebenfalls schwierig, eine T-Zelle zu finden, die eine Synapse bildet. In unseren Händen erreicht eine optimale Dichte von 50.000 Zellen, die sich mit 10 min begnügen. Dieses Problem kann jedoch vermieden werden, wenn ein System mit anhaftenden Zellen verwendet wird. Zellen können im Inkubator mit den Coverlips bis zu einer gewünschten Konfluenz angebaut werden.
Ebenso hängt die Anzahl der In-Zellen, die in das System fallen, von der Größe des Bades und der Entfernung ab, die sie verteilen können. Im hier verwendeten LLSM-System gibt es ein 12 ml Bad und ein 2,5 ml Bad, im Gegensatz zur Vorherigen Version des Systems, die nur ein 10 ml Bad zur Verfügung hatte. Wir verwenden das 12 ml Bad für die ursprüngliche Fluorescein-Bildgebung und wechseln dann zum 2,5 ml-Bad für die Abbildung der Zellen. Dies ermöglicht eine weniger gründliche Sanierung des Bades nach dem Strahlvisualisierungsschritt und senkt auch die Anzahl der T-Zellen, die für jede Bildeinheit benötigt werden. Dies wiederum würde es Benutzern ermöglichen, weniger Zellen zu verwenden.
Auch das Finden von Zellen am richtigen Punkt der Interaktion ist eine Herausforderung. In unseren Händen nehmen T-Zellen ca. 2 min, um sich mit den APCs auf dem Coverslip niederzulassen, daher ist es wichtig, mit der Suche nach dynamischen T-Zellen in der Nähe von APCs zu beginnen. Eine wesentliche Verbesserung davon war die kürzliche Hinzufügung des LED-Lichts in der Finderkamera. Wenn Sie ein selbst gebautes System verwenden, empfehlen wir dringend, diese Funktion in das Design einzubeziehen.
Schließlich sind fluoreszierende Kennzeichnungsstrategien eine weitere wichtige Überlegung. Jedes fluoreszierende Protein oder jeder Farbstoff hat eine andere Quantenausbeute und Eine andere Photobleichrate. Fluoreszierende Farbstoffe sind in der Regel heller, aber wenn die Zellen stabil mit einem fluoreszierenden Protein-labeled Molekül transduziert wurden, wird das Etikett wieder aufgefüllt, während die Zelle das Molekül weiter produziert. Daher ist die Etikettierungsstrategie ein wichtiger Faktor, der bei der Entwicklung von Experimenten zu berücksichtigen ist.
Wir möchten mit einer Diskussion über zukünftige Richtungen für die Technologie schließen. LLSM ist auch in der Lage, strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), die zu 150 nm XY-Auflösung und 280 nm Z Auflösung führt, und ist mindestens 10 mal schneller als Widefield SIM12. Daher bietet LLSM eine nie dagewesene Geschwindigkeit der 4D-Bildgebung, kann aber nicht die räumliche Auflösung der aktuellen Superauflösungstechniken4,5,6erreichen. Diese Auflösung könnte jedoch verbessert werden, wenn ein STED-LLSM erstellt werden könnte. Lichtbogen STED und stimulierte Emissionserschöpfung mit selektiver Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (STED-SPIM) wurden verwendet, aber es fehlt die zeitliche Auflösung von LLSM21,22,23,24. Wenn STED-SPIM an ein Gitter angepasst würde, könnten wir potenziell eine axiale Auflösung von 50 nm mit weit weniger Photobleichungen und ein schnelleres Bild als die derzeit verfügbaren Techniken erhalten. Dennoch bietet uns LLSM mit den derzeit verfügbaren Technologien die schnellste zeitliche Auflösung mit hoher axialer Auflösung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir möchten die Beratung und Anleitung von Dr. Vytas Bindokas von der University of Chicago würdigen. Wir danken der Integrated Light Microscopy Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung und Wartung des Gitter-Lichtbogenmikroskops. Diese Arbeit wurde durch den NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 und den NSF Career Award 1653782 (To J.H.) unterstützt. J.R. wird vom NSF Graduate Research Fellowships Program unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
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