Summary
Målet med denne protokollen er å vise hvordan du bruker Lattice Light-Sheet Microscopy til firedimensjonalt visualisere overflatereseptordynamikk i levende celler. Her vises T-cellereseptorer på CD4+ primære T-celler.
Abstract
Signalingen og funksjonen til en celle dikteres av de dynamiske strukturene og interaksjonene til overflatereseptorene. For å virkelig forstå struktur-funksjon forholdet mellom disse reseptorene in situ, må vi visualisere og spore dem på live celleoverflaten med nok spatiotemporal oppløsning. Her viser vi hvordan du bruker nylig utviklet Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) til å bilde T-celle reseptorer (TCRs) firedimensjonalt (4D, rom og tid) på live celle membran. T-celler er en av de viktigste effektorcellene i det adaptive immunsystemet, og her brukte vi T-celler som et eksempel for å vise at signalog funksjon av disse cellene er drevet av dynamikken og interaksjonene til TCRs. LLSM tillater 4D-avbildning med enestående spatiotemporal oppløsning. Denne mikroskopiteknikken kan derfor vanligvis brukes på et bredt spekter av overflate- eller intracellulære molekyler av forskjellige celler i biologi.
Introduction
Den nøyaktige dynamikken i molekyler smugling og diffusering på tredimensjonal celleoverflaten i sanntid har vært en gåte å løse. Mikroskopi har alltid vært en balanse mellom hastighet, følsomhet og oppløsning; hvis en eller to er maksimert, minimeres den tredje. Derfor, på grunn av den lille størrelsen og enorme hastigheten som overflatereseptorer beveger seg, har sporing av dynamikken deres vært en stor teknologisk utfordring for cellebiologiens felt. For eksempel har mange studier blitt utført ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi1,2,3, som har høy temporal oppløsning, men kan bare bilde en veldig tynn skive av T-celle membran (~ 100 nm), og derfor savner hendelser som skjer lenger unna i cellen. Disse TIRF-bildene viser også bare en todimensjonal del av cellen. Derimot kan superoppløsningsteknikker, som stokastisk optisk rekonstruksjonmikroskopi (STORM)4, fotoaktivert lokaliseringmikroskopi (PALM)5og stimulert utslippsuttømmingsmikroskopi (STED)6, overvinne Abbe-diffraksjonsgrensen for lys. Disse teknikkene har høy romlig oppløsning (~ 20 nm oppløsning)4,5,6,7, men de tar ofte mange minutter å skaffe seg en full todimensjonal (2D) eller tredimensjonal (3D) bilde, og derfor temporal oppløsning går tapt. I tillegg kan teknikker som STORM og PALM som er avhengige av blinkende signaler ha unøyaktigheter i tellingen 8,9. Elektronmikroskopi har den klart høyeste oppløsningen (opptil 50 pm oppløsning)10; Det kan til og med gjennomføres tredimensjonalt med fokusert ionstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM), noe som resulterer i opptil 3 nm XY og 500 nm Z oppløsning11. Imidlertid krever enhver form for elektronmikroskopi hard prøveforberedelse og kan bare utføres med faste celler eller vev, noe som eliminerer muligheten for å forestille levende prøver over tid.
Teknikker for å oppnå den høye spatiotemporal oppløsning som kreves for å identifisere dynamikken i overflaten og intracellulære molekyler i levende celler i deres sanne fysiologiske 3D natur blir bare nylig utviklet. En av disse teknikkene er Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, som benytter et strukturert lysark til drastisk lavere fotobleking. Utviklet i 2014 av nobelprisvinner Eric Betzig, høy aksial oppløsning, lav fotobleking og bakgrunnsstøy, og evne til samtidig å bilde hundrevis av fly per synsfelt gjør LLS mikroskoper bedre enn widefield, TIRF og confocal mikroskoper12,13,14,15,16,17,18,19. Denne firedimensjonale (x, y, z og tid) bildeteknikk, mens fortsatt diffraksjon begrenset (~ 200 nm XYZ oppløsning), har utrolig temporal oppløsning (vi har oppnådd en bildefrekvens på ca 100 fps, noe som resulterer i en 3D rekonstruert cellebilde med 0,85 sekunder per ramme) for 3D romlig oppkjøp.
LLSM kan vanligvis brukes til å spore sanntidsdynamikk av molekyler i en hvilken som helst celle på enmolekyl- og encellenivå, spesielt de i svært motileceller som immunceller. For eksempel viser vi her hvordan du bruker LLSM til å visualisere T-cellereseptor (TCR) dynamikk. T-celler er effektorcellene i det adaptive immunsystemet. TCRs er ansvarlig for å gjenkjenne peptid-MHC (pMHC) ligander som vises på overflaten av antigenpresenterende celler (APC), som bestemmer valg, utvikling, differensiering, skjebne og funksjon av en T-celle. Denne anerkjennelsen skjer i grensesnittet mellom T-celler og APK-er, noe som resulterer i lokalisert reseptorklynge for å danne det som kalles immunologisk synapse. Mens det er kjent at TCRs ved immunologisk synapse er avgjørende for T-celle effektor funksjon, fortsatt ukjent er de underliggende mekanismene for sanntidTCR trafficking til synapse. LLSM har tillatt oss å visualisere i sanntid dynamikken i TCRs før og etter menneskehandel til synapse med den resulterende pMHC-TCR interaksjon (Figur 1). LLSM kan derfor brukes til å løse aktuelle spørsmål om den formative dynamikken til TCRs og gi innsikt for å forstå hvordan en celle skiller mellom selv og utenlandske antigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
5C. C7 TCR-transgene RAG2 knockout mus i B10. En bakgrunn ble brukt i denne studien i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Chicago.
1. Høst og aktiver T-celler
MERK: Denne delen av protokollen er basert på tidligere protokoller. Se sitater for nærmere detaljer20,21.
- Euthanize en 10-12 uke gammel 5C. C7 transgene musen til begge kjønn (~ 20-25 g) i henhold til den godkjente IACUC-protokollen (dvs. CO2 kammer etterfulgt av cervical dislokasjon).
- Spray mus grundig med 70% etanol for å suge ned pelsen og bringe inn i en BSL-2 sikkerhetsskap.
- Slå musen på høyre side og lage et lite snitt i kroppshulen med kirurgisk saks. Fjern milten ved hjelp av kirurgiske tang. Klipp bort bindevev etter behov med kirurgisk saks.
- Plasser milten i en 70 μm-pore mesh celle sil og mos med baksiden av en 1 ml sprøyte stempel. Vask gjennom silen grundig med komplett RPMI (RPMI med 10% føtal storfe serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin, 50 μM 2-merkaptoetanol).
- Sentrifuge enkeltcellesuspensjonen av praktytter ved 300 x g i 5 min. Kast supernatanten.
MERK: Pelleten på dette punktet vil være rød. - Resuspender splenocytter i 5 ml RBC lysis buffer. Inkuber i 5 min, deretter slukke med 5 ml fullstendig RPMI.
- Sentrifuge enkeltcellesuspensjonen av praktytter ved 300 x g i 5 min. Kast supernatanten.
MERK: Pelleten på dette punktet skal være hvit, ikke rød. - Resuspender pelleten på nytt i 5 ml fullstendig RPMI.
- Overfør til en T-25 kolbe og tilsett 10 μM moth cytokrom-C (MCC, sekvens ANERADLIAYLKQATK). Sett cellene i en cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 over natten.
- På neste dag, legge rekombinant mus IL-2 til en endelig konsentrasjon på 100 U / ml.
- Vær oppmerksom på de følgende dagene, og legg til friske medier når gjeldende medier blir gult. T celler vil dø hvis de blir igjen i gule medier uten tilsyn i over 48 timer. Celler er klare til bruk 6-10 dager etter innhøsting.
2. Klargjør celler
- Inkuber 5 mm runde trekkslips med 0,1 % poly-L-lysin i 10 min. Aspirer av og la tørke naturlig.
- Bruk en tetthet gradient reagens (se tabellen av materialer)for å skille ut døde celler og for å få 1 x 106 T-celler og 1 x 106 APK-er (CH27 celler21,22 transduced med cytosolic mCherry) separat.
MERK: Celler telles ved hjelp av et hemocytometer.- Tilsett 3 ml tetthet gradient reagens til en 15 ml konisk rør og legg til celler dropwise til kanten av røret nøye. Ikke bland. Sentrifuge ved 930 x g i 10 min ved 4 °C; bruk akselerasjon/retardasjon: LANGSOM/LANGSOM. Fjern det tynne midterste laget av celler mellom hele mediet og tetthetsgraderingsreagensen nøye, og sett hver celletype i separate koniske rør.
MERK: Det er nødvendig å forberede flere celler enn nødvendig for bildebehandling, da vi finner ut at 50% går tapt i gjennomsnitt under prosessen. Jo flere celler som brukes til prosessen, desto lettere er det å høste dem fra tetthetsgradienten. Vi bruker 4-8 ml av begge celletyper for å sikre overskytende celler. Hvis ønskelig, celler kan telles før dette trinnet for å sikre volum nødvendig. Eventuelle ekstra celler legges tilbake i sine respektive flasker. - Vask begge rørene med T-celler og CH27-celler tre ganger med 5 ml fullstendig RPMI (300 x g i 5 min). Kast supernatanten hver gang under vasken. Resuspender hvert rør i 1 ml komplett RPMI og telle celler med et hemocytometer.
- Tilsett 3 ml tetthet gradient reagens til en 15 ml konisk rør og legg til celler dropwise til kanten av røret nøye. Ikke bland. Sentrifuge ved 930 x g i 10 min ved 4 °C; bruk akselerasjon/retardasjon: LANGSOM/LANGSOM. Fjern det tynne midterste laget av celler mellom hele mediet og tetthetsgraderingsreagensen nøye, og sett hver celletype i separate koniske rør.
- Resuspender 1 x 106 APK-er i 500 μL komplett RPMI og tilsett 10 μM MCC. Inkuber i 3 timer ved 37 °C, 5 % CO2. Vask celler tre ganger med 500 μL komplett RPMI (300 x g i 5 min). Kast supernatantene.
- Resuspender 1 x 106 T-celler i 500 μL fullstendig RPMI. Tilsett 2 μg anti-TCRβ Alexa488-merket Fab (klone H57) til 500 μL celler. Inkubat i 30 min ved 37 °C, 5 % CO2. Vask celler tre ganger med 500 μL fullstendig RPMI (300 x g i 5 min). Kast supernatant etter hver vask.
MERK: Det divalente anti-TCR-antistoffet ble skåret i monovalent Fab ved hjelp av et fab preparatsett (se materialbordet)for å unngå krysskobling av T-cellereseptorene ved det divalente antistoffet (dette trinnet er valgfritt). - Resuspender begge celletypene i 500 μL bildemedi (fenol rødfri Leibovitz L-15 medium med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin).
3. Gjennomføring av LLSM daglig justering
MERK: (Viktig) Denne justeringsprotokollen er basert på LLSM-instrumentet som brukes (se materialtabellen). Hver LLSM kan være forskjellig og krever forskjellige justeringsstrategier, spesielt de som er hjemmebygget. Utfør riktig rutinemessig justering og fortsett til avsnitt 4.
- Tilsett 10 ml vann pluss 30 μL fluorescein (1 mg/ml lager) til LLSM-badet (~ 10 ml volum), trykk på Bilde (Hjem) for å flytte målet til bildeposisjon, og se på et enkelt Bessel laserstrålemønster. Juster laserstrålen ved hjelp av hjelpene og det forhåndsinnstilte interesseområdet (ROI) for å gjøre strålen til et tynt mønster balansert i alle retninger.
- Strålen skal også vises fokusert i finnerkameraet. Bruk to speilvippejusteringer, toppmikrometer, fokus og utslippsobjektiv krage for å justere. Se figur 2A,B for riktig justert stråle.
- Vask badet og mål med minst 200 ml vann for å fjerne fluorescein helt.
- Bildestandard fluorescerende perler i bildebehandlingsmediet (utarbeidet ved å følge perler til en 5 mm forføringsslip med poly-L-lysin, se Materialbordet; dette kan forhåndstilberedes og brukes på nytt) for fysisk punktspredningsfunksjon (PSF) i bildebehandlingsmedier.
MERK: Det kan bare være en perle i sikte for senere behandling, så prøv å finne en perle som er av seg selv i betrakteren eller lett kan beskjæres for å få en enkelt perle.- Slå på dither ved å sette til 3 i 'X Galvo-serien'-boksen. Trykk på Live for å vise gjeldende felt. Flytt langs Z-retningen for å finne dekselet slip og perler. Finn midten av en perle ved å bevege seg langs Z, trykk Stopp for å stoppe laseren. Kontroller 3D, trykk på Midtstill og trykk deretter på Kjør. Dette vil samle inn dataene.
- Juster tiltspeilet manuelt, objektiv krage og fokuser mikrometeret for høyeste grå verdier, og juster deretter etter behov for å oppnå riktige mønstre for objektiv skanning, z galvo, z+objective (totPSF) og prøveskanningsmoduser (samplePSF). Se figur 2C-F for riktig justerte maksimale intensitetsprojeksjoner (MIPer).
MERK: De ulike opptaksmodusene (objektiv skanning, z galvo, z+objektiv og prøveskanning) endrer hvordan lysarket beveger seg gjennom prøven. Alle skannemoduser skal brukes til justering. - Eksempelskanningen viser hvordan data samles inn under eksperimentet. Samle inn eksempelet PSF ved å trykke Kjør i prøveskannemodus for skrivebordog deconvolution (se avsnitt 5). Endre lasere til tre fargemodus (488, 560, 647) og trykk Kjør på nytt.
MERK: Siden LLSM-bildene i en vinkel (57,2°), samles bilder tatt i "prøveskanning"-modus i denne vinkelen, og er derfor "skjev". De-skewing er prosessen med å korrigere for denne vinkelen og "justere" bildet til en ekte z-stabel. Disse dataene må samles inn i bildebehandlingsmedier og i alle kanaler som skal avbildet under eksperimentet. Hvis dette ikke samles inn riktig, vil dataene ikke bli riktig de-skjev. På samme måte må du kontrollere at media har blitt varmet opp til 37 °C (eller ønsket eksperimentell temperatur).
4. Sette opp celler med LLSM
- Tilsett 100 000 APK-er (50 μL) fra trinn 2,5 til en sirkulær dekselslip med 5 mm diameter fra trinn 2.1 og la dem nøye seg i 10 min.
- Smør prøveholderen og legg deretter til dekkslipcellen på den. Legg til en dråpe bildepapir på baksiden av dekkslip for å unngå bobler før du plasserer i badekaret. Skru prøveholderen på piezoen, og trykk på Bilde (Hjem).
- Finn en APC til bilde for å sikre at LLSM og bildebehandling programvare (se Table of Materials) fungerer som den skal.
MERK: Vi ser på 0,4 μm trinnstørrelse med 60 z-trinn og 10 ms eksponering for to farger med dither satt til 3, noe som resulterer i 1,54 s per ramme av 3D-bilde med ~ 200 nm XY og 400 nm Z oppløsning. Disse innstillingene må kanskje justeres basert på cellestørrelse, ønsket z-oppløsning og styrken av signal fra fluorescerende merking teknikken som brukes. Laserstrømbruk vil også variere avhengig av fluorescerende merkingsteknikk som brukes.- Trykk på Live for å vise det gjeldende bildet. Flytt langs Z for å finne dekselet slip og celler.
- Finn midten av en APC ved å bevege seg i Z-retningen, og trykk deretter stopp for å sette laseren på pause. Kontroller 3D og skriv inn de ønskede innstillingene (se trinn 4.3.1), trykk på Midtstill og trykk deretter på Kjør. Dette vil samle inn dataene.
- Senk fasen for å laste posisjon og tilsett 50 μL T-celler i bildebehandlingsmedier (100 000 celler, fra trinn 2,5) fallvis direkte over dekksslip. Det er best å la en dråpe form på enden av pipettespissen og deretter berøre spissen til badevæsken. Hev scenen tilbake ved å klikke "Image (Return)".
- Begynn å bilde. Pass på at du angir ønsket stabelstørrelse og tidsforløpslengde. Bilde 60 z-stabler med en trinnstørrelse på 0,4 μm og inngang 500 tidsrammer. (Vanligvis) stoppe opptaket før 500 bilder nås for å unngå fotobleking. Bruk Live-modus til å søke etter cellepar, og når klare og ønskede innstillinger er angitt, trykker du på Kjør for å samle inn data. Se Film 1 og Figur 1 for eksempel.
5. Spor Surface Dynamics
- Eksporter dataene fra bildeprogramvaren (se Materialoversikten). Dette vil opprette z-stack TIF-filer for hvert tidspunkt i hver farge.
- Først deskew og deconvolve dataene.
MERK: Vi bruker LLSpy rørledningen under lisens av HHMI's Janelia Research Campus18,men deskewing og deconvolution er også tilgjengelig i flere bildebehandlingsprogramvare (se Table of Materials). - Debleke dataene.
MERK: Vi bruker Fijis deblekemiddelfunksjon med histogrammet (Fiji Pathway: Image | Juster | Bleach Korreksjon | Histogrammet Matching | OK). - Importer til sporingsprogramvaren (se Materialbordet). Spor klynger i henhold til programvarespesifikasjoner. Se Film 2 for et eksempel.
MERK: Sporingsresultater vil avhenge av sporingsprogramvaren som brukes, algoritmen som er valgt, ønskede utgangsparametere valgt osv. I sporingsprogramvaren vi brukte (se materialtabellen),valgte vi for eksempel å la programvaren spore uregelmessige former, i stedet for å tilordne hver funksjon ett enkelt sted, siden TCR-klynger ikke er organisert i perfekte sfærer. I tillegg valgte vi å samle inn 35 parametere, inkludert hastighet, retning, volum, intensitet, område, plassering og sporvarighetsinformasjon. Imidlertid vil forskjellige metoder eller parametere være gunstige å svare på forskjellige spørsmål.- Hvis sporing ikke er ønsket, kan du bruke ClearVolume-plugin-modulen for Fiji for å visualisere og lage filmer fra hyperstackdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi isolasjon, forberedelse og avbildning av primær mus 5C. C7 T-celler ved hjelp av et gitterlysarkmikroskop. Under avsnitt 3 er det viktig å justere mikroskopet riktig, og å samle PSF daglig for å dekonvolve dataene etter innsamling. I figur 2viser vi de riktige justeringsbildene som vil bli sett når vi justerer mikroskopet. Figur 2A og figur 2B viser henholdsvis riktig strålebane og strålejustering når den er avbildet i fluorescein. Objektivskanningen skal vise en stor X-form i XZ- og YZ-projeksjonene som er så symmetriske som mulig; dette bør også justeres til å være så liten av en X som mulig (Figur 2C). Dette oppnås hovedsakelig ved å justere utslippsobjektivkragen. Z galvo skanning bør vise en oval i XZ og XY med en enkelt prikk på hver side (over og under for XZ og til venstre og høyre for YZ) (Figur 2D). Dette oppnås hovedsakelig ved å justere galvo speiltilt, enten manuelt eller med motorisert justering i programvaren. Til slutt skal både z+-objektivskanningen og prøveskanningen vise prikker som ser så runde ut som mulig ( henholdsvisfigur 2E og figur 2F). Disse kan ha en liten X, men dette bør være så dimished som mulig. Disse bør være godt justert hvis objektiv skanning og z galvo ble satt godt, men hvis justeringer er nødvendig, vil de for det meste bli utført med galvo speilet. Det er viktig å merke seg at under denne justeringen, når kragen og galvoen justeres, må fokuset (mikrometeret over utslippsmålet) også justeres.
Ved hjelp av denne protokollen kan vi se den firedimensjonale dynamikken i TCRs på en T-celleoverflate (Figur 1, Film 1). Den største fordelen med dette mikroskopet ligger i evnen til å spore de visualiserte overflateenhetene til TCRs, og for å få kvantifiserte data fra deres størrelse, bevegelse, signalintensitet, etc. (se Materialtabell). Film 2 viser et eksempel på sporene som er oppnådd.
Figur 1: 4-dimensjonal avbildning av T-celle-APC Synapse. (A) Et representativt eksempel på 3D-tidsforløpll llsm-bilder som viser en T-celle som samhandler med en APC. Vist er TCR (grønn, merket av anti-TCR-AF488) dynamikk i å gjenkjenne antigener presentert på overflaten av en APC (rød, cytosolic mCherry). Skala bar = 5 μm. Se også Film 1. (B) Orthogonal XY stykke (A). Innfelt er en referanseramme for en hel celle. Skala bar = 5 μm. (C) Orthogonal YZ stykke (A). Innfelt er en referanseramme for en hel celle. Skala bar = 5 μm. (D) Dobbel ortogonal skive (A). Innfelt er referanseramme for hele cellen. Skala bar = 5 μm. Se også Film 3. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: LLSM justering. (A) Ønsket strålemønster for LLSM bildeeksperiment. (B) Skjermbilde av strålejusteringsprosessen; til venstre er fokusvinduet som viser den smale, fokuserte strålen; øverst til høyre er en graf som viser at strålen er sentrert i vinduet; nederst til høyre er søkerkameraet, som også skal være en tynn, fokusert stråle. (C) Maksimal intensitet projeksjoner (MIPs) av en perle ved objektiv skanning. (D) Maksimal intensitet projeksjoner (MIPs) av en perle av z-galvo skanning. (E) Maksimal intensitet projeksjoner (MIPs) av en perle av z + objektiv skanning. (F) Maksimal intensitet projeksjoner (MIPs) av en perle ved prøve skanning. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Film 1: T celle synapse dannelse. Tofarget volumgjengivelse av samspillet mellom en T-celle merket med αTCR-AF488 (grønn) med et mål APC som uttrykker cytosolic mCherry (rød) over 70 tidspunkter ved 1,54 s intervall. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Film 2: Sporing av Dynamisk bevegelse. Sammenlign med Film 1. Klynger som tilsvarer synlige TCR-strukturer ble sporet i 3D over tid med bildeprogramvare. Dragon haler som viser klyngeposisjoner over de fire foregående rammene er fargekodet av forskyvninglengde. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Film 3: Orthogonal skiver av T celle synapse. Sammenlign med film 1 og figur 1B-D. Dual orthogonal stykke Film 1, som viser at αTCRβ-AF488 Fab faktisk merker celleoverflaten TCRs. Inset er en referanseramme av hele cellen. Skala bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen ble optimalisert for bruk av CD4+ T-celler isolert fra 5C. C7 transgene mus på LLSM-instrumentet som brukes, og derfor kan andre cellesystemer og LLSMer kanskje må optimaliseres annerledes. Denne protokollen viser imidlertid kraften i 4D-avbildning, da den kan brukes til å kvantifisere dynamikken i en overflatereseptor på en hel celle med minst forvrengning i fysiologiske forhold. Derfor er det mange mulige fremtidige anvendelser av denne teknikken.
Et kritisk skritt gjør det mulig for cellene å bosette seg ved en passende konsentrasjon. Hvis for mange APCer bosetter seg på coverslip og blir for tett, er det vanskelig å finne en T-celle som samhandler med bare en enkelt APC. Når en T-celle har flere synapser, kan sporing og tolkning av data bli svært komplisert. På samme måte, hvis for få APCer er til stede, er det også vanskelig å finne en T-celle som danner en synapse. I våre hender, slik at 50.000 celler å bosette seg for 10 min oppnår en optimal tetthet. Dette problemet kan imidlertid unngås hvis du bruker et system med tilhengerceller. Celler kan dyrkes i inkubatoren med coverslips til en ønsket samflyt.
Tilsvarende er antall T-celler som slippes inn i systemet avhengig av størrelsen på badet og avstanden de kan spre seg. I LLSM-systemet som brukes her, er det et 12 ml bad og et 2,5 ml bad, i motsetning til den forrige versjonen av systemet som bare hadde et 10 ml bad tilgjengelig. Vi bruker 12 ml bad for den opprinnelige fluorescein avbildning deretter bytte til 2,5 ml bad for bildebehandling cellene. Dette gir mindre grundig vasking av badet etter strålevisualiseringstrinnet, og senker også antall T-celler som kreves for hver bildebehandlingøkt. I sin tur vil dette tillate brukere å bruke færre celler.
Å finne celler på riktig samhandlinger er også en utfordring. I våre hender tar T-celler ca 2 min for å slå seg ned til APCene på coverslip, så det er viktig å begynne å søke i dekkslip etter dynamiske T-celler nær ApCer. En stor forbedring av dette har vært den siste tilføyelsen av LED-lyset i finder-kameraet. Hvis du bruker et hjemmebygd system, anbefaler vi på det sterkeste å inkludere denne funksjonen i designen.
Til slutt er fluorescerende merkingstrategier en annen viktig vurdering. Hvert fluorescerende protein eller fargetan har en annen kvanteutbytte og frekvens av fotobleking. Fluorescerende fargestoffer er vanligvis lysere, men hvis cellene har blitt stabilt transduced med et fluorescerende protein merket molekyl, etterfylles etiketten etter hvert som cellen fortsetter å produsere molekylet. Derfor er merkingsstrategi en viktig faktor å vurdere når du utformer eksperimenter.
Vi ønsker å avslutte med en diskusjon om fremtidige retninger for teknologien. LLSM er også i stand til strukturert belysning mikroskopi (SIM), noe som resulterer i 150 nm XY oppløsning og 280 nm Z oppløsning, og er minst 10 ganger raskere enn widefield SIM12. Derfor, mens LLSM gir enestående hastighet på 4D-avbildning, kan den ikke oppnå den romlige oppløsningen av gjeldende superoppløsningsteknikker4,5,6. Denne oppløsningen kan imidlertid forbedres hvis en STED LLSM kan opprettes. Lysark STED og stimulert utslipp uttømming med selektiv fly belysning mikroskopi (STED-SPIM) har blitt benyttet, men mangler temporal oppløsning av LLSM21,22,23,24. Hvis STED-SPIM ble tilpasset for å innlemme et gitter, kunne vi potensielt få 50 nm aksial oppløsning med langt mindre fotobleking, og bilde raskere enn tilgjengelige teknikker. Likevel, med dagens tilgjengelige teknologier, gir LLSM oss den raskeste tidsoppløsningen med høy aksial oppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne anerkjenne råd og veiledning fra Dr. Vytas Bindokas ved University of Chicago. Vi takker Integrated Light Microscopy Core Facility ved University of Chicago for å støtte og vedlikeholde gitterets lysarkmikroskop. Dette arbeidet ble støttet av NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 og NSF Career Award 1653782 (Til J.H.). J.R. støttes av NSF Graduate Research Fellowships Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
