Summary
El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.
Abstract
La señalización y la función de una célula están dictadas por las estructuras dinámicas y las interacciones de sus receptores de superficie. Para entender realmente la relación estructura-función de estos receptores in situ, necesitamos visualizarlos y rastrearlos en la superficie celular viva con suficiente resolución espaciotemporal. Aquí mostramos cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía (LLSM) recientemente desarrollada para crear imágenes de receptores de células T (TPR) en cuatro dimensiones (4D, espacio y tiempo) en la membrana celular viva. Las células T son una de las principales células efector del sistema inmune adaptativo, y aquí usamos las células T como ejemplo para mostrar que la señalización y la función de estas células son impulsadas por la dinámica y las interacciones de losTPR. LLSM permite imágenes 4D con una resolución espaciotemporal sin precedentes. Por lo tanto, esta técnica de microscopía se puede aplicar generalmente a una amplia gama de moléculas superficiales o intracelulares de diferentes células en biología.
Introduction
La dinámica precisa del tráfico y difusión de moléculas en la superficie celular tridimensional en tiempo real ha sido un enigma a resolver. La microscopía siempre ha sido un equilibrio entre velocidad, sensibilidad y resolución; si uno o dos se maximizan, el tercero se minimiza. Por lo tanto, debido al pequeño tamaño y la inmensa velocidad con la que se mueven los receptores de superficie, el seguimiento de su dinámica ha seguido siendo un gran desafío tecnológico para el campo de la biología celular. Por ejemplo, muchos estudios se han realizado utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)1,2,3, que tiene alta resolución temporal, pero sólo puede imaginar una rebanada muy delgada de la membrana de la célula T (100 nm), y por lo tanto echa de menos eventos que ocurren más lejos en la célula. Estas imágenes TIRF también muestran solo una sección bidimensional de la celda. Por el contrario, las técnicas de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)4, la microscopía de localización fotoactivada (PALM)5y la microscopía de agotamiento de emisiones estimulada (STED)6,pueden superar el límite de difracción de la luz de Abbe. Estas técnicas tienen una alta resolución espacial (resolución de 20 nm)4,5,6,7, pero a menudo tardan muchos minutos en adquirir una imagen bidimensional completa (2D) o tridimensional (3D), y por lo tanto se pierde la resolución temporal. Además, técnicas como STORM y PALM que dependen de señales parpadeantes pueden tener imprecisiones en el conteo8,9. La microscopía electrónica tiene con mucho la resolución más alta (resolución de hasta 50 pm)10; incluso se puede llevar a cabo tridimensionalmente con microscopía electrónica de barrido de haz iónico focalizado (FIB-SEM), lo que resulta en hasta 3 nm XY y 500 nm Z resolución11. Sin embargo, cualquier forma de microscopía electrónica requiere una preparación dura de la muestra y sólo se puede llevar a cabo con células o tejidos fijos, eliminando la posibilidad de tomar imágenes de muestras en vivo a lo largo del tiempo.
Técnicas para obtener la alta resolución espaciotemporal necesaria para identificar la dinámica de las moléculas superficiales e intracelulares en células vivas en su verdadera naturaleza fisiológica 3D sólo se está desarrollando recientemente. Una de estas técnicas es Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, que utiliza una hoja de luz estructurada para reducir drásticamente el fotoblanqueo. Desarrollado en 2014 por el Premio Nobel Eric Betzig, la alta resolución axial, bajo fotoblanqueo y ruido de fondo, y la capacidad de crear simultáneamente imágenes de cientos de planos por campo de visión hacen que los microscopios LLS sean superiores a los microscopios de campo ancho, TIRF yconfocal12,13,14,15,16,17,18,19. Esta técnica de imagen de cuatro dimensiones (x, y, z y tiempo), aunque todavía difracción limitada (resolución XYZ de 200 nm), tiene una resolución temporal increíble (hemos logrado una velocidad de fotogramas de unos 100 fps, lo que resulta en una imagen de celda reconstruida en 3D con 0,85 segundos por fotograma) para la adquisición espacial 3D.
LLSM se puede utilizar generalmente para rastrear la dinámica en tiempo real de cualquier molécula dentro de cualquier célula a nivel de una sola molécula y una sola célula, particularmente aquellas en células altamente móviles como las células inmunes. Por ejemplo, mostramos aquí cómo utilizar LLSM para visualizar la dinámica del receptor de células T (TCR). Las células T son las células efector del sistema inmunitario adaptativo. Las TPR son responsables de reconocer los ligandos peptídicos-MHC (pMHC) que se muestran en la superficie de las células que presentan antígenos (APC), que determina la selección, desarrollo, diferenciación, destino y función de una célula T. Este reconocimiento se produce en la interfaz entre las células T y los AAP, lo que resulta en clustering de receptores localizados para formar lo que se llama la sinapsis inmunológica. Si bien se sabe que los TCR en la sinapsis inmunológica son imperativos para la función del efector de células T, todavía desconocidos son los mecanismos subyacentes del tráfico de TCR en tiempo real a la sinapsis. LLSM nos ha permitido visualizar en tiempo real la dinámica de los TCR antes y después del tráfico a la sinapsis con la interacción resultante pMHC-TCR(Figura 1). Por lo tanto, llSM se puede utilizar para resolver cuestiones actuales de la dinámica formativa de los TPR y proporcionar información para entender cómo una célula distingue entre antígenos uno mismo y otros.
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Protocol
5C. C7 Ratones noqueadores RAG2 transgénicos en B10. Un fondo se utilizó en este estudio de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago.
1. Cosecha y Activa células T
NOTA: Esta parte del protocolo se basa en protocolos anteriores. Véanse las citas para másdetalles 20,21.
- Eutanasia a 10-12 semanas de 5C. Ratón transgénico C7 de ambos sexos (20-25 g) de acuerdo con el protocolo IACUC aprobado (es decir, cámara de CO2 seguida de luxación cervical).
- Rocíe bien la carcasa del ratón con 70% de etanol para empapar el pelaje y llevarlo a un gabinete de seguridad BSL-2.
- Gire el ratón hacia su lado derecho y haga una pequeña incisión en la cavidad corporal con tijeras quirúrgicas. Retire el bazo con fórceps quirúrgicos. Corte el tejido conectivo según sea necesario con tijeras quirúrgicas.
- Coloque el bazo en un colador de células de malla de poro de 70 m y machaque con la parte posterior de un émbolo de jeringa de 1 ml. Lavar bien el colador con RPMI completo (RPMI con 10% de suero bovino fetal [FBS], 2 mM de L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 50 M 2-mercaptoetanol).
- Centrifugar la suspensión de una sola célula de los esplenocitos a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
NOTA: El pellet en este punto será rojo. - Resuspenda los esplenocitos en el tampón de lisis RBC de 5 ml. Incubar durante 5 min, luego amendar con 5 ml de RPMI completo.
- Centrifugar la suspensión de una sola célula de los esplenocitos a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
NOTA: El pellet en este punto debe ser blanco, no rojo. - Resuspenda el pellet en 5 ml de RPMI completo.
- Pasar a un matraz T-25 y añadir 10 m de polilpolilla citocromo-C (MCC, secuencia ANERADLIAYLKQATK). Coloque las células en una incubadora de cultivo celular a 37 oC, 5% CO2 durante la noche.
- Al día siguiente, añadir ratón recombinante IL-2 a una concentración final de 100 U/ml.
- Observe durante los días siguientes, agregando medios nuevos a medida que los medios actuales se vuelven amarillos. Las células T morirán si se dejan en medios amarillos desatendidos durante más de 48 h. Las células están listas para usar 6-10 días después de la cosecha.
2. Preparar células
- Incubar 5 mm de cubiertas redondas con 0.1% poli-L-lisina durante 10 min. Aspirar y dejar secar naturalmente.
- Utilice un reactivo de gradiente de densidad (consulte la Tabla de Materiales)para separar las celdas muertas y obtener 1 x 106 células T y 1 x 106 ACC (células CH2721,22 transducidas con mCherry citosólico) por separado.
NOTA: Las celdas se cuentan usando un hemocaquímetro.- Agregue 3 ml de reactivo de gradiente de densidad a un tubo cónico de 15 ml y agregue las celdas con gotas al borde del tubo con cuidado. No mezcle. Centrífuga a 930 x g durante 10 min a 4 oC; aceleración/desaceleración: SLOW/SLOW. Retire cuidadosamente la capa media delgada de las celdas entre el medio completo y el reactivo de gradiente de densidad, colocando cada tipo de celda en tubos cónicos separados.
NOTA: Es necesario preparar más células de las necesarias para la toma de imágenes, ya que encontramos que el 50% se pierde en promedio durante el proceso. Cuantas más células se utilicen para el proceso, más fácil será cosecharlas del gradiente de densidad. Utilizamos 4-8 mL de ambos tipos de células para asegurar el exceso de células. Si lo desea, las celdas se pueden contar antes de este paso para garantizar el volumen necesario. Las células adicionales se vuelven a colocar en sus respectivos matraces. - Lave los dos tubos de las células T y CH27 tres veces con 5 ml de RPMI completo (300 x g durante 5 min). Deseche el sobrenadante cada vez durante el lavado. Resuspenda cada tubo en RPMI completo de 1 ml y cuente las células por un hemocitómetro.
- Agregue 3 ml de reactivo de gradiente de densidad a un tubo cónico de 15 ml y agregue las celdas con gotas al borde del tubo con cuidado. No mezcle. Centrífuga a 930 x g durante 10 min a 4 oC; aceleración/desaceleración: SLOW/SLOW. Retire cuidadosamente la capa media delgada de las celdas entre el medio completo y el reactivo de gradiente de densidad, colocando cada tipo de celda en tubos cónicos separados.
- Resuspenda 1 x 106 AAP en 500 s RPMI completo y agregue 10 M DE MCC. Incubar durante 3 h a 37oC, 5% CO2. Lave las células tres veces con 500 ml de RPMI completo (300 x g durante 5 min). Descarta los supernatantes.
- Resuspenda 1 x 106 células T en RPMI completo de 500 l. Añadir 2 g de Fab con la etiqueta anti-TCR-Alexa488 (clon H57) a 500 l de células. Incubar durante 30 min a 37oC, 5%CO2. Lave las células tres veces con 500 ml de RPMI completo (300 x g durante 5 min). Deseche el sobrenadante después de cada lavado.
NOTA: El anticuerpo anti-TCR divalente se cortó en Fab monovalente usando un kit de preparación Fab (ver la Tabla de Materiales)para evitar el reticulado de los receptores de células T por el anticuerpo divalente (este paso es opcional). - Resuspender ambos tipos de células en 500 ml de medios de diagnóstico por imágenes (medio L-15 libre de fenol con 10% de FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-glutamina).
3. Realización de la alineación diaria de LLSM
NOTA: (Importante) Este protocolo de alineación se basa en el instrumento LLSM utilizado (consulte la Tabla de materiales). Cada LLSM puede ser diferente y requerir diferentes estrategias de alineación, especialmente aquellas que son caseras. Lleve a cabo la alineación rutinaria adecuada y continúe con la sección 4.
- Añadir 10 ml de agua más fluoresceína de 30 ml (1 mg/ml de stock) al baño LLSM (volumen de 10 ml), pulse Imagen (Inicio) para mover el objetivo a la posición de la imagen y observe un solo patrón de rayo láser Bessel. Alinee el rayo láser utilizando las guías y la región de interés (ROI) preestablecida para hacer que el haz sea un patrón delgado equilibrado en todas las direcciones.
- El haz también debe aparecer enfocado en la cámara del buscador. Utilice dos ajustadores de inclinación de espejo, micrómetro superior, enfoque y collar objetivo de emisión para ajustar. Vea la Figura 2A,B para el haz correctamente alineado.
- Lavar el baño y los objetivos con al menos 200 ml de agua para eliminar completamente la fluoresceína.
- Cuentas fluorescentes estándar de imagen en los medios de imagen (preparadas mediante la adherido de perlas a un cubreobjetos de 5 mm con poli-L-lisina, ver la Tabla de Materiales; esto puede ser pre-preparado y reutilizado) para la función de propagación de punto físico (PSF) en medios de imagen.
NOTA: Solo puede haber un cordón a la vista para su posterior procesamiento, así que trate de encontrar un cordón que esté por sí mismo en el visor o que se pueda recortar fácilmente para obtener un solo cordón.- Active el tramado ajustando a 3 en la caja 'X Galvo range'. Pulse En vivo para ver el campo actual. Muévete a lo largo de la dirección Z para encontrar el deslizamiento de la cubierta y las cuentas. Encuentra el centro de un cordón moviéndote a lo largo de Z, presiona Detener para pausar el láser. Compruebe 3D, pulse Centro y, a continuación, pulse Ejecutar. Esto recopilará los datos.
- Ajuste manualmente el espejo de inclinación, el collar objetivo y el micrómetro de enfoque para obtener los valores grises más altos y, a continuación, ajuste según sea necesario para obtener los patrones adecuados para los modos de captura de escaneo objetivo, z galvo, z+objective (totPSF) y escaneo de muestras (samplePSF). Vea la Figura 2C-F para las proyecciones de intensidad máxima (MIP) correctamente ajustadas.
NOTA: Los distintos modos de captura (escaneo objetivo, z galvo, z+objetivo y escaneo de muestra) cambian la forma en que se mueve la hoja de luz a través de la muestra. Todos los modos de escaneo deben utilizarse para la alineación. - El análisis de ejemplo muestra cómo se recopilarán los datos durante el experimento. Recoja la muestra de PSF pulsando Ejecutar en modo de análisis de muestra para desenkloy y desconvolución (ver sección 5). Cambie los láseres a tres modos de color (488, 560, 647) y pulse Ejecutar de nuevo.
NOTA: Dado que las imágenes LLSM en ángulo (57,2o), las imágenes capturadas en el modo "escaneo de muestras" se recopilan en este ángulo y, por lo tanto, se "sesgan". El desbrociamiento es el proceso de corregir este ángulo y "realinear" la imagen a una verdadera pila z. Estos datos deben recopilarse en los medios de diagnóstico por imágenes y en todos los canales que se mostrarán durante el experimento. Si esto no se recopila correctamente, los datos no se desviarán correctamente. Del mismo modo, asegúrese de que los medios se hayan calentado a 37 oC (o a la temperatura experimental deseada).
4. Configuración de celdas con LLSM
- Agregue 100.000 ACC (50 l) desde el paso 2.5 a un cubreobjetos circular de 5 mm de diámetro del paso 2.1 y permita que se asienten durante 10 minutos.
- Engrase el soporte de la muestra y luego agregue la celda de cubierta hacia arriba. Agregue una gota de papel de imagen en la parte posterior de la cubierta para evitar burbujas antes de colocarlas en el baño. Atornille el soporte de la muestra en el piezo y pulse Imagen (Inicio).
- Encuentre un APC para crear una imagen para asegurarse de que el LLSM y el software de imágenes (consulte Tabla de materiales)funcionan correctamente.
NOTA: Hacemos una imagen de un tamaño de paso de 0,4 m con 60 pasos z y 10 ms de exposición para dos colores con tramado ajustado a 3, lo que da como resultado 1,54 s por fotograma de imagen 3D con resolución XY de 200 nm y resolución Z de 400 nm. Es posible que estos ajustes deban ajustarse en función del tamaño de la celda, la resolución z deseada y la fuerza de la señal de la técnica de etiquetado fluorescente utilizada. El uso de energía láser también variará en función de la técnica de etiquetado fluorescente utilizada.- Pulse En vivo para ver la imagen actual. Muévete a lo largo de Z para encontrar el resbalón de la cubierta y las células.
- Encuentra el centro de un APC moviéndote en la dirección Z y, a continuación, presiona Detener para pausar el láser. Compruebe 3D e introduzca los ajustes deseados (consulte el paso 4.3.1), pulse Centro y, a continuación, pulse Ejecutar. Esto recopilará los datos.
- Bajar la etapa para cargar la posición y añadir 50 l de células T en medios de imagen (100.000 celdas, desde el paso 2.5) con gota directamente sobre el resbalón de la cubierta. Lo mejor es dejar una forma de gota en el extremo de la punta de la pipeta y luego tocar la punta al líquido de baño. Levante el escenario hacia atrás haciendo clic en"Imagen (Retorno)".
- Comiencen las imágenes. Asegúrese de establecer el tamaño de pila y la longitud de lapso de tiempo deseados. Por ejemplo, la imagen 60 z-pilas con un tamaño de paso de 0,4 m y la entrada de 500 marcos de tiempo. (Normalmente) deje de grabar antes de que se alcancen 500 fotogramas para evitar el fotoblanqueo. Utilice el modo Live para buscar pares de celdas, y cuando se hayan introducido ajustes listos y deseados, pulse Ejecutar para recopilar datos. Consulte la película 1 y la figura 1 para obtener un ejemplo.
5. Seguimiento de la dinámica de la superficie
- Exporte los datos desde el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Esto creará archivos TIF de pila z para cada punto de tiempo en cada color.
- Primero desenhorado y desconvolve los datos.
NOTA: Utilizamos la tubería LLSpy bajo licencia por Janelia Research Campus18de HHMI, pero el desenfrenada y la desconvolución también están disponibles dentro de múltiples softwares de imágenes (consulte Tabla de materiales). - Blanquear los datos.
NOTA: Utilizamos la función de blanqueo de Fiji con coincidencia de histograma (Fiji Pathway: Image ? Ajustar ? Corrección de la lejía (Bleach Correction) Coincidencia de histogramas ? OK). - Importar en el software de seguimiento (consulte la Tabla de materiales). Realice un seguimiento de los clústeres de acuerdo con las especificaciones del software. Consulte la película 2 para obtener un ejemplo.
NOTA: Los resultados de seguimiento dependerán del software de seguimiento utilizado, el algoritmo elegido, los parámetros de salida deseados seleccionados, etc. Por ejemplo, en el software de seguimiento que utilizamos (consulte la Tabla de materiales),elegimos permitir que el software realizara un seguimiento de formas irregulares, en lugar de asignar cada entidad a un solo punto, ya que los clústeres de TCR no están organizados en esferas perfectas. Además, elegimos recopilar 35 parámetros, incluyendo información de velocidad, dirección, volumen, intensidad, área, ubicación y duración de la pista. Sin embargo, diferentes métodos o parámetros serán beneficiosos para responder a diferentes preguntas.- Si no se desea realizar el seguimiento, utilice el complemento ClearVolume para Fiji para visualizar y crear películas a partir de datos de hiperpila.
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Representative Results
Aquí, describimos el aislamiento, la preparación y la creación de imágenes del ratón primario 5C. Células T C7 utilizando un microscopio de lámina de luz de celosía. Durante la sección 3, es imprescindible alinear el microscopio correctamente y recopilar PSF diariamente con el que desconvolver los datos después de la recolección. En la Figura 2,mostramos las imágenes de alineación correctas que se verán al alinear el microscopio. La Figura 2A y la Figura 2B muestran la trayectoria correcta del haz y la alineación del haz, respectivamente, cuando se muestra en fluoresceína. El escaneo objetivo debe mostrar una forma X grande en las proyecciones XZ e YZ que sea lo más simétrica posible; esto también debe ajustarse para que sea lo más pequeño posible de una X(Figura 2C). Esto se logra principalmente mediante el ajuste del collar objetivo de emisión. La exploración z galvo debe mostrar un óvalo en XZ y XY con un solo punto a cada lado (por encima y por debajo para XZ y a la izquierda y a la derecha para YZ)(Figura 2D). Esto se logra principalmente ajustando la inclinación del espejo galvo, ya sea manualmente o con el ajuste motorizado en el software. Por último, tanto el análisis z+objetivo como el análisis de muestra deben mostrar puntos que se vean lo más redondos posible(Figura 2E y Figura 2F, respectivamente). Estos pueden tener una Pequeña X, pero esto debe ser lo más dimiñido posible. Estos deben estar bien alineados si el escaneo objetivo y z galvo se fijaron bien, pero si los ajustes son necesarios, se llevarán a cabo principalmente con el espejo galvo. Es importante tener en cuenta que durante esta alineación, cada vez que se ajustan el collar y el galvo, el enfoque (micrometro por encima del objetivo de emisión) también tendrá que ajustarse.
Usando este protocolo, podemos ver la dinámica cuad-dimensional de los TPR en una superficie de célula T(Figura 1, Película 1). La principal ventaja de este microscopio radica en la capacidad de rastrear las unidades superficiales visualizadas de los TPR, y para obtener datos cuantificados de su tamaño, movimiento, intensidad de la señal, etc. (ver Tabla de Materiales). La película 2 muestra un ejemplo de las pistas obtenidas.
Figura 1: Imagen en 4 dimensiones de T cell-APC Synapse. (A) Un ejemplo representativo de imágenes LLSM de lapso de tiempo 3D que muestran una celda T que interactúa con un APC. Se muestran la dinámica TCR (verde, etiquetada por anti-TCR-AF488) en el reconocimiento de antígenos presentados en la superficie de un APC (rojo, citosolic mCherry). Barra de escala a 5 m. Consulte también la película 1. (B) Rebanada Ortogonal XY de (A). Inset es un marco de referencia de una celda completa. Barra de escala a 5 m. (C) Rebanada Ortogonal YZ de (A). Inset es un marco de referencia de una celda completa. Barra de escala a 5 m. (D) Rebanada ortogonal doble de (A). Inset es el marco de referencia de toda la celda. Barra de escala a 5 m. Consulte también la película 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Alineación LLSM. (A) Patrón de haz deseado para el experimento de imágenes LLSM. (B) Captura de pantalla del proceso de alineación de la viga; a la izquierda está la ventana de enfoque que muestra la viga estrecha y enfocada; en la parte superior derecha hay un gráfico que muestra que la viga está centrada dentro de la ventana; en la parte inferior derecha está la cámara del buscador, que también debe ser un haz delgado y enfocado. (C) Proyecciones de intensidad máxima (MIP) de un cordón mediante un análisis objetivo. (D) Proyecciones de intensidad máxima (MIP) de un cordón mediante escaneo z-galvo. (E) Proyecciones de intensidad máxima (MIP) de un cordón mediante z+exploración objetiva. (F) Proyecciones de intensidad máxima (MIP) de un cordón mediante un análisis de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Formación de sinapsis de células T. Representación de volumen de dos colores de la interacción de una celda T etiquetada con el tCR-AF488 (verde) con un APC objetivo que expresa mCherry citosólico (rojo) en 70 puntos de tiempo a intervalos de 1,54 s. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Película 2: Seguimiento del movimiento dinámico TCR. Comparar con la película 1. Los clústeres correspondientes a las estructuras de TCR visibles se realizaron un seguimiento en 3D a lo largo del tiempo con software de imágenes. Las colas de dragón que muestran las posiciones del racimo sobre los cuatro fotogramas anteriores están codificadas por colores por longitud de desplazamiento. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Película 3: Rebanadas ortogonales de sinapsis de células T. Compárese con la película 1 y la figura 1B-D. Doble porción ortogonal de la película 1, que muestra que la fab de la superficie de la célula. Barra de escala a 5 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
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Discussion
El protocolo presentado fue optimizado para el uso de células CD4+ T aisladas de 5C. Los ratones transgénicos C7 en el instrumento LLSM utilizado, y por lo tanto otros sistemas celulares y LLSM pueden necesitar ser optimizados de manera diferente. Sin embargo, este protocolo muestra la potencia de las imágenes 4D, ya que se puede utilizar para cuantificar la dinámica de un receptor de superficie en una célula entera con la menor distorsión en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, hay muchas posibles aplicaciones futuras de esta técnica.
Un paso crítico es permitir que las células se asienten a una concentración adecuada. Si demasiados APC se asientan en el cubreobjetos y se vuelven demasiado densos, es difícil encontrar una célula T que esté interactuando con un solo APC. Cuando una célula T tiene varias sinapsis, el seguimiento y la interpretación de los datos pueden llegar a ser muy complicados. Del mismo modo, si hay muy pocos AAP presentes, encontrar una célula T formando una sinapsis también es difícil. En nuestras manos, permitir que 50.000 células se asienten durante 10 minutos logra una densidad óptima. Sin embargo, este problema se puede evitar si se utiliza un sistema con celdas adherentes. Las células se pueden cultivar en la incubadora con los cubreobjetos a una confluencia deseada.
Del mismo modo, el número de células T caídas en el sistema depende del tamaño del baño y de la distancia a la que pueden dispersarse. En el sistema LLSM utilizado aquí, hay un baño de 12 ml y un baño de 2,5 ml, a diferencia de la versión anterior del sistema que sólo tenía un baño de 10 ml disponible. Usamos el baño de 12 ml para la imagen original de fluoresceína y luego cambiamos al baño de 2,5 ml para tomar imágenes de las células. Esto permite un lavado menos minucioso del baño siguiendo el paso de visualización del haz, y también reduce el número de células T necesarias para cada sesión de imágenes. A su vez, esto permitiría a los usuarios utilizar menos celdas.
Encontrar células en el punto correcto de interacción también es un desafío. En nuestras manos, las células T tardan alrededor de 2 minutos en asentarse en los AAP en la cubierta, por lo que es importante comenzar a buscar en el cubreobjetos células T dinámicas cerca de los AAP. Una mejora importante de esto ha sido la reciente adición de la luz LED en la cámara del buscador. Si utiliza un sistema de construcción casera, le recomendamos incluir esta característica en el diseño.
Por último, las estrategias de etiquetado fluorescente son otra consideración importante. Cada proteína fluorescente o tinte tiene un rendimiento cuántico diferente y la tasa de fotoblanqueo. Los colorantes fluorescentes son típicamente más brillantes, pero si las células han sido transducidas establemente con una molécula etiquetada con proteína fluorescente, la etiqueta se repone a medida que la célula continúa produciendo la molécula. Por lo tanto, la estrategia de etiquetado es un factor importante a tener en cuenta al diseñar experimentos.
Nos gustaría concluir con un debate sobre las orientaciones futuras para la tecnología. LLSM también es capaz de microscopía de iluminación estructurada (SIM), que da como resultado una resolución XY de 150 nm y una resolución Z de 280 nm, y es al menos 10 veces más rápida que la SIM12de campo ancho. Por lo tanto, mientras que LLSM proporciona una velocidad sin precedentes de imágenes 4D, no puede lograr la resolución espacial de las técnicas actuales de superresolución4,5,6. Sin embargo, esta resolución podría mejorarse si se pudiera crear un LlSM STED. Se han utilizado láminas de luz STED y agotamiento de emisiones estimuladas con microscopía selectiva de iluminación plana (STED-SPIM), pero carecen de la resolución temporal de LLSM21,22,23,24. Si STED-SPIM se adaptara para incorporar una celosía, potencialmente podríamos obtener una resolución axial de 50 nm con mucho menos fotoblanqueo, e imagen más rápida que las técnicas disponibles actualmente. Sin embargo, con las tecnologías disponibles actuales, LLSM nos da la resolución temporal más rápida con alta resolución axial.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer el consejo y la orientación del Dr. Vytas Bindokas de la Universidad de Chicago. Agradecemos a la Instalación Central integrada de microscopía de luz de la Universidad de Chicago por apoyar y mantener el microscopio de lámina de luz de celosía. Este trabajo fue apoyado por NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 y NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. cuenta con el apoyo del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
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